CN103602738A - 一种快速鉴定扇贝品种的多重pcr引物及方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法。属于应用生物技术领域。快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物，由栉孔扇贝引物、华贵栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物和虾夷扇贝引物组成。鉴定方法包括以下步骤：提取扇贝基因组总DNA，进行多重PCR扩增，根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝种类。栉孔扇贝、海湾扇贝、虾夷扇贝和华贵栉孔扇贝的PCR产物条带大小分别为514bp、367bp、205bp和149bp。本发明的鉴定引物及多重PCR方法可以灵敏、快速地确定待检测扇贝样品的种类，较传统检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。

Description

一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法
技术领域
本发明涉及扇贝的鉴别方法，尤其是涉及一种快速鉴定四种扇贝品种的多重PCR引物及方法。
背景技术
扇贝属软体动物门（Mollusca）、双壳纲（Lamellibranchia）、翼形亚纲（Pterimorphia）、珍珠贝目（Pterioida）、扇贝科（Pectinidae），是我国沿海主要的经济养殖贝类之一。我国沿海主要养殖扇贝种类包括：栉孔扇贝（Chlamys farreri）、华贵栉孔扇贝（Mimachlamys nobilis）、海湾扇贝（Argopecten irradians）和虾夷扇贝（Mizuhopecten yessoensis）。栉孔扇贝主要养殖地为我国北部沿海，华贵栉孔扇贝主要养殖地为我国的东部和南部沿海，海湾扇贝为从美国引进品种，虾夷扇贝为从日本和朝鲜引进品种。近年来，随着现代科技对扇贝养殖技术的不断成熟，扇贝养殖规模在山东、辽宁沿海地区不断扩大，扇贝养殖已成为水产养殖的支柱产业。在扇贝遗传育种以及加工贸易过程中，都需准确、快速地鉴定扇贝的种类。
传统鉴定扇贝种类的方法主要依靠形态学标准进行，例如：壳色、大小、足丝孔、放射肋、棘等。但是，通常加工后的扇贝只留下闭壳肌，失去了形态学特征，不能利用传统形态学对其进行鉴定。扇贝幼虫还未形成可辨别的形态特征，也不能利用传统形态学对其进行鉴定。因此，在一些情况下传统的方法很难准确鉴定扇贝的种类。所以，亟需一种基于分子生物学技术的能够快速、准确鉴定四种扇贝品种的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种快速鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝等四种扇贝品种的多重PCR引物及方法，本发明的方法可以灵敏、快速地确定待检测养殖扇贝样品的种类，较传统检测方法具有操作简单、可重复性强、成本低等优点。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的：一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物由栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物、虾夷扇贝引物和华贵栉孔扇贝引物组成。
所述的栉孔扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P1：5’ – ATACCCTCCGCTGTCGTCTA –3’ ；
下游引物 P2：5’ – CGCGTCTAATCCCACCGTAA –3’ 。
所述的海湾扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P3：5’ – TGTTCTGATCTTGCCTGGGT –3’ ；
下游引物 P4：5’ – AGCCACATCAAGACACGCAT –3’ 。
所述的虾夷扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P5：5’ – TGTTGATCTTGGACCGGCAT –3’ ；
下游引物 P6：5’ – GCATACATCATTGCCACCGC –3’ 。
所述的华贵栉孔扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P7：5’ – CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT –3’ ；
下游引物 P8：5’ –TCAGCCTTATACGCCTTGCC –3’ 。
上述的多重PCR引物用于鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝。
一种利用上述的多重PCR引物快速鉴定扇贝品种的方法，方法如下：
1) 提取待检测扇贝样品的基因组总DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为5-12ng/μL，制备样品DNA；
2) 利用上述的多重PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增；
3) PCR反应结束后，取产物做琼脂糖凝胶电泳检测；根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝的种类：如果出现大小为514bp的条带说明样品为栉孔扇贝；如果出现大小为367bp的条带说明样品为海湾扇贝；如果出现大小为205bp的条带说明样品为虾夷扇贝；如果出现大小为149bp的条带说明样品为华贵栉孔扇贝。
上述步骤2）中多重PCR扩增的反应体系为：5μL 10×PCR buffer，4μL 浓度为2.5mM的dNTP，0.4μL 浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的P1- P8引物各2μL，1μL样品DNA，无菌超纯水补齐到50μL。
上述步骤2）中多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min。
本发明的有益效果是：本发明利用来自扇贝的线粒体基因组COI基因序列设计合成了四对针对四种不同扇贝品种的特异性PCR引物，并利用此引物建立了一个多重PCR反应，实现了利用分子生物学方法快速鉴定四种扇贝品种的新方法。本方法具有操作简单、重复性好、准确、快速、灵敏等优点。本发明主要应用于扇贝种质资源保护、遗传育种以及产品鉴定等领域。
附图说明
图1 为实施例1鉴定的四种已知扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNA Marker，泳道1为栉孔扇贝，泳道2为海湾扇贝，泳道3为虾夷扇贝，泳道4为华贵栉孔扇贝。
图2 为实施例2快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNA Marker，泳道1为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为栉孔扇贝。
图3 为实施例3快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNA Marker，泳道1为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为华贵栉孔扇贝。
图4 为实施例4快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNA Marker，泳道1为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为海湾扇贝。
图5 为实施例5快速鉴定市购扇贝的PCR电泳检测结果，泳道M为DL1000 DNA Marker，泳道1为样本扇贝，结果显示待鉴定扇贝品种为虾夷扇贝。
具体实施方式
下面的实施例是对本发明进一步的说明，但并不因此而限制本发明。
实施例1   一种快速鉴定扇贝品种的方法
1) 分别取已知品种为栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝的四种扇贝，分别取扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/μL，分别制备样品DNA，即分别得到栉孔扇贝样品DNA、华贵栉孔扇贝样品DNA、海湾扇贝样品DNA和虾夷扇贝样品DNA；
2) 分别对不同品种的样品DNA进行多重PCR扩增：具体步骤如下：PCR反应体系为：5μL 10×PCR buffer，4μL 浓度为2.5mM的dNTP，0.4μL 浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2μL，1μL样品DNA，加无菌超纯水补齐到50μL ；PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min；扩增完成后PCR产物于4℃保存；
3) PCR反应结束后，取5μL PCR产物与1μL 上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000（宝生物工程(大连)有限公司），然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果；
4) PCR琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1所示：栉孔扇贝样品DNA出现大小为514bp的条带；海湾扇贝样品DNA出现大小为367bp的条带；虾夷扇贝样品DNA出现大小为205bp的条带；华贵栉孔扇贝样品DNA出现大小为149bp的条带。
实施例2   一种快速鉴定扇贝品种的方法
1) 取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/μL，制备样品DNA；
2) 对样品DNA进行多重PCR扩增：具体步骤如下：PCR反应体系为：5μL 10×PCR buffer，4 μL 浓度为2.5mM的dNTP，0.4μL 浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2μL，1μL样品DNA，加无菌超纯水补齐到50μL ；PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min；扩增完成后PCR产物于4℃保存；
3) PCR反应结束后，取5μL PCR产物与1μL 上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000（宝生物工程(大连)有限公司），然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2所示：出现大小为514bp的条带，说明此扇贝为栉孔扇贝品种。
实施例3   一种快速鉴定扇贝品种的方法
1) 取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/μL，制备样品DNA；
2) 对样品DNA进行多重PCR扩增：具体步骤如下：PCR反应体系为：5μL 10×PCR buffer，4μL 浓度为2.5mM的dNTP，0.4μL 浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2μL，1μL样品DNA，加无菌超纯水补齐到50μL ；PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min；扩增完成后PCR产物于4℃保存；
3) PCR反应结束后，取5μL PCR产物与1μL 上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000（宝生物工程(大连)有限公司），然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图3所示：出现大小为149bp的条带，说明此扇贝为华贵栉孔扇贝品种。
实施例4   一种快速鉴定扇贝品种的方法
1) 取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/μL，制备样品DNA；
2) 对样品DNA进行多重PCR扩增：具体步骤如下：PCR反应体系为：5μL 10×PCR buffer，4μL 浓度为2.5mM的dNTP，0.4μL 浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2μL，1μL样品DNA，加无菌超纯水补齐到50μL ；PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min；扩增完成后PCR产物于4℃保存；
3) PCR反应结束后，取5μL PCR产物与1μL 上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000（宝生物工程(大连)有限公司），然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图4所示：出现大小为367bp的条带，说明此扇贝为海湾扇贝品种。
实施例5   一种快速鉴定扇贝品种的方法
1) 取市购扇贝的闭壳肌组织，剪碎，按照常规酚氯仿法提取样品的DNA，用无菌超纯水溶解DNA样品，调节DNA浓度为8ng/μL，制备样品DNA；
2) 对样品DNA进行多重PCR扩增：具体步骤如下：PCR反应体系为：5μL 10×PCR buffer，4μL 浓度为2.5mM的dNTP，0.4μL 浓度为5U/μl的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的引物P1-P8各2μL，1μL样品DNA，加无菌超纯水补齐到50μL ；PCR反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45sec，59℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min；扩增完成后PCR产物于4℃保存；
3）PCR反应结束后，取5μL PCR产物与1μL 上样缓冲液混匀，上样于3%琼脂糖凝胶电泳，DNA Marker采用DL1000（宝生物工程(大连)有限公司），然后进行100V恒压电泳，电泳约30min，EB染色，在紫外灯下观察结果，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图5所示：出现大小为205bp的条带，说明此扇贝为虾夷扇贝品种。
序 列 表
<110>  辽宁大学
<120>  一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物及方法
<160>  8
 
<210>   1
<211>   20
<212>   DNA
<213>  栉孔扇贝上游引物P1
<400>   1
ATACCCTCCGCTGTCGTCTA
 
<210>   2
<211>   20
<212>   DNA
<213>  栉孔扇贝下游引物P2
<400>   2
CGCGTCTAATCCCACCGTAA
 
<210>   3
<211>   20
<212>   DNA
<213>  海湾扇贝上游引物P3
<400>   3
TGTTCTGATCTTGCCTGGGT
 
 
<210>   4
<211>   20
<212>   DNA
<213>  海湾扇贝下游引物P4
<400>   4
AGCCACATCAAGACACGCAT
 
<210>   5
<211>   20
<212>   DNA
<213>  虾夷扇贝上游引物P5
<400>   5
TGTTGATCTTGGACCGGCAT
 
<210>   6
<211>   20
<212>   DNA
<213>  虾夷扇贝下游引物P6
<400>   6
GCATACATCATTGCCACCGC
 
<210>   7
<211>   20
<212>   DNA
<213>  华贵栉孔扇贝上游引物P7
<400>   7
CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT
 
<210>   8
<211>   20
<212>   DNA
<213>  华贵栉孔扇贝下游引物P8
<400>   8
TCAGCCTTATACGCCTTGCC

Claims (5)

1.一种快速鉴定扇贝品种的多重PCR引物，其特征在于多重PCR引物由栉孔扇贝引物、海湾扇贝引物、虾夷扇贝引物和华贵栉孔扇贝引物组成；
所述的栉孔扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P1：5’ – ATACCCTCCGCTGTCGTCTA –3’ ；
下游引物 P2：5’ – CGCGTCTAATCCCACCGTAA –3’ ；
所述的海湾扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P3：5’ – TGTTCTGATCTTGCCTGGGT –3’ ；
下游引物 P4：5’ – AGCCACATCAAGACACGCAT –3’；
所述的虾夷扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P5：5’ – TGTTGATCTTGGACCGGCAT –3’ ；
下游引物 P6：5’ – GCATACATCATTGCCACCGC –3’ ；
所述的华贵栉孔扇贝引物的DNA序列为：
上游引物 P7：5’ – CCTCCTTTGTCCAGAACTCCT –3’ ；
下游引物 P8：5’ –TCAGCCTTATACGCCTTGCC –3’ 。
2.权利要求1所述的多重PCR引物在鉴定栉孔扇贝、华贵栉孔扇贝、海湾扇贝和虾夷扇贝中的应用。
3.一种利用权利要求1所述的多重PCR引物快速鉴定扇贝品种的方法，其特征在于方法如下：
1）提取待检测扇贝样品的基因组总DNA，无菌超纯水溶解DNA，调节DNA浓度为5-12ng/μL，制备样品DNA；
2）利用权利要求1所述的多重PCR引物对样品DNA进行多重PCR扩增；
3）PCR反应结束后，取产物做琼脂糖凝胶电泳检测；根据琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物大小判定待检测扇贝的种类：如果出现大小为514bp的条带说明样品为栉孔扇贝；如果出现大小为367bp的条带说明样品为海湾扇贝；如果出现大小为205bp的条带说明样品为虾夷扇贝；如果出现大小为149bp的条带说明样品为华贵栉孔扇贝。
4.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述多重PCR扩增的反应体系为：5μL 10×PCR buffer，4 μL 浓度为2.5mM的dNTP，0.4μL 浓度为5U/μL的Taq DNA聚合酶，8种浓度分别为0.2mM的P1-P8引物各2μL，1μL样品DNA，无菌超纯水补齐到50μL。
5.如权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤（2）中所述多重PCR扩增的反应条件为：95℃预变性5min；94℃变性45sec，60℃退火30sec，72℃延伸1min，共30个循环；72℃延伸7min。
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