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Abstract

本发明属于分子标记领域，具体公开了一段区分草鱼和青鱼的DNA片段和一组引物及PCR-RFLP鉴别方法。使用该引物进行PCR反应，草鱼和青鱼都可以扩增出长度为1140bp的Cyt b片段，该PCR产物使用限制性内切酶Bgl I进行酶切，电泳图谱出现2条条带的为草鱼，只有1条条带的为青鱼。因此可根据PCR产物酶切后有无条带的变化实现物种的准确快速鉴别。

Description

一种区分草鱼和青鱼的PCR-RFLP方法
所属技术领域  本发明属于分子标记技术领域具体说是一组区分草鱼和青鱼的引物、片段、内切酶和方法。
背景技术  草鱼(Ctenopharyngodon idellus)和青鱼(Mylopharyngodon piceus)是我国淡水养殖的传统经济品种，是四大家鱼之二。二者都属于鲤科雅罗鱼亚科，外观形态十分相似，很难区分。成鱼体色以青鱼较深而草鱼较浅，常被用作两者区分的重要标志。然而，颜色信息并不稳定，例如经固定液浸泡的标本会失去其本来颜色，即便是活鱼其体色也往往随生长环境的颜色变化而变化，因此，在类似情况下，依靠体色来鉴别二者显然是不可靠的。另外，在仔稚鱼等早期发育阶段，无论根据形态还是体色都很难将二者准确区分。物种难以准确鉴别，无疑给种质保存、养殖生产以及科学研究等工作增加了难度和失败的风险。
利用RAPD、AFLP、SSR等分子标记技术对研究对象的核基因组进行筛查，可以从分子水平直接寻找两者的核基因组差异，但是这些方法大都需要经过大量测序或复杂的技术操作后进行比较做出判断，费时费力。本发明利用线粒体DNA Cyt b基因PCR-RFLP方法，可以快速准确简便的区分草鱼和青鱼。
目前国内外尚无有关利用PCR-RFLP方法区分草鱼和青鱼的报道，本发明填补了该领域的空白。
发明内容  发明内容分列如下：
1、一组区分草鱼青鱼的引物、片段、限制性内切酶及其方法，其特征在于该引物的序列是由GenBank数据库关于两者的线粒体DNA Cytb基因序列(草鱼JN673556.1)和(青鱼AF051870.1)的保守区设计合成的。
2、如1所述的引物，其序列长度为15～22bp
3、如1～2所述的引物，其中一对引物序列为SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4所示的序列。
4、一段鉴别草鱼青鱼的Cytb基因片段，其特征在于该片段的序列包含SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2所示序列。
5、一种鉴别草鱼青鱼苗种的PCR-RFLP方法，其特征在于该方法根据样品PCR-RFLP反应产物的电泳结果鉴定样品为草鱼或是青鱼。
6、如4和5所述的方法，其特征在于该方法中PCR产物经经Bgl I酶切后，被切成256bp和884bp两条带的为草鱼，PCR产物没有被酶切的为青鱼。
具体来说，本发明目的是提供快速鉴别草鱼青鱼的一对引物和一种限制性内切酶及一段DNA片段，以及一种区分草鱼和青鱼的方法。
本分明利用PCR-RFLP技术，首先根据GenBank数据库关于两者的线粒体DNACytb基因序列(草鱼JN673556.1)和(青鱼AF051870.1)的保守区设计了一对引物(引物序列：SEQ ID NO：3：5'-ATGGCAAGCCTACGAAAAACC-3’；SEQ ID NO：4：5'-AGCTCATTTTAGTGCTTTAT-3’)对草鱼和青鱼的基因组DNA进行扩增，两者都可以扩增出一条约1100bp的条带，通过测序获得了长度为1140bp的DNA序列，如SEQ IDNO：1(草鱼)和SEQIDNO：2(青鱼)所示，对此序列进行内切酶位点分析，并选择出可用于区分草鱼青鱼的限制性内切酶Bgl I。
本发明提供了一种区分草鱼青鱼的方法，其特征在于根据样品的PCR-RFLP反应产物的电泳结果鉴定样品。该方法中PCR引物由SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示的序列间隔不少于1140bp的序列设计合成。RFLP所用内切酶根据SEQ ID NO：1和SEQ IDNO：2所示的序列去掉含种类多态性位点后设计。该方法中，PCR产物经限制性内切酶Bgl I酶切后，在256bp处被切成两条带(256bp和884bp)的为草鱼，没有被酶切的为青鱼。
PCR反应体系为25μl，含10×Buffer2.5μl、MgCl22μl、dNTP(各2.5μmol／L)2μl、上下游引物(10μmol／L)各1μl、Taq DNA聚合酶1U、基因组DNA20ng。反应程序为94℃预变性5min，之后进行40个循环(94℃45scc，47.5℃50sec，72℃50sec)，最后72℃延伸8min；4℃保存。
RFLP反应体系为20μl，含6μlPCR产物，2μl10×Buffcr，1μlBgl I(10U／mL)，11μl灭菌双蒸水。反应程序：混匀并瞬时离心，用封口膜封口后，置37℃水浴中消化5～8h，80℃处理25min以灭活内切酶。
用物种已准确知晓的30条草鱼和30条青鱼样品的基因组DNA进行检验，PCR反应显示所有样品均可以扩增出一条约1100bp的条带(图1)。经Bgl I酶切后，电泳结果显示，草鱼Cyt b被切成256bp和884bp两条带，而青鱼PCR产物没有被酶切(图2)。因而，根据PCR产物酶切后呈现2条或1条电泳条带可鉴别其为草鱼或青鱼。
综上所述，本发明提供了一种快速准确区分草鱼青鱼的分子标记方法，该方法通过对细胞色素b基因的扩增，然后对其PCR产物进行限制性内切酶酶切，根据酶切后有无条带的变化来判断是草鱼还是青鱼。实施例证明了该方法鉴别草鱼青鱼准确可靠。
附图说明
图1、草鱼青鱼的Cyt b基因PCR反应结果，显示用一对引物SEQ ID NO：3和SEQID NO：4对草鱼青鱼的基因组DNA进行PCR扩增，都可以扩增出一条约1100bp的条带。泳道1～12为草鱼，泳道13～24为青鱼，泳道25为分子量标准。
图2、草鱼青鱼Cytb基因PCR扩增产物被Bgl I酶切后的效果。草鱼Cyt b被切成256bp和884bp两条带，而青鱼PCR产物没有被酶切。泳道1～12为青鱼，泳道13～24为草鱼，泳道25为分子量标准。
具体实施方式
实施例：
用常规DNA提取方法分别提取草鱼青鱼各30尾的基因组DNA，稀释到10ng／μl以备PCR扩增使用；
PCR引物根据GenBank中提交的草鱼(JN673556.1)和青鱼(AF051870.1)Cyt b序列设计：
SEQ ID NO：3：5’-ATGGCAAGCCTACGAAAAACC-3’
SEQ ID NO：4：5'-AGCTCATTTTAGTGCTTTAT-3’
PCR反应体系25μl，含10×Buffer2.5μL、MgCl22μL、dNTP(各2.5μmol／L)2μL、上下游引物(10μmol／L)各1μL、Taq酶(5U／μL)0.25μL、基因组DNA1.5μL。反应程序为94℃预变性5min，之后进行40个循环(94℃变性45s，47.5℃退火50s，72℃延伸50s)，最后72℃延伸8min；4℃保存。反应设不含反应设不含模板DNA的空白对照。PCR产物用1％的琼脂糖凝胶电泳进行检测，溴化乙锭(EB)染色，凝胶成像系统观察拍照，结果如图1所示。
从图1可以看出，所有草鱼和青鱼的PCR产物都扩出一条约1100bp的条带，空白对照没有扩出条带。
随机选取草鱼和青鱼各8个样本的PCR扩增产物送至上海生工生物工程有限公司纯化，并进行双向测序，测序反应采用和PCR反应一致的正、反向引物。根据所测得的序列，跳过种类多态性位点后设计得出可用于鉴定草鱼青鱼的限制性内切酶Bgl I。
酶切反应体系为20μl，含6μLPCR产物，2μL10×Buffer，lμLBgl I(10U／ML)，11μL灭菌双蒸水。混匀并瞬时离心，用封口膜封口后，置37℃水浴中消化5～8h，80℃处理25min以灭活内切酶。酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色，照相，结果如图2所示：
经Bgl I酶切后，电泳结果显示，草鱼Cyt b被切成256bp和884bp两条带，而青鱼PCR产物没有被酶切。
为了验证结果的准确性，选取了青鱼和草鱼多个不同的个体进行重复实验，验证结果都一致。
PCR-RFLP方法结果准确、操作简便，同时对实验设备要求也较低，只需剪取实验用鱼的小部分尾鳍提取基因组DNA，当天就可以出结果，实现对青鱼和草鱼的快速准确的鉴别。本发明利用PCR-RFLP方法可以快速、准确地区分青鱼和草鱼。

Claims (1)

1.一种根据样品DNA的PCR-RFLP反应产物的电泳结果鉴定样品所属物种的快速鉴定方法，其特征在于该方法采用的PCR引物其序列为SEQ ID NO:3和SEQ IDNO:4所示的序列，PCR产物经过内切酶BglⅠ酶切后，电泳图谱出现大小为256bp和884bp两个条带的样品为草鱼，出现大小为1140bp一个条带的样品为青鱼；
其中，PCR反应体系为25μl，含10×Buffer 2.5μl、25m mol/L的MgCl2 2μl、各2.5μmol/L的dNTP 2μl、SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4所示序列的引物各0.4μmol/L、Taq DNA聚合酶1U、基因组DNA 20ng，PCR反应程序为94℃预变性5min，40个循环的94℃45sec、47.5℃50sec、72℃50sec，接着72℃延伸8min；RFLP反应体系和程序为20μl，含6μl PCR产物、2μl 10×Buffer、10U/ml的BglⅠ 1μl，37℃水浴消化5～8h，80℃25min灭活内切酶；酶切产物经2％的琼脂糖凝胶电泳，EB染色、照相。
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