JP2017520268A - Rnaを高収率で単離するための方法 - Google Patents
Rnaを高収率で単離するための方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2017520268A JP2017520268A JP2017502197A JP2017502197A JP2017520268A JP 2017520268 A JP2017520268 A JP 2017520268A JP 2017502197 A JP2017502197 A JP 2017502197A JP 2017502197 A JP2017502197 A JP 2017502197A JP 2017520268 A JP2017520268 A JP 2017520268A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- rna
- precipitation
- supernatant
- organic solvent
- buffer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 176
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 claims abstract description 324
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 claims abstract description 266
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims abstract description 193
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims abstract description 193
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims abstract description 188
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims abstract description 181
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims abstract description 172
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims abstract description 151
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 claims abstract description 136
- 108091032955 Bacterial small RNA Proteins 0.000 claims abstract description 120
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 claims abstract description 98
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims abstract description 97
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims abstract description 97
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 89
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 89
- 239000003586 protic polar solvent Substances 0.000 claims abstract description 39
- 239000002798 polar solvent Substances 0.000 claims abstract description 34
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 claims abstract description 34
- 230000001376 precipitating effect Effects 0.000 claims abstract description 29
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims abstract description 25
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 167
- 230000027455 binding Effects 0.000 claims description 163
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 138
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 claims description 127
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 74
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 71
- KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N Isopropanol Chemical compound CC(C)O KFZMGEQAYNKOFK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 70
- 230000003196 chaotropic effect Effects 0.000 claims description 69
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 claims description 41
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 34
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 claims description 32
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 30
- 230000004570 RNA-binding Effects 0.000 claims description 25
- WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N Tetrahydrofuran Chemical compound C1CCOC1 WYURNTSHIVDZCO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 24
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 20
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 20
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 20
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 19
- 239000003495 polar organic solvent Substances 0.000 claims description 17
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 15
- XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N Silicon Chemical compound [Si] XUIMIQQOPSSXEZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims description 14
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims description 14
- YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N tetrahydrofuran Natural products C=1C=COC=1 YLQBMQCUIZJEEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 12
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 9
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N N-Butanol Chemical compound CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 230000006378 damage Effects 0.000 claims description 6
- 150000003384 small molecules Chemical class 0.000 claims description 6
- RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 1,4-Dioxane Chemical compound C1COCCO1 RYHBNJHYFVUHQT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 150000001732 carboxylic acid derivatives Chemical class 0.000 claims description 5
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 claims description 5
- DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N (R)-(-)-Propylene glycol Chemical compound C[C@@H](O)CO DNIAPMSPPWPWGF-GSVOUGTGSA-N 0.000 claims description 3
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 3
- BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N propan-1-ol Chemical compound CCCO BDERNNFJNOPAEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims 1
- 125000003158 alcohol group Chemical group 0.000 claims 1
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 claims 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims 1
- 230000006920 protein precipitation Effects 0.000 abstract description 36
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 167
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 75
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 69
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 46
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 44
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 34
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 34
- -1 RNA from a sample Chemical class 0.000 description 32
- 238000002123 RNA extraction Methods 0.000 description 31
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 26
- JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L zinc dichloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Zn+2] JIAARYAFYJHUJI-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 26
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 25
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 24
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 24
- 210000002381 plasma Anatomy 0.000 description 22
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 22
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 21
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 20
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 20
- 239000006249 magnetic particle Substances 0.000 description 19
- 238000011529 RT qPCR Methods 0.000 description 18
- VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M Sodium acetate Chemical compound [Na+].CC([O-])=O VMHLLURERBWHNL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 17
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 17
- 239000001632 sodium acetate Substances 0.000 description 17
- 235000017281 sodium acetate Nutrition 0.000 description 17
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 16
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 15
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 15
- 241000894007 species Species 0.000 description 15
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 14
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 14
- 239000011592 zinc chloride Substances 0.000 description 13
- 235000005074 zinc chloride Nutrition 0.000 description 13
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 12
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 12
- 108700011259 MicroRNAs Proteins 0.000 description 11
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Natural products CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 10
- ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N guanidinium thiocyanate Chemical compound SC#N.NC(N)=N ZJYYHGLJYGJLLN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 9
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 9
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 8
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 8
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 8
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 8
- 239000013592 cell lysate Substances 0.000 description 8
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 7
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 7
- 230000005291 magnetic effect Effects 0.000 description 7
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 7
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 7
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- 239000006172 buffering agent Substances 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 6
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 6
- 108091033433 MiR-191 Proteins 0.000 description 5
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 5
- 108020003224 Small Nucleolar RNA Proteins 0.000 description 5
- 102000042773 Small Nucleolar RNA Human genes 0.000 description 5
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 5
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 5
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 5
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 5
- 239000000835 fiber Substances 0.000 description 5
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 5
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 description 5
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 5
- 108020004463 18S ribosomal RNA Proteins 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000282414 Homo sapiens Species 0.000 description 4
- 101710163270 Nuclease Proteins 0.000 description 4
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 4
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004556 brain Anatomy 0.000 description 4
- 150000001735 carboxylic acids Chemical class 0.000 description 4
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 4
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 4
- 239000003365 glass fiber Substances 0.000 description 4
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 4
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 4
- 239000001509 sodium citrate Substances 0.000 description 4
- NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K sodium citrate Chemical compound O.O.[Na+].[Na+].[Na+].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NLJMYIDDQXHKNR-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 4
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 4
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 108020005096 28S Ribosomal RNA Proteins 0.000 description 3
- 230000004568 DNA-binding Effects 0.000 description 3
- 108700039887 Essential Genes Proteins 0.000 description 3
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 3
- 102000039471 Small Nuclear RNA Human genes 0.000 description 3
- 108020004459 Small interfering RNA Proteins 0.000 description 3
- 108090000787 Subtilisin Proteins 0.000 description 3
- 108010056079 Subtilisins Proteins 0.000 description 3
- 102000005158 Subtilisins Human genes 0.000 description 3
- 150000001242 acetic acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 3
- 229910052783 alkali metal Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 3
- 125000000129 anionic group Chemical group 0.000 description 3
- 239000008346 aqueous phase Substances 0.000 description 3
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 3
- 210000001124 body fluid Anatomy 0.000 description 3
- 239000010839 body fluid Substances 0.000 description 3
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 3
- 150000003841 chloride salts Chemical class 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 3
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 3
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 108091027943 miR-16 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091062762 miR-21 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091041631 miR-21-1 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091044442 miR-21-2 stem-loop Proteins 0.000 description 3
- 108091027963 non-coding RNA Proteins 0.000 description 3
- 102000042567 non-coding RNA Human genes 0.000 description 3
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 3
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 3
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 3
- SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M potassium acetate Chemical compound [K+].CC([O-])=O SCVFZCLFOSHCOH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 159000000001 potassium salts Chemical class 0.000 description 3
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 3
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 3
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 3
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 3
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 3
- 230000022532 regulation of transcription, DNA-dependent Effects 0.000 description 3
- 235000012239 silicon dioxide Nutrition 0.000 description 3
- 239000004055 small Interfering RNA Substances 0.000 description 3
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 3
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 3
- FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M sodium iodide Chemical compound [Na+].[I-] FVAUCKIRQBBSSJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 108091092584 GDNA Proteins 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N Guanidine Chemical class NC(N)=N ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 2
- 108091007412 Piwi-interacting RNA Proteins 0.000 description 2
- 206010036790 Productive cough Diseases 0.000 description 2
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 2
- 108010022999 Serine Proteases Proteins 0.000 description 2
- 102000012479 Serine Proteases Human genes 0.000 description 2
- 108020004688 Small Nuclear RNA Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 101710135785 Subtilisin-like protease Proteins 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 2
- MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N Zirconium dioxide Chemical compound O=[Zr]=O MCMNRKCIXSYSNV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] Chemical compound [O--].[Al+3].[Al+3].[O-][Si]([O-])([O-])[O-] YKTSYUJCYHOUJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 125000000218 acetic acid group Chemical group C(C)(=O)* 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003146 anticoagulant agent Substances 0.000 description 2
- 229940127219 anticoagulant drug Drugs 0.000 description 2
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 2
- 230000003139 buffering effect Effects 0.000 description 2
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 2
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 2
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 2
- 150000007942 carboxylates Chemical class 0.000 description 2
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 2
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 2
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 description 2
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- 150000004292 cyclic ethers Chemical class 0.000 description 2
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 description 2
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 description 2
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 2
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 2
- 150000001991 dicarboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 description 2
- 238000004090 dissolution Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 2
- 238000010438 heat treatment Methods 0.000 description 2
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 2
- XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N hydrogen iodide Chemical compound I XMBWDFGMSWQBCA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052588 hydroxylapatite Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 2
- 208000014674 injury Diseases 0.000 description 2
- 150000002576 ketones Chemical class 0.000 description 2
- 150000003951 lactams Chemical class 0.000 description 2
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 210000005228 liver tissue Anatomy 0.000 description 2
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 2
- UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L magnesium acetate Chemical compound [Mg+2].CC([O-])=O.CC([O-])=O UEGPKNKPLBYCNK-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 239000011654 magnesium acetate Substances 0.000 description 2
- 235000011285 magnesium acetate Nutrition 0.000 description 2
- 229940069446 magnesium acetate Drugs 0.000 description 2
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 2
- 108091070501 miRNA Proteins 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 150000002763 monocarboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 150000002825 nitriles Chemical class 0.000 description 2
- XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D pentacalcium;hydroxide;triphosphate Chemical compound [OH-].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O XYJRXVWERLGGKC-UHFFFAOYSA-D 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M perchlorate Inorganic materials [O-]Cl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N perchloric acid Chemical compound OCl(=O)(=O)=O VLTRZXGMWDSKGL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 238000007858 polymerase cycling assembly Methods 0.000 description 2
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 2
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 2
- 210000003802 sputum Anatomy 0.000 description 2
- 208000024794 sputum Diseases 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 2
- 150000003462 sulfoxides Chemical class 0.000 description 2
- 210000001179 synovial fluid Anatomy 0.000 description 2
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- 150000003628 tricarboxylic acids Chemical class 0.000 description 2
- 229940066528 trichloroacetate Drugs 0.000 description 2
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 2
- 239000011534 wash buffer Substances 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 3-(N-morpholino)propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCN1CCOCC1 DVLFYONBTKHTER-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000012232 AGPC extraction Methods 0.000 description 1
- 101710184263 Alkaline serine protease Proteins 0.000 description 1
- 108700028369 Alleles Proteins 0.000 description 1
- USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N Ammonium acetate Chemical compound N.CC(O)=O USFZMSVCRYTOJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005695 Ammonium acetate Substances 0.000 description 1
- 239000007989 BIS-Tris Propane buffer Substances 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 108091070482 Caenorhabditis elegans miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004638 Circular DNA Proteins 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 238000007399 DNA isolation Methods 0.000 description 1
- 238000001712 DNA sequencing Methods 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 1
- 108091007413 Extracellular RNA Proteins 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 1
- 108020005198 Long Noncoding RNA Proteins 0.000 description 1
- 239000007987 MES buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007993 MOPS buffer Substances 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 108060004795 Methyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 1
- 102000007999 Nuclear Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010089610 Nuclear Proteins Proteins 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102000015636 Oligopeptides Human genes 0.000 description 1
- 108010038807 Oligopeptides Proteins 0.000 description 1
- 238000002944 PCR assay Methods 0.000 description 1
- 208000002151 Pleural effusion Diseases 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 238000011530 RNeasy Mini Kit Methods 0.000 description 1
- 108091060271 Small temporal RNA Proteins 0.000 description 1
- 108091046869 Telomeric non-coding RNA Proteins 0.000 description 1
- RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N Thiophosphoric acid Chemical class OP(O)(S)=O RYYWUUFWQRZTIU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M Trifluoroacetate Chemical compound [O-]C(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 description 1
- 206010000269 abscess Diseases 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 159000000021 acetate salts Chemical class 0.000 description 1
- 230000000996 additive effect Effects 0.000 description 1
- 102000011759 adducin Human genes 0.000 description 1
- 108010076723 adducin Proteins 0.000 description 1
- 238000013019 agitation Methods 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 1
- 235000019257 ammonium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229940043376 ammonium acetate Drugs 0.000 description 1
- 210000004381 amniotic fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000000010 aprotic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001742 aqueous humor Anatomy 0.000 description 1
- 238000003491 array Methods 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000000440 bentonite Substances 0.000 description 1
- 229910000278 bentonite Inorganic materials 0.000 description 1
- SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N bentoquatam Chemical compound O.O=[Si]=O.O=[Al]O[Al]=O SVPXDRXYRYOSEX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006177 biological buffer Substances 0.000 description 1
- 238000001574 biopsy Methods 0.000 description 1
- HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N bis-tris propane Chemical compound OCC(CO)(CO)NCCCNC(CO)(CO)CO HHKZCCWKTZRCCL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 210000001754 blood buffy coat Anatomy 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 238000010804 cDNA synthesis Methods 0.000 description 1
- 229910052793 cadmium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910001424 calcium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000005251 capillar electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 1
- 125000002091 cationic group Chemical group 0.000 description 1
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 230000002925 chemical effect Effects 0.000 description 1
- 239000003638 chemical reducing agent Substances 0.000 description 1
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 1
- 239000012539 chromatography resin Substances 0.000 description 1
- 239000007979 citrate buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001860 citric acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- 238000005352 clarification Methods 0.000 description 1
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 1
- 238000005345 coagulation Methods 0.000 description 1
- 230000015271 coagulation Effects 0.000 description 1
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 1
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000005289 controlled pore glass Substances 0.000 description 1
- 208000031513 cyst Diseases 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 238000000354 decomposition reaction Methods 0.000 description 1
- 239000007857 degradation product Substances 0.000 description 1
- 238000006731 degradation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 230000000779 depleting effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000007847 digital PCR Methods 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 230000001819 effect on gene Effects 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 230000007515 enzymatic degradation Effects 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 125000001495 ethyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000010195 expression analysis Methods 0.000 description 1
- 210000000416 exudates and transudate Anatomy 0.000 description 1
- 230000005293 ferrimagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000005294 ferromagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000007429 general method Methods 0.000 description 1
- 238000000227 grinding Methods 0.000 description 1
- 229960000789 guanidine hydrochloride Drugs 0.000 description 1
- 210000002216 heart Anatomy 0.000 description 1
- 239000008240 homogeneous mixture Substances 0.000 description 1
- 238000000265 homogenisation Methods 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000010348 incorporation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 1
- 229910052500 inorganic mineral Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000002452 interceptive effect Effects 0.000 description 1
- 210000000936 intestine Anatomy 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000011901 isothermal amplification Methods 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 229910052745 lead Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 1
- 210000004880 lymph fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000007403 mPCR Methods 0.000 description 1
- 229910001437 manganese ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000004949 mass spectrometry Methods 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 1
- 229910052753 mercury Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910044991 metal oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004706 metal oxides Chemical class 0.000 description 1
- 230000011987 methylation Effects 0.000 description 1
- 238000007069 methylation reaction Methods 0.000 description 1
- YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N methylphosphonic acid Chemical class CP(O)(O)=O YACKEPLHDIMKIO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091090568 miR-39 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091056739 miR-39-1 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 108091039160 miR-39-2 stem-loop Proteins 0.000 description 1
- 239000002679 microRNA Substances 0.000 description 1
- 238000010208 microarray analysis Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 1
- 235000010755 mineral Nutrition 0.000 description 1
- 239000011707 mineral Substances 0.000 description 1
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 1
- 210000003205 muscle Anatomy 0.000 description 1
- 230000031689 negative regulation of reverse transcription Effects 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006386 neutralization reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007481 next generation sequencing Methods 0.000 description 1
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 1
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 1
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 238000011275 oncology therapy Methods 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 1
- 230000005298 paramagnetic effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 150000004713 phosphodiesters Chemical class 0.000 description 1
- 230000000704 physical effect Effects 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 1
- 235000011056 potassium acetate Nutrition 0.000 description 1
- 229960004109 potassium acetate Drugs 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000002265 prevention Effects 0.000 description 1
- 238000003672 processing method Methods 0.000 description 1
- 239000000047 product Substances 0.000 description 1
- 230000001737 promoting effect Effects 0.000 description 1
- KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N propane-1-sulfonic acid Chemical compound CCCS(O)(=O)=O KCXFHTAICRTXLI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000019833 protease Nutrition 0.000 description 1
- 235000019419 proteases Nutrition 0.000 description 1
- 230000013777 protein digestion Effects 0.000 description 1
- 238000000751 protein extraction Methods 0.000 description 1
- 108010056508 proteinase R Proteins 0.000 description 1
- 108010056534 proteinase T Proteins 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 239000003161 ribonuclease inhibitor Substances 0.000 description 1
- 239000002342 ribonucleoside Substances 0.000 description 1
- 235000002020 sage Nutrition 0.000 description 1
- 210000003296 saliva Anatomy 0.000 description 1
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 210000000582 semen Anatomy 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 125000003607 serino group Chemical group [H]N([H])[C@]([H])(C(=O)[*])C(O[H])([H])[H] 0.000 description 1
- 125000005372 silanol group Chemical group 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000004760 silicates Chemical class 0.000 description 1
- LIVNPJMFVYWSIS-UHFFFAOYSA-N silicon monoxide Chemical class [Si-]#[O+] LIVNPJMFVYWSIS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052814 silicon oxide Inorganic materials 0.000 description 1
- 108091029842 small nuclear ribonucleic acid Proteins 0.000 description 1
- 229960001790 sodium citrate Drugs 0.000 description 1
- 235000011083 sodium citrates Nutrition 0.000 description 1
- 235000009518 sodium iodide Nutrition 0.000 description 1
- 229910001415 sodium ion Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 1
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 1
- 238000003756 stirring Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008093 supporting effect Effects 0.000 description 1
- 230000003319 supportive effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000005026 transcription initiation Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 description 1
- 230000008733 trauma Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000000870 ultraviolet spectroscopy Methods 0.000 description 1
- 210000004127 vitreous body Anatomy 0.000 description 1
- 238000003260 vortexing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
- C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
- C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Crystallography & Structural Chemistry (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
Abstract
Description
本発明者らは、非プロトン性極性溶媒(例えば、DMSOまたはTHF)およびプロトン性溶媒(例えば、イソプロパノールまたはエタノール)から選択される有機溶媒が、タンパク質沈殿ステップの間に15%またはそれに満たない濃度で存在する場合、タンパク質枯渇上清から核酸を単離する前に金属カチオンで誘導されたタンパク質沈殿ステップを含む核酸単離方法が、有意に改善され得ることを見出した。沈殿物の除去後に、小さなRNA(200nt未満)と共に大きなRNA(少なくとも1000nt)と、試料に含有される場合は当然ながら中間サイズのRNAを含むタンパク質枯渇上清が提供される。したがって、これらのRNA種は全て、例えば、全RNAの形態で、またはそれぞれがサイズ範囲である、所望のサイズのRNAが富化された1種もしくは複数の別々の画分として、タンパク質枯渇上清から単離することができる。したがって、この方法は、RNAの単離に特に適する。さらに、実施例に示す通り、得られた上清からDNAも単離され得る。これにより、単離しようとする核酸に関する柔軟性を使用者に与える、改善された核酸単離方法が提供される。
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を試料に添加することにより沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
i)金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から核酸を単離するステップと
を含む方法が提供される。
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
i)金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、得られた上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと
を含む方法が提供される。
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤と、
b)非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒と、
c)少なくとも1種の緩衝剤と
を含む沈殿バッファーであって、3〜5.5の範囲であるpH値を有する沈殿バッファーが提供される。
本発明は、沈殿後に、小および大RNAと、実施形態ではDNAも含むタンパク質枯渇上清を提供する、RNA含有試料を処理するための改善されたタンパク質沈殿に基づく方法を提供する。含有される核酸型のうち1種または複数はその後に、上清から単離することができる。タンパク質枯渇上清は、小および大RNAを含む異なる種類のRNA種を含み、したがって、単離される標的核酸に関するさらなる柔軟性を使用者にもたらすため、方法は、先行技術方法を上回る改善である。よって、異なる核酸の単離のために使用することができる一方法が提供される。
第1の態様によれば、試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法であって、
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
i)金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清からRNAを単離するステップと
を含む方法が提供される。
ステップa)において、試料を含有する沈殿混合物が調製され、タンパク質が沈殿される。試料は、好ましくは、生物学的試料であり、例えば、試料破壊が核酸放出に必要な場合は、破壊された試料であり得る。その後に記載される通り、試料破壊は、タンパク質沈殿ステップの間に行うこともできる。沈殿を開始するために、1種の(すなわち、少なくとも1種の)金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される1種の(すなわち、少なくとも1種の)有機溶媒が、試料に添加される。本明細書に記載されている濃度での、タンパク質沈殿ステップの間のかかる有機溶媒の取り込みは、その後に得られるタンパク質枯渇上清が、200nt未満の長さを有する小RNA(先行技術方法と同様に)を含むのみならず、少なくとも1000ntの長さを有する大RNAをさらに含むという効果を有する。当然ながら、上清は、試料に含まれる場合は、中間サイズのRNA種を含むこともできる。方法の適用性が広がり、使用者は、異なる型のRNAを単離することができるため、小さいのみならず、より大きなRNA種もタンパク質枯渇上清に含まれることが有利である。さらに、実施例において実証される通り、実施形態では、上清は、DNAも含む。
a)少なくとも1種の破壊試薬、少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を試料に添加して、試料を破壊し、
i)金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有し、
v)破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から核酸を単離するステップと
を含む方法が提供される。
x)試料を破壊するステップと、
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を破壊された試料に添加して、
i)金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有する
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から核酸を単離するステップと
を含む方法が提供される。
aa)少なくとも1種のアルコールを上清に添加して、≧35%、好ましくは≧40%、より好まれる≧45%の濃度でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
bb)結合混合物に含有される全RNAを核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップbb)後に、大および小RNAが、固相に結合される、ステップと、
cc)任意選択で、結合されたRNAを洗浄するステップと、
dd)固相からRNAを溶出するステップと
を含む。
− DNAase消化の間にフロースルーとして核酸結合固相から放出された可能性がある小RNAを収集するステップ、
− 前記核酸結合固相へと含有される小RNAを再結合させるために、回収溶液と混合された小RNAを含む前記フロースルーを、核酸結合固相と接触させるステップ。
a)溶解された塩の形態の少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤、ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、好ましくは、プロトン性溶媒が、水混和性アルコールであり、より好まれることには、エタノールおよびイソプロパノールから選択され、沈殿混合物が、
i)300mM〜625mM、350mM〜600mMまたは400mM〜550mMから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤塩を含み、
ii)6.5%〜14.5%、7%〜14%、8%〜13.5%、9%〜13%または9.5%〜12%から選択される濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)3〜5.25、3.25〜5.0、3.25〜4.75、3.5〜4.5または3.75〜4.4の範囲である酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から少なくとも小および大RNAを単離するステップであって、
aa)少なくとも1種のアルコールを上清に添加して、濃度≧40%、≧45%または≧50%でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
bb)結合混合物に含有される全RNAをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップbb)後に、少なくとも大および小RNAが、固相に結合される、ステップと、
cc)任意選択で、結合されたRNAを洗浄するステップと、
dd)固相からRNAを溶出するステップと
を含む、ステップと
を含む。
x)試料を破壊するステップと、
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を破壊された試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、プロトン性溶媒は、好ましくは、水混和性アルコールであり、沈殿混合物が、
i)300mM〜625mM、350mM〜600mMまたは400mM〜550mMから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)6.5%〜14.5%、7%〜14%、8%〜13.5%、9%〜13%または9.5%〜12%から選択される濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)3〜5.25、3〜5、3.25〜4.75、3.5〜4.5または3.75〜4.4の範囲である酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から少なくとも小および大RNAを単離するステップであって、
aa)少なくとも1種のアルコールを上清に添加して、濃度≧40%、≧45%または≧50%でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
bb)結合混合物に含有される全RNAをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップbb)後に、少なくとも大および小RNAが、固相に結合される、ステップと、
cc)任意選択で、結合されたRNAを洗浄するステップと、
dd)固相からRNAを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。
x)試料を破壊するステップと、
a)溶解された塩の形態のZn2+およびAl3+から選択される少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤、好ましくは塩化亜鉛、ならびに非プロトン性極性溶媒である少なくとも1種の有機溶媒を破壊された試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
i)300mM〜625mM、350mM〜600mMまたは400mM〜550mMから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤塩を含み、
ii)8%〜13.5%、9%〜13%または9.5%〜12%から選択される濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)3.5〜4.5または3.75〜4.4の範囲である酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から小および大RNAを単離するステップであって、
aa)少なくとも1種のアルコールを上清に添加して、濃度≧40%、≧45%または≧50%でアルコールを含む結合混合物を提供するステップであって、結合混合物が、カオトロピック塩をさらに含む、ステップと、
bb)結合混合物に含有される全RNAをケイ素+含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップbb)後に、少なくとも大および小RNAが、固相に結合される、ステップと、
cc)結合されたRNAを洗浄するステップと、
dd)固相からRNAを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。
a)少なくとも1種の破壊試薬、少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、プロトン性溶媒は、好ましくは、試料を破壊し、
i)300mM〜625mM、350mM〜600mMまたは400mM〜550mMから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)6.5%〜14.5%、7%〜14%、8%〜13.5%、9%〜13%または9.5%〜12%から選択される濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)3〜5.25、3〜5、3.25〜4.75、3.5〜4.5または3.75〜4.4の範囲である酸性pH値を有し、
v)破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製するための水混和性アルコールであり、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から少なくとも小および大RNAを単離するステップであって、
aa)少なくとも1種のアルコールを上清に添加して、濃度≧40%、≧45%または≧50%でアルコールを含む結合混合物を提供するステップと、
bb)結合混合物に含有される全RNAをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップbb)後に、少なくとも大および小RNAが、固相に結合される、ステップと、
cc)任意選択で、結合されたRNAを洗浄するステップと、
dd)固相からRNAを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。
a)少なくとも1種の破壊試薬、溶解された塩の形態のZn2+およびAl3+から選択される少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤、好ましくは塩化亜鉛、ならびに非プロトン性極性溶媒である少なくとも1種の有機溶媒を添加して、試料を破壊し、
i)300mM〜625mM、350mM〜600mMまたは400mM〜550mMから選択される濃度で金属カチオン沈殿剤塩を含み、
ii)8%〜13.5%、9%〜13%または9.5%〜12%から選択される濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)3.5〜4.5または3.75〜4.4の範囲である酸性pH値を有し、
v)破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)上清から小および大RNAを単離するステップであって、
aa)少なくとも1種のアルコールを上清に添加して、濃度≧40%、≧45%または≧50%でアルコールを含む結合混合物を提供するステップであって、結合混合物が、カオトロピック塩をさらに含む、ステップと、
bb)結合混合物に含有される全RNAをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、ステップbb)後に、少なくとも大および小RNAが、固相に結合される、ステップと、
cc)結合されたRNAを洗浄するステップと、
dd)固相からRNAを溶出するステップと
を含む、ステップとを含む。
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、沈殿混合物が、
i)金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、得られた上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと
を含む方法が提供される。
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤と、
b)非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒と、
c)少なくとも1種の緩衝剤と
を含む沈殿バッファーであって、3〜5.5の範囲であるpH値を有する沈殿バッファーが提供される。
aa)1.25M〜2.8M、1.5M〜2.6Mまたは1.7M〜2.5Mから選択される濃度で、溶解された塩の形態の金属カチオン沈殿剤として、Zn2+またはAl3+、好ましくはZn2+を含み、
bb)13%〜65%、20%〜63%、25%〜62.5%、30%〜60%、33%〜57.5%、37.5%〜55%または40%〜52.5%から選択される濃度で好ましくは非プロトン性極性有機溶媒である有機溶媒を含み、
cc)3.25〜4.75または3.4〜4.5の範囲であるpH値を有する。
− 少なくとも1種の破壊試薬;
− 少なくとも1種の核酸結合固相;
− 少なくとも1種の結合溶液;
− 少なくとも1種の洗浄溶液;および/または
− 少なくとも1種の溶出溶液
のうち1種または複数とを含む。
他に断りがなければ、全RNAは、次の標準プロトコールに従って血清、血漿または組織から単離した:
沈殿バッファーXP(45%(v/v)DMSO;ZnCl2(1.909M);NaOAc;pH4〜4.5)
− シリカカラム(RNeasy(登録商標)MinElute(登録商標)スピンカラム)
− 収集チューブ(1.5mlおよび2ml)
− 洗浄バッファーRWT(QIAGEN;GTCを含有、2容量エタノール(96%〜100%)を使用前にバッファー濃縮物RWTに添加)
− 洗浄バッファーRPE(QIAGEN;4容量エタノール(96%〜100%)を使用前にバッファー濃縮物RPEに添加)
− 溶解バッファーRLT Plus(QIAGEN;カオトロピック塩および洗剤を含有)
− RNaseフリー水
− Ce_miR−39_1 miScript(登録商標)プライマーアッセイ
2.1.手動手順
120μl溶解バッファー(RLT Plus、QIAGEN)を、血清または血漿等の200μl試料に添加する。溶解混合物を5秒間ボルテックスにかけ、3分間室温でインキュベートして、試料を破壊する。
破壊された試料に95μl沈殿バッファーXPを添加し、3秒間ボルテックスにかける。任意選択で、3.5μl miRNeasy血清スパイクイン対照(1.6×108コピー/μl)を添加し、再度3秒間ボルテックスにかける。次に、試料を3分間氷上でインキュベートする。任意選択で、試料は、数時間4℃で貯蔵することもできる。得られた沈殿物を>11,000rpmで3分間の遠心分離により除去する。核酸含有上清を新たな収集チューブに移す。
1容量(360μl)アルコール(例えば、イソプロパノール)を上清に添加し、結合混合物を5秒間ボルテックスにかける。次に、結合混合物をシリカスピンカラムにアプライし、室温で2分間インキュベートする。その後、カラムを30秒間>11.000rpmで遠心分離する。
結合されたRNAをさらに精製するために、数回の洗浄ステップを行った:700μl RWT、15秒間>8000×gで遠心分離、フロースルーを廃棄;800μl RPE、15秒間>8000×gで遠心分離、フロースルーを廃棄;700μl RPE、15秒間>8000×gで遠心分離、フロースルーを廃棄。最後に、300μl 100%エタノールをカラムに添加し、2分間>8000×gで遠心分離;フロースルーを廃棄する。次に、洗浄されたRNAの入ったカラムを新たな2ml収集チューブに移す。次に、蓋を開けたカラムを5分間、最大rpmで遠心分離して、残る微量のエタノールを除去する。
カラムを新たな1.5ml反応槽に移す。20μl RNaseフリー水をカラム中央にアプライする。カラムを閉じ、1分間、最大rpmで遠心分離する。任意選択で、例えば、既に得られた溶出液を使用して、第2の溶出ステップを行うことができる。
BioRobot Universalロボットシステムまたは例えば、QIAcube HTシステムにおいて96ウェルプレートを使用して、複数の試料を同時に処理して、手動プロトコールを行うこともできる。CMTR(収集マイクロチューブラック)ブロックにおいて試料調製を行うことができる:
200μl血清または血漿をCMTRブロックに添加する。120μl溶解バッファー(RLT Plus、QIAGEN)を添加し、混合する。溶解のため、溶解混合物を3分間、室温でインキュベートする。
95μl沈殿バッファーXPを溶解混合物に添加し、試料を混合する。任意選択で、3.5μl miRNeasy血清スパイクイン対照(1.6×108コピー/μl)を添加し、混合する。上述の通り、この段階で、数時間4℃で試料を貯蔵することも可能である。沈殿物を4℃、>5.000rpmで5分間の遠心分離により除去する。続いて、BioRobot UniversalシステムにおいてCMTRブロックをさらに処理する。このさらなるBioRobotプロトコールは、血清/血漿試料のための現存するmiRNeasy BioRobotプロトコールに相当する。唯一の適応は、試料から得られる上清の容量である。RNA単離は、RNeasy 96プレートを使用して行われる。洗浄ステップは、手動調製のために記載されているステップに相当する。溶出容量は、2×55μlである。
BioRobot Universalプロトコールを使用した、血清および血漿からのmiRNAを含む全RNAの単離
単離されたmiRNAのスペクトル
miRNA単離における非プロトン性極性溶媒の影響
全RNA単離における非プロトン性極性有機溶媒の影響
組織試料からのmiRNA単離
沈殿の間に使用される有機溶媒の役割
緩衝剤およびpH値
沈殿バッファーにおいて使用される金属カチオン
有機溶媒および金属カチオン沈殿剤の濃度範囲
図14によって実証される通り、大RNAも効率的に単離するために、既に、沈殿バッファーにおける15%DMSO(沈殿混合物における最終濃度3.4%)が適している。沈殿バッファーXPにおける30%DMSO(沈殿混合物における最終濃度6.9%)を使用する場合、さらに、ゲノムDNA等、高分子核酸を単離することができた。したがって、有機溶媒の濃度の選択は、どの種類の核酸が、上清に存在し続けるか、したがって、単離することができるかに影響する。しかし、沈殿バッファーにおけるより高濃度の75%DMSOの使用(沈殿混合物における最終濃度17.2%)は、大RNAの収率を低下させたが、高分子DNAは、上清から依然として単離することができた。さらにより高濃度のDMSOは、小RNAのみを単離することができる結果をもたらした。しかし、この場合、ゲル分析によると、小RNAの全体的な収率も低下されると思われた(図14、25.6%DMSOを参照)。したがって、沈殿混合物における本発明に従って使用される有機溶媒の濃度は、重要であり、好まれる濃度範囲は、沈殿混合物における3.4〜15%の間にある。これらの濃度は、例えば、本発明に従って15%〜60%の間の有機溶媒を含む沈殿バッファーを使用して達成することができる。それぞれの濃度範囲は、沈殿物の除去後に、小分子と共に大RNAを含むタンパク質枯渇上清をもたらすのに特に適しており、続いてこのRNAは、前記上清から単離することができる。単離されたmiRNAの分析は、濃度が高すぎない限り、DMSOが存在するか存在しないかにかかわらず、同様に十分に小分子核酸が単離されたことを示した。例えば、図4および図14によって実証される通り、数種類のmiRNAに関して、有機溶媒が存在する場合、結果はさらに改善された。例えば、DMSOが存在する場合(沈殿混合物における少なくとも3.4%最終濃度)、miR−191をより効率的に単離することができる。大RNAの単離を可能にするために、本明細書において実証される通り、有機溶媒は非常に重要である。有機溶媒が存在しない場合、または濃度が高すぎて、特許請求される範囲の外側にある場合、大RNAは、上清に存在しない、それぞれ、ごく少量存在する。
結果を図14および図16に示す。沈殿剤、塩化亜鉛の場合、タンパク質を沈殿させるために、既に最小の検査した量の塩化亜鉛(沈殿バッファーにおける0.212M、これは、沈殿混合物における48mM最終濃度に相当)で十分である。沈殿バッファーにおける最大2.55Mの塩化亜鉛濃度(沈殿混合物における最終濃度582mM)は、細胞溶解物から全核酸調製物をもたらすのに同様に適している。さらにより高濃度(沈殿バッファーXPにおける3.18M、これは沈殿混合物における728mM最終濃度に相当)を使用する場合、図14から明らかな通り、高分子核酸(high molecular acid)の単離は妨害される。血清からのmiRNA単離に関して、沈殿バッファーにおける0.212Mおよび0.63M塩化亜鉛の濃度(最終濃度それぞれ48mM、145mM)が、検査されたより高濃度ほど効率的に、miRNAの単離に寄与しないことが示された。したがって、金属カチオン沈殿剤の好まれる範囲は、例えば、沈殿混合物における290〜580mMである。これは、例えば1.27〜2.55M塩化亜鉛を含む沈殿バッファーを使用することにより達成することができる。
破壊試薬の添加
破壊試薬により溶解された試料の沈殿
図17は、得られた結果を示す。プロトン性(EtOH、左ゲル)および非プロトン性(DMSO、右ゲル)有機溶媒を使用した。M=マーカー;沈殿混合物におけるカオトロピック塩濃度(4.0〜2.5Mに及ぶ)をレーン毎に示す。結果は、ある範囲のカオトロピック剤濃度にわたって、プロトン性および非プロトン性有機溶媒の存在下で、大RNAを含む大分子核酸を単離することができることを実証する。検査した4.0〜2.5Mの例示的な範囲は、優れた結果を生じた。
非プロトン性およびプロトン性有機溶媒の濃度範囲
結果を図18に示す。図は、DMSO(上パネル)およびEtOH(下パネル)の結果を示す。M=マーカー;レーン毎のパーセント値は、沈殿混合物におけるパーセントDMSOまたはEtOHを示す。図18によって実証される通り、沈殿混合物における2%非プロトン性またはプロトン性有機溶媒の最終濃度は、大RNAを効率的に単離するために既に適している。この知見は、僅かにより高濃度の3%DMSOまたはEtOHを使用して同様に確認された。ゲノムDNA等、高分子核酸をさらに別の検査した濃度において単離することもでき、これにより、最終有機溶媒濃度6.9%でゲノムDNAを単離することができたという実施例9の知見を確認した。比較的高い有機溶媒濃度14%を使用した場合でも、大RNAを溶出液から依然として回収することができた。
異なる酸性pH値の沈殿バッファーを使用した大分子核酸の単離
異なる検査したpH値3.30〜4.75の結果を下表に示す:
異なるpH値の沈殿バッファーを使用した小RNAの単離
追加的なpH値に関して実施例7の結果を確認した。pH3.3〜pH4.75に及ぶpH値により、複雑なタンパク質に富んだ血清試料においても、RNA結合ステップの間のイソプロパノールの添加後の濁りを回避することが可能であった。カラムの混入および詰りを回避した。miRNAを優れた収率で単離した;miScriptアッセイを使用したmiRNA分析の結果を図19に示す(miRTC=逆転写対照;PPC=陽性PCR対照)。
Claims (20)
- 試料から核酸を単離するためのフェノールフリーの方法であって、
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を前記試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、前記沈殿混合物が、
i)前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で前記有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)上清から沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)前記上清から核酸を単離するステップと
を含む方法。 - 前記沈殿混合物が、2%〜15%の濃度で前記有機溶媒を含み、前記有機溶媒が、水混和性である、請求項1に記載の方法。
- 単離される前記核酸が、RNAであり、ステップc)が、前記上清から少なくとも小分子および/または大RNAを単離することを含む、請求項1または2に記載の方法。
- ステップc)が、
aa)少なくとも1種のアルコールを前記上清に添加して、濃度≧35%または≧40%の前記アルコールを含む結合混合物を提供することと、
bb)前記結合混合物に含有される全RNAをケイ素含有核酸結合固相に結合させることであって、このステップbb)後に、少なくとも大分子および小RNAが、前記固相に結合される、ことと、
cc)任意選択で、前記結合されたRNAを洗浄することと、
dd)前記固相からRNAを溶出することと
を含む、請求項3に記載の方法。 - 次の特徴:
i)前記金属カチオン沈殿剤が、Zn2+もしくはAl3+、好ましくはZn2+であること、および/または
ii)前記金属カチオン沈殿剤が、溶液の形態で添加され、ステップa)において提供される前記沈殿混合物が、200mM〜675mM、250mM〜650mM、300mM〜625mM、350mM〜600mMもしくは400mM〜550mMから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含むこと、および/または
iii)前記金属カチオン沈殿剤が、前記金属カチオン沈殿剤の溶解された塩を含む溶液の形態で添加されること
のうち1種または複数を有する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。 - 次の特徴:
i)ステップa)において提供される前記沈殿混合物が、3%〜15%、5%〜14.5%、6%〜14%、7%〜13.5%、8%〜13%、9%〜12.5%もしくは9.5%〜12%から選択される濃度で前記有機溶媒を含むこと、
ii)前記有機溶媒が、非プロトン性極性溶媒であること、
iii)前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(THF)、ジオキサン、1−メチル−2−ピロリドン(NMP)およびジメチル−ホルムアミド(DMF)からなる群から選択される非プロトン性極性溶媒であること、
iv)前記有機溶媒が、アルコールであるプロトン性溶媒であること、ならびに/または
v)前記有機溶媒が、好ましくはエタノールおよびイソプロパノールから選択される水混和性アルコールであるプロトン性溶媒であること
のうち1種または複数を有する、請求項1〜5のうち一項または複数に記載の方法。 - 沈殿の間のpH値が、≦5.5、≦5.25、≦5、≦4.75、≦4.5または≦4.4である、請求項1〜6のうち一項または複数に記載の方法。
- ステップa)が、前記試料に沈殿バッファーを添加することを含み、前記沈殿バッファーが、前記金属カチオン沈殿剤、前記有機溶媒および前記緩衝剤を含む、請求項1〜7のうち一項または複数に記載の方法。
- 前記沈殿バッファーが、次の特徴:
i)0.75M〜3M、1M〜2.8M、1.25M〜2.7M、1.5M〜2.6Mもしくは1.7M〜2.5Mから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含むこと、
ii)13%〜65%、20%〜63%、25%〜62.5%、30%〜60%、33%〜57.5%、37.5%〜55%もしくは40%〜52.5%から選択される濃度で前記有機溶媒を含むこと、および/または
iii)3〜5、3.25〜4.75、3.5〜4.5もしくは3.75〜4.4から選択されるpH値を有すること
のうち1種または複数を有する、請求項8に記載の方法。 - 単離される前記核酸が、RNAであり、ステップc)において、RNAが、核酸結合固相を使用して単離され、少なくとも1種のアルコールおよび/または少なくとも1種のカオトロピック塩を使用して、RNA結合条件を確立する、請求項1〜9のうち一項または複数に記載の方法。
- ステップc)が、前記上清に少なくとも1種のアルコールを添加して、前記RNA結合条件を確立することを含み、ステップc)において添加される前記アルコールが、次の特徴:
i)1〜5個の炭素原子を有する分枝状もしくは非分枝状脂肪族アルコールであること、
ii)メタノール、エタノール、プロパノール、イソプロパノールおよびブタノールならびにこれらの混合物から選択されること、
iii)イソプロパノールおよびエタノールから選択されること、ならびに/または
iv)イソプロパノールであること
のうち1種または複数を有する、請求項10に記載の方法。 - 前記試料を破壊し、試料破壊を、前記金属カチオン沈殿剤および前記有機溶媒の添加に先立ち、ならびに/または前記沈殿混合物が調製されるのと同じとき/段階に行う、請求項1〜11のうち一項または複数に記載の方法。
- x)前記試料を破壊するステップと、
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を破壊された試料に添加して、
i)前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で前記有機溶媒を含み、
iii)緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有する
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、タンパク質を沈殿させるステップと、
b)前記上清から前記沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)前記上清から核酸を単離するステップと
を含むか、あるいは
a)少なくとも1種の破壊試薬、少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を前記試料に添加して、前記試料を破壊し、
i)前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)15%またはそれに満たない濃度で前記有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)酸性pH値を有し、
v)前記破壊試薬を含む
沈殿混合物を調製することにより、沈殿混合物を調製し、
タンパク質を沈殿させるステップと、
b)前記上清から前記沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)前記上清から核酸を単離するステップと
を含む、請求項12に記載の方法。 - 前記沈殿混合物が、2%〜15%の濃度で前記有機溶媒を含み、前記有機溶媒が、水混和性である、請求項13に記載の方法。
- 次の特徴:
i)前記上清から全RNAが単離されること、
ii)富化された画分の形態で小RNAが単離されること、
iii)小RNAおよび大RNAを含む前記上清が、ゲノムDNAをさらに含むこと、
iv)前記上清から全核酸が単離されること、
v)前記上清から、RNAとは別個にゲノムDNAが単離されること、ならびに/または
vi)ステップc)において、RNAが、シリカ、ポリケイ酸材料、ホウケイ酸塩、ケイ酸塩もしくはガラス等、ケイ素含有材料である核酸結合固相に結合されること
のうち1種または複数を有する、請求項1〜14のうち一項または複数に記載の方法。 - x)前記試料を破壊するステップと、
a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤ならびに非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒を前記破壊された試料に添加することにより、沈殿混合物を調製するステップであって、プロトン性溶媒が使用される場合、前記プロトン性溶媒が、水混和性アルコールであり、前記沈殿混合物が、
i)300mM〜625mM、350mM〜600mMもしくは400mM〜550mMから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含み、
ii)6.5%〜14.5%、7%〜14%、8%〜13.5%、9%〜13%もしくは9.5%〜12%から選択される濃度で前記有機溶媒を含み、
iii)少なくとも1種の緩衝剤を含み、
iv)3〜5.25、3〜5、3.25〜4.75、3.5〜4.5もしくは3.75〜4.4の範囲である酸性pH値を有し、
タンパク質を沈殿させる、ステップと、
b)前記上清から前記沈殿物を分離するステップであって、前記上清が、200nt未満の長さを有する小RNAおよび少なくとも1000ntの長さを有する大RNAを含む、ステップと、
c)前記上清から少なくとも小および大RNAを単離するステップであって、
aa)少なくとも1種のアルコールを前記上清に添加して、濃度≧40%、≧45%または≧50%で前記アルコールを含む結合混合物を提供することと、
bb)前記結合混合物に含有される全RNAをケイ素含有核酸結合固相に結合させるステップであって、このステップbb)後に、少なくとも大および小RNAが、前記固相に結合される、ことと、
cc)任意選択で、前記結合されたRNAを洗浄することと、
dd)前記固相からRNAを溶出することと
を含む、ステップと
を含む、RNAを単離するための、請求項1〜15のうち一項または複数に記載の方法。 - a)少なくとも1種の金属カチオン沈殿剤と、
b)非プロトン性極性溶媒およびプロトン性溶媒から選択される少なくとも1種の有機溶媒と、
c)少なくとも1種の緩衝剤と
を含む、タンパク質を沈殿させるための沈殿バッファーであって、3〜5.5の範囲であるpH値を有する沈殿バッファー。 - 前記有機溶媒が、水混和性であり、前記沈殿バッファーが、請求項1に記載の方法における沈殿バッファーとしての使用に適している、請求項17に記載の沈殿バッファー。
- 次の特徴:
i)前記金属カチオン沈殿剤が、Zn2+およびAl3+から選択され、好ましくは、Zn2+であること、
ii)前記有機溶媒が、ジメチルスルホキシド(DMSO)、アセトン、アセトニトリル、テトラヒドロフラン(THF)、1,4ジオキサン、1−メチル−2−ピロリドン(NMP)およびジメチル−ホルムアミド(DMF)からなる群から選択される非プロトン性極性溶媒であること、
iii)前記有機溶媒が、アルコール、好ましくは、エタノールまたはイソプロパノール等の水混和性アルコールであるプロトン性溶媒であること、
iv)前記緩衝剤が、カルボン酸またはリン酸塩であるまたはこれに由来すること
のうち1種または複数を有する、請求項17または18に記載の沈殿バッファー。 - 次の特徴:
i)0.75M〜3M、1M〜2.8M、1.25M〜2.7M、1.5M〜2.6Mもしくは1.7M〜2.5Mから選択される濃度で前記金属カチオン沈殿剤を含むこと、
ii)13%〜65%、20%〜63%、25%〜62.5%、30%〜60%、33%〜57.5%、37.5%〜55%もしくは40%〜52.5%から選択される濃度で前記有機溶媒を含むこと、
iii)3〜5、3.25〜4.75もしくは3.4〜4.5から選択される範囲であるpH値を有すること、
iv)300mM〜2M、400mM〜1.75M、450mM〜1.5M、500mM〜1.4M、550mM〜1.3Mおよび600mM〜1.25Mから選択される濃度で前記緩衝剤を含むこと
ならびに/または
v)
aa)1.25M〜2.8M、1.5M〜2.6Mもしくは1.7M〜2.5Mから選択される濃度で、溶解された塩の形態の金属カチオン沈殿剤としてZn2+もしくはAl3+、好ましくはZn2+を含み、
bb)13%〜65%、20%〜63%、25%〜62.5%、30%〜60%、33%〜57.5%、37.5%〜55%もしくは40%〜52.5%から選択される濃度で非プロトン性極性有機溶媒もしくはプロトン性溶媒を含み、
cc)3.25〜4.75もしくは3.4〜4.5の範囲であるpH値を有すること
のうち1種または複数を有する、請求項17〜19のうち一項または複数に記載の沈殿バッファー。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP14177538.7 | 2014-07-17 | ||
EP14177538 | 2014-07-17 | ||
PCT/EP2015/066447 WO2016009059A1 (en) | 2014-07-17 | 2015-07-17 | Method for isolating rna with high yield |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2017520268A true JP2017520268A (ja) | 2017-07-27 |
JP6689251B2 JP6689251B2 (ja) | 2020-04-28 |
Family
ID=51178809
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2017502197A Expired - Fee Related JP6689251B2 (ja) | 2014-07-17 | 2015-07-17 | Rnaを高収率で単離するための方法 |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US10954507B2 (ja) |
EP (1) | EP3169780B1 (ja) |
JP (1) | JP6689251B2 (ja) |
CN (1) | CN106574265B (ja) |
AU (1) | AU2015289027B2 (ja) |
WO (1) | WO2016009059A1 (ja) |
Cited By (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20220036315A (ko) * | 2020-09-15 | 2022-03-22 | 주식회사 제노헬릭스 | Rna 분리용 조성물 |
WO2022209943A1 (ja) * | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 東レ株式会社 | 生体試料中のマイクロrnaの検出方法、中性アミノ酸の塩酸塩の組成物および容器 |
Families Citing this family (36)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US11111543B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US10081839B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US9424392B2 (en) | 2005-11-26 | 2016-08-23 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data from target individuals using genetic data from genetically related individuals |
US10083273B2 (en) | 2005-07-29 | 2018-09-25 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US11111544B2 (en) | 2005-07-29 | 2021-09-07 | Natera, Inc. | System and method for cleaning noisy genetic data and determining chromosome copy number |
US10113196B2 (en) | 2010-05-18 | 2018-10-30 | Natera, Inc. | Prenatal paternity testing using maternal blood, free floating fetal DNA and SNP genotyping |
EP2854056A3 (en) | 2009-09-30 | 2015-06-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive pre-natal ploidy calling |
US11408031B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-08-09 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal paternity testing |
US11322224B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-03 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
EP2572003A4 (en) | 2010-05-18 | 2016-01-13 | Natera Inc | METHOD FOR NONINVASIVE PRANATAL PLOIDIE ASSIGNMENT |
US9677118B2 (en) | 2014-04-21 | 2017-06-13 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11326208B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-10 | Natera, Inc. | Methods for nested PCR amplification of cell-free DNA |
US11339429B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-24 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US11332793B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US11332785B2 (en) | 2010-05-18 | 2022-05-17 | Natera, Inc. | Methods for non-invasive prenatal ploidy calling |
US11939634B2 (en) | 2010-05-18 | 2024-03-26 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US10316362B2 (en) | 2010-05-18 | 2019-06-11 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
US20190010543A1 (en) | 2010-05-18 | 2019-01-10 | Natera, Inc. | Methods for simultaneous amplification of target loci |
CN103608818B (zh) | 2011-02-09 | 2017-12-08 | 纳特拉公司 | 非侵入性产前倍性识别装置 |
US10577655B2 (en) | 2013-09-27 | 2020-03-03 | Natera, Inc. | Cell free DNA diagnostic testing standards |
US10262755B2 (en) | 2014-04-21 | 2019-04-16 | Natera, Inc. | Detecting cancer mutations and aneuploidy in chromosomal segments |
CN106460070B (zh) | 2014-04-21 | 2021-10-08 | 纳特拉公司 | 检测染色体片段中的突变和倍性 |
WO2016183106A1 (en) | 2015-05-11 | 2016-11-17 | Natera, Inc. | Methods and compositions for determining ploidy |
US11485996B2 (en) | 2016-10-04 | 2022-11-01 | Natera, Inc. | Methods for characterizing copy number variation using proximity-litigation sequencing |
US10011870B2 (en) | 2016-12-07 | 2018-07-03 | Natera, Inc. | Compositions and methods for identifying nucleic acid molecules |
US10894976B2 (en) | 2017-02-21 | 2021-01-19 | Natera, Inc. | Compositions, methods, and kits for isolating nucleic acids |
WO2019063071A1 (en) | 2017-09-27 | 2019-04-04 | Qiagen Gmbh | METHOD FOR HIGH-PERFORMANCE RNA ISOLATION |
WO2019161244A1 (en) * | 2018-02-15 | 2019-08-22 | Natera, Inc. | Methods for isolating nucleic acids with size selection |
US11525159B2 (en) | 2018-07-03 | 2022-12-13 | Natera, Inc. | Methods for detection of donor-derived cell-free DNA |
CN109679947A (zh) * | 2019-01-09 | 2019-04-26 | 深圳瑞奥康晨生物科技有限公司 | RNA纯化试剂盒及富集miRNA的方法 |
CN111004798A (zh) * | 2019-12-29 | 2020-04-14 | 觅瑞(杭州)生物科技有限公司 | 一种高效提取MicroRNA的方法 |
CN112176029B (zh) * | 2020-06-12 | 2021-05-14 | 中山大学达安基因股份有限公司 | 一种拭子核酸样本释放剂及其应用 |
US20220162587A1 (en) * | 2020-11-20 | 2022-05-26 | Team Medical Llc | Rna stabilization |
CN112899268B (zh) * | 2021-03-13 | 2022-08-09 | 山东博弘基因科技有限公司 | 一种磁珠法病毒核酸提取试剂盒 |
WO2023159085A1 (en) * | 2022-02-15 | 2023-08-24 | Gate Scientific, Inc. | Sample testing devices and methods |
EP4257685A1 (en) * | 2022-04-07 | 2023-10-11 | Sartorius BIA Separations d.o.o. | Methods for the removal of double- and/or multi-stranded nucleic acid impurities from rna preparations by low ph treatment |
Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002521071A (ja) * | 1998-07-31 | 2002-07-16 | アンバイオン,インコーポレイテッド | 細胞および組織試料中にrnaを保存するための方法および試薬 |
US20100221788A1 (en) * | 2008-09-04 | 2010-09-02 | Edmund Radmacher | Method for recovering short rna, and kit therefor |
Family Cites Families (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
ATE554166T1 (de) | 2003-07-25 | 2012-05-15 | Life Technologies Corp | Verfahren und zusammensetzungen zur herstellung von rna aus einer fixierten probe |
US20050059024A1 (en) | 2003-07-25 | 2005-03-17 | Ambion, Inc. | Methods and compositions for isolating small RNA molecules |
SG11201500655VA (en) * | 2012-09-03 | 2015-05-28 | Qiagen Gmbh | Method for isolating rna including small rna with high yield |
-
2015
- 2015-07-17 WO PCT/EP2015/066447 patent/WO2016009059A1/en active Application Filing
- 2015-07-17 AU AU2015289027A patent/AU2015289027B2/en not_active Ceased
- 2015-07-17 JP JP2017502197A patent/JP6689251B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2015-07-17 US US15/324,993 patent/US10954507B2/en active Active
- 2015-07-17 CN CN201580038931.3A patent/CN106574265B/zh not_active Expired - Fee Related
- 2015-07-17 EP EP15742208.0A patent/EP3169780B1/en active Active
Patent Citations (2)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2002521071A (ja) * | 1998-07-31 | 2002-07-16 | アンバイオン,インコーポレイテッド | 細胞および組織試料中にrnaを保存するための方法および試薬 |
US20100221788A1 (en) * | 2008-09-04 | 2010-09-02 | Edmund Radmacher | Method for recovering short rna, and kit therefor |
Cited By (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
KR20220036315A (ko) * | 2020-09-15 | 2022-03-22 | 주식회사 제노헬릭스 | Rna 분리용 조성물 |
KR102587121B1 (ko) * | 2020-09-15 | 2023-10-11 | 주식회사 제노헬릭스 | Rna 분리용 조성물 |
WO2022209943A1 (ja) * | 2021-03-29 | 2022-10-06 | 東レ株式会社 | 生体試料中のマイクロrnaの検出方法、中性アミノ酸の塩酸塩の組成物および容器 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2016009059A1 (en) | 2016-01-21 |
CN106574265A (zh) | 2017-04-19 |
AU2015289027A1 (en) | 2017-01-12 |
US20170198279A1 (en) | 2017-07-13 |
US10954507B2 (en) | 2021-03-23 |
EP3169780B1 (en) | 2020-02-12 |
AU2015289027B2 (en) | 2021-08-19 |
JP6689251B2 (ja) | 2020-04-28 |
CN106574265B (zh) | 2020-07-28 |
EP3169780A1 (en) | 2017-05-24 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP6689251B2 (ja) | Rnaを高収率で単離するための方法 | |
US11021736B2 (en) | Rapid method for isolating extracellular nucleic acids | |
US20210189377A1 (en) | Method for isolating nucleic acids from a formaldehyde releaser stabilized sample | |
US10329553B2 (en) | Method for isolating RNA including small RNA with high yield | |
US20230357747A1 (en) | Method for isolating rna with high yield | |
US20210380966A1 (en) | Method for isolating poly(a) nucleic acids | |
JP2018518171A (ja) | 核酸の単離のための自動化可能な方法 | |
EP2060629B1 (en) | Method of separating small RNA molecules using kosmotropic salt |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20180420 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20190527 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20190826 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20191015 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20191120 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20200327 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20200407 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 6689251 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |