KR20200041020A

KR20200041020A - 자성비드를 이용한 작은 핵산의 분리 방법 및 이 방법에 사용되는 키트

Info

Publication number: KR20200041020A
Application number: KR1020180120888A
Authority: KR
Inventors: 장욱진; 정연준; 윤관희
Original assignee: (주)진스랩
Priority date: 2018-10-11
Filing date: 2018-10-11
Publication date: 2020-04-21

Abstract

본 발명은 페놀, 클로로포름, PEG(polyethylene glycol), 및 자성비드를 이용한 작은 핵산(small nucleic acid)의 분리 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다. 본 발명의 방법에 의하면, 혈장과 같은 생물학적 시료내에서 작은 크기의 DNA 분자 및 RNA 분자와 같은 핵산을 간단한 방법을 통해 매우 효과적으로 분리할 수 있다.

Description

자성비드를 이용한 작은 핵산의 분리 방법 및 이 방법에 사용되는 키트{Method for Isolating Small Nucleic Acid Using Magnetic Bead and Kit for the Same Method}

본 발명은 자성비드를 이용한 작은 핵산의 분리 방법 및 이 방법에 사용되는 키트에 관한 것이다.

분자 진단의 기술이 발전하며 기존의 유전진단분야에서 다양한 진단기법이 발전하고 따라서 진단의 대상이 되는 다양한 시료들이 분석되고 있다. 특히, 분자진단분야 중 후생학적 진단분야가 급속하게 발전하고 다양한 후생학적 시료들을 분석하는 기법들이 발전되고 있다.

그 중에 혈액 내에 특히 혈장 내에 다양한 ccfDNA(circulating cell-free DNA) 또는 cfDNA(cell-free DNA)나, miRNA 등의 작은 핵산(small nucleic acid)들이 존재하며 임상적으로도 의미가 있음이 계속적으로 밝혀지고 있다. 최근 기존에 검출이 어려웠던 작은 핵산(small nucleic acid)의 추출 기법이 발전함에 따라 전 세계적으로 조기 진단의 중요성이 부각되고 있으며 miRNA나 cfDNA 등의 추출과 증폭을 통해 작은 핵산(small nucleic acid)의 정량적 변이나 정성적 변이를 정확하게 검출하는 것은 조직 샘플의 채취 및 내시경 검사 등의 침습적인 방법을 이용하지 않고 액상 검체를 이용하는 분자진단법을 이용하기 때문에 검사 결과 도출 속도와 다각적인 분석을 수행할 수 있으며 비용 절감의 효과가 있다. 그러나 혈액, 소변 등 액체 시료 내 작은 핵산(small nucleic acid)은 극히 낮은 수준으로 발견되며 기존의 컬럼을 이용하여 ccfDNA나 cfDNA를 분리하는 키트 및 방법 등이 이미 알려져 있다(QIAamp Circulating Nucleic Acid Kit 등). 그러나, 현재까지 알려진 방법에 비하여 개선된 작은 핵산(small nucleic acid)의 추출기법의 개발이 여전히 요구된다. 따라서 적은 시료의 양으로 높은 순도의 작은 핵산(small nucleic acid)를 효율적으로 추출하는 방법을 개발하는 것이 진단분야에서 여전히 중요시되고 있다.

본 명세서에서 언급된 특허문헌 및 참고문헌은 각각의 문헌이 참조에 의해 개별적이고 명확하게 특정된 것과 동일한 정도로 본 명세서에 참조로 삽입된다.

대한민국 공개특허 제10-2015-0107374호

본 발명자들은 생물학적 시료로부터 작은 핵산(small nucleic acid)을 효율적으로 분리하는 방법을 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과, 생물학적 시료에 페놀을 첨가하여 처리한 후 카르복시기를 갖는 자성비드(magnetic bead)를 이용하여 핵산을 추출하면, ccfDNA, cfDNA 및 miRNA와 같은 작은 핵산을 효율적으로 분리할 수 있음을 실험적으로 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 생물학적 시료로부터 작은 핵산(small nucleic acid)을 분리하는 방법을 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적은 생물학적 시료로부터 작은 핵산(small nucleic acid)을 분리하기 위한 용도의 키트를 제공하는 데에 있다.

본 발명의 다른 목적 및 기술적 특징은 이하의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 구체적으로 제시된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 작은 핵산(small nucleic acid)을 분리하는 방법을 제공한다:

(a) 작은 핵산(small nucleic acid)이 포함되어 있는 것으로 추정되는 분리된 생물학적 시료에 페놀(phenol)을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합하는 단계;

(b) 상기 페놀을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합한 시료에 클로로포름을 첨가하여 혼합하는 단계;

(c) 상기 단계 (b)를 수행한 시료에 PEG(polyethylene glycol)를 포함하는 용액과 자성비드를 첨가하여 혼합하는 단계; 및

(d) 상기 자성비드를 회수하여 작은 핵산을 분리하는 단계.

이하에서, 본 발명의 방법을 각 단계에 따라 상세히 설명한다.

단계 (a): 작은 핵산(small nucleic acid)이 포함되어 있는 것으로 추정되는 분리된 생물학적 시료에 페놀을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합하는 단계

본 발명의 방법에서 먼저 작은 핵산 분자가 포함되어 있을 것으로 추정되는 분리된 생물학적 시료에 페놀을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합한다.

본 발명에서 상기 생물학적 시료는 동물 또는 사람으로부터 얻어지는 모든 시료를 의미한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 조직, 세포, 림프액, 골수액, 타액(saliva), 요액(urine), 분변, 안구액, 정액, 뇌 추출물, 척수액, 관절액, 흉선액, 복수, 양막액, 세포 조직액 및 세포 배양액을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 구체적인 구현예에 따르면, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 뇨액rine), 또는 타액(saliva) 이다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 작은 핵산(small nucleic acid)은 크기가 예를 들어 5000bp 이하, 4000bp 이하, 3000bp 이하, 2000bp 이하, 1000bp 이하, 또는 900bp 이하의 핵산을 의미하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 작은 핵산은 DNA 분자 또는 RNA 분자이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 작은 핵산은 예를 들어 ccfDNA(circulating cell-free DNA), cfDNA(cell-free DNA), 또는 miRNA(Micro RNA)이나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 상기 ccfDNA 또는 cfDNA는 세포, 특히 암세포로부터 유리되어 혈액내에서 순환하며 존재하는 작은 크기의 DNA 분자를 의미한다.

본 발명에서 상기 페놀을 포함하는 용액 중에 페놀은 상기 생물학적 시료내의 단백질 및 지질 성분들의 변성을 촉진하여 후속 단계에서 첨가되는 자성입자가 시료내의 단백질 및 지질 성분들과 응집하는 현상을 억제한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 페놀을 포함하는 용액은 구아니디늄 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 및 클로로포름을 더 포함한다.

단계 (b): 상기 페놀을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합한 시료에 클로로포름을 첨가하여 혼합하는 단계

상기 페놀을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합한 시료에 클로로포름을 첨가하여 혼합한다. 상기 클로로포름은 상기 페놀에 의한 시료 중의 단백질 및 지질 성분의 변성을 더욱 촉진한다.

단계 (c): 상기 단계 (b)를 수행한 시료에 PEG(polyethylene glycol)를 포함하는 용액과 자성비드를 첨가하여 혼합하는 단계

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 PEG를 포함하는 용액은 킬레이트제(chelating agent) 및 계면활성제를 더 포함한다.

상기 킬레이트제는 Mg²⁺ 및 Ca²⁺와 같은 2가의 양이온을 격리시키기 위해 사용된다. 상기 킬레이트제는 상기 2가 양이온을 격리시킴으로서, DNA 분해 효소들이 DNA 핵산을 분해하는 것을 억제한다. 상기 킬레이트제의 예로는 DTPA(diethylenetriaminepentaacetic acid), EDTA(ethylenediaminetetraacetic acid), EGTA(ethylene glycol tetraacetic acid), 및 NTA(N,N-bis(carboxymethyl)glycine)으로 이루어진 군으로부터 선택된 것 일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 킬레이트제는 EDTA이다.

본 발명에서 상기 계면활성제는 비이온성 계면활성제(non-ionic surfactant)이다.

본 발명의 일 구현에에 따르면, 상기 비이온성 계면활성제는 Tween20이다.

본 발명의 구체적인 일 구현예에 따르면, 상기 PEG를 포함하는 용액은 PEG, Tris-HCl, EDTA, 및 Tween20를 포함한다.

본 발명에서 사용되는 자성비드는 자기장에 반응하는 입자 또는 비드를 의미한다. 상기 자성비드는 스스로 자기장을 가지지 않으나, 자기장에 노출되면 자기 쌍극자를 형성하는 물질이 포함되어 있다. 상기 자성물질은 상자성(paramagnetic) 물질 또는 초상자성(superparamagnetic) 물질을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 자성비드의 표면은 핵산과 결합할 수 있는 관능기를 가진다. 상기 핵산과 결합할 수 있는 관능기의 예로는 카르복시기(-COOH, carboxyl group)을 들 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

단계 (d): 상기 자성비드를 회수하여 작은 핵산을 분리하는 단계

상기 단계 (c)를 수행한 후 자성비드를 회수하여, 이로부터 작은 핵산을 분리한다. 상기 자성비드의 회수는 자석을 이용하여 행할 수 있다.

상기 단계 (d)는 PEG, 킬레이트제(chelating agent) 및 계면활성제를 포함하는 세정용액으로 자성비드를 세정하는 단계를 포함한다.

상기 킬레이트제 및 계면활성제에 대한 내용은 상기 단계 (c)에서 설명된 내용과 동일하므로, 중복하여 설명하지 않는다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 세정용액은 PEG, Tris-HCl, EDTA, 및 Tween20을 포함한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 (i) 페놀을 포함하는 용액; (ⅱ) 클로로포름; (ⅲ) PEG (polyethylene glycol)를 포함하는 용액; 및 (ⅳ) 자성비드를 포함하는, 생물학적 시료로부터 작은 핵산(small nucleic acid)을 분리하기 위한 용도의 키트를 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따르면, 상기 키트에서 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 요액(urine), 또는 타액(saliva)이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 페놀을 포함하는 용액은 구아니디늄 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 및 클로로포름을 더 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 자성비드는 표면에 카르복시기(carboxyl group)을 갖는 자성비드이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 PEG를 포함하는 용액은 킬레이트제(chelating agent), 및 계면활성제를 더 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 PEG를 포함하는 용액에서 상기 킬레이트제는 EDTA이고 상기 계면활성제는 Tween20이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 PEG, 킬레이트제(chelating agent), 및 계면활성제를 포함하는 세정용액을 더 포함한다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 세정용액의 킬레이트제는 EDTA이고, 상기 계면활성제는 Tween20이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 작은 핵산은 DNA 분자 또는 RNA 분자이다.

본 발명의 다른 구현예에 따르면, 상기 키트에서 상기 작은 핵산은 ccfDNA(circulating cell-free nucleic acid), cfDNA(cell-free DNA), 또는 miRNA(Micro RNA)이다.

도 1a는 자성비드(magnetic bead)와 PEG 용액의 응집현상을 보여주고, 도 1b는 SDS와 PEG 용액과의 응집현상 결과를 보여준다.
도 2a는 클로로포름의 양을 200㎕ 사용하여 분리한 결과를 보여주고, 도 2b는 클로로포름 600㎕을 사용하여 분리한 결과를 보여준다.
도 3a는 Dengue 유전자 DNA를 표준물질로서 각각 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg 씩 주입하여 분리한 후 이를 실시간(real-time) PCR을 수행한 결과를 보여준다. 도 3b는 Dengue 유전자 DNA를 FBS에 주입한 후 이를 본 발명의 방법에 따라 분리하여 실시간(real-time) PCR을 수행한 결과를 보여준다. 도 3c는 FBS를 트리졸(Trizol)로 처리한 후 얻은 상층액에 Dengue 유전자 DNA를 주입한 후 이를 본 발명의 방법에 따라 분리하여 실시간(real-time) PCR을 수행한 결과를 보여준다. 도 3b와 도 3c에서의 Ct값을 비교하면 도 3c의 트리졸(Trizol)로 처리하는 경우가 도 3b의 트리졸(Trizol)로 처리하지 않은 경우에 비해 핵산 분리 효율이 우수하다는 것을 알 수 있다.
도 4는 건조기에서 완전히 건조시킨 자성비드의 모습을 보여주는 사진이다.
도 5a 내지 도 5d는 Dengue 유전자 DNA 주입량 및 자성비드(magnetic bead)의 주입양의 변화에 따른 차이를 보여준다. 도 5a는 Dengue 유전자 DNA를 표준물질로서 각각 1 pg, 100 fg, 10 fg, 1 fg 씩 주입하여 본 발명의 방법에 따라 분리한 후 이를 실시간(real-time) PCR을 수행한 결과를 보여준다. 도 5b 내지 도 5d는 본 발명이 방법에서 자성 비드의 양을 각각 100 ㎕(5pg), 150 ㎕(5pg) 및 150 ㎕(5ng)을 각각 주입하여 핵산을 분리하고 실시간(real-time) PCR을 수행한 결과를 보여준다.

실시예

실험방법

생체 시료를 모사하기 위해 소태아혈청(Fetal bovine serum, 이하 FBS)를 이용하여 인간의 체액(bio-fluid)과 유사한 환경을 조성하고, 이 소태아혈청 용액에 정량된 DNA 분자 또는 RNA 분자를 주입하여 최종 농도를 계산하였으며, 핵산 추출 후 수율을 측정하는 방식으로 실험을 수행하였다. 생물학적 시료에 페놀 화합물을 처리하는 경우의 효과를 알아보기 위해 페놀이 주성분인 트리졸(Trizol^TM)을 처리하여 실험을 진행하였다.

먼저, FBS 시료 2 ml에 1 ml의 트리졸(TRIzol Reagent 제품, Ambion by Life technologies社)을 넣고, 5-10 분간 반응시켰다. 이어서, 클로로포름(chloroform, Merck社) 600 ㎕를 첨가한 후 볼텍스(vortex)를 15 초간 행하여 잘 혼합하였다. 원심분리기를 이용하여 13,500 rpm에서 15 분간 원심분리하여 상층액을 분리하였다. 분리된 상층액을 새 튜브(tube)에 분리하고 정량한 DNA를 주입하였다. 여기에 PEG 용액[22.4mM Tris-HCl(pH 8.0), 2.24mM EDTA (pH 8.0), 0.11％ Tween20, 20％ PEG, 2.23M NaCl] 1 ml과 표면에 카르복시기(-COOH)를 갖는 자성비드(magnetic bead)(AMPure XP Bead, Beckman Coulter社) 를 추가하여 10 분간 반응시켰다. 반응시킨 용액을 자성비드 랙(magnetic bead rack)에 2분간 둔 후, 자석을 이용하여 자성비드를 붙이고, 상층액을 제거한 후, 세정용액(washing solution)[22.4 mM Tris-HCl(pH 8.0), 2.24 mM EDTA (pH 8.0), 0.11％ Tween20, 12.8％ PEG, 2.23 M NaCl] 1 ml을 사용하여 자성비드를 재현탁하였다. 다시 자성비드 랙(magnetic bead rack)에 2 분간 둔 후, 자석을 이용하여 자성비드를 붙이고, 상층액을 제거한 후, 80％ 에탄올(ethanol) 1 ml로 비드를 재현탁하였다. 다시, 자성비드 랙(magnetic bead rack)에 2 분간 두고 자성비드를 자석에 붙인 후, 상기 80％ 에탄올로 세정하는 과정을 반복하였다. 80％ 에탄올에 의한 세정이 끝난 후 상층액을 제거하고 자성비드가 완전히 건조될 때까지 건조 과정을 수행하였다. 비드 건조 후 용출버퍼(elution buffer) 50 ㎕를 사용하여 핵산을 용리하였다.

실험결과

실험에 사용한 DNA는 대장균(E.coli)의 지놈(genome) DNA 분자의 일부 서열을 클로닝하여 앰플리콘(amplicon)으로 사용하였다. 가장 먼저 작은 핵산(small nucleic acid)을 캡처링(capturing)하는 프로토콜에 의하여 실험을 진행하였을 때, FBS와 PEG, 및 자성비드(magnetic bead)가 응집되는 현상이 나타났다. 이러한 현상은 FBS에 있는 지질성분들이 응집 현상에 관여했을 것이라 추정하였고, 자성비드가 용액에 용리되지 않았다. 따라서, 종래에 사용하는 계면활성제인 Tween20 보다 강력한 SDS(sodium dodecyl sulfate)를 농도 별로 사용해서 실험을 행하였다. 그러나, SDS자체가 고농도의 PEG와의 응집현상을 보임과 동시에 용리 과정에서 완전히 제거되지 않아, 분리한 핵산에 대해 실시간(real-time) PCR를 행하였을 때 그 결과를 확인할 수 없었다. 도 1a는 자성비드(magnetic bead)와 PEG 용액의 응집현상을 보여주고, 도 1b는 SDS와 PEG 용액과의 응집현상을 보여준다.

따라서, 작은 크기 핵산의 분리 수율을 증가시키기 위해 전혀 다른 프로토콜을 개발을 시도하였다. 먼저, 페놀 화합물을 포함하는 트리졸(Trizol^TM)을 사용하여 FBS에 있는 단백질 및 지질 성분들을 제거하고, PEG 응집현상을 줄이고자 시도하였다. 실험은 상기 설명된 실험방법에 따라 DNA가 캡처링(capturing) 되는지 확인하였고, 클로로포름( chloroform)의 양을 조절하면서 핵산 분리수율을 측정하여, 약 13％의 분리수율을 얻을 수 있음을 확인하였다. 도 2a는 클로로포름 200㎕ 사용하여 분리한 결과를 보여주고, 도 2b는 클로로포름 600 ㎕을 사용하여 분리한 결과를 보여준다.

이어서, DNA가 아닌 RNA를 주입하여 이의 분리 수율을 확인하였다. 최초 실험은 FBS에 직접 RNA을 주입한 후 이로부터 분리하는 방법과, 트리졸(Trizol^TM)을 처리하여 상층액을 분리한 뒤에 주입하여 이로부터 분리하는 방법의 2가지 경우로 나누어 실험을 수행하였다. 이렇게 실험을 2가지로 나누어 디자인한 이유는 생체내로부터 유래한 시료의 cell-free DNA 또는 RNA는 시료내에서 분해되지 않도록 보호되어 있기 때문에 추출이 가능하지만, FBS에 존재하는 핵산은 핵산 분해 효소의 영향을 받아 주입하는 DNA 또는 RNA가 분해될 가능성이 있어, 이를 고려하여 두 가지 방법으로 나누어 실험을 진행하였다. 실험결과, FBS에 핵산을 직접 주입한 후 이를 분리하는 경우, 분리 수율이 0.1 - 0.45％ 이었고, 트리졸(Trizol^TM)을 처리하고 분리한 상층액에 RNA를 주입한 후 이를 분리하는 경우 수율이 약 1 - 5％ 까지 임을 확인할 수 있었다. 실험에 사용한 RNA는 Dengue 유전자의 일부 서열을 합성하여 RNA로 전사한 후 정량하여 사용하였다. 도 3b와 도 3c에서의 Ct값을 비교하면, 도 3c의 트리졸(Trizol^TM)로 처리하는 경우가 도 3b의 트리졸(Trizol^TM)로 처리하지 않은 경우에 비해 분리 효율이 우수하다는 것을 알 수 있었다.

최종적으로 RNA를 자성비드(magnetic bead)로부터 용리하는 과정에 에탄올 세척 단계에서 에탄올이 잔류하게 되면 실시간(real-time) PCR의 신호를 억제하는 경향을 보인다. 이를 방지하기 위해 자성비드 랙(rack)에 부착한 시료를 건조기에서 완전히 건조시킨 후 용리시켰을 때 좋은 수율값을 기대할 수 있었다(도 4 참조).

또한, 핵산의 수득율을 높이기 위해서 자성비드(magnetic bead)의 양을 증가시키는 실험에서는 150 ㎕(5 ng)까지는 증가하는 경향성을 보였으나, 그 이상에서는 효과가 미미하였다. 또한, 주입하는 RNA의 양을 늘렸을 경우에도 큰 차이는 없었다.(도 5a - 도 5d 참조). 하기 표 1에는 도 5a 내지 도 5d의 결과의 계산과정을 보여준다. 50 ㎕를 넣고 45㎕로 계산한 이유는 자성비드가 건조되면서 수분을 흡수하여 소실된 양을 감안한 것이다.

본 명세서에서 설명된 구체적인 실시예는 본 발명의 바람직한 구현예 또는 예시를 대표하는 의미이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되지는 않는다. 본 발명의 변형과 다른 용도가 본 명세서 특허청구범위에 기재된 발명의 범위로부터 벗어나지 않는다는 것은 당업자에게 명백하다.

Claims

다음의 단계를 포함하는 생물학적 시료로부터 작은 핵산(small nucleic acid)을 분리하는 방법:
(a) 작은 핵산(small nucleic acid)이 포함되어 있는 것으로 추정되는 분리된 생물학적 시료에 페놀(phenol)을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합하는 단계;
(b) 상기 페놀을 포함하는 용액을 첨가하여 혼합한 시료에 클로로포름을 첨가하여 혼합하는 단계;
(c) 상기 단계 (b)를 수행한 시료에 PEG(polyethylene glycol)를 포함하는 용액과 자성비드를 첨가하여 혼합하는 단계; 및
(d) 상기 자성비드를 회수하여 작은 핵산을 분리하는 단계.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (a)의 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 요액(urine), 또는 타액(saliva)인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (b)의 페놀을 포함하는 용액은 구아니디늄 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 및 클로로포름을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 자성비드는 표면에 카르복시기(carboxyl group)을 갖는 자성비드임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (c)의 PEG를 포함하는 용액은 킬레이트제(chelating agent) 및 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA이고, 상기 계면활성제는 Tween20임을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 단계 (d)는 PEG, 킬레이트제(chelating agent), 및 계면활성제를 포함하는 세정용액으로 자성 비드를 세정하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
제 7 항에 있어서, 상기 세정용액의 킬레이트제는 EDTA이고, 상기 계면활성제는 Tween20인 것을 특징으로 하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 작은 핵산(small nucleic acid)은 DNA 분자 또는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 작은 핵산은 ccfDNA(circulating cell-free DNA), cfDNA(cell-free DNA), 또는 miRNA(Micro RNA)인 것을 특징으로 하는 방법.
(i) 페놀을 포함하는 용액; (ⅱ) 클로로포름; (ⅲ) PEG (polyethylene glycol)를 포함하는 용액; 및 (ⅳ) 자성비드를 포함하는, 생물학적 시료로부터 작은 핵산(small nucleic acid)을 분리하기 위한 용도의 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 생물학적 시료는 혈액, 혈장, 혈청, 요액(urine), 또는 타액(saliva)인 것을 특징으로 하는 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 페놀을 포함하는 용액은 구아니디늄 티오시아네이트(guanidinium thiocyanate) 및 클로로포름을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 자성비드는 표면에 카르복시기(carboxyl group)을 갖는 자성비드임을 특징으로 하는 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 PEG를 포함하는 용액은 킬레이트제(chelating agent), 및 계면활성제를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 15 항에 있어서, 상기 킬레이트제는 EDTA이고, 상기 계면활성제는 Tween20인 것을 특징으로 하는 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 키트는 PEG, 킬레이트제(chelating agent), 및 계면활성제를 포함하는 세정용액을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 키트.
제 17 항에 있어서, 상기 세정용액의 킬레이트제는 EDTA이고, 상기 계면활성제는 Tween20인 것을 특징으로 하는 키트.
제 11 항에 있어서, 상기 작은 핵산은 DNA 분자 또는 RNA 분자인 것을 특징으로 하는 키트.
제 19 항에 있어서, 상기 작은 핵산은 ccfDNA(circulating cell-free nucleic acid), cfDNA(cell-free DNA), 또는 miRNA(Micro RNA)인 것을 특징으로 하는 키트.