WO2010004785A1 - 全血試料の前処理方法及び核酸増幅方法 - Google Patents

全血試料の前処理方法及び核酸増幅方法 Download PDF

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WO2010004785A1
WO2010004785A1 PCT/JP2009/055037 JP2009055037W WO2010004785A1 WO 2010004785 A1 WO2010004785 A1 WO 2010004785A1 JP 2009055037 W JP2009055037 W JP 2009055037W WO 2010004785 A1 WO2010004785 A1 WO 2010004785A1
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WO
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nucleic acid
whole blood
blood sample
treatment
acid amplification
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PCT/JP2009/055037
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健 田窪
Original Assignee
ベックマン・コールター社
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • the present invention provides a method for simply performing a pretreatment for amplifying a nucleic acid of a whole blood sample without performing a centrifugation treatment, and a nucleic acid amplification using a whole blood sample pretreated by the method. On how to do.
  • This application claims priority based on Japanese Patent Application No. 2008-179087 filed in Japan on July 9, 2008 and Japanese Patent Application No. 2008-333576 filed in Japan on December 26, 2008. The contents are incorporated herein.
  • nucleic acids contained in samples have been widely performed not only in the field of academic research but also in the medical field.
  • nucleic acids such as genomic DNA and mRNA in biological samples are analyzed.
  • analysis is often performed by amplifying a target nucleic acid to be analyzed.
  • the biological sample contains various substances including proteins, but these substances can be an inhibitory factor for nucleic acid amplification reaction.
  • proteins have nucleolytic activity and inhibitory activity such as enzymes used for nucleic acid amplification.
  • nucleic acid amplification is usually performed using a biological sample that has been subjected to pretreatment such as nucleic acid extraction.
  • the extraction method using a silica gel particle column refers to (a) adding a surfactant to a biological sample to lyse cells and digesting protein with proteinase K. (b) biological sample after the digestion treatment Is passed through a silica gel particle column to adsorb the nucleic acid to the silica gel particle, and (c) the nucleic acid is then extracted by eluting the nucleic acid from the column using an eluent.
  • This method using a silica gel particle column is widely used by commercially available kits and the like, and a fully automatic machine for nucleic acid extraction using silica gel particles as magnetic particles is also commercially available.
  • a commercially available kit for purification using this silica gel particle column is simple and can obtain a nucleic acid having a very high purity, and is therefore widely used in genetic testing using blood.
  • the silica gel particle column is expensive and very expensive.
  • a method for removing comprising: (a) contacting the nucleic acid-containing sample with at least one flocculant to form a flocculant precipitate; and (b) separating the nucleic acid from the flocculant precipitate.
  • the method including the process of performing is disclosed (for example, refer patent document 1).
  • the method may include purifying or isolating the nucleic acid after step (b) and including degrading, denaturing or destroying the nucleic acid-containing sample prior to contact with the aggregating agent. May be.
  • the flocculant include a cationic chemical substance, an anionic chemical substance, an amphoteric chemical substance, an uncharged chemical substance, or a combination thereof.
  • Non-Patent Document 2 there is a boiling method in which a biological sample is simply boiled, and contaminants such as proteins in the biological sample are coagulated and separated from nucleic acids.
  • a pretreatment method for amplifying a nucleic acid in a whole blood sample (i) a step of diluting the whole blood sample, and (ii) diluted
  • a pretreatment method including a step of heat treating a whole blood sample and (iii) a step of centrifuging the sample after the heat treatment see, for example, Patent Document 2.
  • the number of examination steps is small and no special equipment is required. Moreover, if the operation of each process is simple, it is easier to automate the inspection, which is more preferable.
  • the methods (1) and (2) have a problem that the number of steps is large, the work is complicated, and the work efficiency is not sufficient.
  • the method (3) has a smaller number of steps than the methods (1) and (2), there is a problem that the operation is complicated because the method includes a centrifugal separation process. Further, when the process including the centrifugation operation is automated, there is a problem that the configuration of the apparatus becomes complicated and the apparatus cost increases.
  • the present invention is a pretreatment method for amplifying nucleic acid of a whole blood sample, a method capable of easily coagulating contaminants without performing a centrifugation treatment, and a nucleic acid in a whole blood sample simply It is an object of the present invention to provide a nucleic acid amplification method that can be efficiently amplified.
  • the present inventor easily simplifies contaminants such as proteins by diluting a whole blood sample with a diluting solvent containing polyvalent cations such as magnesium ions.
  • the present invention was completed by finding that it can be inactivated and that the obtained treatment solution can be subjected to a nucleic acid amplification reaction without being subjected to a centrifugal separation treatment.
  • the present invention (1) A pretreatment method for amplifying a nucleic acid in a whole blood sample, comprising: (a) diluting the whole blood sample with a diluting solvent containing a polyvalent cation; and (b) step ( a step of heat-treating the whole blood sample diluted in a), and a pretreatment method of the whole blood sample, (2) The pretreatment method of a whole blood sample according to (1), wherein the polyvalent cation is an alkaline earth metal ion or an aluminum ion, (3) The pretreatment method of a whole blood sample according to (1), wherein the polyvalent cation is an aluminum ion or an iron ion, (4) The whole blood sample pretreatment method according to any one of (1) to (3) above, wherein the temperature of the heat treatment in the step (b) is 50 to 100 ° C., (5) The whole blood sample pretreatment method according to (1) or (2), wherein the temperature of the heat treatment in the step (b) is 50 to 90 ° C., (6) A nucle
  • the pretreatment method of a whole blood sample of the present invention can inactivate contaminants in the whole blood sample easily without performing a centrifugation treatment. For this reason, nucleic acid amplification can be performed with high accuracy and efficiency by using the treatment liquid obtained by the whole blood sample pretreatment method of the present invention.
  • Example 1 it is the dyeing
  • Example 1 it is the figure which showed the result of having measured the density of each band obtained by SYBR Green1 dyeing
  • Example 2 it is the dyeing
  • Example 2 it is the figure which showed the result of having measured the density of each band obtained by SYBR Green1 dyeing
  • Example 3 it is the dyeing
  • Example 3 it is the figure which showed the result of having measured the density of each band obtained by SYBR Green1 dyeing
  • Example 4 it is the dyeing
  • Example 4 it is the figure which showed the result of having measured the density of each band obtained by SYBR Green1 dyeing
  • Example 4 it is the figure which observed the state of the process liquid obtained after the pre-processing.
  • Example 5 it is the dyeing
  • Example 6 it is the dyeing
  • Example 7 it is the dyeing
  • the whole blood sample used for the whole blood sample pretreatment method of the present invention may be whole blood collected from an animal.
  • it may be a whole blood sample derived from a human, a whole blood sample derived from a laboratory animal such as a mouse, rabbit or guinea pig, or a whole blood sample derived from a livestock such as a cow, horse, pig or bird.
  • a whole blood sample immediately after blood collection or a whole blood sample after storage may be used.
  • the storage conditions are not particularly limited, and it may be stored at room temperature, or may be stored refrigerated or frozen.
  • the whole blood sample pretreatment method of the present invention comprises (a) a step of diluting a whole blood sample with a diluent solvent containing a polyvalent cation, and (b) a step of heat-treating the diluted whole blood sample. It is characterized by having.
  • a polyvalent cation to a whole blood sample and heat-treating it, nucleic acids contained in leukocytes are extracted into the solution due to rupture of leukocytes, etc., and impurities such as proteins are removed. It can be inactivated efficiently. This is presumably because the protein denatured by the heat treatment and the polyvalent cation cause a chelate reaction, causing aggregation.
  • step (a) a whole blood sample is diluted with a diluting solvent containing a polyvalent cation.
  • the dilution rate is too small, the finally obtained treatment solution is almost completely filled with the formed aggregate, and it becomes difficult to collect a sufficient amount of treatment solution for use in the nucleic acid amplification reaction. There is a fear.
  • the dilution rate is too high, the nucleic acid concentration in the obtained treatment solution may be too low. If the nucleic acid concentration is too low, the amount of the treatment solution supplied to the reaction solution for the nucleic acid amplification reaction increases, and as a result, the reaction scale of the nucleic acid amplification reaction increases and the cost may increase.
  • the dilution factor is 2 to 100 times, preferably 4 to 64 times, a treatment solution preferable for nucleic acid amplification reaction can be recovered from both the amount and the nucleic acid concentration.
  • the dilution factor is 16 to 32 times, the amount of precipitation due to inactivated contaminants can be sufficiently reduced, and when the resulting treatment solution is subjected to a nucleic acid amplification reaction, Bringing in insoluble materials can be suppressed.
  • the dilution factor is 2 to 64 times, preferably 4 to 32 times.
  • the dilution factor can be lowered.
  • the polyvalent cation contained in the dilution solvent used in the step (a) is not particularly limited as long as it does not cause precipitation or the like when brought into the reaction solution of the nucleic acid amplification reaction provided with the treatment solution. Although not intended, it is preferably a divalent or trivalent cation. Moreover, a metal ion may be sufficient and nonmetallic ions, such as barium ion, may be sufficient. From the viewpoint of drainage treatment, polyvalent cations other than heavy metal ions are preferable.
  • the polyvalent cation is preferably an alkaline earth metal ion, an aluminum ion, or an iron ion, and more preferably a magnesium ion, an aluminum ion, or a trivalent iron ion. This is because contaminants in the whole blood sample can be inactivated more effectively.
  • the concentration of the polyvalent cation contained in the dilution solvent is sufficient to inactivate contaminants contained in the whole blood sample, and does not inhibit the nucleic acid amplification reaction to which the treatment solution is provided.
  • the concentration is not particularly limited, considering the type of polyvalent cation, the type of dilution solvent, the dilution factor of the whole blood sample, the amount brought into the nucleic acid amplification reaction, the type of nucleic acid amplification reaction, etc. Can be determined as appropriate.
  • the higher the concentration of the polyvalent cation contained in the dilution solvent the better the efficiency of the chelation reaction. For this reason, for example, when the dilution ratio is 10 times or more, if the polyvalent cation concentration of the dilution solvent is 1 ⁇ M or more, contaminants in the whole blood sample can be sufficiently inactivated.
  • the upper limit of the polyvalent cation concentration of the diluent solvent is not particularly limited when the polyvalent cation used is a kind of ion that does not particularly affect the nucleic acid amplification reaction such as aluminum ion.
  • the concentration of aluminum ions in the diluent solvent is preferably 1 ⁇ M or more, more preferably 1 ⁇ M to 50 mM, and even more preferably 25 ⁇ M to 20 mM. .
  • a divalent metal ion such as a divalent iron ion
  • it is preferably 1 ⁇ M to 2.5 mM, and more preferably 1 ⁇ M to 0.5 mM.
  • the concentration is preferably 1 ⁇ M to 5 mM, more preferably 1 ⁇ M to 2.5 mM, and more preferably 0.5 to 2.5 mM. Further preferred.
  • the influence on the nucleic acid amplification reaction is considered in consideration of the amount brought into the nucleic acid amplification reaction.
  • the concentration range in which a chelate reaction can be efficiently generated can be appropriately determined while suppressing the above. If the polyvalent cation concentration in the diluent solvent is too high, the nucleic acid amplification reaction may be inhibited. Conversely, if it is too low, the chelation reaction efficiency is low, the inactivation efficiency of contaminants is reduced, and the nucleic acid amplification reaction is not performed. It is because it is inhibited.
  • the polyvalent cation of the diluting solvent is magnesium ion
  • the dilution rate is 10 times or more
  • the amount of treatment solution brought into the nucleic acid amplification reaction is 1/10 or less of the final volume of the reaction solution of the nucleic acid amplification reaction If the concentration is approximately 1, the concentration of polyvalent cation is 1 ⁇ M to 0.5 mM, preferably 25 ⁇ M to 125 ⁇ M, it is possible to efficiently inactivate contaminants while suppressing the influence on the nucleic acid amplification reaction.
  • the type of the dilution solvent used in the step (a) is not particularly limited as long as it does not inhibit the nucleic acid amplification reaction to which the treatment solution is provided. Preparation of water or a biological sample or nucleic acid analysis is generally possible.
  • a buffer to which a polyvalent cation is added can be used.
  • the buffer include Tris buffer, phosphate buffer, and citrate buffer.
  • a surfactant, an organic solvent, or the like may be added to the dilution solvent as long as the nucleic acid amplification reaction to which the treatment solution is provided is not inhibited.
  • the whole blood sample diluted in step (a) (diluted whole blood sample) is heat-treated.
  • the temperature of the heat treatment is not particularly limited as long as it is a temperature that can inactivate impurities in the whole blood sample, but it is preferably not more than boiling treatment (100 ° C.).
  • the heat treatment is performed at a relatively lower temperature than the boiling treatment (100 ° C.).
  • the heat treatment temperature is preferably 50 to 100 ° C., more preferably 50 to 90 ° C., and further preferably 65 to 90 ° C. 80 to 90 ° C. is particularly preferable.
  • the time of the heat treatment can be appropriately determined in consideration of the temperature of the heat treatment, the amount of diluted whole blood sample, and the like.
  • the heat treatment temperature is relatively high such as 80 to 90 ° C.
  • a shorter treatment time may be required than when the heat treatment temperature is relatively low such as 50 to 70 ° C.
  • the heat treatment time is preferably within 10 minutes, more preferably within 2.5 minutes, and even more preferably within 1 minute.
  • the time for the heat treatment includes not only the time for holding the diluted whole blood sample at the predetermined heat treatment temperature but also the time for the heating step. This is because the inactivation of impurities proceeds even in this heating step.
  • step (b) when the heat treatment in step (b) is performed at 80 ° C. or higher after step (a) is performed at room temperature, the step of heating to 80 ° C. generally requires several seconds to several tens of seconds. For this reason, the heat treatment may be terminated when the temperature of the diluted whole blood sample reaches 80 ° C.
  • the contaminants in the whole blood sample are inactivated and aggregated by the heat treatment. Aggregates obtained by this aggregation are much stronger than aggregates due to proteins denatured by boiling, so that, for example, when centrifuged, the volume of the precipitate is reduced and more You can get Qing.
  • the whole blood sample pretreatment method of the present invention is It is suitable as a pretreatment for nucleic acid analysis using a whole blood sample.
  • the pretreatment method of the whole blood sample of the present invention Is particularly suitable as a pretreatment method for nucleic acid analysis using a nucleic acid amplification reaction.
  • the treatment liquid obtained by the whole blood sample pretreatment method of the present invention can be used for nucleic acid analysis such as nucleic acid amplification reaction, as with other nucleic acid samples.
  • the nucleic acid amplification reaction to which the treatment solution is provided include a PCR (polymerase chain reaction) method, an LCR (ligase chain reaction) method, an SDA (strand displacement amplification) method, a LAMP (Loop-Mediated Amplification IC) method. (Isothermal and Chimeric primer-initiated Amplification of Nucleic acids) method.
  • the PCR method is preferred in the present invention.
  • the treatment solution can be added to the reaction solution of these nucleic acid amplification reactions without worrying about bringing in aggregates due to contaminants.
  • the aggregate obtained by the chelate reaction has a small volume due to its strong cohesive force and is likely to precipitate. For this reason, for example, from the viewpoint of analysis operation after the nucleic acid amplification reaction, etc., when it is desired to suppress the introduction of aggregates, after the heat treatment in the step (b), by lowering the liquid temperature to about room temperature, By adding the treatment liquid collected from the upper layer portion of this treatment liquid to the reaction solution by precipitating the aggregates, the amount of aggregate brought in can be easily reduced.
  • an aggregate obtained when using a trivalent cation such as aluminum ion or trivalent iron ion is an aggregate obtained when using a divalent cation such as magnesium ion or divalent iron ion.
  • the inhibitory effect on the nucleic acid amplification reaction is smaller.
  • the treatment solution after the heat treatment can be obtained without considering the amount of impurities brought into the reaction solution of the nucleic acid amplification reaction than in the case of using a divalent cation. It can be conveniently used for nucleic acid amplification reaction in a suspension state.
  • the treatment liquid obtained using the trivalent cation tends to have a higher reaction efficiency when subjected to the nucleic acid amplification reaction than the treatment liquid obtained using the divalent cation. . This is presumably because the higher the valence of the polyvalent cations, the higher the flocculation ability and the ability to inactivate impurities efficiently.
  • the treatment solution after the heat treatment used for the nucleic acid amplification reaction is the one after the aggregate is precipitated by standing or the like.
  • a suspension containing aggregates is preferable to the liquid. This is because bringing the suspension containing aggregates into the reaction solution of the nucleic acid amplification reaction has better reproducibility of results and higher reaction efficiency.
  • the nucleic acids in the solution are also aggregated together. As a result, the aggregates contain nucleic acids. It is presumed that it is more suitable for nucleic acid amplification reaction than the supernatant from which the product is removed.
  • the suspension containing impurities separated from the central portion of the solution is subjected to a nucleic acid amplification reaction. Can be used.
  • the pretreatment method of the whole blood sample of the present invention is different from the conventional pretreatment method, even when the step of removing aggregates from the obtained treatment liquid by centrifugation is omitted, A treatment solution suitable for nucleic acid analysis can be obtained. Therefore, the whole blood sample pretreatment method of the present invention can easily automate the whole process using an apparatus including a solution addition unit and a temperature control unit without providing a complicated centrifugation processing unit. is there. In addition, a series of steps from the pretreatment step to the nucleic acid amplification reaction are fully automated by a simple configuration device equipped with a solution dispensing device in a nucleic acid amplification reaction device equipped with a temperature control unit such as a commercially available PCR device. It is also easy.
  • Example 1 Using magnesium ions with different concentrations as the polyvalent cation, whole blood collected from humans by the pretreatment method for whole blood samples of the present invention is pretreated, PCR is performed, and an amplification product of the gene to be analyzed is obtained. Obtained.
  • the subunit 1 (VKORC1) gene of human vitamin K epoxide reductase complex (VKORC) and the human liver cytochrome P450 (cytochrome P450: CYP) 2C9 gene were used as the genes to be analyzed.
  • the final concentration is 1 ⁇ PCR Buffer (manufactured by Toyobo Co., Ltd.), 0.2 mM dNTP, 1 mM magnesium sulfate, 0.3 ⁇ M each primer, and 0.9 ⁇ L KODplus. (Toyobo Co., Ltd.) was added to each, and pure water was added to prepare a total amount of 36 ⁇ L of a reaction solution.
  • PCR reaction was performed under the reaction conditions consisting of Whether the target CYP2C9 amplification product (82 bp) and VKORC1 amplification product (144 bp) are amplified by electrophoresis of the reaction solution after the PCR reaction using 8% polyacrylamide gel and then staining with SYBR Green1 It was confirmed.
  • FIG. 1 is a staining diagram showing a band pattern obtained by SYBR Green 1 staining.
  • Lane M is a molecular weight marker 20 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.).
  • positive controls using human genome as a template
  • the density of each band was measured with a densitograph, and the results of measuring the amount of each amplification product are shown in FIG.
  • both CYP2C9 amplification product and VKORC1 amplification product were detected in lanes 3 to 9 where the concentration of magnesium ions in the bittern solution used for pretreatment was 7.3 ⁇ M to 0.469 mM, as in lane 10.
  • both amplification products could be obtained in a balanced manner.
  • only the CYP2C9 amplification product was detected in lane 1, and only the VKORC1 amplification product was detected in lane 2.
  • the treatment liquid treated by the whole blood sample pretreatment method of the present invention can be subjected to a nucleic acid amplification reaction without performing a centrifugation treatment.
  • a liquid containing magnesium ions is not used for pretreatment for a nucleic acid amplification reaction using a polymerase such as PCR. This is because it is well known that the magnesium ion concentration in the polymerase reaction has an optimum value, and it is necessary to avoid bringing in magnesium from the specimen. Nevertheless, in the present invention, even when the magnesium ion-containing liquid was used, the pretreatment could be performed satisfactorily.
  • Example 2 The effect of heat treatment temperature in pretreatment was investigated. Specifically, the whole blood sample was pretreated in the same manner as in Example 1 except that the magnesium sulfate concentration of the bittern liquid used for the pretreatment was 0.117 mM and the temperature of the heat treatment was 50 ° C. to 90 ° C. Then, PCR reaction was performed using the pretreatment solution as a template, and the obtained amplification product was detected by SYBR Green 1 staining after electrophoresis.
  • FIG. 3 is a staining diagram showing a band pattern obtained by SYBR Green1 staining.
  • Lane M is a molecular weight marker 20 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.), lanes 1 to 5 are reaction solutions using a pretreated solution at the heat treatment temperature shown in Table 3 as a template, and lane 6 is a positive control. (Using human genome as a template). Furthermore, the density of each band was measured with a densitograph, and the results of measuring the amount of each amplification product are shown in FIG.
  • both the CYP2C9 amplification product and the VKORC1 amplification product were detected with sufficient intensity, and multiplex amplification was achieved in both cases.
  • the heat treatment temperature in the pretreatment was 80 ° C. to 90 ° C., nonspecific amplification could be reduced. Since the signal intensity was high and non-specific amplification was small, the heat treatment temperature was most suitable at 80 ° C. in this example.
  • Example 3 The effect of heat treatment time on pretreatment was investigated. Specifically, except that the magnesium sulfate concentration of the bittern liquid used in the pretreatment is 0.117 mM, the temperature of the heat treatment is 80 ° C., and the heat holding time after reaching 80 ° C. is 0 to 10 minutes.
  • a whole blood sample was pretreated, a PCR reaction was performed using the pretreated solution as a template, and the obtained amplification product was subjected to electrophoresis and then detected by SYBR Green1 staining.
  • FIG. 5 is a staining diagram showing a band pattern obtained by SYBR Green1 staining.
  • Lane M is a molecular weight marker 20 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.), lanes 1 to 5 are reaction solutions using a pre-treated treatment solution with heating and holding times shown in Table 4 as templates, and lane 6 is positive. Each control (using human genome as a template) was run. Furthermore, the density of each band was measured with a densitograph, and the results of measuring the amount of each amplification product are shown in Table 4 and FIG.
  • both the CYP2C9 amplification product and the VKORC1 amplification product were detected with sufficient intensity, and multiplex amplification was achieved in both cases.
  • the heating and holding time in the pretreatment was 0 minutes (when heated to 80 ° C. and immediately brought to 25 ° C.), the largest amount of amplified product was obtained.
  • Example 4 The influence of the dilution rate of whole blood in the pretreatment was examined.
  • the magnesium sulfate concentration of the bittern solution used for the pretreatment is 0.117 mM
  • the dilution rate for 5 ⁇ L of whole blood is 4 to 64 times
  • the temperature of the heat treatment is 80 ° C.
  • the heat retention after reaching 80 ° C. Except for setting the time to 0 minutes, the whole blood sample was pretreated in the same manner as in Example 1, a PCR reaction was performed using the pretreated solution as a template, the obtained amplification product was electrophoresed, and then stained with SYBR Green1. Detected by.
  • FIG. 7 is a staining diagram showing a band pattern obtained by SYBR Green1 staining.
  • Lane M is a molecular weight marker 20 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.), lanes 1 to 5 are reaction solutions prepared by using a pretreated solution at a dilution rate shown in Table 5, and lane 6 is a positive control. (Using human genome as a template). Furthermore, the density of each band was measured with a densitograph, and the results of measuring the amount of each amplification product are shown in FIG.
  • FIG. 9 is a diagram observing the state of the treatment liquid obtained after the pretreatment.
  • the dilution ratio was 4 times or 8 times, a large amount of precipitate (blood denatured product) was generated in the treatment liquid obtained after the pretreatment. Therefore, when applied to an automated apparatus, it is preferable to carry out at a dilution rate of 16 to 32 times with a small amount of precipitation and a sufficient amount of amplification product.
  • Example 5 Using aluminum ions as polyvalent cations, 10 samples of whole blood collected from a human by the whole blood sample pretreatment method of the present invention are pretreated, PCR is performed, and an amplification product of the gene to be analyzed is obtained. It was.
  • the analysis target genes were the VKORC1 gene and the CYP2C9 gene, as in Example 1.
  • 6.25 ⁇ L of each whole blood was diluted with 43.75 ⁇ L of an aqueous aluminum sulfate solution (aluminum sulfate, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and mixed.
  • the aluminum sulfate concentration in these dilutions was 10 mM.
  • FIG. 10 is a staining diagram showing a band pattern obtained by SYBR Green1 staining.
  • Lane M is a molecular weight marker 20 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.)
  • lanes 1 to 10 are reaction solutions using a treatment solution obtained from 10 samples of whole blood
  • lane 11 is a positive control (human genome).
  • a negative control with pure water added
  • Example 6 Using divalent iron ions and trivalent iron ions as the polyvalent cations, the influence of the valence of the polyvalent cations was observed. Specifically, 6.25 ⁇ L of whole blood was mixed with 43.75 ⁇ L of ferrous chloride aqueous solution (FeCl 2 , manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) or ferric chloride aqueous solution (FeCl 3 , Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) having different concentrations. The product was diluted with 43.75 ⁇ L and mixed. The concentration of ferrous chloride or ferric chloride in these dilutions was 0.5-50 mM. These diluted solutions were subjected to a heat treatment at 80 ° C.
  • ferrous chloride aqueous solution FeCl 2 , manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.
  • FeCl 3 ferric chloride aqueous solution
  • FIG. 11 is a staining diagram showing a band pattern obtained by SYBR Green1 staining.
  • Lane M is a molecular weight marker 20 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.), and lanes 1 to 6 are pretreated with a ferrous chloride aqueous solution having a ferrous chloride (FeCl 2 ) concentration shown in Table 6.
  • reaction solutions using the solution as a template are shown in lanes 9 to 14 as reaction solutions using the treatment solution pretreated with the ferric chloride aqueous solution having the ferric chloride (FeCl 3 ) concentration shown in Table 7 as a template.
  • Lanes 7 and 15 were run with a positive control (using human genome as a template), and lanes 8 and 16 were fed with a negative control (with pure water added), respectively.
  • both genes could be detected by multiplex PCR both when using divalent iron ions (FeCl 2 ) and when using trivalent iron ions (FeCl 3 ).
  • a tendency was observed that the amount of amplified product was larger when trivalent iron ions were used than when divalent iron ions were used.
  • PCR amplification is very good when the trivalent iron ion concentration in the diluted solution is 2.5 to 0.5 mM, particularly 2.5 mM. I understood.
  • Example 7 When a treatment solution obtained using a trivalent cation as a polyvalent cation is used for a nucleic acid amplification reaction, when a suspension containing an aggregate is used and when a supernatant not containing an aggregate is used And the nucleic acid amplification efficiency were compared.
  • the supernatant after centrifugation was used as the supernatant in order to clarify the influence of the presence or absence of the aggregate.
  • 10 samples of whole blood were prepared, and 6.25 ⁇ L of each whole blood was diluted with 43.75 ⁇ L of an aluminum sulfate aqueous solution (aluminum sulfate, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) and mixed.
  • the aluminum sulfate concentration in these dilutions was 10 mM.
  • These diluted solutions were subjected to a heat treatment at 80 ° C. for 5 minutes by a thermal cycler and then set to 25 ° C. to obtain a treated solution. From the resulting treatment solution, 2 ⁇ L of the supernatant was collected by the method (a) below, and 2 ⁇ L of the suspension was collected by the method (b) below, and used as a PCR template.
  • Each treatment solution was centrifuged at 10,000 rpm for 5 seconds (Chibitan II, manufactured by Nihon Millipore), and then 2 ⁇ L of the supernatant was collected from the meniscus.
  • FIG. 12 is a staining diagram showing a band pattern obtained by SYBR Green1 staining.
  • Lane M is a molecular weight marker 20 bp ladder (manufactured by Takara Bio Inc.)
  • lanes 1 to 10 are a reaction solution using 2 ⁇ L of supernatant as a template
  • lanes 11 to 20 are a suspension 2 ⁇ L as a template. Each reaction solution was allowed to flow.
  • nucleic acid samples suitable for nucleic acid analysis particularly nucleic acid amplification reaction, without performing centrifugation treatment. It can be used in fields such as clinical tests where genetic analysis is performed.

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Abstract

本発明により、全血試料の核酸を増幅するための前処理であって、遠心分離処理を行うことなく、夾雑物を簡単に凝固させ得る方法、及び、全血試料中の核酸を簡便に効率良く増幅させることができる核酸増幅方法が提供される。本発明の核酸増幅方法は、 (ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、 (ｂ)工程（ａ）において希釈された全血試料を熱処理する工程と、を有する前処理方法を有し、前記記載の全血試料の前処理方法を用いて前処理された処理液を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする。

Description

全血試料の前処理方法及び核酸増幅方法
　本発明は、遠心分離処理を行うことなく、簡便に、全血試料の核酸を増幅するための前処理を行うための方法、及び該方法により前処理された全血試料を用いて核酸増幅を行う方法に関する。
　本願は、２００８年７月９日に日本に出願された特願２００８－１７９０８７号、及び２００８年１２月２６日に日本に出願された特願２００８－３３３５７６号に基づき優先権を主張し、その内容をここに援用する。
　近年の遺伝子工学技術や分子生物学の進歩に伴い、試料中に含まれる核酸の解析は、学術研究の分野のみならず、医療分野においても広く行われるようになってきている。例えば、遺伝病、癌、感染症、生活習慣病等の診断のために、生体試料中のゲノムＤＮＡやｍＲＮＡ等の核酸の解析が行われている。通常は、生体試料中に含まれる核酸は微量であるため、解析対象となる標的核酸を増幅することにより解析が行われることが多い。
　生体試料中には、タンパク質をはじめとする様々な物質が含まれているが、これらの物質は、核酸増幅反応の阻害要因となり得る。特にタンパク質には、核酸分解活性や、核酸増幅に用いられる酵素等の阻害活性を有するものが多く、高精度かつ高感度に標的核酸を増幅するためには、生体試料中のタンパク質の失活や除去を行うことが好ましい。このため、通常、核酸抽出等の前処理がなされた生体試料を用いて核酸増幅は行われる。
　このような前処理方法については、種々の方法が開示されている。例えば、シリカゲル粒子カラムを用いた抽出法等がある。ここで、シリカゲル粒子カラムを用いた抽出法とは、（ａ）生体試料に界面活性剤を添加して細胞を溶解し、プロテイナーゼＫでタンパク質を消化する、（ｂ）該消化処理後の生体試料をシリカゲル粒子カラムに通すことにより、核酸をシリカゲル粒子に吸着させる、（ｃ）その後、溶出液を用いてカラムから核酸を溶出することにより、核酸を抽出する、という方法である。このシリカゲル粒子カラムを用いた方法は、市販のキット等により広く用いられており、シリカゲル粒子を磁性粒子とした核酸抽出用全自動機も市販されている。このシリカゲル粒子カラムを用いて精製する市販のキットは、簡便であり、かつ非常に純度の高い核酸を得ることができるため、血液を使った遺伝子検査等において広く使用されている。しかしながら、シリカゲル粒子カラムは高価であり、非常にコストがかかるという問題がある。
　また、核酸を含有する生体試料から、核酸以外の夾雑物、特に、核酸増幅反応等の酵素反応を阻害する物質を除去する方法として、例えば、（１）核酸含有サンプルから少なくとも一つの夾雑物を除去するための方法であって、（ａ）前記核酸含有サンプルを少なくとも一つの凝集剤と接触させて凝集剤沈殿物を形成する工程；および、（ｂ）前記凝集剤沈殿物から前記核酸を分離する工程、を含む方法が開示されている（例えば、特許文献１参照。）。当該方法では、工程（ｂ）の後に前記核酸を精製または単離することを含んでいてもよく、核酸含有サンプルを、前記凝集剤と接触される前に分解、変性または破壊する工程を含んでいてもよい。なお、当該凝集剤としては、陽イオン性化学物質、陰イオン性化学物質、両イオン性化学物質、非帯電性化学物質、またはこれらの組合せが挙げられている。その他、（２）土壌から、土壌に含まれる細菌のＤＮＡを抽出する方法として、アルミニウムイオンや３価鉄イオンを用いて前処理を行い、核酸抽出を行うことにより、土壌由来の阻害物質を除去する方法が開示されている（例えば、非特許文献１参照。）。
　これに対して、より安価な方法として、単に生体試料を煮沸処理し、生体試料中のタンパク質等の夾雑物を凝固させ、核酸と分離させるボイリング法がある（例えば、非特許文献２参照。）。このボイリング法を応用した方法として、例えば、（３）全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、(i)全血試料を希釈する工程と、(ii)希釈された全血試料を熱処理する工程と、(iii)熱処理後の試料を遠心分離する工程とを含む前処理方法等がある（例えば、特許文献２参照。）。血液のように、夾雑物が多く、核酸含量が微量である生体試料では、ボイリング法のように単に煮沸処理するだけでは、得られる核酸の精度が不十分であり、正確な検査が困難な場合が多いが、上記（３）の方法のように、夾雑物を凝固させた後に遠心分離処理することにより、核酸増幅反応を阻害する物質等を効率よく除去することができ、より正確な検査をすることが可能となる。
特表２００８－５０００６６号公報 特開２００６－１８７２２１号公報 ブレイド（Braid）、外２名、ジャーナル・オブ・マイクロバイオロジカル・メソッズ（Journal of Microbiological Methods）、２００３年、第５２巻、ｐ３８９～３９３ 蛋白質核酸酵素、共立出版、１９９６年、第４１巻、第５号、ｐ４５３～４５６
　臨床検査等のように多検体を処理する場合には、作業効率の点から、検査工程が少なく、かつ特殊な装置を要さないことが好ましい。また、各工程の操作が簡便であれば、検査を自動化しやすく、より好ましい。しかしながら、上記（１）や（２）の方法では、工程数が多く、作業が煩雑であり、作業効率が十分ではない、という問題がある。また、上記（３）の方法は、上記（１）や（２）の方法よりも工程数が少ないものの、遠心分離処理を含む方法であるため、操作が煩雑であるという問題がある。また、遠心分離操作を含む工程を自動化する場合には、装置の構成が複雑になり、装置コストが高くなるという問題もある。
　本発明は、全血試料の核酸を増幅するための前処理方法であって、遠心分離処理を行うことなく、夾雑物を簡単に凝固させ得る方法、及び、全血試料中の核酸を簡便に効率良く増幅させることができる核酸増幅方法を提供することを目的とする。
　本発明者は、上記課題を解決すべく鋭意研究した結果、全血試料を、マグネシウムイオン等の多価の陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈することにより、タンパク質等の夾雑物を簡単に不活性化させることができること、及び、得られた処理液は、遠心分離処理することなく、核酸増幅反応に供することができることを見出し、本発明を完成させた。
　すなわち、本発明は、
（１）　全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、 (ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、 (ｂ)工程（ａ）において希釈された全血試料を熱処理する工程と、を有することを特徴とする全血試料の前処理方法、
（２）　前記多価陽イオンが、アルカリ土類金属イオン又はアルミニウムイオンであることを特徴とする前記（１）記載の全血試料の前処理方法、
（３）　前記多価陽イオンが、アルミニウムイオン又は鉄イオンであることを特徴とする前記（１）記載の全血試料の前処理方法、
（４）　前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０～１００℃であることを特徴とする前記（１）～（３）のいずれかに記載の全血試料の前処理方法、
（５）　前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０～９０℃であることを特徴とする前記（１）又は（２）記載の全血試料の前処理方法、
（６）　前記（１）～（５）のいずれかに記載の全血試料の前処理方法を用いて前処理された処理液を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする核酸増幅方法、
（７）　前記処理液が、懸濁液であることを特徴とする前記（６）記載の核酸増幅方法、
を提供することを目的とする。
　本発明の全血試料の前処理方法により、遠心分離処理をすることなく、簡便に、全血試料中の夾雑物を不活性化させることができる。このため、本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液を用いることにより、核酸増幅を高精度かつ効率的に行うことができる。
実施例１において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。 実施例１において、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。 実施例２において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。 実施例２において、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。 実施例３において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。 実施例３において、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。 実施例４において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。 実施例４において、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られた各バンドの濃さをデンシトグラフで測定した結果を示した図である。 実施例４において、前処理後に得られた処理液の状態を観察した図である。 実施例５において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。 実施例６において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。 実施例７において、ＰＣＲ反応後の反応溶液をポリアクリルアミドゲル電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色して得られたバンドパターンを示した染色像である。
発明を実施するための形態
　本発明の全血試料の前処理方法に供される全血試料は、動物から採取された全血であればよい。例えば、ヒト由来の全血試料であってもよく、マウスやウサギ、モルモット等の実験動物由来の全血試料であってもよく、ウシ、ウマ、ブタ、トリ等の家畜由来の全血試料であってもよい。また、採血直後の全血試料であってもよく、保存後の全血試料であってもよい。保存後の全血試料を用いる場合、保存条件は特に限定されるものではなく、室温保存されたものであってもよく、冷蔵や冷凍保存されたものであってもよい。
　本発明の全血試料の前処理方法は、(ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、(ｂ)希釈された全血試料を熱処理する工程と、を有することを特徴とする。このように、全血試料に多価陽イオンを添加して熱処理することにより、白血球の破裂等により、白血球中に含まれている核酸が溶液中に抽出されるとともに、タンパク質等の夾雑物を効率よく不活性化させることができる。これは、熱処理により変性したタンパク質と、多価陽イオンとが、キレート反応を起こすため、凝集が生じるためと推察される。すなわち、試料を煮沸処理することにより細胞を破壊してタンパク質を変性し、核酸を抽出するボイリング法とは異なり、キレート反応によりタンパク質を凝集させるため、脂質や糖類等のタンパク質以外の夾雑物も巻き込んで凝集物が形成される結果、より効果的に夾雑物を不活性化させることができると推察される。
　以下、工程ごとに説明する。
　まず、工程（ａ）として、全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する。ここで、希釈倍率が小さすぎる場合には、最終的に得られる処理液が形成された凝集物でほぼ埋め尽くされてしまい、核酸増幅反応に用いるために十分量の処理液が回収しにくくなるおそれがある。一方、希釈倍率が高すぎる場合には、得られた処理液中の核酸濃度が低くなりすぎるおそれがある。核酸濃度が低くなりすぎると、核酸増幅反応の反応液へ供される処理液量が多くなり、結果、核酸増幅反応の反応スケールが大きくなり、コストが高くなる可能性がある。希釈倍率が２～１００倍、好ましくは、４～６４倍であれば、量と核酸濃度の双方の点から、核酸増幅反応に好ましい処理液を回収することができる。
　例えば、希釈倍率が１６～３２倍であれば、不活性化された夾雑物による沈殿量を十分に少なくすることができ、得られた処理液を核酸増幅反応に供する場合に、反応溶液への不溶物の持ち込みを抑えることができる。
　一方で、多価陽イオンとして、アルミニウムイオン等の核酸増幅反応に特段の影響を及ぼさない種類のイオンを用いる場合には、希釈倍率が２～６４倍、好ましくは４～３２倍と、比較的希釈倍率を低くすることができる。このように、希釈倍率を低くすることにより、血液由来の核酸を、より多量に核酸増幅反応に供することが可能となる。
　工程（ａ）において用いられる希釈溶媒に含まれる多価陽イオンは、処理液が供される核酸増幅反応の反応液に持ち込まれた場合に、沈殿等を生じさせないものであれば、特に限定されるものではないが、２価又は３価の陽イオンであることが好ましい。また、金属イオンであってもよく、バリウムイオン等の非金属イオンであってもよい。排液処理の点からは、重金属イオン以外の多価陽イオンであることが好ましい。本発明においては、多価陽イオンとして、アルカリ土類金属イオン、アルミニウムイオン、又は鉄イオンであることが好ましく、マグネシウムイオン、アルミニウムイオン、又は３価鉄イオンであることがより好ましい。全血試料中の夾雑物をより効果的に不活性化させることができるためである。
　希釈溶媒に含まれる多価陽イオンの濃度は、全血試料に含まれている夾雑物を不活性化させるために十分な量であり、かつ、処理液が供される核酸増幅反応を阻害しない濃度であれば、特に限定されるものではなく、多価陽イオンの種類、希釈溶媒の種類、全血試料の希釈倍率、核酸増幅反応へ持ち込まれる量、及び核酸増幅反応の種類等を考慮して、適宜決定することができる。一般的には、希釈溶媒に含まれる多価陽イオンの濃度が高いほど、キレート反応の効率がよい。このため、例えば、希釈倍率が１０倍以上である場合には、希釈溶媒の多価陽イオン濃度が１μＭ以上であれば、十分に全血試料中の夾雑物を不活性化させることができる。
　希釈溶媒の多価陽イオン濃度の上限は、用いられる多価陽イオンが、アルミニウムイオン等の核酸増幅反応に特段の影響を及ぼさない種類のイオンである場合には、特に限定されるものではない。例えば、多価陽イオンとしてアルミニウムイオンを用いた場合には、希釈溶媒のアルミニウムイオン濃度が１μＭ以上であることが好ましく、１μＭ～５０ｍＭであることがより好ましく、２５μＭ～２０ｍＭであることがさらに好ましい。一方、多価陽イオンとして２価鉄イオン等の２価の金属イオンを用いた場合には、１μＭ～２．５ｍＭであることが好ましく、１μＭ～０．５ｍＭであることがより好ましい。また、多価陽イオンとして３価鉄イオンを用いた場合には、１μＭ～５ｍＭであることが好ましく、１μＭ～２．５ｍＭであることがより好ましく、０．５～２．５ｍＭであることがさらに好ましい。
　一方、多価陽イオンが、マグネシウムイオン等のように核酸増幅反応に影響を及ぼす可能性があるイオンである場合には、核酸増幅反応へ持ち込まれる量等を考慮して、核酸増幅反応に対する影響を抑えつつ、効率よくキレート反応を生じさせ得る濃度範囲を適宜決定することができる。希釈溶媒の多価陽イオン濃度が高すぎると、核酸増幅反応が阻害されるおそれがあり、逆に低すぎるとキレート反応効率が低く、夾雑物の不活性化効率が低下し、核酸増幅反応が阻害されるためである。例えば、希釈溶媒の多価陽イオンがマグネシウムイオンであり、希釈倍率が１０倍以上であり、核酸増幅反応へ持ち込まれる処理液量が、核酸増幅反応の反応液の最終容量の１０分の１以下程度である場合には、多価陽イオン濃度が１μＭ～０．５ｍＭ、好ましくは２５μＭ～１２５μＭであれば、核酸増幅反応に対する影響を抑えつつ、効率よく夾雑物を不活性化することができる。
　工程（ａ）において用いられる希釈溶媒の種類は、処理液が供される核酸増幅反応を阻害しない溶媒であれば特に限定されるものではなく、水や、一般的に生体試料の調製や核酸解析等に使用されるバッファー等に、多価陽イオンを添加したものを用いることができる。該バッファーとしては、例えば、トリスバッファー、リン酸バッファー、クエン酸バッファー等が挙げられる。また、希釈溶媒には、処理液が供される核酸増幅反応を阻害しない限度で、界面活性剤や有機溶媒等を添加してもよい。
　その後、工程（ｂ）として、工程（ａ）において希釈された全血試料（希釈済全血試料）を熱処理する。熱処理の温度は、全血試料中の夾雑物を不活性化し得る温度であれば、特に限定されるものではないが、煮沸処理（１００℃）以下であることが好ましい。特に、キレート反応により夾雑物を不活性化させるため、熱処理の温度は、煮沸処理（１００℃）よりも比較的低めの温度で熱処理することがより好ましい。例えば、本発明の全血試料の前処理方法においては、熱処理温度を、５０～１００℃とすることが好ましく、５０～９０℃とすることがより好ましく、６５～９０℃とすることがさらに好ましく、８０～９０℃とすることが特に好ましい。
　該熱処理の時間は、熱処理の温度や希釈済全血試料の量等を考慮して、適宜決定することができる。熱処理温度が８０～９０℃のように比較的高い場合には、熱処理温度が５０～７０℃のように比較的低い場合よりも短時間の処理時間でよい。例えば、熱処理温度が８０℃以上である場合には、熱処理時間は１０分間以内であることが好ましく、２．５分間以内であることがより好ましく、１分間以内であることがさらに好ましい。また、該熱処理の時間は、所定の熱処理温度において希釈済全血試料を保持する時間のみならず、加温工程の時間も含まれる。この加温工程においても、夾雑物の不活性化は進行するためである。例えば、工程（ａ）を室温で行った後、工程（ｂ）の熱処理を８０℃以上で行う場合には、８０℃まで加温する工程に、一般的には数秒～数十秒間を要する。このため、希釈済全血試料の温度が８０℃に達した時点で熱処理を終了してもよい。
　該熱処理により、全血試料中の夾雑物は不活性化され、凝集する。この凝集により得られる凝集物は、煮沸処理により変性したタンパク質による凝集物に比べて非常に強固であるため、例えば、遠心分離処理した場合には、沈殿物の容積が小さくなり、より多くの上清を得ることができる。
　本発明の全血試料の前処理方法により全血試料を処理して得られる処理液は、夾雑物が不活性化された核酸抽出液であるため、本発明の全血試料の前処理方法は、全血試料を用いた核酸解析の前処理として好適である。また、処理液中の不活性化された夾雑物が核酸増幅反応の反応溶液中に持ち込まれたとしても、核酸増幅反応を良好に行うことができることから、本発明の全血試料の前処理方法は、特に核酸増幅反応を用いた核酸解析のための前処理方法として特に好適である。本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液中の不活性化された夾雑物（凝集物）が、核酸増幅反応を阻害しない理由は明らかではないが、キレート反応による凝集物は、煮沸処理により変性したタンパク質による凝集物に比べて非常に強固であるためと推察される。
　本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液は、他の核酸試料と同様に、核酸増幅反応等の核酸解析に供されることができる。該処理液が供される核酸増幅反応としては、例えば、ＰＣＲ（ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＬＣＲ（ｌｉｇａｓｅ　ｃｈａｉｎ　ｒｅａｃｔｉｏｎ）法、ＳＤＡ（ｓｔｒａｎｄ　ｄｉｓｐｌａｃｅｍｅｎｔ　ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＬＡＭＰ（Ｌｏｏｐ－Ｍｅｄｉａｔｅｄ　Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＩＣＡＮ（Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ　ａｎｄ　Ｃｈｉｍｅｒｉｃ　ｐｒｉｍｅｒ－ｉｎｉｔｉａｔｅｄ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄｓ）法等がある。中でも、本発明においては、ＰＣＲ法であることが好ましい。なお、これらの手法は、核酸として本発明の全血試料の前処理方法により得られた処理液を用いる以外は、一般的な反応条件により行うことができる。
　上述したように、該処理液中の不活性化された夾雑物は、核酸増幅反応をほとんど阻害しない。このため、これらの核酸増幅反応の反応溶液に、該処理液を、夾雑物による凝集物の持ち込みを気にすることなく、添加することができる。また、キレート反応により得られる凝集物は、その強い凝集力により容積が小さくなり、沈殿し易い。このため、例えば、核酸増幅反応後の解析操作等の点から、凝集物の持ち込みを抑制したい場合には、工程（ｂ）による熱処理後、室温程度まで液温を低下させ静置することにより、凝集物を沈澱させ、この処理液の上層部分から回収した処理液を反応溶液に添加することにより、凝集物の持ち込み量を簡便に低下させることができる。
　また、例えば、アルミニウムイオンや３価鉄イオン等の３価陽イオンを用いた場合に得られる凝集物は、マグネシウムイオンや２価鉄イオン等の２価陽イオンを用いた場合に得られる凝集物よりも、核酸増幅反応への阻害効果が小さい。このため、３価陽イオンを用いた場合のほうが、２価陽イオンを用いた場合よりも、核酸増幅反応の反応溶液への夾雑物の持ち込み量を考慮することなく、熱処理後の処理液を懸濁液の状態で簡便に核酸増幅反応へ供することができる。さらに、２価陽イオンを用いて得られる処理液よりも、３価陽イオンを用いて得られる処理液のほうが、核酸増幅反応に供された場合に、反応効率が高くなる傾向が観察される。これは、多価陽イオンとしては、より価数の高いほうが、凝集能力が高く効率よく夾雑物を不活性化することができるためと推察される。
　特に、多価陽イオンとしてアルミニウムイオン等の３価陽イオンを用いた場合には、核酸増幅反応に供される熱処理後の処理液としては、静置等により凝集物を沈殿させた後の上清よりも、凝集物を含んだ懸濁液であることが好ましい。核酸増幅反応の反応溶液に、凝集物を含む懸濁液を持ち込むほうが、結果の再現性が良好であり、かつ、反応効率も高くなりやすいためである。夾雑物が不活性化されて凝集する際に、溶液中の核酸も一緒に凝集される結果、凝集物中に核酸が含まれてしまうために、凝集物を含む懸濁液を用いるほうが、凝集物を除いた上清よりも核酸増幅反応に好適となると推察される。具体的には、アルミニウムイオン等の３価陽イオンを添加して熱処理した後の処理液を攪拌等した後、溶液の中心部位から分取した夾雑物を含んだ懸濁液を、核酸増幅反応に用いることができる。
　このように、本発明の全血試料の前処理方法は、従来の前処理方法とは異なり、得られた処理液から遠心分離処理により凝集物を除去する工程を省いた場合であっても、核酸解析に好適な処理液を得ることができる。このため、本発明の全血試料の前処理方法は、複雑な遠心分離処理部を設けることなく、溶液添加部と温度制御部を備えた装置を用いて、全工程を自動化することも容易である。さらに、市販のＰＣＲ装置等の温度制御部を備えた核酸増幅反応装置に、溶液分注装置を備えた簡単な構成の装置により、前処理工程から核酸増幅反応までの一連の工程を全自動化することも容易である。
　次に実施例を示して本発明をさらに詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。
［実施例１］
　多価陽イオンとして、濃度の異なるマグネシウムイオンを用いて、本発明の全血試料の前処理方法によりヒトから採取した全血を前処理し、ＰＣＲを行い、解析対象である遺伝子の増幅産物を得た。ヒトのビタミンＫエポキシド還元酵素複合体（ｖｉｔａｍｉｎ　Ｋ　ｅｐｏｘｉｄｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ　ｃｏｍｐｌｅｘ：ＶＫＯＲＣ）のサブユニット１（ＶＫＯＲＣ１）遺伝子及びヒトの肝チトクロームＰ４５０（ｃｙｔｏｃｈｒｏｍｅ　Ｐ４５０：ＣＹＰ）２Ｃ９遺伝子を解析対象の遺伝子とした。
　まず、全血５μＬを、硫酸マグネシウム濃度が異なるにがり液（硫酸マグネシウム、和光純薬工業社製）１５５μＬで希釈し（希釈倍率が３２倍）、それぞれ混合した。にがり液中の硫酸マグネシウム濃度は１．８８ｍＭ～７．３μＭとした。これらの希釈液に、サーマルサイクラーにて、７０℃で５分間の熱処理を施した後、２５℃とし、処理液を得た。
　これらの処理液を鋳型とし、表１記載のプライマーを用いてマルチプレックスＰＣＲを行った。なお、これらのプライマーを用いることにより、８２ｂｐのＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物、１４４ｂｐのＶＫＯＲＣ１遺伝子の増幅産物が、それぞれ得られる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　具体的には、２μＬの処理液に、最終濃度が、１×ＰＣＲ　Ｂｕｆｆｅｒ（東洋紡績社製）、０．２ｍＭのｄＮＴＰ、１ｍＭの硫酸マグネシウム、０．３μＭの各プライマー、及び０．９μＬのＫＯＤｐｌｕｓ（東洋紡績社製）となるようにそれぞれ添加し、純水を加え、全量３６μＬの反応溶液を調製した。なお、処理液に代えて、表１記載のプライマーを用いて、ＶＫＯＲＣ１遺伝子及びＣＹＰ２Ｃ９遺伝子の増幅産物が得られることが確認されているヒト抽出ゲノム１０ｎｇ（財団法人ヒューマンサイエンス振興財団が提供しているヒューマンサイエンス研究資源バンクより非連結匿名化された状態で入手）を用いたものをＰＣＲのポジティブコントロールとし、等量の純水を用いたものを、ネガティブコントロールとした。
　これらの反応溶液を、９４℃で５分間の変性工程、次に９４℃で３０秒間、６４℃で３０秒間、６８℃で３０秒間を３５サイクルの増幅工程、６８℃で２分間の伸長工程、からなる反応条件によりＰＣＲ反応を行った。ＰＣＲ反応後の反応溶液を、８％ポリアクリルアミドゲルを用いて電気泳動した後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色することにより、目的のＣＹＰ２Ｃ９増幅産物（８２ｂｐ）及びＶＫＯＲＣ１増幅産物（１４４ｂｐ）が増幅されているか否かを確認した。
　図１はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１～９には、表２記載の硫酸マグネシウム濃度のにがり液を用いて前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン１０にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を図２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　この結果、前処理に用いるにがり液中のマグネシウムイオンの濃度が７．３μＭ～０．４６９ｍＭであるレーン３～９において、レーン１０と同様にＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が検出された。特に、マグネシウムイオンの濃度が０．０２９～０．１１７ｍＭであるレーン５～７において、両増幅産物をバランスよく得ることができた。一方、レーン１ではＣＹＰ２Ｃ９増幅産物のみが、レーン２ではＶＫＯＲＣ１増幅産物のみが検出された。
　これらの結果から、本発明の全血試料の前処理方法により処理された処理液は、遠心分離処理を行うことなく核酸増幅反応に供し得ることが明らかである。なお、一般的には、ＰＣＲ等のポリメラーゼを用いる核酸増幅反応のための前処理には、マグネシウムイオンを含有する液は用いない。ポリメラーゼ反応におけるマグネシウムイオン濃度は最適値があることがよく知られており、検体からのマグネシウム持込を避ける必要があるためである。にもかかわらず、本発明においては、マグネシウムイオン含有液を用いた場合でも、良好に前処理を行うことができた。
［実施例２］
　前処理における熱処理温度の影響を調べた。
　具体的には、前処理に用いたにがり液の硫酸マグネシウム濃度を０．１１７ｍＭとし、熱処理の温度を５０℃～９０℃とした以外は、実施例１と同様にして、全血試料を前処理し、該前処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
　図３はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１～５には、表３記載の熱処理温度で前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン６にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を図４に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
　この結果、全てのレーンにおいて、ＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が十分な強度で検出され、いずれもマルチプレックス増幅ができた。特に、前処理における熱処理温度を８０℃～９０℃とした場合には、非特異増幅も少なくすることができた。シグナル強度も高く、非特異増幅も少なかったことから、本実施例においては、熱処理の温度は８０℃が最も適切であった。
［実施例３］
　前処理における熱処理時間の影響を調べた。
　具体的には、前処理に用いたにがり液の硫酸マグネシウム濃度を０．１１７ｍＭとし、熱処理の温度を８０℃とし、８０℃に達した後の加熱保持時間を０～１０分間とした以外は、実施例１と同様にして、全血試料を前処理し、該前処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
　図５はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１～５には、表４記載の加熱保持時間で前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン６にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を表４及び図６に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
　この結果、全てのレーンにおいて、ＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が十分な強度で検出され、いずれもマルチプレックス増幅ができた。特に、前処理における加熱保持時間が０分間の場合（加熱して８０℃になってすぐに２５℃とした場合）には、最も増幅産物量が多く得られた。
［実施例４］
　前処理における全血の希釈倍率の影響を調べた。
　まず、前処理に用いたにがり液の硫酸マグネシウム濃度を０．１１７ｍＭとし、５μＬの全血に対する希釈倍率を４～６４倍とし、熱処理の温度を８０℃とし、８０℃に達した後の加熱保持時間を０分間とした以外は、実施例１と同様にして、全血試料を前処理し、該前処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
　図７はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１～５には、表５記載の希釈倍率で前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン６にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）をそれぞれ流した。さらに、各バンドの濃さをデンシトグラフで測定し、各増幅産物量を測定した結果を図８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　この結果、全てのレーンにおいて、ＣＹＰ２Ｃ９増幅産物とＶＫＯＲＣ１増幅産物の両方が検出され、いずれもマルチプレックス増幅ができた。特に、希釈倍率が４～３２倍であったレーン２～５では、両増幅産物が十分な強度で検出することができた。
　一方、図９は、前処理後に得られた処理液の状態を観察した図である。希釈倍率が４倍及び８倍の場合には、前処理後に得られた処理液中に、多量の沈澱（血液変性物）が生じていた。このため、自動化装置に適用する場合には、沈殿量の少なく、かつ十分量の増幅産物が得られる１６～３２倍の希釈倍率で行うことが好ましい。
［実施例５］
　多価陽イオンとして、アルミニウムイオンを用いて、本発明の全血試料の前処理方法によりヒトから採取した全血１０検体を前処理し、ＰＣＲを行い、解析対象である遺伝子の増幅産物を得た。解析対象の遺伝子は、実施例１と同様に、ＶＫＯＲＣ１遺伝子及びＣＹＰ２Ｃ９遺伝子とした。
　まず、各全血６．２５μＬを、硫酸アルミニウム水溶液（硫酸アルミニウム、和光純薬工業社製）４３．７５μＬで希釈し、それぞれ混合した。これらの希釈液中の硫酸アルミニウム濃度は１０ｍＭとした。これらの希釈液に、サーマルサイクラーにて、８０℃で５分間の熱処理を施した後、２５℃とし、処理液を得た。
　実施例１と同様にして、これらの処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
　図１０はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１～１０には、全血１０検体から得られた処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン１１にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）を、レーン１２にはネガティブコントロール（純水を添加したもの）を、それぞれ流した。この結果、検体による増幅量の差が見られたものの、いずれの検体においても、マルチプレックスＰＣＲによって両遺伝子が検出できた。
［実施例６］
　多価陽イオンとして、２価鉄イオンと３価鉄イオンを用いて、多価陽イオンの価数による影響を観察した。
　具体的には、全血６．２５μＬを、濃度が異なる塩化第一鉄水溶液（ＦｅＣｌ２、和光純薬工業社製）４３．７５μＬ、又は塩化第二鉄水溶液（ＦｅＣｌ３、和光純薬工業社製）４３．７５μＬで希釈し、それぞれ混合した。これらの希釈液中の塩化第一鉄又は塩化第二鉄の濃度は０．５～５０ｍＭとした。これらの希釈液に、サーマルサイクラーにて、８０℃で５分間の熱処理を施した後、２５℃とし、処理液を得た。
　実施例１と同様にして、これらの処理液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
　図１１はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１～６には、表６記載の塩化第一鉄（ＦｅＣｌ２）濃度の塩化第一鉄水溶液を用いて前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン９～１４には、表７記載の塩化第二鉄（ＦｅＣｌ３）濃度の塩化第二鉄水溶液を用いて前処理した処理液を鋳型とした反応溶液を、レーン７及び１５にはポジティブコントロール（ヒトゲノムを鋳型としたもの）を、レーン８及び１６にはネガティブコントロール（純水を添加したもの）を、それぞれ流した。この結果、二価の鉄イオン（ＦｅＣｌ２）を用いた場合も、三価の鉄イオン（ＦｅＣｌ３）を用いた場合も、マルチプレックスＰＣＲによって両遺伝子が検出できた。特に、二価の鉄イオンを用いた場合よりも、三価の鉄イオンを用いた場合の方が、増幅産物量が多い傾向が観察された。塩化第二鉄水溶液を用いた場合には、希釈液中の三価の鉄イオン濃度が、２．５～０．５ｍＭ、特に２．５ｍＭの場合に、ＰＣＲ増幅が非常に良好であることが分かった。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
［実施例７］
　多価陽イオンとして３価陽イオンを用いて得られた処理液を核酸増幅反応に用いる場合に、凝集物を含む懸濁液を用いた場合と、凝集物を含まない上清を用いた場合との核酸増幅効率を比較した。本実施例においては、凝集物の混入の有無による影響をより明確にするために、上清として、遠心分離処理後の上清を用いた。
　まず、全血１０検体を用意し、各全血６．２５μＬを、硫酸アルミニウム水溶液（硫酸アルミニウム、和光純薬工業社製）４３．７５μＬで希釈し、それぞれ混合した。これらの希釈液中の硫酸アルミニウム濃度は１０ｍＭとした。これらの希釈液に、サーマルサイクラーにて、８０℃で５分間の熱処理を施した後、２５℃とし、処理液を得た。
　得られた処理液から、下記（ａ）の方法により上清２μＬを、下記（ｂ）の方法により懸濁液２μＬを、それぞれ分取し、ＰＣＲの鋳型とした。
（ａ）各処理液を、１０，０００ｒｐｍ、５秒間遠心分離処理（チビタンII、日本ミリポア社製を使用）を行った後、メニスカスから２μＬの上清を分取した。
（ｂ）各処理液を、Ｖｏｒｔｅｘを用いた攪拌処理を行い、十分に懸濁させた後、チューブの中心点から２μＬの懸濁液を分取した。
　実施例１と同様にして、これらの上清又は懸濁液を鋳型としてＰＣＲ反応を行い、得られた増幅産物を電気泳動後、ＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により検出した。
　図１２はＳＹＢＲ　Ｇｒｅｅｎ１染色により得られたバンドパターンを示した染色図である。レーンＭは分子量マーカーである２０ｂｐラダー（タカラバイオ社製）を、レーン１～１０には、上清２μＬを鋳型とした反応溶液を、レーン１１～２０には、懸濁液２μＬを鋳型とした反応溶液を、それぞれ流した。なお、レーン１とレーン１１には、同じ処理液から回収された上清と懸濁液が用いられた反応溶液が流されている。レーン２～１０及び１２～２０も同様である。
　この結果、レーン１～２０の全てにおいて、目的のＣＹＰ２Ｃ９増幅産物（８２ｂｐ）及びＶＫＯＲＣ１増幅産物（１４４ｂｐ）が増幅されていることが確認された。但し、１０検体全てにおいて、上清を鋳型とした場合（レーン１～１０）には、非常に薄いバンドしか検出できなかったにも関わらず、懸濁液を鋳型とした場合（レーン１１～２０）には、明確なバンドが検出された。つまり、上清を鋳型とするよりも、懸濁液を鋳型とするほうが、非常に多くの増幅産物が得られることが確認された。
　本実施例により、多価陽イオンとして３価陽イオンを用いて本発明の前処理方法により得られた処理液を核酸増幅の鋳型とする場合には、処理液中の凝集物を含む懸濁液を用いることにより、安定して効率よく核酸増幅を行うことができることが明らかとなった。
　本発明の全血試料の前処理方法を用いることにより、遠心分離処理をすることなく、簡便に、核酸解析、特に核酸増幅反応に好適な核酸試料を調製することができるため、特に多検体の遺伝子解析を行うような臨床検査等の分野で利用が可能である。

Claims (7)

  1. 　全血試料中の核酸を増幅するための前処理方法であって、
    (ａ)全血試料を、多価陽イオンを含む希釈溶媒を用いて希釈する工程と、
    (ｂ)工程（ａ）において希釈された全血試料を熱処理する工程と、
    を有することを特徴とする全血試料の前処理方法。　
  2. 　前記多価陽イオンが、アルカリ土類金属イオン又はアルミニウムイオンであることを特徴とする請求項１記載の全血試料の前処理方法。
  3. 　前記多価陽イオンが、アルミニウムイオン又は鉄イオンであることを特徴とする請求項１記載の全血試料の前処理方法。
  4. 　前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０～１００℃であることを特徴とする請求項１～３のいずれか一項に記載の全血試料の前処理方法。
  5. 　前記工程（ｂ）における熱処理の温度が、５０～９０℃であることを特徴とする請求項１又は２記載の全血試料の前処理方法。
  6. 　請求項１～５のいずれか一項に記載の全血試料の前処理方法を用いて前処理された処理液を用いて核酸増幅反応を行うことを特徴とする核酸増幅方法。
  7. 　前記処理液が、懸濁液であることを特徴とする請求項６記載の核酸増幅方法。
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