JP5434199B2 - 抗酸菌遺伝子の増幅方法 - Google Patents
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Description
そこでこれらの検査の前処理には古くよりN−アセチルL−システイン水酸化ナトリウム(NALC−NaOH)法(非特許文献1)が利用されている。
NALC−NaOH法は抗酸菌が酸やアルカリに強い性質を利用し、喀痰に含まれる抗酸菌以外の細菌を死滅させ、かつ後工程を阻害する喀痰成分を除去する役割を担う。喀痰は個人差が大きく、抗酸菌を生きたまま前処理を行う必要があることから現在でも喀痰の前処理に利用されている(非特許文献2)。
従来から用いられているNALC−NaOH法は、生菌のまま処理する方法であることから抗酸菌の破砕をする方法ではなかった。抗酸菌はこの脂質層の細胞壁を持つため、溶菌を妨げる一つの原因となっている。
特許文献2にはもうひとつの方法(第2)が開示されている。抗酸菌の溶菌にリパーゼ含む溶液を使用し脂質分解処理を行う工程、非イオン界面活性剤および金属キレート剤を含む溶液中で加熱して抗酸菌を溶菌する工程からなる方法である。第2の方法では、抗酸菌の細胞壁が脂質を含んでいることに着目し、脂質分解工程を第1の方法に加えることによって、抗酸菌の細胞壁を脆弱化し、加熱工程によってさらなる溶菌効率を得ている。
以下の(1)〜(3)の工程を含むことを特徴とする抗酸菌遺伝子の増幅方法。
(1)抗酸菌を含む検体をNALC−NaOH法で処理する工程。
(2)(1)の工程で処理された試料を水または緩衝液で懸濁し、試料溶液とする工程。
(3)(2)の工程で得られた試料溶液を核酸増幅試薬と混合し増幅を開始する工程。
[項2]
抗酸菌を含む検体が喀痰である項1に記載の抗酸菌遺伝子の増幅方法。
[項3]
核酸増幅反応がPCRである項1または2に記載の抗酸菌遺伝子の増幅方法。
[項4]
PCRに用いるDNAポリメラーゼが、以下の(1)および(2)からなる群から選ばれる1つ以上からなる、項1〜3のいずれかに記載の抗酸菌遺伝子の増幅方法。
(1)Tbr,Tfl,Tru,Tth,T1i,Tac,Tne,Tma,Tih、Tfi,Pfu,Pfutubo,Pyrobest(登録商標),Pwo,KOD,Bst,Sac,Sso,Poc,Pab,Mth,Pho,ES4,VENTおよびDEEPVENTからなる群。
(2)(1)で示される群のDNAポリメラーゼの変異体であり、かつ、DNAポリメラーゼ活性を有する変異体。
本発明の実施形態の一つは、以下の(1)〜(3)の工程を含むことを特徴とする抗酸菌遺伝子の増幅方法である。
(1)抗酸菌を含む検体をNALC−NaOH法で処理する工程。
(2)(1)の工程で処理された試料を水または緩衝液で懸濁し、試料溶液とする工程。
(3)(2)の工程で得られた試料溶液を核酸増幅試薬と混合し増幅を開始する工程。
本発明で対象となる抗酸菌とは、マイコバクテリウム属細菌の総称であり、大きくは結核菌群と非結核性抗酸菌とに分けられる。
抗酸菌は、結核菌群に分類されているヒト型結核菌(Mycobacterium tuberculosis)の他にも、ウシ型結核菌(Mycobacterium bovis)、アフリカ型結核菌(Mycobacterium africanum)、ネズミ型結核菌(Mycobacterium microti)、マイコバクテリウム・カネッティ(Mycobacterium canettii)、マイコバクテリウム・カプレ(Mycobacterium caprae)、アシカ型結核菌(Mycobacterium pinnipedii)などが挙げられるが、特に限定されない。
また、非結核性抗酸菌は様々な種が挙げられ、特にヒトに病原性を示すトリ型結核菌(Mycobacterium avium)、マイコバクテリウム・イントラセルラーレ(Mycobacterium intracellulare)、マイコバクテリウム・カンサシイ(Mycobacterium kansasii)、マイコバクテリウム・スクロフラセウム(Mycobacterium scrofulaceum)、マイコバクテリウム・フォーチュイタム(Mycobacterium fortuitum)が対象である。ただしこれらに限定されるものではない。
本発明では、抗酸菌を含む検体を、まずNALC−NaOH法で処理する。
NALC−NaOH法とは、一般的に行われている喀痰の処理方法である。具体的には粘性溶解剤としてNALCを加えて喀痰の粘性物質の消化を促進し、低濃度の水酸化ナトリウムにより抗酸菌以外の汚染菌を死滅除去し、緩衝液で希釈した後、遠心分離を行い、沈さを緩衝液で懸濁して培地へ接種する方法である。抗酸菌の培養検査や塗沫検査に用いるための喀痰の前処理法である。
本発明のNALC−NaOH法は上述の原理を利用した方法を示し、さらには集菌剤を追加した改良されたNALC−NaOH法などの一般的方法と同様の効果を持つ変法も含まれる。
NALC−NaOH法で処理された試料を、例えばリン酸緩衝液(PBS)やEDTAなどの金属キレート剤を含む緩衝液などで懸濁すると増幅工程を阻害するため、試料は水または増幅阻害を起こさない緩衝液で懸濁することが好ましい。緩衝液としては特に限定されるものではないが、トリスやヘペスなどのグッドバッファーおよび、リン酸緩衝液などが用いられるが、具体的には、10〜200mMの各種バッファー(pH7.5〜9(25℃))が例示できる。好ましくはトリス緩衝液である。好ましい緩衝pH範囲は7〜9である。
増幅方法としては特に限定されず、適宜公知の方法を用いることができる。
例えば、PCR、NASBA(Nucleic acid sequence−basedamplification method;Nature 第350巻、第91頁、1991年参照)、LCR(国際公開89/12696号、特開平2−2934号参照)、SDA(Strand Displacement Amplification:Nucleic Acids Res. 第20巻、第1691頁、1992年参照)、RCA(国際公開90/1069号参照)、TMA(Transcription mediated amplification method;J. Clin. Microbiol. 第31巻、第3270頁、1993年参照)、LAMP(Loop−mediated isothermal amplification method:J. Clin Microbiol. 第42巻:第1956頁、2004年参照)、ICAN(isothermal and chimeric primer−initiated amplification of nucleic acids:Kekkaku. 第78巻、第533頁、2003年参照)などを挙げることができるが、これらに限定されない。好ましくはPCRなどの温度変化を利用して増幅する方法が良い。
(1)Tbr,Tfl,Tru,Tth,T1i,Tac,Tne,Tma,Tih、Tfi,Pfu,Pfutubo,Pyrobest(登録商標),Pwo,KOD,Bst,Sac,Sso,Poc,Pab,Mth,Pho,ES4,VENTおよびDEEPVENTからなる群。
(2)(1)で示される群のDNAポリメラーゼの変異体であり、かつ、DNAポリメラーゼ活性を有する変異体。
(1)試料の調製
細菌は、Mycobacterium bovis BCG株(BCGと略す)を使用した。3%小川培地(日水製薬製)にて2週間35℃で培養後、抗酸菌培養の液体培地であるMycoBroth(極東製薬工業製)に接種し6日間37℃で培養した。培養後の液体培地は、分散性の高い菌液を得るため、5μmの親水性フィルターでろ過した後、濁度計でOD600を測定し、マクファーランド比濁法に従ってマクファーランド1の濃度に菌液を調整した。さらにマクファーランド1の菌液1.0mLを1.5mLのチューブに加え、遠心分離操作で菌体だけを沈殿させた。その後上清を取り除いて1.0mLの滅菌水で再懸濁させた。この操作は液体培地中に既に遊離している核酸を除去するために行った。さらに、BCGのゲノムDNAを得るために、フェノールクロロホルム法にてゲノムDNAを抽出した。
調製したマクファーランド1濃度のBCG菌体懸濁液を滅菌水で1000倍希釈した溶液を準備した(試料1)。コントロールとして同じくBCG菌体懸濁液より抽出したゲノム溶液100コピーおよび滅菌水を用いた。
試料1、100コピーのBCGゲノム溶液および滅菌水をそれぞれ下記試薬に添加して、下記条件によりPCR増幅および検出を行った。下記試薬・条件はBCG株を特異的に検出できるプライマーおよびプローブの組み合わせである。増幅産物とプローブがハイブリダイゼーションすることでプローブに標識された蛍光色素の蛍光が消光すること(QProbe法:)を検出原理としている。核酸増幅および検出にはロシュ・ダイアグノスティック社製ライトサイクラー(登録商標)を使用した。測定モードは530nmを利用し、増幅反応後、融解曲線解析を実施した。融解曲線解析は蛍光標識プローブが標的核酸から解離する時の蛍光量の増加を検出している。図1〜4の縦軸は蛍光強度の一次導関数の逆符号の値(−dF/dt)、横軸は温度(℃)である。
以下の試薬を含む10μL溶液を調製した。
KOD plus DNAポリメラーゼ反応液
オリゴ1 250nM、
オリゴ2 1500nM、
オリゴ3(3’末端をBODIPY−FL標識) 250nM、
×10緩衝液 1μL、
dNTP 0.2mM、
MgSO4 4mM、
ジメチルスルホキシド 7.5%
KOD plus DNAポリメラーゼ 0.3U、
試料またはコントロール溶液 3μL
(PCR)
94℃・2分
98℃・0秒、60℃・5秒、50サイクル
(融解曲線解析)
94℃・1分、40℃・1分
0.5℃/秒で75℃まで温度上昇
図1は、菌体懸濁液を直接増幅検出用反応液に混合して検出した結果である。菌懸濁液を用いた場合でも、ゲノムDNA同様に抗酸菌ゲノムの増幅および検出が可能であった。抗酸菌については強固な細胞壁を持っているが、溶菌操作を行わなくともPCR反応中にBCGのゲノムDNAを取り出して増幅できることがわかった。
(1)試料の調製
喀痰は、あらかじめ培養検査で陽性陰性がわかっているヒト型結核菌陽性およびヒト型結核菌陰性の検体を用いて一般的なNALC−NaOH法に従って前処理を実施した。最終的に得られた沈殿物は滅菌水に懸濁した。
ヒト型結核菌陽性検体のNALC−NaOH法処理済み溶液を試料2とした。ヒト型結核菌陰性検体のNALC−NaOH法処理済み試料を試料3とした。また、調製したマクファーランド1濃度のBCG菌体懸濁液を滅菌水で100倍希釈した溶液を準備した。BCG菌体100倍希釈液をヒト型結核菌陰性検体のNALC−NaOH法処理済み試料に10倍希釈して混合した液を試料4とした。コントロールとして同じくBCG菌体懸濁液より抽出したゲノム溶液100コピーおよび滅菌水を用いた。
試料2〜4、100コピーのBCGゲノム溶液および滅菌水をそれぞれ実施例1に記載の試薬に添加し、実施例1と同様の条件にてPCR増幅および検出を行った。
図2〜図4は試料1〜3をコントロールとともに検出した結果である。図2および図4からNALC−NaOH法処理済み溶液を用いた場合でも、ゲノムDNA同様に抗酸菌ゲノムの増幅および検出が可能であった。NALC−NaOH法処理済み溶液には喀痰の残存物も残渣として残っているが、喀痰成分の影響を受けることなく標的遺伝子の増幅が可能であることがわかった。
Claims (3)
- 以下の(1)〜(3)の工程を含む抗酸菌遺伝子の増幅方法であって、抗酸菌の溶菌工程と核酸の精製工程を含まないことを特徴とする抗酸菌遺伝子の増幅方法。
(1)喀痰をNALC−NaOH法で処理する工程。
(2)(1)の工程で処理された試料を水または緩衝液で懸濁し、試料溶液とする工程。
(3)(2)の工程で得られた試料溶液を核酸増幅試薬と混合し増幅を開始する工程。 - 核酸増幅反応がPCRである請求項1に記載の抗酸菌遺伝子の増幅方法。
- PCRに用いるDNAポリメラーゼが、以下の(1)および(2)からなる群から選ばれる1つ以上からなる、請求項1または2に記載の抗酸菌遺伝子の増幅方法。
(1)Tbr,Tfl,Tru,Tth,T1i,Tac,Tne,Tma,Tih、Tfi,Pfu,Pfutubo,Pyrobest(登録商標),Pwo,KOD,Bst,Sac,Sso,Poc,Pab,Mth,Pho,ES4,VENTおよびDEEPVENTからなる群。
(2)(1)で示される群のDNAポリメラーゼの変異体であり、かつ、DNAポリメラーゼ活性を有する変異体。
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