JP5138197B2

JP5138197B2 - Ｌｇ２１株用プライマー及び該プライマーを用いた検出方法

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Publication number: JP5138197B2
Application number: JP2006273065A
Authority: JP
Inventors: 茂藤村; 勝紀木村; 宗宏小田; 喜之伊藤; 道則宮原
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2006-10-04
Filing date: 2006-10-04
Publication date: 2013-02-06
Anticipated expiration: 2026-10-04
Also published as: JP2008086285A

Description

本発明は、発酵乳製品製造やプロバイオティクスに関わる乳酸菌など食品微生物、及び、乳酸・アミノ酸・核酸など有用物質を生産する微生物、環境浄化に関わる微生物の検出方法に関する。さらに詳しくは、ラクトバチルス属ガセッリー菌の検出方法に関する。

ヘリコバクター・ピロリ（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ）は、慢性胃炎および胃癌に関連する（非特許文献１）。ヘリコバクター・ピロリは、世界中の人口の５０％以上に感染している。ヘリコバクター・ピロリに対する治療として、現在のところ、プロトンポンプ・インヒビターに基づくトリプル・レジメンツ（ｔｒｉｐｌｅｒｅｇｉｍｅｎｔｓ）のような根絶治療が利用できるが、ヘリコバクター・ピロリの抗生物質抵抗性および根絶治療に関連する副作用などの問題がある。

近年、ラクトバチルス（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属およびビフィドバクテリウム（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）属といった乳酸菌が、ヘリコバクター・ピロリ感染のためのプロバイオティクスに有用であると考えられている（非特許文献２および３）。特に、多くのインビボ研究により、様々なラクトバチルス属がヘリコバクター・ピロリの成長を抑制することができるという可能性が示された（非特許文献４〜６）。

また、非特許文献７では、ラクトバチルス属菌を補給することにより、ヘリコバクター・ピロリ根絶治療における副作用が緩和されると報告している。報告されている胃のプロバイオティクスの中で、ラクトバチルス・ガッセリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（以下ＬＧ２１株;寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）は、ヒトにおけるヘリコバクター・ピロリの定着を抑制するとともに、胃粘膜炎症を抑えるという効果を有する（非特許文献８）。

ヘリコバクター・ピロリは、胃の粘液層および上皮細胞への接着部分に定着することが知られている。また、多くの臨床試験の結果は、ＬＧ２１株はヘリコバクター・ピロリを根絶するのではなく、その病原体を低レベルに維持することを示唆していることが報告されている（非特許文献９）。

乳酸菌の利用の有効性を評価するためには、例えば、生物試料中の乳酸菌の存在量を算出し、さらに各々の乳酸菌の菌種を測定することによって、臨床的な効果を判定することが必要である。それによって、摂取された乳酸菌の大腸への移行率や生存率を明らかにすることが可能となり、その保健効果が判定可能となる。したがって摂取された乳酸菌を確実に識別する技術が求められている。

従来、生物試料中や環境中の乳酸菌は、検体を嫌気培養してコロニーを分離した後、グラム染色や検鏡による菌型の観察などの形態学検査、あるいは、酵素活性、酸素耐性、糖発酵性などの生化学検査により、同定されてきた。前記検体の培養は、菌数測定や菌種の同定に通常用いられる標準的な方法で行われるが、必ずしも全ての生物試料中の乳酸菌を培養できるわけではなく、また嫌気装置を用いて培養を行う必要があり、培養時間が数日から１週間程度必要であるなど、手間がかかり複雑である。また、検体に含まれる乳酸菌を嫌気的かつ低温で保存し、生菌のまま分析に供しなければならず、さらに、分析を行う者の習熟度が要求されること等、多くの問題があった。

一方、近年、微生物の同定法としてリボソームＲＮＡ（ｒＲＮＡ）遺伝子を用いて検出する分子生物学的手法を用いて行われるようになってきた。原核生物のｒＲＮＡ遺伝子は５Ｓ、１６Ｓ、２３ＳリボソームＲＮＡ遺伝子からなり、特に１６ＳｒＲＮＡ遺伝子は原核生物に普遍的に存在し、属及び菌種間に共通な塩基配列があるため、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列を基準株と比較して種を決定することができる。この方法では、被検菌の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を決定した後、これと近縁の菌の１６ＳｒＲＮＡの塩基配列を整列させ（アラインメント）、塩基配列の違いを解析することによって行われる。しかし、この方法では、比較対照として、土壌、汚泥、糞便や食品などに存在する菌の１６ＳｒＲＮＡの配列を決定し、多数配列間での系統的な解析を行う必要であり、多大な労力と時間を要する（非特許文献１０）。

また、被検菌が、既に１６ＳｒＲＮＡの特異的配列が知られている比較対照の菌と同一種であるか否かは、その配列を検出するためのプローブを用いて決定することができる。しかし、この方法は、実施に長時間を要するという問題がある。

さらに、１６ＳｒＲＮＡ遺伝子と２３ＳｒＲＮＡ遺伝子の中間に位置するＩｎｔｅｒｇｅｎｉｃｔｒａｎｓｃｒｉｂｅｄｓｐａｃｅｒの塩基配列は、種間で相違点が多いことから、乳酸菌の菌種間の比較に使用可能であることが報告されている（非特許文献１１）。しかし、同属同種異株間の比較に関して応用可能かどうかについては詳細に検討されていない。

また、染色体ＤＮＡの多型性を用いて菌株を同定する方法がある。例えば、制限酵素を用いて染色体ＤＮＡを切断し、その切断ＤＮＡをパルスフィールドゲル電気泳動（Ｐｕｌｓｅｄ−ＦｉｅｌｄＧｅｌＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ）によって分離後、染色を行い泳動パターンにより菌株の違いを比較するＰＦＧＥ法が行われている（非特許文献１２）。また、１０塩基長程度のＰＣＲ用プライマーを用いＲＡＰＤ（ＲａｎｄｏｍＡｍｐｌｉｆｉｅｄＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｃＤＮＡ）によってＰＣＲを行い、アガロース電気泳動によって分離後、染色を行い泳動パターンを比較することが行われている（非特許文献１３）

しかし、ＰＦＧＥ法は精査を行うのには好適であるが、複雑な工程が必要であり、実施するのに数日が必要であるなどルティーンワークには不向きである。一方、ＲＡＰＤ法は迅速に検出が可能であるが、短いＰＣＲ用プライマーを使用して低温でアニーリングを行うため、再現性が劣る、あるいは使用する機器によって結果が異なることが知られている。

Ｓｕｅｒｂａｕｍ，Ｓ．ａｎｄＭｉｃｈｅｔｔｉ，Ｐ．，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，Ｖｏｌ．３４７，ｐ．１１７５−１１８６（２００２）Ｈａｍｉｌｔｏｎ−Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｍ．，ＩｎｔＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＡｇｅｎｔｓ，Ｖｏｌ．２２，ｐ．３６０−３６６（２００３）ＳｈｅｕＢＳ，ＣｈｅｎｇＨＣ，ＫａｏＡＷ，ＷａｎｇＳＴ，ＹａｎｇＹＪ，ＹａｎｇＨＢａｎｄＷｕＪＪ．，ＪＣｌｉｎＮｕｔｒ，Ｖｏｌ．８３，ｐ．８６４−８６９（２００６）ＯｈＹ，ＯｓａｔｏＭＳ，ＨａｎＸ, ＢｅｎｎｅｔｔＧａｎｄＨｏｎｇＷＫ．，ＪＡｐｐｌＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．９３，ｐ．１０８３−１０８８（２００２）Ｊｏｈｎｓｏｎ−ＨｅｎｒｙＫＣ，ＭｉｔｃｈｅｌｌＤＪ，ＡｖｉｔｚｕｒＹ，Ｇａｌｉｎｄｏ−ＭａｔａＥ，ＪｏｎｅｓＮＬａｎｄＳｈｅｒｍａｎＰＭ．，ＤｉｇＤｉｓＳｃｉ，Ｖｏｌ．４９，ｐ．１０９５−１１０２（２００４）ＳｇｏｕｒａｓＤ，ＭａｒａｇｋｏｕｄａｋｉｓＰ，ＰｅｔｒａｋｉＫ，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−ＧｏｎｚａｌｅｚＢ，ＥｒｉｏｔｏｕＥ．ｅｔａｌ．，ＡｐｐｌＥｎｖＭｉｃｒｏｂｉｏｌ，Ｖｏｌ．７０，ｐ．５１８−５２６（２００４）ＡｒｍｕｚｚｉＡ，ＣｒｅｍｏｎｉｎｉＦ，ＢａｒｔｏｌｏｚｚｉＦ，ＣａｎｄｕｃｃｉＦ，ＣａｎｄｅｌｌｉＭ，ＯｊｅｔｔｉＶ，ＣａｍｍａｒｏｔａＧ，ＡｎｔｉＭ．ｅｔａｌ．，ＡｌｉｍｅｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ，Ｖｏｌ．１５，ｐ．１６３−１６９．ＳａｋａｍｏｔｏＩ，ＩｇａｒａｓｈｉＭ，ＫｉｍｕｒａＫ，ＴａｋａｇｉＡ，ＭｉｗａＴａｎｄＫｏｇａＹ．，ＪＡｎｔｉｍｉｃｒｏｂＣｈｅｍｏｔｈｅｒ，Ｖｏｌ．４７，ｐ．７０９−７１０（２００１）ＧｏｔｔｅｌａｎｄＭ，ＢｒｕｎｓｅｒＯａｎｄＣｒｕｃｈｅｔＳ．，ＡｌｉｍｅｎｔＰｈａｒｍａｃｏｌＴｈｅｒ，Ｖｏｌ．２３，ｐ．１０７７−１０８６（２００６）ＧｕｔｅｌｌＲＲ，ＷｅｉｓｅｒＢ，ＷｏｅｓｅＣＲ，ＮｏｌｌｅｒＨＦ．，ＰｒｏｇｒｅｓｓｉｎＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅｒｃｈａｎｄＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３２，ｐ．１５５−２１６（１９８５）Ｌｅｂｌｏｎｄ−ＢｏｕｒｇｅｔＮ，ＰｈｉｌｉｐｐｅＨ，ＭａｎｇｉｎＩ，ＤｅｃａｒｉｓＢ．，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｒｎａｌｏｆｓｙｓｔｅｍａｔｉｃＢａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４６，ｐ．１０２−１１１（１９９６）ＲｏｙＤ，ＷａｒｄＰ，ＣｈａｍｐａｇｎｅＧ．，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２９，ｐ．１１−２９（１９９６）ＲｙｕＪＨ，ＢｅｕｃｈａｔＬＲ．，ＩｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌＪｏｕｒｎａｌｏｆＦｏｏｄＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．４３，ｐ．１８５−１９３（１９９８）

本発明は、ＬＧ２１株に特異的であり、他のラクトバチルス属の異なる菌株と交差反応を示さず、迅速かつ簡便にＬＧ２１株を検出し得るＰＣＲ用プライマー、及び該プライマーを用いた検出法を提供することを課題とする。

本発明者らは、上記課題を解決するため鋭意検討した結果、ＬＧ２１株に特異的な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドを含むＰＣＲ用プライマーを見出し、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明は、以下のとおりである。
１．配列番号１〜３のいずれか１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むラクトバチルス属ガッセリー（Ｌａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓｇａｓｓｅｒｉ）ＯＬＬ２７１６株（ＬＧ２１株）検出用プライマー。
２．配列番号１または２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの対からなる、ＬＧ２１株検出用プライマー。
３．前項１または２記載のプライマーを含むことを特徴とするＬＧ２１株検出用キット。
４．以下の工程を含むＬＧ２１株の検出方法。
（１）前項１または２記載のプライマーを用いて核酸断片を増幅する工程
（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程

本発明によりＬＧ２１株を簡便かつ迅速に、かつ同種のラクトバチルス属ガッセリー菌株と交差反応を示すことなく、検出することができる。

本発明のプライマーは、ＬＧ２１株に特異的な塩基配列を有する染色体ＤＮＡ領域をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション）により増幅し得るプライマーである。

本発明のプライマーとして、配列番号１〜３のいずれか１の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーを例示することができる。また、配列番号１または２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの対からなる、プライマーを例示することができる。

本発明の検出法において使用できるプライマーには、塩基長やＰＣＲ条件等に依存して配列番号１〜３の塩基配列と実質的に相同な塩基配列を有するオリゴヌクレオチドからなるプライマーも含まれる。ここで、「実質的に相同」とは、ＰＣＲ用プライマー等として機能し得る程度の断片長と相同性を有することを意味する。

例えば、本発明のプライマーは、使用目的や条件によっては、必ずしも配列番号１〜３の塩基配列と１００％の相同性を有している必要はなく、目的とする領域のプライマーの５´末端付近で数塩基が異なっていてもよい。そのようなプライマーを使用しても、アニーリング温度等を検討することによって目的ＤＮＡ断片を適宜増幅させることは可能である。

例えば、ＬＧ２１株の検出に際し、高い特異性が要求される場合には、完全に相同な配列部位（配列番号１〜３の塩基配列）を使用し且つそのような配列でしかアニーリングしないＰＣＲ条件を選択すればよく、その反面、比較的特異性の低い条件が許容される場合には、配列番号１〜３の塩基配列とは数塩基異なる配列を使用し且つそれでもアニーリングするようなＰＣＲ条件を選択することができる。

配列番号１〜３の塩基配列は、ＬＧ２１株に特異的な配列であることから、これらの一部の配列をＤＮＡプローブとしたＦＩＳＨ法やサザンハイブリダイゼーション、ドットハイブリダイゼーションなどを実施することも可能である。

尚、ＬＧ２１株とは、ラクトバチルス属ガッセリー菌株のうち、ラクトバチルス属ガッセリーＯＬＬ２７１６株（ＬＧ２１株、寄託番号ＦＥＲＭＢＰ−６９９９）を示す。

本発明のプライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法により、例えばＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。また、ＤＮＡ合成業者に合成を委託することによっても、本発明のプライマーを得ることができる。

本発明のプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することにより、ＬＧ２１株を検出することができる。すなわち、プライマーの配列に特異的なＰＣＲの反応が起こると、ＬＧ２１株の染色体ＤＮＡ内の、各プライマーの配列に相当する配列に挟まれた領域（標的領域）が増幅される。

したがって、本発明のプライマーを用いて増幅産物が得られれば、被検菌はＬＧ２１株であると同定されるか、又は、被検菌にＬＧ２１株が含まれていると判定される。また、ＰＣＲを定量的に行うことにより、ＬＧ２１株の存在量を測定することもできる。

また、増幅産物が得られる場合は、増幅産物の有無の決定には、増幅産物の長さの決定が含まれてもよい。例えば、配列番号１および配列番号３、または配列番号２および３の各組み合わせからなるオリゴヌクレオチドを含むＬＧ２１株検出用プライマーを用いた場合、被検菌にＬＧ２１株が含まれていれば、通常は各々３３０ｂｐ、１９３ｂｐの増幅産物が得られる。

尚、本発明において、ＬＧ２１株の検出とは、試料中にＬＧ２１株が存在するか否かを検出すること、及び、被検菌が単一種である場合には、同被検菌がＬＧ２１株であるか否かを同定すること、さらには、試料中のＬＧ２１株の存在量を測定することを含む。

被検菌は、ＬＧ２１株が存在し得る試料に含まれる細菌であれば特に制限されず、例えば、ヒトや家畜の組織由来の生検試料、または糞便、食品、若しくは土壌等の環境中に含まれる細菌が挙げられる。好ましくは、ＬＧ２１株又は同菌株以外の乳酸菌、特にラクトバチルス属ガッセリーである。被検菌は、分離された単一種であってもよく、複数の菌種を含む混合物であってもよい。

前記鋳型には、被検菌の染色体ＤＮＡを用いる。染色体ＤＮＡの調製は、ＰＣＲの鋳型となり得るこれらの核酸を取得することができるものであれば特に制限されず、通常、細菌の染色体ＤＮＡの抽出又は単離に用いられる方法を採用することできる。

前記核酸の抽出に用いる菌体は、例えば、前記生検試料、糞便、食品、又は土壌等から得た被検菌を、適当な培地、例えば３％グルコースを添加したＧＡＭ寒天培地で、二酸化炭素存在下で嫌気的に培養を行うことによって、取得することができる。また、必要に応じて、水、緩衝液、有機溶媒等によって培地から菌体を抽出してもよい。

得られた菌体をそのままＰＣＲに供してもよく、菌体から核酸を抽出してＰＣＲに用いてもよい。菌体から目的の核酸を抽出するには、例えば、日本バイオラッド社のインスタジーンマトリックス（ＩｎｓｔａＧｅｎｅＭａｔｒｉｘ）や、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐＤＮＡＳｔｏｏｌＭｉｎｉＫｉｔなどの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することができる。

また、Ｍｕｒｍｕｒの方法［ＪｏｕｒｎａｌｏｆＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．３，ｐ.２０８−２１８（１９６１）］やベンジルクロライド法［ＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄＲｅｓｅａｒｃｈ，Ｖｏｌ．２１，ｐ５２７９−５２８０（１９９３）］などにより細胞からＤＮＡを抽出し、さらにはリボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去することによっても、ＤＮＡを抽出することができる。

核酸の抽出に際しては、ＰＣＲ阻害物質を除去する物質、例えば牛血清アルブミン等を加えることが好ましい。ＤＮＡの抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、”ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ”，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ（１９８９）等にも記載されている。

本発明においては、ＰＣＲの反応は、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる通常のＰＣＲと同様にして行うことができる。典型的には、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を、変性、アニーリング及び伸長反応を各々適した温度に保温し、これを２０〜３５サイクル繰り返す。

ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲに用いることができるものであれば特に制限されず、例えば、市販のＫＯＤＤａｓｈ(タカラバイオ)、ＡｍｐｌｉＴａｑＧｏｌｄ（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、ＴａｋａｒａＴａｑ（タカラバイオ）、ＰｌａｔｉｎｕｍＴａｑＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）などのＴａｑＤＮＡポリメラーゼや、ＰｌａｔｉｎｕｍＰｆｘＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）やＰｙｒｏｂｅｓｔＤＮＡｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ）等のＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらの酵素と緩衝液からなるキットも使用することができる。

ＰＣＲの反応条件は、使用する酵素や装置等に応じて、適宜設定すればよい。具体的には例えば、９４℃ ４分間加温後、変性９４℃ ２０秒、アニーリング６０℃ １０秒、及び伸長反応７２℃ ３０秒からなる反応を３０サイクル繰返し、最後に７２℃で１０分間加熱する条件が挙げられる。鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、０．１μｇのゲノムＤＮＡ量に対し、プライマー０．５μＭ程度が好ましい。

また、本発明においては更に感度の高い、かつ特異性の高い増幅を行うために上述の第１のＰＣＲの反応後、第２のＰＣＲを行ってもよい。このような方法はネスティッドＰＣＲ法（「入れ子ＰＣＲ法」とも呼ばれる）と呼ばれる。ネスティッドＰＣＲ法は、増幅対象配列特異的な第１のプライマーセットを用いて１回目のＰＣＲを行い、次に第１のプライマーセットによって増幅されるＤＮＡ断片を増幅し得る１対のプライマーであって第１のプライマーセットと共通のプライマーを含まない第２のプライマーセットを用いて、第１のプライマーセットを用いたＰＣＲ産物を鋳型として２回目のＰＣＲを行う方法である。

ネスティッドＰＣＲ法によって、１回目のＰＣＲにおいて目的とするＤＮＡ断片以外が増幅されることがあったとしても、２回目のＰＣＲにおいて再びその目的とするＤＮＡ断片でないＤＮＡ断片が増幅される可能性が極めて低いため、増幅すべきＤＮＡ配列に非常に特性の高い増幅を行うことができる。例えば、配列番号１および配列番号３からなるオリゴヌクレオチドを含むＬＧ２１株検出用プライマーセットＰＣＲを行えば、１９３ｂｐのバンドの出現により、より高い特異性でＬＧ２１株を検出することができる。

ＰＣＲにより得られる増幅産物の有無又はその量もしくはその大きさは、通常の核酸の検出又は定量法によって、決定するができる。例えば、アガロース電気泳動やキャピラリ電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、蛍光強度によって増幅産物の量を、分子量マーカーとの比較によって分子量を決定することができる。また、予め蛍光染色液を含むアガロースゲルを用いて電気泳動を行うと、電気泳動終了後に染色作業を行うことなく、増幅産物を検出することができる。さらにはＰＣＲ産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによっても、増幅産物の有無又は量を確認することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、経時的に増幅反応を検出することができる。

本発明のプライマーは、それのみで、又は、他の要素と併せて、ＬＧ２１株検出用のキットとすることができる。前記の他の要素としては、核酸の抽出、ＰＣＲ、及び増幅産物の検出に必要な試薬類の任意の１種又は２種以上が挙げられる。また、前記キットは、陽性コントロールとして、ＬＧ２１株の染色体ＤＮＡの配列の一部を有し、本発明のプライマーにより増幅され得るＤＮＡ断片、および／または、陰性コントロールとして、本発明のプライマーに対応するが、１塩基又は数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでいてもよい。

本発明のプライマーは、前記したように、ＬＧ２１株の検出に用いることができる。また、本発明のプライマーを用いることにより、ＬＧ２１株菌体又は同菌体を含む飲食品等を工業的に製造するに際し、菌数の測定や発酵状態の管理を容易に行うことができる。

以下、実施例を挙げて本発明を更に詳細に説明するが、本発明はこれに限定されない。

＜方法＞
１．被検者
ヘリコバクター・ピロリに感染していない５８歳の日本人男性（被験者Ａ）と同様に感染者である５４歳の日本人男性を被験者（被験者Ｂ）とした。両者はともにヘリコバクター・ピロリの根絶治療およびプロトンポンプ・インヒビターを使用した治療を受けたことはなかった。両被験者は、ＬＧ株を投与する２週間前に、上部消化管内視鏡検査および生検（胃前庭部および胃体）を受けた。ヘリコバクター・ピロリは［^１３Ｃ］−ウレア呼気検査（大塚製薬）により確認し（陽性は２．５％またはそれ以上）、ヘマトキシリン−エオシン染色を使用して組織学的検査をした。

被験者ＡおよびＢの［^１３Ｃ］−ウレア呼気検査の結果は、それぞれ０．４％および２１．６％であった。上部消化管内視鏡検査の結果、両被験者とも内視鏡的病変は検出されなかった。しかし、ＵｐｄａｔｅｄＳｙｄｎｅｙｓｙｓｔｅｍ（Ｄｉｘｏｎｅｔａｌ，１９９６）による解析の結果、被験者Ｂは胃体にグレード２の慢性活動性胃炎を有していた。被験者Ｂのヘリコバクター・ピロリ密度はグレード２であった。一方、被験者Ａの組織像は正常であり、ヘリコバクター・ピロリは、胃前庭部および胃体の両方において検出されなかった。

２．ＬＧ２１の投与
一晩の断食の後、被験者ＡおよびＢは各々ＬＧ２１含有（８．４―１２×１０^９ＣＦＵ／１２０ｍｌ）ヨーグルトドリンク［ＬＧ２１ヨーグルト（登録商標）；明治乳業］を１２０ｍｌ摂取した。ＬＧ２１ヨーグルトドリンクを摂取した１時間後に、内視鏡生検を受けた。生検試料は両被験者の胃前庭部および胃体の両方から採取した。その際、内視鏡的な粘膜病変は観察されなかった。

３．顕微解剖
胃前庭部および胃体由来の生検試料を滅菌水中で洗浄後、１０％ホルマリンで固定した後に、パラフィンに包埋した。洗浄した試料を１２μｍの薄さにスライスし、顕微解剖のためにトルイジンブルーで染色した。脱パラフィン後、ＰＡＬＭ−ＭＢ−ＩＩＩ（Ｐ．Ａ．Ｌ．Ｍ）を使用してＬＡＭＣ法により粘液層を解剖した。摘出した組織断片由来のＬＧ２１株およびヘリコバクター・ピロリのＤＮＡは、Ｉｎｓｔａｇｅｎｅ−ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用して、製造元のプロトコールにしたがって以下の方法で抽出した。

２００μｌの滅菌水を摘出した試料を入れた遠心チューブに添加し、チューブを穏やかに振とうした。室温にて１２０００×ｇで遠心後、ペレットに１００μｌのＩｎｓｔａｇｅｎｅ−ｍａｔｒｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を添加して混合し、５６℃にて２５分間振とうしながらインキュベートした。その後、製造元のプロトコール（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）にしたがい、Ｉｎｓｔａｇｅｎ−ｍａｔｒｉｘを使用してＤＮＡを抽出した。

４．ＰＣＲによる増幅およびヌクレオチド配列
（１）試料の前処理
ＰＣＲに供する菌体懸濁を以下の手順で調製した。１ｍｌ程度の培養液を１．５ｍｌの微量遠心管に移し、室温にて７０００ｒｐｍで５分間遠心し、上清をデカントして除いた。その後の手順は方法１または２により行った。

（２）方法１
５００μｌのＴＥ緩衝液を各チューブに入れ、Ｖｏｒｔｅｘで軽く攪拌し、７０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をマイクロピペットで完全に除き、１００μｌのＴＥ緩衝液に菌体をマイクロピペットで懸濁し、凍結した（凍結／融解過程での菌体の破壊を目的としているので直後にＰＣＲを行う場合も、一度凍結した）。

（３）方法２
５００μｌのＰＢＥ緩衝液［０．３ｍｏｌ／ｌラフィノース、２０ｍｍｏｌ／ｌＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ７．０）、１ｍｍｏｌ／ｌＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）］を各チューブに入れ、Ｖｏｒｔｅｘで軽く攪拌し、室温にて７０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をマイクロピペットで完全に除き、１２０μｌのＰＢＥ緩衝液に菌体をマイクロピペットで懸濁した。２４μｌのリゾチーム溶液（１２．５ｍｇ／ｍｌ）と６μｌのムタノリシン溶液（４ｍｇ／ｍｌ）を加え、３７℃にてで２０分間消化した。その後、５００μｌのＰＢＥ緩衝液を各チューブに入れ、Ｖｏｒｔｅｘで軽く攪拌し、室温にて７０００ｒｐｍで５分間遠心した。上清をデカントして除き、数秒遠心して壁面の液を落としてからマイクロピペットで完全に除き、１００μｌのＴＥ緩衝液に菌体をマイクロピペットで懸濁し、凍結保存した。

５．ＬＧ２１株特異的ＰＣＲ用プライマー
ＬＧ２１株についてはゲノム塩基配列のほとんどが判明しており、他のラクトバチルス属ガッセリーの菌株系統に較べて非常に多くのＩＳ(挿入塩基配列)を持つことが判明している。そこで、図１に示すＩＳの端部と近傍のラクトバチルス属ガッセリーの塩基配列に基づいて、以下に示すプライマー［ＣＴＧ１Ａ（配列番号１）、ＣＴＧ１Ｂ（配列番号２）、ＩＳ３０ＨＲ（配列番号３）］を作製し、約２０系統のラクトバチルス属ガッセリー菌株について調べた結果、ＩＳ３０ＨＲ−ＣＴＧ１Ａの３３０ｂｐのＰＣＲ断片がＬＧ２１株でのみで観察されることを確認した。また、ＩＳ３０ＨＲ−ＣＴＧ１Ｂのｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行えば、１９３ｂｐのバンドの出現で、より高い特異性でＬＧ２１株を検出することができる。

６．ＰＣＲの条件
ＫＯＤＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼ（東洋紡）を使用して行った。一般に用いられるＴａｑＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲについては検討していないが通常の反応条件で支障ないと考えられる。ＫＯＤＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼを使用したＰＣＲでは時として副産物のバンドが多数出現することがあるが、増幅力が強く、反応時間も短縮できるのでＫＯＤＤａｓｈＤＮＡポリメラーゼを使用して実験することが推奨される。

ＰＣＲは、表２に示す組成の反応液を０．２ｍｌのＰＣＲチューブに入れ、９４℃にて４分間熱変性後、９４℃ ２０秒、６０℃ １０秒および７２℃ ３０秒を３０サイクル行った。反応終了後、全量を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＬＧ２１株特異的なＰＣＲ断片（３３０ｂｐ）の増幅の有無を確認した。

また検出感度を高めたい場合は二段目のｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄＰＣＲを行った。表３に示す組成の反応液を０．２ｍｌのＰＣＲチューブに入れ、９４℃にて４分間熱変性後、９４℃ ２０秒、６０℃ １０秒および７２℃ ３０秒を２０サイクル行った。反応終了後、全量を８％ポリアクリルアミドゲル電気泳動にかけ、ＬＧ２１株特異的なＰＣＲ断片（１９３ｂｐ）の増幅の有無を確認した。

＜結果＞
本発明のＬＧ２１株検出用プライマーを用いたｓｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄＰＣＲ法により、ヨーグルトドリンクにより投与されたＬＧ２１株がヒトの胃粘液層において検出できるか否かを解析した。

レーザーを使用した顕微解剖の後、各生検試料由来の一つの組織断片を用いた。粘液層における切断標本の平均領域は、約２００μｍ^２であった。顕微鏡写真法に用いる場合、パラフィン包埋ブロックは、通常５−７μｍに切断するが、本実施例においては各組織由来のＬＧ２１株およびヘリコバクター・ピロリのゲノムＤＮＡを得るために１２μｍの薄さに生検試料を切断し、ＬＡＭＣ法により解剖試料における粘液層のみを得た。被験者Ａの胃前庭部、ならびに被験者Ｂの胃前庭部および胃体からＬＧ２１株特異的な領域のＤＮＡを増幅した結果を図２に示す。

図２のレーン１〜５および６〜１０は、それぞれＬＧ２１株およびヘリコバクター・ピロリについてＰＣＲを行った結果を示す。レーン２および６は、ヘリコバクター・ピロリの感染がない被験者Ａの胃体、レーン３および７は被験者Ａの胃前庭部の結果である。レーン４および８は、ヘリコバクター・ピロリに感染した被験者Ｂの胃体、レーン５および９は被験者Ｂの胃前庭部の結果である。レーン１（１９３ｂｐ）および１０（２０４ｂｐ）は、それぞれＬＧ２１株およびヘリコバクター・ピロリ陽性のコントロールであり、レーンＭは分子サイズマーカーを示す。

ＰＣＲの結果、図２に示したように、被験者ＡおよびＢの胃前庭部（レーン３および５）並びに被験者Ｂの胃体（レーン４）において、コントロール（レーン１）のＰＣＲ産物と同様の位置である１９３ｂｐのＬＧ２１株特異的なＰＣＲ産物が検出された。この結果から、本発明のプライマーによれば、ＬＧ２１株を特異的に検出し得ることがわかった。

ＬＧ２１株の生存については解析しなかったが、ＬＧ２１株を成人の胃液に２時間曝したとしても、ほとんどの生菌数は変化しない。胃粘膜においては、その高度の酸性環境によって胃の中に摂取されたほとんどのバクテリアが殺されると考えられている。したがって、粘液層におけるＬＧ２１株特異的なＰＣＲ産物は、生菌の存在を示している可能性が高い。

ＬＧ２１株のゲノム塩基配列の一部（ｃｏｎｔｉｇ．１）を示す。ＬＧ２１株の特異的検出のためのプライマー（ＣＴＧ１Ａ、ＣＴＧ１Ｂ、ＩＳ３０ＨＲ）がハイブリダイズする部位を下線で示す。太字の部分はＩＳを示す(１００８塩基を省略した)。摘出した組織試料におけるＬＧ２１株特異的遺伝子およびＵｒｅＡ遺伝子をＳｅｍｉ−ｎｅｓｔｅｄＰＣＲで検出した結果を示す。

Claims

配列番号１または２の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドと、配列番号３の塩基配列からなるオリゴヌクレオチドの対からなる、ＬＧ２１株検出用プライマー。
請求項１記載のプライマーを含むことを特徴とするＬＧ２１株検出用キット。
以下の工程を含むＬＧ２１株の検出方法。
（１）請求項１記載のプライマーを用いて核酸断片を増幅する工程
（２）工程（１）で得られた核酸断片を検出する工程