JP4528773B2 - ビフィドバクテリウムインファンティスの検出法 - Google Patents
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Description
本発明は、ビフィドバクテリウム インファンティス（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｉｎｆａｎｔｉｓ）の検出に関する技術に関し、特に、ビフィドバクテリウム インファンティスをＰＣＲにより検出するためのプライマー、並びに、同プライマーを用いてビフィドバクテリウム インファンティスを検出する方法及びキットに関する。本発明は、微生物工業等の分野において有用である。
母乳を哺乳している乳児では、ビフィズス菌（Ｂｉｆｉｄｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属細菌）が腸内細菌の８０〜９０％存在し、最優勢となっている。ビフィズス菌は、乳児の腸管機能の維持や腸管において外来から進入する有害細菌や、通常は問題がないが体調の異変により腸管に存在する有害な常在細菌が増殖して感染症を起こす日和見菌からの感染を防いでいることが知られている。乳児栄養の領域においては、育児用粉乳に乳児型ビフィズス菌を添加したり、あるいは製剤化したビフィズス菌を投与することにより感染症を防いだり、アレルギー疾患の治療を促進させることが考案されている。このような用途においては、生理的観点から、ヒト由来のビフィズス菌をヒトに与えることが好ましく、ヒト型のビフィズス菌を用いることが望まれている。乳児の糞便に認められるビフィズス菌としては、ビフィドバクテリウム インファンティス、ビフィドバクテリウム ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）などが知られているが、ビフィドバクテリウム インファンティスは乳児特有に検出されるビフィズス菌である。
上記のようなビフィズス菌の利用の有効性を評価するためには、例えば、糞便中のビフィズス菌の存在量を算出し、さらに各々のビフィズス菌の菌種を測定することによって臨床的な効果を判定することが必要である。したがって、ビフィドバクテリウム インファンティスを確実に検出する技術が求められている。
従来、糞便中や環境中のビフィズス菌は、検体を嫌気培養してコロニーを分離した後、グラム染色や検鏡による菌型の観察などの形態学検査、あるいは、フルクトース６−リン酸ホスホケトラーゼ活性、酸素耐性、糖発酵性などの生化学検査により、同定が行われて来た。前記の検体の培養は、菌数測定や菌種の同定に通常用いられる標準的な方法で行われるが、必ずしも全ての糞便中のビフィズス菌を培養できるわけではなく、また嫌気装置を用いて培養を行う必要があり、培養時間が数日から１週間程度必要であるなど、手間がかかり複雑である。また、検体に含まれるビフィズス菌を嫌気的かつ低温で保存し、生菌のまま分析に供しなければならず、さらに、分析を行う者の習熟度が要求されること等、多くの問題があった。
一方、近年、ビフィズス菌の同定にはＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験や、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の塩基配列解析により基準株との類似性を測定することが行われるようになってきた。ＤＮＡ−ＤＮＡ相同性試験は、分離された被検対象の菌を培養し、その染色体ＤＮＡを調製して基準株との相同性をハイブリダイゼーションにより比較するものである（非特許文献１）。この方法は、試験に必要な染色体ＤＮＡを調製するためには、培養可能な菌であることが絶対的な条件であり、また、培養が可能であっても、染色体ＤＮＡを多量に調製する必要があることから、手間がかかる。また、この方法は、遺伝子学的な距離が離れた菌種間を検討するのに好適ではあるが、近縁種の判定には鋭敏でないなどの本質的な問題がある。
１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子は、原核生物に普遍的に存在し、属間に共通な塩基配列や菌種間に共通な配列があるため、菌種の同定に使用することができる。この方法は、被検菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を決定した後、これと近縁の菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの塩基配列を整列させ（アラインメント）、塩基配列の違いを解析することによって行われる。しかし、この方法では、比較対象として、土壌、汚泥、糞便や食品などに存在する菌の１６Ｓ ｒＲＮＡの配列を決定し、多数配列間での系統的な解析を行う必要であり、多大な労力と時間を要する（非特許文献２）。
また、被検菌が、既に１６Ｓ ｒＲＮＡの特異的配列が知られている比較対象の菌と同一種であるか否かは、その配列を検出するためのプローブを用いて決定することができる。このような技術を応用した例として、ビフィドバクテリウム インファンティスの１６Ｓ ｒＲＮＡを標的として検出するオリゴヌクレオチドおよびその誘導体をプローブとする検出方法が開示されている（特許文献１）。しかし、この方法は、実施に長時間を要するという問題がある。一方、１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子を検出し得るＰＣＲプライマーを用いてビフィズス菌を解析する技術が知られている（特許文献２及び非特許文献３）。しかし、これらの文献に開示されているビフィドバクテリウム インファンティスに特異的なプライマーは、ビフィドバクテリウム ブレーベを誤って検出するという問題点がある。
特開平６−１９７７６３号公報 特開平１１−１２３０９３号公報 Ｂｅｒｇｅｙ’ｓ Ｍａｎｕａｌ ｏｆ Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２ ｐ１４１８−１４３４（１９８６） Ｐｒｏｇｒｅｓｓ ｉｎ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅｒｃｈ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３２ ｐ１５５−２１６（１９８５） Ｓｙｓｔｅｍａｔｉｃ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．２５ ｐ．５３６（２００２）
本発明は、ビフィドバクテリウム インファンティスに特異的であり、他のビフィズス菌と交差反応を示さず、迅速かつ簡便にビフィドバクテリウム インファンティスを検出し得る１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子増幅用のＰＣＲプライマー、及びそれを用いた検出法を提供することを課題とする。
本発明者らは、前記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ビフィドバクテリウム インファンティスを特異的に検出することのできるＰＣＲプライマーを見出し、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明は、以下のとおりである。
（１）配列番号５〜２８から選ばれる塩基配列からなる第１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２、３２又は３３の塩基配列からなる第２のオリゴヌクレオチドの対からなる、ビフィドバクテリウム インファンティスを検出するためのＰＣＲプライマー。
（２）前記ＰＣＲプライマーを含む、ビフィドバクテリウム インファンティス検出用のキット。
（３）前記ＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡ又は１６Ｓ ｒＲＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することを含む、ビフィドバクテリウム インファンティスを検出する方法。
（１）配列番号５〜２８から選ばれる塩基配列からなる第１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２、３２又は３３の塩基配列からなる第２のオリゴヌクレオチドの対からなる、ビフィドバクテリウム インファンティスを検出するためのＰＣＲプライマー。
（２）前記ＰＣＲプライマーを含む、ビフィドバクテリウム インファンティス検出用のキット。
（３）前記ＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡ又は１６Ｓ ｒＲＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することを含む、ビフィドバクテリウム インファンティスを検出する方法。
［図１］本発明のＰＣＲプライマーの関係を示す図。Ａはフォワードプライマー、Ｂはリバースプライマーを示す。
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明のＰＣＲプライマーは、ビフィドバクテリウム インファンティスの１６Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９））により増幅し得る２種のオリゴヌクレオチドの対からなる。前記オリゴヌクレオチドのうち一方は、配列番号１の塩基配列から選ばれる連続する２０〜２５塩基、好ましくは２０塩基の塩基配列からなる第１のオリゴヌクレオチドであり、他方は配列番号２の塩基配列又は同塩基配列の５’末端側が０〜７塩基、好ましくは５塩基欠失した塩基配列からなる第２のオリゴヌクレオチドである。
前記第１のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号５〜２８から選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、前記第２のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号２、３２又は３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明のプライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法により、例えばＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。また、ＤＮＡ合成業者に合成を委託することによっても、本発明のプライマーを得ることができる。
本発明のＰＣＲプライマーは、ビフィドバクテリウム インファンティスの１６Ｓ ｒＲＮＡ又は１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子をＰＣＲ（ポリメラーゼ・チェイン・リアクション、Ｗｈｉｔｅ，Ｔ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，Ｔｒｅｎｄｓ Ｇｅｎｅｔ．，５，１８５（１９８９））により増幅し得る２種のオリゴヌクレオチドの対からなる。前記オリゴヌクレオチドのうち一方は、配列番号１の塩基配列から選ばれる連続する２０〜２５塩基、好ましくは２０塩基の塩基配列からなる第１のオリゴヌクレオチドであり、他方は配列番号２の塩基配列又は同塩基配列の５’末端側が０〜７塩基、好ましくは５塩基欠失した塩基配列からなる第２のオリゴヌクレオチドである。
前記第１のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号５〜２８から選ばれる塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。また、前記第２のオリゴヌクレオチドとしては、配列番号２、３２又は３３の塩基配列を有するオリゴヌクレオチドが挙げられる。
本発明のプライマーは、当業者によく知られた通常のＤＮＡの合成法により、例えばＤＮＡ合成機を用いて合成することができる。また、ＤＮＡ合成業者に合成を委託することによっても、本発明のプライマーを得ることができる。
本発明のＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡ又は１６Ｓ ｒＲＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することにより、ビフィドバクテリウム インファンティスを検出することかできる。すなわち、プライマーの配列に特異的なＰＣＲ反応が起こると、ビフィドバクテリウム インファンティスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子内の、各プライマーの配列に相当する配列に挟まれた領域（標的領域）が増幅される。したがって、本発明のＰＣＲプライマーを用いて増幅産物が得られれば、被検菌はビフィドバクテリウム インファンティスであると同定されるか、又は、被検菌にビフィドバクテリウム インファンティスが含まれていると判定される。また、ＰＣＲを定量的に行うことにより、ビフィドバクテリウム インファンティスの存在量を測定することもできる。尚、本発明において、ビフィドバクテリウム インファンティスの検出とは、試料中にビフィドバクテリウム インファンティスが存在するか否かを検出すること、及び、被検菌が単一種である場合には、同被検菌がビフィドバクテリウム インファンティスであるか否かを同定すること、さらには、試料中のビフィドバクテリウム インファンティスの存在量を測定することを含む。
被検菌は、ビフィドバクテリウム インファンティスが存在し得る試料に含まれる細菌であれば特に制限されず、例えば、糞便、食品、又は土壌等の環境中に含まれる細菌が挙げられる。好ましくは、ビフィドバクテリウム インファンティス又は同細菌以外のビフィズス菌である。被検菌は、分離された単一種であってもよく、複数の菌種を含む混合物であってもよい。
前記鋳型には、被検菌の染色体ＤＮＡ又は１６Ｓ ｒＲＮＡを用いる。染色体ＤＮＡ又は又は１６Ｓ ｒＲＮＡの調製は、ＰＣＲの鋳型となり得るこれらの核酸を取得することができるものであれば特に制限されず、通常、細菌の染色体ＤＮＡ又はＲＮＡの抽出又は単離に用いられる方法を採用することできる。
前記核酸の抽出に用いる菌体は、例えば、前記糞便、食品、又は土壌等から得た被検菌を、適当な培地、例えば３％グルコースを添加したＧＡＭ寒天培地で、二酸化炭素存在下で嫌気的に培養を行うことによって、取得することができる。また、必要に応じて、水、緩衝液、有機溶媒等によって培地から菌体を抽出してもよい。
得られた菌体から目的の核酸を抽出するには、例えば、日本バイオラッド社のインスタジーンマトリックス（ＩｎｓｔａＧｅｎｅ Ｍａｔｒｉｘ）や、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡａｍｐ ＤＮＡ Ｓｔｏｏｌ Ｍｉｎｉ Ｋｉｔなどの市販のＤＮＡ抽出キットを使用することができる。また、Ｍｕｒｍｕｒの方法（Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３ ｐ２０８−２１８（１９６１））やベンジルクロライド法（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｖｏｌ．２１ ｐ５２７９−５２８０（１９９３））などにより細胞からＤＮＡを抽出し、さらにはリボヌクレアーゼによりＲＮＡを除去することによっても、ＤＮＡを抽出することができる。核酸の抽出に際しては、ＰＣＲ阻害物質を除去する物質、例えば牛血清アルブミン等を加えることが好ましい。また、ＲＮＡは、フェノール法又はチオシアン酸グアニジン法等によって、抽出することができる。ＤＮＡ及びＲＮＡの抽出法は、Ｓａｍｂｒｏｏｋら、″Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ″，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等にも記載されている。
本発明においては、ＰＣＲ反応は、２種類のオリゴヌクレオチドプライマーを用いる通常のＰＣＲと同様にして行うことができる。典型的には、鋳型ＤＮＡ、プライマー、及びＤＮＡポリメラーゼを含む反応液を、変性、アニーリング及び伸長反応を各々適した温度に保温し、これを２０〜３５サイクル繰り返す。尚、鋳型として１６Ｓ ｒＲＮＡを用いる場合は、逆転写反応と組み合わせたＲＴ−ＰＣＲにより、標的領域を増幅することができる。
ＰＣＲに用いるＤＮＡポリメラーゼは、ＰＣＲ反応に用いることができるものであれば特に制限されず、例えば、市販のＡｍｐｌｉＴａｑ Ｇｏｌｄ（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）、Ｔａｋａｒａ Ｔａｑ（タカラバイオ社）、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｔａｑ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）などのＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼや、Ｐｌａｔｉｎｕｍ Ｐｆｘ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（インビトロジェン社）やＰｙｒｏｂｅｓｔ ＤＮＡ ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅ（タカラバイオ社）等のＤＮＡポリメラーゼ、又はこれらの酵素と緩衝液からなるキットも使用することができる。
ＰＣＲ反応の条件は、使用する酵素等に応じて、適宜設定すればよい。具体的には例えば、９４℃ １０分間加温後、変性９４℃ ３０秒、アニーリング５５〜６５℃ ３０秒、及び伸長反応７２℃ ３０秒からなる反応を３０サイクル繰返し、最後に７２℃で１０分間加熱する条件が挙げられる。アニーリング温度は、一対のプライマーの内、Ｔｍ値が低いプライマーに設定するのが好ましく、ｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ（最近接塩基対）法によるＴｍ値が６０℃程度の場合には５５℃程度、Ｔｍ値が６５℃程度の場合には６０℃程度、Ｔｍ値が７０〜７５℃程度の場合には６５℃程度が好ましい。鋳型ＤＮＡとプライマーの量比は、１０２〜１０８コピーの染色体ＤＮＡに対し、プライマー０．２〜２μｍｏｌ程度が好ましい。
ＰＣＲ反応により得られる増幅産物の有無又はその量は、通常の核酸の検出又は定量法によって、決定するができる。例えば、アガロース電気泳動やキャピラリ電気泳動によって電気泳動した後、エチジウムブロマイドやＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩで染色することによって、増幅産物を検出することができる。また、蛍光強度によって増幅産物の量を、分子量マーカーとの比較によって分子量を決定することができる。また、予め蛍光染色液を含むアガロースゲルを用いて電気泳動を行うと、電気泳動終了後に染色作業を行うことなく、増幅産物を検出することができる。さらにはＰＣＲ産物をサイクルシーケンスした後、ＤＮＡシーケンサーを用いて塩基配列と長さを測定することによっても、増幅産物の有無又は量を確認することができる。また、リアルタイムＰＣＲ法によれば、経時的に増幅反応を検出することができる。
本発明のＰＣＲプライマーは、それのみで、又は、他の要素と併せて、ビフィドバクテリウム インファンティス検出用のキットとすることができる。前記の他の要素としては、核酸の抽出、ＰＣＲ反応、及び増幅産物の検出に必要な試薬類の任意の１種又は２種以上が挙げられる。また、前記キットは、陽性コントロールとして、ビフィドバクテリウム インファンティスの１６Ｓ ｒＲＮＡ遺伝子の配列の一部を有し、本発明のＰＣＲプライマーにより増幅され得るＤＮＡ断片、及び／又は、陰性コントロールとして、本発明のＰＣＲプライマーに対応するが、１塩基又は数塩基のミスマッチを有する塩基配列を有するＤＮＡ断片を含んでいてもよい。
本発明のＰＣＲプライマーは、前記したように、ビフィドバクテリウム インファンティスの検出に用いることができる。また、本発明のＰＣＲプライマーを用いることにより、ビフィドバクテリウム インファンティス菌体を工業的に製造するに際し、菌数の測定や発酵状態の管理を容易に行うことができる。
以下に、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明の範囲はこれらの実施例により限定されない。
＜１＞プライマーの合成
配列番号２〜３５に示すオリゴヌクレオチド（各々順にプライマー２〜３５という）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の３４００ ＤＮＡ合成機を用いてフォスフォアミダイト法によって合成した。
配列番号２〜３５に示すオリゴヌクレオチド（各々順にプライマー２〜３５という）を、Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社の３４００ ＤＮＡ合成機を用いてフォスフォアミダイト法によって合成した。
プライマー２、５〜２８、３２、３３（配列番号２、５〜２８、３２、３３）は、本発明のプライマーである（図１）。便宜的に、プライマー５〜２８をフォワードプライマー、プライマー２、３２及び３３をリバースプライマーと呼ぶ。
プライマー３（配列番号３）は、特開平６−１９７７６３号に記載されたビフィドバクテリウム インファンティスの１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用のＲＮＡプローブの塩基配列をＤＮＡ配列に置き換え、ＰＣＲ用プライマーとしたものである。
プライマー３４（配列番号３４）及びプライマー３５（配列番号３５）は、特開平１１−１２３０９３号に、ＢｉＬＯＮｇ及びＢｉＩＮＦとして記載されたビフィドバクテリウム インファンティスの特異検出プライマーである。
プライマー３（配列番号３）は、特開平６−１９７７６３号に記載されたビフィドバクテリウム インファンティスの１６Ｓ ｒＲＮＡ検出用のＲＮＡプローブの塩基配列をＤＮＡ配列に置き換え、ＰＣＲ用プライマーとしたものである。
プライマー３４（配列番号３４）及びプライマー３５（配列番号３５）は、特開平１１−１２３０９３号に、ＢｉＬＯＮｇ及びＢｉＩＮＦとして記載されたビフィドバクテリウム インファンティスの特異検出プライマーである。
＜２＞被検菌の染色体ＤＮＡの調製
ＧＡＭ寒天培地（市販品（日水製薬）に３％（Ｗ／Ｗ）グルコースを添加した。）上で生育させたビフィズス菌のコロニーを白金耳を用いて採取し、１．０ｍｌの滅菌水を入れたチューブに分散させた。これを１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。得られた菌体沈殿物に、２００μｌのインスタジーンマトリックス（日本バイオラッド社）を加え、５６℃で１５〜３０分間加熱した。１０秒間ボルテックスミキサーで混合した後、沸騰水中で８分間加熱した。再度１０秒間ボルテックスミキサーで混合した後、１０，０００〜１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を得た。この上清液の２６０ｎｍの波長における吸光度を分光光度計で測定し、ＤＮＡ濃度を測定後、滅菌水で希釈して、１０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液とした。
ＧＡＭ寒天培地（市販品（日水製薬）に３％（Ｗ／Ｗ）グルコースを添加した。）上で生育させたビフィズス菌のコロニーを白金耳を用いて採取し、１．０ｍｌの滅菌水を入れたチューブに分散させた。これを１２，０００ｒｐｍで１分間遠心分離し、上清を除去した。得られた菌体沈殿物に、２００μｌのインスタジーンマトリックス（日本バイオラッド社）を加え、５６℃で１５〜３０分間加熱した。１０秒間ボルテックスミキサーで混合した後、沸騰水中で８分間加熱した。再度１０秒間ボルテックスミキサーで混合した後、１０，０００〜１２，０００ｒｐｍで２分間遠心分離し、上清を得た。この上清液の２６０ｎｍの波長における吸光度を分光光度計で測定し、ＤＮＡ濃度を測定後、滅菌水で希釈して、１０ｎｇ／μｌのＤＮＡ溶液とした。
前記ビフィズス菌は、以下のとおりである。
ビフィドバクテリウム インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＡＴＣＣ１５６９７株
ビフィドバクテリウム ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）ＡＴＣＣ１５７００株
ビフィドバクテリウム ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ＪＣＭ１２５５株
ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＪＣＭ１２１７株
ビフィドバクテリウム シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＪＣＭ１２００株
ビフィドバクテリウム アドレスセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＪＣＭ１２７５株
ビフィドバクテリウム デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＪＣＭ１１９５株
ビフィドバクテリウム ガリカム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＪＣＭ８２２４株
ビフィドバクテリウム アングラータム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）ＪＣＭ７０９６株
ビフィドバクテリウム ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）ＪＣＭ７０２０株
ビフィドバクテリウム インファンティス（Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ）ＡＴＣＣ１５６９７株
ビフィドバクテリウム ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）ＡＴＣＣ１５７００株
ビフィドバクテリウム ビフィダム（Ｂ．ｂｉｆｉｄｕｍ）ＪＣＭ１２５５株
ビフィドバクテリウム ロンガム（Ｂ．ｌｏｎｇｕｍ）ＪＣＭ１２１７株
ビフィドバクテリウム シュードカテヌラータム（Ｂ．ｐｓｅｕｄｏｃａｔｅｎｕｌａｔｕｍ）ＪＣＭ１２００株
ビフィドバクテリウム アドレスセンティス（Ｂ．ａｄｏｌｅｓｃｅｎｔｉｓ）ＪＣＭ１２７５株
ビフィドバクテリウム デンティウム（Ｂ．ｄｅｎｔｉｕｍ）ＪＣＭ１１９５株
ビフィドバクテリウム ガリカム（Ｂ．ｇａｌｌｉｃｕｍ）ＪＣＭ８２２４株
ビフィドバクテリウム アングラータム（Ｂ．ａｎｇｕｌａｔｕｍ）ＪＣＭ７０９６株
ビフィドバクテリウム ブレーベ（Ｂ．ｂｒｅｖｅ）ＪＣＭ７０２０株
［実施例１］
（１）ＰＣＲ反応
下記組成のＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＲ（宝酒造社）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃ １０分間加温後、変性９４℃ ３０秒、アニーリング６５℃ ３０秒、及び伸長反応７２℃ ３０秒の条件で３０サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱。尚、比較例１及び２のアニーリングは５５℃ ３０秒で行った。
（１）ＰＣＲ反応
下記組成のＰＣＲ反応液を調製し、ＰＣＲサーマルサイクラーＭＲ（宝酒造社）を用いて、以下の条件でＰＣＲを行った。９４℃ １０分間加温後、変性９４℃ ３０秒、アニーリング６５℃ ３０秒、及び伸長反応７２℃ ３０秒の条件で３０サイクル、最後に７２℃で１０分間加熱。尚、比較例１及び２のアニーリングは５５℃ ３０秒で行った。
フォワードプライマー及びリバースプライマーの組み合わせは、以下のとおりであった。
（２）ＰＣＲ反応産物の検出
ＰＣＲ反応液１μｌに４μｌの色素液を加え、０．５×ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒを用いて作製した２％（ｗ／ｗ）のＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ社）ゲルで電気泳動を行った。０．５×ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒで２０，０００倍に希釈したＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ社）染色液でゲルを染色後、デンシトグラムＡＥ−６９２０Ｖ−ＦＸ（アトー社）を用いて３００ｎｍの波長で蛍光を観察した。増幅産物は、ＤＮＡマーカーを指標として検出した。その結果を、表２及び表３に示す。表中、「＋」は増幅産物が検出されたことを、「−」は増幅産物が検出されなかったことを示す。
ＰＣＲ反応液１μｌに４μｌの色素液を加え、０．５×ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒを用いて作製した２％（ｗ／ｗ）のＮｕＳｉｅｖｅ３：１アガロース（Ｃａｍｂｒｅｘ社）ゲルで電気泳動を行った。０．５×ＴＢＥ ｂｕｆｆｅｒで２０，０００倍に希釈したＳＹＢＲＧｒｅｅｎＩ（Ｃａｍｂｒｅｘ社）染色液でゲルを染色後、デンシトグラムＡＥ−６９２０Ｖ−ＦＸ（アトー社）を用いて３００ｎｍの波長で蛍光を観察した。増幅産物は、ＤＮＡマーカーを指標として検出した。その結果を、表２及び表３に示す。表中、「＋」は増幅産物が検出されたことを、「−」は増幅産物が検出されなかったことを示す。
表２及び表３に示したように、比較例１及び比較例２では、ビフィドバクテリウム インファンティスＡＴＣＣ１５６９７株とビフィドバクテリウム ブレーベＪＣＭ７０２０株の両株で増幅産物が得られ、ビフィドバクテリウム インファンティスを特異的に検出できなかった。それに対して、実施例１では、ビフィドバクテリウム インファンティスＡＴＣＣ１５６９７株のみが５７９ｂｐの長さの増幅産物が得られた。
［実施例２］
フォワードプライマーにプライマー４〜３１を、リバースプライマーにプライマー３３を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。結果を表４に示す。空欄は、実施していないことを示す。
フォワードプライマーにプライマー４〜３１を、リバースプライマーにプライマー３３を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。結果を表４に示す。空欄は、実施していないことを示す。
［実施例３］
実施例２と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃で反応を行った。
実施例２と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃で反応を行った。
［実施例４］
フォワードプライマーにプライマー５、１６、２８を、リバースプライマーにプライマー３２を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃で反応を行った。その結果、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
フォワードプライマーにプライマー５、１６、２８を、リバースプライマーにプライマー３２を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃で反応を行った。その結果、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
［実施例５］
フォワードプライマーにプライマー５、１６、２８を、リバースプライマーにプライマー３３を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃又は６５℃で反応を行った。その結果、いずれの温度においても、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
フォワードプライマーにプライマー５、１６、２８を、リバースプライマーにプライマー３３を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃又は６５℃で反応を行った。その結果、いずれの温度においても、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
［実施例６］
フォワードプライマーにプライマー５、１６、２８を、リバースプライマーにプライマー２を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃で反応を行った。その結果、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
フォワードプライマーにプライマー５、１６、２８を、リバースプライマーにプライマー２を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６０℃で反応を行った。その結果、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
［実施例７］
フォワードプライマーにプライマー５、１６を、リバースプライマーにプライマー２を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６５℃で反応を行った。その結果、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
フォワードプライマーにプライマー５、１６を、リバースプライマーにプライマー２を用いて、実施例１と同様にしてＰＣＲ反応を行い、反応産物の検出を行った。ただし、アニーリング温度は６５℃で反応を行った。その結果、Ｂ．ｉｎｆａｎｔｉｓ ＡＴＣＣ１５６９７でのみ増幅産物が認められた。
以上のとおり、本願発明のプライマーは、ビフィドバクテリウム インファンティスを極めて高い特異性で検出することが可能である。
産業上の利用の可能性
産業上の利用の可能性
本発明により、ビフィドバクテリウム インファンティスを、簡便、迅速に、かつ他の種（ｓｐｅｃｉｅｓ）のビフィズス菌と交差反応を示すことなく、検出することができる。
Claims (3)
- 配列番号５〜２８から選ばれる塩基配列からなる第１のオリゴヌクレオチドと、配列番号２、３２又は３３の塩基配列からなる第２のオリゴヌクレオチドの対からなる、ビフィドバクテリウム インファンティスを検出するためのＰＣＲプライマー。
- 請求項１に記載のＰＣＲプライマーを含む、ビフィドバクテリウム インファンティス検出用のキット。
- 請求項１に記載のＰＣＲプライマーを用いて、被検菌の染色体ＤＮＡ又は１６Ｓ ｒＲＮＡを鋳型とするＰＣＲを行い、増幅産物の有無を決定することを含む、ビフィドバクテリウム インファンティスを検出する方法。
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