TWI532845B - 鑑定變形桿菌屬菌種的方法及其檢驗套組 - Google Patents

Description

鑑定變形桿菌屬菌種的方法及其檢驗套組

本發明是有關於一種快速鑑定變形桿菌屬菌種的方法及其檢驗套組，特別是有關於一種以限制片段長度多型性聚合酶連鎖反應(Polymerase Chain Reaction-Restriction Fragment Length Polymorphism；PCR-RFLP)快速鑑定變形桿菌屬菌種的方法及其檢驗套組。

傳統上關於細菌感染症的診斷，主要有賴於細菌的培養及鑑定，但是體外細菌生長所需時間冗長，耗事費時。現在利用多種方法可以克服傳統時效上的問題，而達到快速診斷的目的。這些方法包括了菌體抗原、菌體酵素、菌體核酸和在生物體中所誘發抗體的測定等等，其中以分子生物技術應用於感染症的鑑定最具發展潛力。

首例將分子生物技術應用於感染症的診斷被報告於1980年Moseley等人，以核酸雜交的方法從糞便檢體中偵測腸毒素型大腸桿菌(Enterotoxigenic E.coli；ETEC)，由於此方法優異的敏感度及特異性，使得診斷感染症的領域 上浮現出一新的方向。由於自然界之各種不同生物間其核酸均有序列上之差異，運用此原則，即可藉著一些敏感之分生技術例如核酸探針或聚合酶連鎖反應等方式，自受感染者檢體中藉著偵測此特異序列而得知病原體之存在。

感染症的診斷與治療非常依賴臨床細菌學的報告，而目前傳統方法最大的問題是不夠快速與準確。雖然近年來以16S rRNA基因發展的分子檢驗方法已不少，但此方法需萃取細菌之染色體並定序16S rDNA方能鑑定細菌種類，所得結果雖然準確但很耗時，且DNA定序之花費高，故臨床檢驗上不易推廣普及使用。因此仍須針對臨床上重要感染細菌尋找新的基因標的或發展新方法，以改善不易鑑定或檢驗時間過長等問題。

因此，本發明提供一種快速鑑定變形桿菌屬菌種之方法及其檢驗套組，用以解決傳統鑑定變形桿菌屬菌種方法耗事費時、操作不易及結果判讀困難的問題。

本發明之一態樣是在提供一種鑑定變形桿菌屬菌種的方法，包含下列步驟：提供一未知樣品之去氧核醣核酸作為一模版。將模板以序列辨識編號1所示之寡核苷酸及序列辨識編號2所示之寡核苷酸進行聚合酶連鎖反應，以獲得聚合酶連鎖反應產物。利用限制酶Taq I剪切聚合酶連鎖反應產物，將限制酶Taq I剪切後之聚合酶連鎖反應產物進行凝膠電泳得到未知樣品的Taq I限制酶圖譜。再將未 知樣品的Taq I限制酶圖譜與變形桿菌屬菌種鑑定圖譜比對，其中變形桿菌屬菌種鑑定圖譜至少包含若干可鑑定Proteus vulgaris之片段、若干可鑑定Proteus mirabilis之片段、若干可鑑定Proteus penneri之片段及一可鑑定Proteus myxofaciens之片段。可鑑定Proteus vulgaris之片段之分子量大小分別為84bp及357bp；可鑑定Proteus mirabilis之片段之分子量大小分別為6bp、81bp、132bp及222bp；可鑑定Proteus penneri之片段之分子量大小分別為50bp及391bp；及可鑑定Proteus myxofaciens之片段之分子量大小係為441bp。

根據本發明之一實施例，其中模版係為變形桿菌屬之recA基因部分片段。

本發明之另一態樣是在提供一種鑑定變形桿菌屬菌種的套組，包含序列辨識編號1所示之寡核苷酸、序列辨識編號2所示之寡核苷酸以及限制酶Taq I。

根據本發明之一實施例，其中變形桿菌屬菌種係選自於由Proteus vulgaris BCRC 10728、Proteus mirabilis BCRC 10725、Proteus penneri BCRC 14123及Proteus myxofaciens BCRC 12222所組成之一族群。

根據本發明之另一實施例，其中鑑定變形桿菌屬菌種的套組更包含Taq DNA Polymerase、PCR緩衝液及dNTP。

藉此，本發明利用PCR-RFLP，建立四種常見變形桿菌屬菌種鑑定圖譜，可快速準確鑑定未知之變形桿菌 屬菌種樣本，以改善利用傳統的生化方法鑑定變形桿菌屬需24到72小時才能完成且方法繁複的問題。

上述發明內容旨在提供本揭示內容的簡化摘要，以使閱讀者對本揭示內容具備基本的理解。此發明內容並非本揭示內容的完整概述，且其用意並非在指出本發明實施例的重要/關鍵元件或界定本發明的範圍。

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：第1圖繪示本發明之退化性引子進行聚合酶連鎖反應增幅出之變形桿菌屬菌種之recA基因部分片段之凝膠電泳圖。

第2圖繪示本發明之變形桿菌屬菌種鑑定圖譜。

第3圖繪示本發明之一實施方式之鑑定變形桿菌屬菌種的方法之凝膠電泳圖。

第4圖繪示本發明之另一實施方式之鑑定變形桿菌屬菌種的方法之凝膠電泳圖。

本說明書揭露內容提供一種鑑定變形桿菌屬菌種的方法以及鑑定變形桿菌屬菌種的套組。鑑定變形桿菌屬菌種的方法係以重組酶A(recombinase A；recA)基因為目標基因，分析各變形桿菌屬菌種的recA基因序列後，設計退化性引子，以增幅出各種變形桿菌屬菌種之recA基因部 分片段。將各變形桿菌屬菌種增幅出之recA基因部分片段以限制酶Taq I剪切後建立變形桿菌屬菌種鑑定圖譜。再利用退化性引子增幅出未知樣品的recA基因部分片段。將增幅出未知樣品的recA基因部分片段以限制酶Taq I進行剪切，將剪切後的去氧核醣核酸進行凝膠電泳，以得到未知樣品的Taq I限制酶切割電泳圖譜，最後將未知樣品的Taq I限制酶切割電泳圖譜與變形桿菌屬菌種鑑定圖譜比對以鑑定變形桿菌屬菌種。

本發明之另一實施方式之鑑定變形桿菌屬菌種的 套組，包含序列辨識編號1所示之寡核苷酸、序列辨識編號2所示之寡核苷酸、限制酶Taq I、Taq DNA Polymerase、PCR緩衝液以及dNTP。其中變形桿菌屬菌種係選自於由Proteus vulgaris BCRC 10728、Proteus mirabilis BCRC 10725、Proteus penneri BCRC 14123及Proteus myxofaciens BCRC 12222所組成之一族群。

因聚合酶連鎖反應本身之特性，引子與欲增幅之模版間之序列即便存在變異性，仍可藉調節聚合酶連鎖反應中黏合步驟之反應溫度而合成特定之去氧核醣核酸片段。故於本發明所屬技術領域中具一般知識之人士根據本發明之揭示，即可根據欲增幅之去氧核醣核酸片段設計不同之引子。因此，任何針對本發明實施例所述之引子所為之鹼基置換、加入或縮減所形成的引子，如其仍可與本發明實施例所述之相對應引子組成引子對而增幅出的特定片段，皆不脫離本發明所欲保護之範圍。

本發明前述所稱之「退化性引子」係指專一性不高的引子，一個去氧核醣核酸可以與2至4種不同的去氧核醣核酸結合。其中不同英文字母所代表的鹼基如下：R=AG、Y=CT、M=AC、K=GT、W=AT、S=CG、B=CGT、D=AGT、H=ACT、V=ACG和N=ACGT。

本發明前述所稱之「變形桿菌屬菌種鑑定圖譜」係指係利用PCR-RFLP，得到不同變形桿菌屬菌種長短相異的去氧核醣核酸片段。在生物基因組中存在著許多限制性內切酶切點，限制酶能專一性的剪切且切點具有明顯的遺傳性。由於去氧核醣核酸的多型性使不同菌種特定的限制酶切位點和數目不同，因此使用此特定的限制酶剪切時，不同菌種所產生的片段數目和長度就會不同。

本發明前述之「變形桿菌屬」係指Proteus species，為革蘭氏陰性桿菌、兼性厭氧菌，廣泛存在於水、土壤腐敗的有機物以及人和動物的腸道中，為條件致病菌，多為繼發感染，如慢性中耳炎、創傷感染等，也可引起膀胱炎、嬰兒腹瀉、食物中毒等。主要包含四種細菌：Proteus mirabilis、Proteus vulgaris、Proteus penneri和Proteus myxofaciens。

下列實驗例用於示範說明本發明，係用以有利於本發明所屬技術領域通常知識者，可在不需過度解讀的情形下完整利用並實踐本發明，而不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制，但用於如何實施本發明的材料及方法。

實驗例1：設計退化性引子

變形桿菌屬菌種之recA基因之退化性引子的設計 係利用GeneBank中已發表變形桿菌屬菌種包括Proteus mirabilis(Accession no.AM942759)及Proteus vulgaris(Accession no.X55555)的基因資料庫，比較此兩種菌之recA基因序列及其他細菌之recA基因序列，利用其相似性較高的保留區域(conserved region)，設計出退化性引子對，分別為序列如序列辨識編號1所示之正向退化性引子，以及序列如序列辨識編號2所示之負向退化性引子。並利用退化性引子對變形桿菌屬進行聚合酶連鎖反應，可增殖出四種變形桿菌屬菌種之recA基因部分片段，四種變形桿菌屬菌種分別為Proteus vulgaris BCRC 10728、Proteus mirabilis BCRC 10725、Proteus penneri BCRC 14123和Proteus myxofaciens BCRC 12222。

實驗例2：變形桿菌屬菌種鑑定圖譜

變形桿菌屬菌種鑑定圖譜，首先利用商品化套組或 以習知萃取方法萃取四種變形桿菌屬菌種之去氧核醣核酸作為模板，接著以recA基因之退化性引子進行聚合酶連鎖反應，反應物及試劑依下述比例進行：5μl 10X Taq緩衝液、1μl之10mM dNTP混合液、10μM之引子各1μl、1μl之Taq DNA polymerase(5U/μl)和100ng去氧核醣核酸模板，最後加入滅菌之二次去離子水，調整總體積為50μl，將溶液混合均勻後進行聚合酶連鎖反應。反應條件為36個周期之熱循環，包括變性94℃反應1分鐘、黏合50℃反應1分鐘、延長72℃反應1分鐘，之後進行最終延長72℃ 反應4分鐘，終止溫度為4℃。將增幅出之去氧核醣核酸片段以凝膠電泳分離。

請參照第1圖，第1圖為利用退化性引子對進行聚合酶連鎖反應增幅出之變形桿菌屬菌種之recA基因部分片段之凝膠電泳圖，其中M為去氧核醣核酸之分子量標記。 泳道1為Proteus vulgaris BCRC 10728，泳道2為Proteus mirabilis BCRC 10725，泳道3為Proteus penneri BCRC 14123，泳道4為Proteus myxofaciens BCRC 12222。可以看出利用退化性引子進行聚合酶連鎖反應可順利增幅出四種變形桿菌屬菌種之recA基因部分片段，聚合酶連鎖反應產物的分子量大小為441bp。

利用國家衛生研究院TBI生物資訊核心設施軟體GCG 3.1.2軟體之Mapping分析recA基因序列限制酶切位圖譜，發現限制酶Taq I能將四種變形桿菌屬菌種441bp之recA基因部份片段剪切成不同的去氧核醣核酸片段，故選擇使用限制酶Taq I進行PCR-RFLP。再將上述增幅出之四種變形桿菌屬菌種之recA基因部分片段，利用限制酶Taq I剪切，之後進行凝膠電泳分析，得到呈現具有不同長度片段多型性的變形桿菌屬菌種鑑定圖譜。

請參照表一及第2圖。表一為四種變形桿菌屬菌種441bp之recA基因部份片段使用限制酶Taq I進行剪切之限制酶切位圖譜，第2圖為上述限制酶切位圖譜之凝膠電泳圖，其中M1和M2為去氧核醣核酸之分子量標記。泳道1為Proteus vulgaris BCRC 10728，泳道2為Proteus mirabilis BCRC 10725，泳道3為Proteus penneri BCRC 14123，泳道4為Proteus myxofaciens BCRC 12222。分析結果顯示：Proteus vulgaris之recA基因部分片段以限制酶Taq I進行剪切後會切出84bp和357bp二個去氧核醣核酸片段；Proteus mirabilis之recA基因部分片段以限制酶Taq I進行剪切後會切出6bp、81bp、132bp和222bp四個去氧核醣核酸片段，但於第2圖泳道2中6bp的位置未見明顯的去氧核醣核酸片段，推測可能因此片段之去氧核醣核酸分子量太小，未能鑲嵌足夠使肉眼觀察到的螢光染劑；Proteus penneri之recA基因部分片段以限制酶Taq I進行剪切後會切出50bp和391bp二個去氧核醣核酸片段；Proteus myxofaciens之recA基因部分片段因不具限制酶Taq I切位，故經進行限制酶Taq I剪切後去氧核醣核酸片段大小仍為441bp。

實驗例3：PCR-RFLP鑑定變形桿菌屬菌種結果

為確定本發明之鑑定變形桿菌屬菌種的方法的準確性，收集了臨床上常見的5株Proteus vulgaris臨床分離株(Proteus vulgaris CN.1-CN.5)與15株Proteus mirabilis臨床分離株(Proteus mirabilis CN.1-CN.15)進行同樣的PCR-RFLP實驗。請參照第3圖和第4圖，其中M為去氧 核醣核酸之分子量標記，第3圖的泳道1至4為Proteus vulgaris CN.1-CN.4，第4圖泳道1為Proteus vulgaris CN.5，泳道2至16為Proteus mirabilis CN.1-CN.15。結果顯示，Proteus vulgaris的臨床分離株經PCR-RFLP後經凝膠電泳分析，可以得到大小為84bp和357bp的去氧核醣核酸片段。Proteus mirabilis的臨床分離株經PCR-RFLP後經凝膠電泳分析，可以得到大小為6bp、81bp、132bp和222bp的去氧核醣核酸片段。結果與變形桿菌屬菌種鑑定圖譜一致。

根據上述，本發明係運用分子生物學技術，先利用 變形桿菌屬菌種之recA基因之保留區域設計退化性引子，再利用不同變形桿菌屬菌種於基因體分子層次上的差異，以限制酶Taq I剪切得到不同片段大小之去氧核醣核酸片段，用以快速、準確鑑定不同變形桿菌屬菌種。本發明之鑑定方法及其檢驗套組不僅實驗重複性高、快速、簡易且成本較低，可快速鑑定包含Proteus vulgaris、Proteus mirabilis、Proteus penneri和Proteus myxofaciens等四種變形桿菌屬菌種，優於存在培養時間過長、不易操作及判讀結果困難等問題之傳統鑑定方法。

本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，任何熟習此技藝者，在不脫離本發明的精神和範圍內，當可作各種的更動與潤飾，因此本發明的保護範圍當視後附的申請專利範圍所界定者為準。

<110> 中臺科技大學

<120> 鑑定變形桿菌屬菌種的方法及其檢驗套組

<160> 2

<210> 1

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> primer

<223> 進行PCR的引子(forward)

<400> 1

<210> 2

<21> 31

<212> DNA

<213> 人工序列

<220> primer

<223> 進行PCR的引子(reversed)

<400> 2

Claims (5)

1. 一種鑑定變形桿菌屬菌種的方法，包含：提供一未知樣品之去氧核醣核酸作為一模版；將該模版以序列辨識編號1所示之寡核苷酸及序列辨識編號2所示之寡核苷酸進行聚合酶連鎖反應，以獲得一聚合酶連鎖反應產物；利用限制酶Taq I剪切該聚合酶連鎖反應產物；將限制酶Taq I剪切後之該聚合酶連鎖反應產物進行凝膠電泳得到未知樣品的Taq I限制酶圖譜；以及將未知樣品的Taq I限制酶圖譜與一變形桿菌屬菌種鑑定圖譜比對，其中該變形桿菌屬菌種鑑定圖譜至少包含若干可鑑定Proteus vulgaris之片段、若干可鑑定Proteus mirabilis之片段、若干可鑑定Proteus penneri之片段及一可鑑定Proteus myxofaciens之片段，該些可鑑定Proteus vulgaris之片段之分子量大小係為84bp及357bp；該些可鑑定Proteus mirabilis之片段之分子量大小係為6bp、81bp、132bp及222bp；該些可鑑定Proteus penneri之片段之分子量大小係為50bp及391bp；及該可鑑定Proteus myxofaciens之片段之分子量大小係為441bp。
2. 如請求項1所述之鑑定變形桿菌屬菌種的方法，其中該模版係為變形桿菌屬之recA基因部分片段。
3. 一種鑑定變形桿菌屬菌種的套組，包含序列辨識編號1所示之寡核苷酸、序列辨識編號2所示之寡核苷酸以及限制酶Taq I。
4. 如請求項3所述之鑑定變形桿菌屬菌種的套組，其中該變形桿菌屬菌種係選自於由Proteus vulgaris BCRC 10728、Proteus mirabilis BCRC 10725、Proteus penneri BCRC 14123及Proteus myxofaciens BCRC 12222所組成之一族群。
5. 如請求項3所述之鑑定變形桿菌屬菌種的套組，更包含Taq DNA Polymerase、PCR緩衝液及dNTP。