JP6064722B2 - 抗酸菌の溶菌試薬および当該試薬を用いた抗酸菌の検出方法 - Google Patents

Description

本発明は、抗酸菌を溶菌し核酸を抽出するための試薬、および当該試薬を用いて試料中に含まれる抗酸菌を検出する方法に関する。

結核および非結核性抗酸菌症は世界的に蔓延する細菌性疾患であり、当該疾患の根絶が世界的に取り組まれている中、当該疾患であることを迅速に診断することが非常に重要となってきている。また結核と非結核性抗酸菌症とでは感染防護や治療戦略が異なるため、結核菌群と非結核性抗酸菌とを区別して検出することは極めて重要である。

結核および非結核性抗酸菌（以下あわせて抗酸菌とする）検査の公定法は培養法である。しかしながら抗酸菌（特に結核菌群）の増殖速度は極めて遅く、確定が出るまでに時間を要するため、培養法のみで検査する場合、二次感染の発生や拡大のリスクを有していた。そこで実際の抗酸菌検査業務では、時間のかかる培養法と迅速に抗酸菌の有無を検査可能な方法とを併用して検査している。

迅速に抗酸菌の有無を検査可能な方法として、最近注目されている方法は、抗酸菌特異的な核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）を増幅し検出する方法である。具体的には検査対象の抗酸菌由来の核酸（ＤＮＡ／ＲＮＡ）に特異的なプライマー・プローブを用い、当該核酸を増幅・検出することで、試料中に前記抗酸菌が含まれているか否かを検出する。本方法は、結核菌群由来の核酸に特異的なプライマー・プローブと、非結核性抗酸菌由来の核酸に特異的なプライマー・プローブとを用いることで、結核菌群と非結核性抗酸菌とを区別して検出できるため、迅速な検査方法として好ましい。

抗酸菌特異的な核酸を増幅し検出する方法では、あらかじめ、抗酸菌を溶菌して核酸を抽出する必要がある。抗酸菌を溶菌する方法としては、従来より、有機溶媒等を用いた化学的方法、酵素を用いる生物学的方法、および超音波処理または微粒子存在下での超音波破砕や凍結・融解の繰り返し等の物理的方法等が知られている。また特許文献１には、抗酸菌を含む試料を、非イオン性界面活性剤を含む液体中で加熱処理することで、抗酸菌からＤＮＡを抽出する方法を開示しており、非特許文献１には、有機溶媒や遠心操作を多用することで、抗酸菌からＲＮＡを抽出する方法を開示しており、特許文献２には、抗酸菌を含む試料を界面活性剤を含む液体中で加熱処理後、前記抗酸菌を分離し、当該分離した抗酸菌にジルコニア微粒子を添加して超音波破砕することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出する方法を開示している。

ＷＯ２００３／０９７８１６号 ＷＯ２００７／０９４５０６号

Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２５（３），６７５−６７６（１９９７）

抗酸菌を溶菌して核酸を抽出しようとした場合、抗酸菌は強固な細胞壁を有しているため、処理条件が過酷であったり、処理時間が長くなったり、操作が煩雑であったり、特別な装置を使用する必要があった。またそれに伴いコンタミネーションのリスクもあった。さらに抽出する核酸がＲＮＡの場合、ＤＮＡに比べてアルカリ加水分解に対して脆弱であるため、アルカリ加熱法による簡便な抽出が適用できないという問題もあった。

そこで本発明は、特殊な装置や煩雑な操作を必要とせず、簡便かつ短時間に試料中に含まれる抗酸菌を溶菌して核酸（特にＲＮＡ）を抽出可能な試薬、および前記試薬を用いた試料中に含まれる抗酸菌を検出する方法を提供することを目的とする。

本発明者らは、上記目的に鑑みて鋭意検討した結果、本発明を完成するに至った。

すなわち本発明の第一の態様は、アルキルベンゼンスルホン酸と、前記酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤を含む水溶液からなる、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出するための試薬である。

また本発明の第二の態様は、アルキルベンゼンスルホン酸がドデシルベンゼンスルホン酸である、前記第一の態様に記載の試薬である。

また本発明の第三の態様は、中和剤がトリスヒドロキシメチルアミノメタンである、前記第一または第二の態様に記載の試薬である。

また本発明の第四の態様は、さらに非イオン性界面活性剤を含む、前記第一から第三の態様のいずれかに記載の試薬である。

また本発明の第五の態様は、さらに水溶性有機溶媒を含む、前記第一から第四の態様のいずれかに記載の試薬である。

さらに本発明の第六の態様は、アルキルベンゼンスルホン酸と、前記酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤を含む水溶液を、抗酸菌を含む試料に添加後、加熱処理することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出する方法である。

また本発明の第七の態様は、ドデシルベンゼンスルホン酸とトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む水溶液を、ドデシルベンゼンスルホン酸の終濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）以上となるよう、抗酸菌を含む試料に添加後、７０℃から９０℃で５分間から６０分間加熱処理することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出する方法である。

さらに本発明の第八の態様は、
アルキルベンゼンスルホン酸と、前記酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤を含む水溶液を、抗酸菌を含む試料に添加後、加熱処理することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出する工程と、
前記工程で抽出した抗酸菌由来ＲＮＡを当該ＲＮＡに特異的なプライマー・プローブを用いて、増幅・検出する工程とを含む、
試料中に含まれる抗酸菌を検出する方法である。

以下、本発明を詳細に説明する。

本発明の、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出するための試薬（以下、単に本発明の試薬とする）は、アルキルベンゼンスルホン酸と中和剤を少なくとも含むことを特徴としている。

本発明の試薬を構成するアルキルベンゼンスルホン酸は、界面活性剤としての機能を有するものであれば特に限定はなく、一例として、デシルベンゼンスルホン酸、ウンデシルベンゼンスルホン酸、ドデシルベンゼンスルホン酸、トリデシルベンゼンスルホン酸、テトラデシルベンゼンスルホン酸といった、炭素数１０から１４の直鎖または分枝鎖を有するアルキル鎖が結合したベンゼンスルホン酸があげられる。中でもドデシルベンゼンスルホン酸（ＤＢＳＡ）は、本発明の試薬を構成するアルキルベンゼンスルホン酸として好ましい態様の一つといえる。

本発明の試薬を構成するアルキルベンゼンスルホン酸はスルホ基（−ＳＯ_３Ｈ）を有しているため、水溶液にすると強酸性を示す（一例として、１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ水溶液のｐＨは１以下である）。一方、ＲＮＡは強酸性下では加水分解される可能性がある。そのため、本発明の試薬ではアルキルベンゼンスルホン酸に中和剤を添加することでＲＮＡの加水分解が生じない程度のｐＨに調整する必要がある。ただし本発明の試薬に添加する中和剤として、金属水酸化物（例えば、水酸化ナトリウムや水酸化カリウム）など、アルキルベンゼンスルホン酸との反応により前記酸の金属塩を生成する中和剤を用いるのは好ましくない。その理由として、アルキルベンゼンスルホン酸金属塩は、アルキルベンゼンスルホン酸と比較し溶菌性能が劣るからである（後述の実施例１参照）。本発明の試薬に添加する中和剤の一例として、アンモニアや、２−アミノエタノール、２，２’−イミノジエタノール、２，２’，２’’−ニトリロトリエタノール、２−アミノ−２−メチル−１，３−プロパンジオールなどのアルカノールアミン類や、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）があげられる。中でも、毒劇物の扱いを受けず臭気もないＴｒｉｓは、本発明の試薬に添加する中和剤として好ましい態様の一つといえる。

本発明の試薬におけるアルキルベンゼンスルホン酸の濃度は、アルキルベンゼンスルホン酸がＤＢＳＡの場合、抗酸菌を含む試料に本発明の試薬を添加した時点の終濃度で０．０５％（ｗ／ｖ）以上であればよく、０．５％（ｗ／ｖ）以上であるとより好ましい。上限については特に限定はないが、アルキルベンゼンスルホン酸がＤＢＳＡの場合、２０％（ｗ／ｖ）以上の水溶液は粘性が高く、取り扱いが困難となるため、避けたほうが好ましい。なおアルキルベンゼンスルホン酸は、粘性が高く、水への溶解速度も遅い。そのため本発明の試薬を調製する際、あらかじめアルキルベンゼンスルホン酸に、２−プロパノールといった低級アルコールや、エチレングリコールといったジオールや、ジメチルスルフォキシドといった非プロトン性有機溶媒などの水溶性の有機溶媒を混和させてから調製すると、粘性を下げることができ、かつ水への溶解速度も向上するため好ましい。

本発明の試薬の好ましい態様として、非イオン性界面活性剤をさらに添加した試薬があげられ、前記試薬により溶菌効率のばらつきを改善することができる。添加する非イオン性界面活性剤は、当業者が通常用いるものから適宜選択することができ、その一例として、ＭＥＧＡ−８（ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）、ＭＥＧＡ−９（ｎ−Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）、ＭＥＧＡ−１０（ｎ−Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）、ｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド、オクチル−β−Ｄ−グルコシド、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（商品名）があげられる。濃度については、臨界ミセル濃度（ＣＭＣ）を考慮のうえ、適宜設定すればよい。

本発明の試薬を抗酸菌を含む試料に添加し、加熱処理することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出することができる。加熱処理する温度は６０℃以下では抗酸菌が実質的に溶菌しないことから（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６４（９），１９４４−１９５１（２００９））、６５℃から９５℃までの範囲内であればよく、７０℃から９０℃までの範囲内が特に好ましい。加熱処理する時間は温度に依存するが、加熱処理する温度が７０℃から９０℃までの場合、５分から６０分までの間とすればよく、１０分前後が特に好ましい。

本発明の試薬を抗酸菌を含む試料に添加し、加熱処理することで、抗酸菌を溶菌して抗酸菌由来ＲＮＡを抽出した後は、当該ＲＮＡに特異的なプライマー・プローブを用いて、増幅・検出することにより、試料中に含まれる抗酸菌を検出することができる。なおＲＮＡを抽出した後、ＲＮｅａｓｙ（ＱＩＡＧＥＮ）などの市販のＲＮＡ精製キットを用いてＲＮＡを高純度に精製してから、前記増幅・検出を行なってもよい。また前記増幅・検出は、ＴＭＡ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＮＡＳＢＡ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ−Ｂａｓｅｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）法、ＴＲＣ（Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｒｅｖｅｒｓｅ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ Ｃｏｎｃｅｒｔｅｄ ｒｅａｃｔｉｏｎ）（特開２０００−０１４４００号公報）法など従来より知られているＲＮＡ増幅法を用いて行なえばよい。

本発明の試薬で溶菌可能な抗酸菌は、Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ属に属する菌のことを指し、具体的には、Ｍ．ａｖｉｕｍ、Ｍ．ｉｎｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒａｅ、Ｍ．ｇｏｒｄｏｎａｅ、Ｍ．ｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（結核菌）、Ｍ．ｋａｎｓａｓｉｉ、Ｍ．ｆｏｒｔｕｉｔｕｍ、Ｍ．ｃｈｅｌｏｎａｅ、Ｍ．ｂｏｖｉｓ、Ｍ．ｓｃｒｏｆｕｌａｃｅｕｍ、Ｍ．ｐａｒａｔｕｂｅｒｃｕｌｏｓｉｓ（ヨーネ菌）、Ｍ．ｐｈｌｅｉ、Ｍ．ｍａｒｉｎｕｍ、Ｍ．ｓｉｍｉａｅ、Ｍ．ｓｚｕｌｇａｉ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅ（らい菌）、Ｍ．ｘｅｎｏｐｉ、Ｍ．ｕｌｃｅｒａｎｓ、Ｍ．ｌｅｐｒａｅｍｕｒｉｕｍ、Ｍ．ｆｌａｖｅｓｃｅｎｓ、Ｍ．ｔｅｒｒａｅ、Ｍ．ｎｏｎｃｈｒｏｍｏｇｅｎｉｃｕｍ、Ｍ．ｍａｌｍｏｅｎｓｅ、Ｍ．ａｓｉａｔｉｃｕｍ、Ｍ．ｖａｃｃａｅ、Ｍ．ｇａｓｔｒｉ、Ｍ．ｔｒｉｖｉａｌｅ、Ｍ．ａｆｒｉｃａｎｕｍ、Ｍ．ｔｈｅｒｍｏｒｅｓｉｓｔａｂｌｅ、Ｍ．ｓｍｅｇｍａｔｉｓ、Ｍ．ｓｈｉｎｊｕｋｕｅｎｓｅが例示できる。試料中に含まれる抗酸菌を検出するには、前述した抗酸菌のＲＮＡに特異的なプライマー・プローブを設計し、当該設計したプライマー・プローブを用いて適切な条件下でＲＮＡの増幅・検出を行なえばよい（例えば、特開２００４−１９４５８３号公報）。

本発明における抗酸菌を含む試料の一例として、喀痰、気管支洗浄液、気管支肺胞洗浄液、胃液、血液、骨髄液、尿、糞便、組織、その他体液、培養液などがあげられる。なお、抗酸菌を含む試料が喀痰の場合は、ＮＡＬＣ（Ｎ−ａｃｅｔｙｌ−Ｌ−ｃｙｓｔｅｉｎｅ）−ＮａＯＨ法などの公知の方法によりあらかじめ試料の粘性を下げる前処理を行なったほうがよい。

本発明の試薬は、アルキルベンゼンスルホン酸と、前記酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤を少なくとも含むことを特徴としている。抗酸菌を含む試料に本発明の試薬を添加し加熱処理することで抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出後、当該ＲＮＡに特異的なプライマー・プローブを用いて増幅・検出することで、試料中に含まれる抗酸菌を簡便かつ短時間に検査することができる。また本発明の試薬を用いた抗酸菌の溶菌操作は、１本のチューブで完結し、ヒートブロック以外の特別な装置が不要なため、容易に実施することができる。またコンタミネーションリスクが少なく、バイオセーフティも確保できる操作である。

以下、本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１ 界面活性剤による抗酸菌から溶菌効率の検討
各種界面活性剤により抗酸菌の溶菌操作を行ない、溶菌効率を、前記操作により液相に放出された抗酸菌由来のＲＮＡを増幅・検出することで評価した。
（１）ＭｙｃｏＢｒｏｔｈ（極東製薬）中で静置培養したＭｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ ｂｏｖｉｓ ＢＣＧ Ｔｏｋｙｏ株（以下、ＢＣＧと記載）を孔径５μｍの親水性シリンジフィルター（日本ＰＡＬＬ）でろ過後、ろ液の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定し、その吸光度を基にＯＤ６００が０．１になるように滅菌蒸留水で希釈した（１０^７ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍＬ相当）。
（２）（１）の希釈液を段階希釈し、１０^２ｃｆｕのＢＣＧを含む２００μＬの菌液を調製した。
（３）（２）で調製した菌液２００μＬに、１０％（ｗ／ｖ）ドデシルベンゼンスルホン酸（ＤＢＳＡ）水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ドデシルベンゼンスルホン酸ナトリウム塩（Ｎａ−ＤＢＳ）水溶液、１０％（ｗ／ｖ）ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）水溶液、または１０％（ｗ／ｖ）セチルトリメチルアンモニウムブロミド（ＣＴＡＢ）水溶液、各２００μＬを添加し混和後、８０℃で１０分加熱処理することで溶菌操作を行なった。なお１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ水溶液はｐＨ１以下の強酸性水溶液であり、ＲＮＡが加水分解される可能性があるので、あらかじめトリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）で中和している。
（４）（３）の処理液のうち２００μＬを、ＲＮｅａｓｙ ｍｉｎｉ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いることで精製操作を行ない、溶出液５０μＬを得た。なお本操作は、キットの取扱説明書に従い実施した。
（５）（４）の溶出液５μＬを、市販の結核菌群ｒＲＮＡ検出試薬（ＴＲＣＲａｐｉｄ Ｍ．ＴＢ、東ソー）およびＴＲＣＲリアルタイムモニター（ＴＲＣＲａｐｉｄ−１６０、東ソー）を用いて溶出液中のＲＮＡを増幅検出し、前記モニターで陽性判定となる時間（陽性時間）を測定した。なお本操作は、前記試薬の添付文書および前記モニターの取扱説明書に従い実施した。陽性時間が短いほど測定試料中のＢＣＧ ＲＮＡ量が多いことから、溶菌効率がよいといえる。

溶菌操作（前記（３）の操作）は３重で行ない、精製操作と測定（前記（４）および（５））は各処理液に対し１重で行なった。結果を表１に示す。なお表１中、Ｎ．Ｄ．は標的ＲＮＡを検出できなかったことを表す。

表１の結果より、陰イオン性界面活性剤であるＤＢＳＡ、Ｎａ−ＤＢＳ、ＳＤＳは抗酸菌を良好に溶菌している一方、陽イオン性界面活性剤でありＤＮＡ抽出で頻用されるＣＴＡＢでは抗酸菌の溶菌が全く進んでいないことがわかる。また前記陰イオン性界面活性剤の中でも、ＤＢＳＡを用いて溶菌操作を行なったときは、そのナトリウム塩であるＮａ−ＤＢＳや陰イオン性界面活性剤として通常用いられるＳＤＳを用いて溶菌操作を行なったときと比較し、陽性時間が短いことから、ＤＢＳＡが抗酸菌を溶菌するための界面活性剤として最も好ましいことがわかる。

実施例２ ＤＢＳＡの最適濃度検討
実施例１で検討した界面活性剤のうち、抗酸菌を最も良好に溶菌したＤＢＳＡについて最適濃度を検討した。
（１）実施例１（１）の希釈液から滅菌蒸留水で段階希釈し、１０^２ｃｆｕのＢＣＧを含む１００μＬの菌液を調製した。
（２）あらかじめＴｒｉｓで中和した１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ水溶液を蒸留水で段階希釈し、１％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）および０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液を調製した。
（３）（１）で調製した菌液１００μＬに、（２）で調製したＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液１００μＬを添加し混和後、８０℃で１０分加熱処理することで溶菌操作を行なった。なお、１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液を添加した場合の終濃度は５％（ｗ／ｖ）、１％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液を添加した場合の終濃度は０．５％（ｗ／ｖ）、０．１％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液を添加した場合の終濃度は０．０５％（ｗ／ｖ）、０．０１％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液を添加した場合の終濃度は０．００５％（ｗ／ｖ）となる。
（４）（３）の処理液全量（２００μＬ）を実施例１（４）と同様な方法で精製し、実施例１（５）と同様な方法で陽性時間を測定した。

結果を表２に示す。なお表２中、Ｎ．Ｄ．は標的ＲＮＡを検出できなかったことを表す。

表２の結果より、抗酸菌の溶菌に必要なＤＢＳＡの濃度は、少なくとも終濃度０．０５％（ｗ／ｖ）以上、好ましくは０．５％（ｗ／ｖ）以上であることがわかる。なお対照試験として、ＤＢＳＡを添加しない系も同時に実施したが、抗酸菌の溶菌がほとんど進んでいないことがわかる。

実施例３ 非イオン性界面活性剤の添加の効果（その１）
ＤＢＳＡに非イオン界面活性剤をさらに添加することで、抗酸菌の溶菌効率がさらに向上するか評価した。

実施例１（２）で調製した菌液２００μＬに添加する水溶液として、２．８ｍｇ／ｍＬのＭＥＧＡ−１０（ｎ−Ｄｅｃａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）（同仁化学）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液２００μＬとした他は、実施例１と同様な方法で評価した。結果を表３に示す。

表３の結果より、非イオン性界面活性剤であるＭＥＧＡ−１０を加えることで、陽性時間のばらつき、すなわち溶菌効率のばらつきが改善されることがわかる。

実施例４ 非イオン性界面活性剤の添加の効果（その２）
ＤＢＳＡにＭＥＧＡ−１０以外の非イオン界面活性剤を添加することで、ＭＥＧＡ−１０を添加したときと同様な効果が得られるか検討した。

実施例１（２）で調製した菌液２００μＬに添加する水溶液として、以下に示す（Ａ）から（Ｆ）の水溶液２００μＬとした他は、実施例１と同様な方法で評価した。
（Ａ）２．８ｍｇ／ｍＬのＭＥＧＡ−８（ｎ−Ｏｃｔａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）（同仁化学）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液
（Ｂ）２．８ｍｇ／ｍＬのＭＥＧＡ−９（ｎ−Ｎｏｎａｎｏｙｌ−Ｎ−ｍｅｔｈｙｌ−Ｄ−ｇｌｕｃａｍｉｎｅ）（同仁化学）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液
（Ｃ）２．８ｍｇ／ｍＬのＭＥＧＡ−１０（同仁化学）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液
（Ｄ）２．８ｍｇ／ｍＬのｎ−ドデシル−β−Ｄ−マルトシド（１２ｍ）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液
（Ｅ）２．８ｍｇ／ｍＬのｎ−オクチル−β−Ｄ−グルコシド（８ｇ）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液
（Ｆ）２．８ｍｇ／ｍＬのＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１００（ＴＸ）（商品名）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ−Ｔｒｉｓ水溶液
結果を表４に示す。本実施例で検討した５種類の非イオン性界面活性剤のいずれもがＭＥＧＡ−１０と同様、溶菌効率のばらつきが改善されていることがわかる。

実施例５ 加熱条件の検討
ＤＢＳＡとＭＥＧＡ−１０とを含む水溶液で抗酸菌を溶菌する際の加熱処理温度および加熱処理時間の検討を行なった。
（１）実施例１（２）で調製した菌液２００μＬに、２．８ｍｇ／ｍＬのＭＥＧＡ−１０（同仁化学）と１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡとを含む水（９０％）／２−プロパノール（１０％）混合溶液（Ｔｒｉｓで中和）２００μＬを添加し、混和した。なお２−プロパノールは、ＤＢＳＡの粘性の低下と水への溶解性の向上を目的に添加している。
（２）７０℃、８０℃または９０℃で５分間、１０分間、３０分間または６０分間加熱処理後、前記処理液１００μＬを実施例１（４）と同様な方法で精製し、実施例１（５）と同様な方法で陽性時間を測定した。

結果を表５に示す。本実施例で検討した加熱処理温度（７０℃から９０℃）および加熱処理時間（５分から６０分）の範囲であれば、溶菌効率に大きな差はないことがわかる。また本実施例では、ＤＢＳＡの粘性の低下と水への溶解性の向上を目的に２−プロパノールを添加したが、溶菌自体には大きな影響を与えていないことがわかる。

実施例６ 水溶性有機溶媒の検討
実施例５では、ＤＢＳＡの粘性の低下と水への溶解性の向上を目的に２−プロパノールを添加したが、他の水溶性有機溶媒も同様に適用可能か検討した。

２−プロパノール（２−ＰｒＯＨ）の代わりに、非プロトン性有機溶媒であるジメチルスルフォキシド（ＤＭＳＯ）またはジオールであるエチレングリコール（Ｅｔ−Ｇｌｙ）を用い、加熱処理温度・加熱処理時間を８０℃・１０分とした他は、実施例５と同様な方法で実施した。結果を表６に示す。本実施例で検討した水溶性有機溶媒はいずれも使用可能であることがわかる。

実施例７ バイオセーフティの確認
結核菌を含む抗酸菌の検査では、操作者のバイオセーフティが確保されていることが重要である。抗酸菌検査における塗抹検査の陽性最高値は３＋であり、これは１０^６ｃｆｕ（ｃｏｌｏｎｙ ｆｏｒｍｉｎｇ ｕｎｉｔ）／ｍＬに相当する（結核 第８３巻 第４号 ３８７−３９０、２００８年）。また、液体培養の陽性時の菌数は１０^６から１０^７ｃｆｕ／ｍＬである（日本ＢＤ 培養同定・抗酸菌キット「ミジット分離培養剤」 添付文書）。そこで本発明者らは、検体が濃厚試料または培養液の場合は、１０^７ｃｆｕ程度の抗酸菌が検体に持ち込まれ得ると考え、１０^７ｃｆｕの抗酸菌を本発明の試薬で処理した液から生菌が検出されない、すなわちバイオセーフティが確保されているかどうかを検討した。
（１）ＭｙｃｏＢｒｏｔｈ（極東製薬）中で静置培養したＢＣＧを孔径５μｍの親水性シリンジフィルター（日本ＰＡＬＬ）でろ過後、ろ液の６００ｎｍにおける吸光度（ＯＤ６００）を測定し、その吸光度を基にＯＤ６００が０．１になるように、氷冷した滅菌蒸留水で希釈した（１０^７ｃｆｕ／ｍＬ相当）。
（２）希釈した菌液を１ｍＬ分取後、１６０００Ｇで１０分間、４℃の条件で遠心（以下、前記条件を「強遠心」と記載）し、上清を慎重に取り除いた後、沈殿を２００μＬの滅菌蒸留水に懸濁させた。得られたＢＣＧ懸濁液を抗酸菌を含む試料として、以下に示す溶菌処理を行なった。
（３）（２）で調製した菌液２００μＬに対し、１２％（ｗ／ｖ）の２−プロパノール、と２．８ｍｇ／ｍＬのＭＥＧＡ−１０とを含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ水溶液（Ｔｒｉｓで中和）、または滅菌蒸留水を、それぞれ２００μＬ添加し、混和した。
（４）（３）で混和した液のうち、ＤＢＳＡ水溶液と混和した液は７分間、９分間、１０分間または１５分間、蒸留水と混和した液は１０分間、それぞれ７０℃または８０℃で加熱した。加熱後は氷上に５分以上静置した。前記処理は、それぞれの温度・時間で２重で行なった。
（５）加熱処理後、強遠心により上清を取り除いた後、沈殿に０．０５％（ｗ／ｖ）のＴｗｅｅｎ ８０（Ｓｉｇｍａ）を含む１／１５Ｍのリン酸緩衝液（以下、Ｔ−ＰＢと記載)を１ｍＬ加え、よく撹拌することで沈殿を洗浄した。
（６）（５）の洗浄を再度行なった後、最終的に沈殿を３００μＬのＴ−ＰＢに懸濁させ、全量を７Ｈ９−Ｃ平板培地（極東製薬）に塗布し、３７℃、５％ＣＯ_２の条件で培養した。培養期間は結核菌検査指針２００７（日本結核病学会抗酸菌検査法検討委員会編）に従って８週間とした。なお（１）で希釈した菌液が正しく１０^７ｃｆｕ／ｍＬに調製されたかどうかを確認する目的で、当該菌液から、Ｔ−ＰＢを用いて１０^５倍に段階希釈した液を７Ｈ９−Ｃ平板培地に塗布したものを培養陽性として同時に培養した。
（７）コロニーが認められた時点でコロニー数をカウントした。８週間後でもコロニーが認められないものはＮ．Ｄ．とした。

培養の結果を表７に示す。蒸留水を用いた場合、一部試料で菌の検出が確認され、バイオセーフティが必ずしも確保されていないことがわかる。一方、本発明の試薬を用いた場合は、いずれの試料も菌の検出が確認されないことから、少なくとも７０℃以上かつ７分間以上の加熱処理を行なえば、バイオセーフティが確保された溶菌操作が行なえるといえる。すなわち、前述した本発明の試薬による抗酸菌の処理方法は、濃厚試料や培養液が検体であったとしても、１０^７ｃｆｕの抗酸菌を死滅させることができるため、バイオセーフティの観点からも極めて有効な方法といえる。

実施例８ 中和剤の検討
実施例１から７においては、強酸性のドデシルベンゼンスルホン酸（ＤＢＳＡ）水溶液の中和剤として、トリスヒドロキシメチルアミノメタン（Ｔｒｉｓ）を採用したが、アルキルベンゼンスルホン酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない他の中和剤が採用できるか検討した。
（１）実施例１（１）から（２）に記載の方法にしたがい、１０^２ｃｆｕのＢＣＧを含む１００μＬの菌液を調製した。
（２）（１）で調製した菌液１００μＬに、以下に示す（Ａ）から（Ｃ）の水溶液１００μＬを添加し混和後、８０℃で１０分加熱処理した。
（Ａ）中和剤としてＴｒｉｓを含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ水溶液
（Ｂ）中和剤としてアンモニア水（ＮＨ_３）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ水溶液
（Ｃ）中和剤として２−アミノエタノール（ＮＨ_２−ＥｔＯＨ）を含む１０％（ｗ／ｖ）ＤＢＳＡ水溶液
（３）実施例１（４）と同様な方法で精製し、実施例１（５）と同様な方法で陽性時間を測定した。

結果を表８に示す。本実施例で検討した、アルキルベンゼンスルホン酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤は、いずれも使用可能であることがわかる。

本発明の試薬を用いた抗酸菌を溶菌し核酸を抽出する方法は、特殊な装置を用いることなく、簡便かつ短時間に抗酸菌から核酸を確実に抽出でき、かつ操作者の安全（バイオセーフティ）が確保された方法である。したがって、当該方法を、例えば、核酸の増幅・検出法による抗酸菌検査における試料の前処理に適用することにより、安全かつ効率的な抗酸菌検査を容易に実現できる。

Claims (8)

1. アルキルベンゼンスルホン酸と、前記酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤を含む水溶液からなる、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出するための試薬。
2. アルキルベンゼンスルホン酸がドデシルベンゼンスルホン酸である、請求項１に記載の試薬。
3. 中和剤がトリスヒドロキシメチルアミノメタンである、請求項１または２に記載の試薬。
4. さらに非イオン性界面活性剤を含む、請求項１から３のいずれかに記載の試薬。
5. さらに水溶性有機溶媒を含む、請求項１から４のいずれかに記載の試薬。
6. アルキルベンゼンスルホン酸と、前記酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤を含む水溶液を、抗酸菌を含む試料に添加後、加熱処理することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出する方法。
7. ドデシルベンゼンスルホン酸とトリスヒドロキシメチルアミノメタンを含む水溶液を、ドデシルベンゼンスルホン酸の終濃度が０．０５％（ｗ／ｖ）以上となるよう、抗酸菌を含む試料に添加後、７０℃から９０℃で５分間から６０分間加熱処理することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出する方法。
8. アルキルベンゼンスルホン酸と、前記酸との反応により前記酸の金属塩を生成しない中和剤を含む水溶液を、抗酸菌を含む試料に添加後、加熱処理することで、抗酸菌を溶菌しＲＮＡを抽出する工程と、
   前記工程で抽出した抗酸菌由来ＲＮＡを当該ＲＮＡに特異的なプライマー・プローブを用いて、増幅・検出する工程とを含む、
   試料中に含まれる抗酸菌を検出する方法。