KR101687156B1 - 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법 - Google Patents

마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다. 본 발명에 따른 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 프라이머 세트를 이용 시, 상기 마이코박테리움 보비스균에 대해 높은 특이도 및 민감도로 검출하는 효과가 있어, 마이코박테리움 보비스 균의 신속한 검출 및 진단에 유용하게 이용될 수 있다.

Description

마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법{Composition for diagnosing Mycobacterium bovis and method for diagnosing the same}
본 발명은 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물, 진단용 키트 및 진단 방법에 관한 것이다.
결핵은 사람과 동물에 공중 보건학적 및 경제적으로 심각한 피해를 일으키는 질병이다. 마이코박테리움 튜버클로시스(Mycobacterium tuberculosis), 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis), 마이코박테리움 마이크로티(Mycobacterium microti) 등을 포함하는 마이코박테리움 튜버클로시스군(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)은 결핵을 일으키는 주요한 마이코박테리움 속 균이다. 상기 MTC에 속하는 균 종은 유전적으로 매우 유사하나, 숙주특이성과 역학적인 특성이 상이하다. 마이코박테리움 보비스 및 마이코박테리움 카프래(Mycobacterium caprae)는 사람에게도 감염될 수 있으며, 감염의 주요경로는 감염동물과 접촉하거나 우유를 섭취함으로써 일어날 수 있다. 이러한 인수공통 MTC는 선진국과 개발도상국에서 사람결핵의 7.2%와 15%를 차지한다.
또한, 소에서는 특히 마이코박테리움 보비스가 직접적인 결핵 원인균이다. 소결핵은 제2종 법정 가축 전염병으로 분류되는 질병으로, 잠복 기간이 길고, 증상이 뚜렷하지 않아 발견하기 어려우나, 인수 공통 전염병이므로 반드시 진단이 필요한 질병이다.
결핵의 방역을 위해서는 생물학적 시료에서 빠르고 정확하게 결핵을 유발하는 MTC를 검출하는 것이 무엇보다 중요하다. 현재까지 항산성 염색이나 조직병리, 배양 등 시간이 많이 소요되는 방법에 의존해 왔으며, 배양방법은 골드-스탠다드(gold-standard) 방법이지만 균을 배양하는데는 수주가 소요된다. 또한, MTC 진단을 위하여, 일반적인 PCR 및 실시간 PCR법(Real-time PCR) 등이 진단의 도구로서 유용하게 이용되어 왔다(Pedro Costa1, et al, 2013, PLOS ONE, 8(11), e81337). 그러나, 상기 방법을 이용하여 진단 시, 시간이 오래 걸리고 비특이적인 단점이 있다.
이에 본 발명자는 결핵의 원인균인 마이코박테리움 보비스균을 신속하고 특이적으로 진단하기 위해 연구를 지속한 결과, 상기 마이코박테리움 보비스에 특이적인 프라이머 세트를 제작하고 이를 이용하여 초고속실시간중합효소연쇄반응(Ultra-Rapid Real Time PCR)을 수행할 경우, 마이코박테리움 보비스균을 신속하고 특이적으로 진단할 수 있음을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 키트를 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 목적은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 초고속실시간중합효소연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 키트를 제공한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 초고속실시간중합효소연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 프라이머 세트를 이용 시, 상기 마이코박테리움 보비스균에 대해 높은 특이도 및 민감도로 검출하는 효과가 있어, 마이코박테리움 보비스 균의 신속한 검출 및 진단에 유용하게 이용될 수 있다.
도 1은 URRT-PCR을 이용하여 마이코박테리움 보비스의 진단을 위한 조건을 확립을 위하여, 40회 동안의 변성(denaturation)-어닐링(annealing)-중합(polymerization)의 각 PCR 단계의 시간(A); 및 용해 분석 온도(B)를 나타낸 도이다.
도 2는 확립된 URRT-PCR 조건을 이용하여, 마이코박테리움 진단 시, 40회 동안의 변성(denaturation)-어닐링(annealing)-중합(polymerization)의 각 PCR 단계의 시간(A); 및 용해 분석 온도(B)를 분석하여 민감도를 확인한 결과를 나타낸 도이다.
본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물을 제공한다.
상기 프라이머 세트는 초고속실시간중합효소연쇄반응(URRT-PCR)용 프라이머이다.
본 발명에 있어서, '초고속실시간중합효소연쇄반응(URRT-PCR)'은 리얼타임 PCR(real-time PCR)의 문제점을 개선한 것으로, 리얼 타임 PCR 기기가 96 웰 블록을 기반으로 하고 있어, PCR 중 온도의 변화시간(ramping time)이 상대적으로 느리다. 또한, 일반적으로 20μl 이상의 PCR 용액의 양도 상대적으로 많아, 전체 PCR 반응에서 빠른 온도변화를 저해시키는 요인으로 작용하며, 이는 용액 내부의 온도 불균형에 의한 어닐링(annealing) 효과를 감소시킴으로써 비특이적 생산물을 합성하는 요인으로도 작용하는 문제점이 있다.
따라서, 열 전도성이 우수한 실리콘 및 유리재질로 제작된 마이크로칩(microchip)을 기반으로한 초고속실시간중합효소연쇄반응용 기기를 이용하면, PCR용액의 총량을 1μl 수준으로 감소시키고 신속한 온도 조절이 가능하여 PCR에 소요되는 시간을 극단적으로 단축할 수 있다. 따라서, 본 발명에서는 상기 초고속실시간중합효서연쇄반응용 기기를 이용하여 마이코박테리움 보비스를 진단하였으며, 이를 위한 프라이머 디자인을 설계하였다
본 발명에 있어서, '프라이머'는 증폭하려는 핵산 가닥에 상보적인 단일 가닥 올리고뉴클레오티드 서열을 말하며, 프라이머 연장 산물의 합성을 위한 개시점으로서 작용할 수 있다. 상기 프라이머의 길이 및 서열은 연장 산물의 합성을 시작하도록 허용해야 한다. 프라이머의 구체적인 길이 및 서열은 요구되는 DNA 또는 RNA 표적의 복합도(complexity)뿐만 아니라 온도 및 이온 강도와 같은 프라이머 이용 조건에 의존할 것이다.
본 발명에 있어서, 프라이머로서 이용된 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 유사체(analogue), 예를 들면, 포스포로티오에이트(phosphorothioate), 알킬포스포로티오에이트 또는 펩티드 핵산(peptide nucleic acid)을 포함할 수 있거나, 삽입 물질(intercalating agent)을 포함할 수 있다.
상기 프라이머 세트는 초고속 실시간 중합효소 연쇄반응(Ultra-Rapid Real-Time PCR, URRT-PCR)용 프라이머 세트이다. 상기에서 적용되는 실시간중합효소연쇄반응 증폭은 공지된 방법을 적용하면 용이하게 실시할 수 있다. 예를 들어 본 발명에서는, 증폭 주형으로 사용되는 서열과 하기 표 1의 서열번호 1 및 2의 염기서열로 이루어진 프라이머 세트 및 통상의 완충액 등으로 이루어지는 반응액을 만들고, 여기에 시료를 첨가하여 DNA 합성을 진행할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초고속 실시간 중합효소 연쇄반응은 93-95℃에서 95-105초간 선변성(pre-denaturation); 93-95℃에서 0.5-1.5초 간 변성(denaturation); 59-61℃에서 1.5-2.5초 간 어닐링(annealing); 및 71-73℃에서 2.5-3.5초간 중합(polymerization)하는 과정을 반복하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 변성(denaturation)-어닐링(annealing)-중합(polymerization)의 시간을 각 1초-2초-3초로 단축하여 실시할 수 있다.
상기 조성물을 이용하여 마이코박테리움 보비스의 감염 진단 시, 신속하고 특이적으로 마이코박테리움 보비스를 진단할 수 있다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 키트를 제공한다.
상기 진단용 키트는 필요에 따라서 반응액이 포함되도록 제작될 수도 있으며, 이는 공지기술을 적용하면 용이하게 실시할 수 있는 것이다. 본 발명의 키트는 URRT-PCR에 필요한 시약을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 시약은 예를 들면, 이에 제한되지 않고, 완충액 등일 수 있다. 또한, 상기 키트는 안내서를 포함할 수 있다. 안내서는 키트 사용법, 예를 들면, 완충액 제조 방법, 제시되는 반응 조건 등을 설명하는 인쇄물이다. 안내서는 팜플렛 또는 전단지 형태의 안내 책자, 키트에 부착된 라벨, 및 키트를 포함하는 패키지의 표면상에 설명을 포함한다. 또한, 안내서는 인터넷과 같이 전기 매체를 통해 공개되거나 제공되는 정보를 포함한다.
또한, 본 발명은 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 프라이머 세트를 이용하여 초고속실시간중합효소연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단 방법을 제공한다.
바람직하게는, 시료의 게놈 DNA (gDNA)를 분리하는 단계;를 더 포함할 수 있으며, 이때, 게놈 DNA를 분리하는 방법은 당업계에 공지된 방법을 이용할 수 있고, 이에 제한되지 않는다. 상기 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨, 체액 등일 수 있으나, 마이코박테리움 보비스가 검출될 수 있는 시료이면 어느 것이나 사용 가능하고, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 초고속실시간중합효소연쇄반응을 수행하여 마이코박테리움 보비스 감염을 진단할 시, 상기 초고속 실시간 중합효소 연쇄반응은 93-95℃에서 95-105초간 선변성(pre-denaturation); 93-95℃에서 0.5-1.5초 간 변성(denaturation); 59-61℃에서 1.5-2.5초 간 어닐링(annealing); 및 71-73℃에서 2.5-3.5초간 중합(polymerization)하는 과정을 반복하여 수행할 수 있으며, 바람직하게는 변성(denaturation)-어닐링(annealing)-중합(polymerization)의 시간을 각 1초-2초-3초로 단축하여 실시할 수 있다.
이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1. 마이코박테리움 보비스( Mycobacterium bovis )의 진단을 위한 프라이머 세트 설계
결핵균 중의 하나인 마이코박테리움 보비스를 효과적으로 진단하기 위한 프라이머 세트를 설계하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, NCBI Gene bank에 등록되어 있는 마이코박테리움 보비스의 IS1081 시퀀스(GeneBank accession no X61270.1)를 분석하여 마이코박테리움 보비스를 특이적으로 진단할 수 있는 프라이머 세트를 설계하였다. 그 후 PCR을 통해 77bp 크기의 마이크로박테리움 보비스 유전자 산물이 형성됨을 확인하였다. 상기 마이크로박테리움 보비스 진단을 위한 프라이머 서열을 하기 표 1에 나타내었다.
상기 프라이머 세트는 마크로젠사(Korea)에 주문 의뢰하여 제작하여 사용하였으며, 제조된 마이코박테리움 튜버클로시스군 진단용 URRT-PCR용 프라이머 서열을 표 1에 나타내었다. 하기 프라이머 서열은 마이코박테리움 보비를 특이적이고 신속하게 증폭하도록 설계된 프라이머다.
Figure 112014074036245-pat00001
실시예 2. 마이코박테리움 보비스( Mycobacterium bovis )의 진단을 위한 조건 확립
*상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트를 이용하고, URRT-PCR을 수행하여 마이코박테리움 보비스를 진단하기 위한 조건을 확립하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, URRT-PCR의 반응조성은 상기 실시예 1에서 제작한 URRT-PCR 프라이머 세트(서열번호 1 및 2) 각 7 pmole, 2X Prime Q-Master Mix 및 시료의 DNA를 포함하게 하여 총 6㎕로 조성하였다. 반응조건은 94℃, 100초간 선변성(pre-denaturation) 시킨 후, 94℃에서 1초; 60℃에서 2초; 및 72℃에서 3초를 40회 반복한 후, 용융온도분석을 수행하였다.
마이코박테리움 보비스가 감염된 시료를 URRT-PCR을 이용하여 진단 시, 소요되는 최단시간을 측정하기 위해서, 증폭 시간을 1 내지 5초로 변화를 주어 그 증폭여부를 확인함으로써, 진단에 필요한 최소 반응시간을 확인하였다. 또한, 용해 분석(melting point analysis)은 60-90℃ 구간을 측정하여 Tm값을 결정하였다. 그 결과를 도 1의 (A) 및 (B)에 나타내었다.
도 1의 (A) 및 (B)에 나타낸 바와 같이, 변성(denaturation)-어닐링(annealing)-중합(polymerization)의 각 PCR 단계의 시간을 1초-2초-3초까지 단축시켰으며(A), 16분 55초 이내에 용해 분석을 포함한 진단이 완료됨을 확인하여(B), 최종적으로, 진단에 필요한 시간은 최소 17분임을 확인하였다.
실시예 3. 마이코박테리움 보비스의 진단의 민감도 측정
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트를 이용하고, URRT-PCR을 수행하여 마이코박테리움 보비스를 진단 시 검출한계를 측정하고, 민감도를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트를 이용하여, 마이크로박테리움 보비스의 검출한계를 측정하기 위하여, 초기 기질양에 따른 마이크로박테리움 보비스 특이적 URRT-PCR을 수행하였다. 상기 마이크로박테리움 보비스가 감염된 조직에서 DNA를 추출하기 위하여, 상기 감염 조직 1 g을 잘게 잘라 PBS 5 ml 넣고 균질화한 후 PBS에 잘 녹는 1 ml의 20 mg/ml 라이소자임(lysozyme) 및 0.1 ml 프로테나아제 K(proteinase K)(>600 mAU/ml)를 가하고 56℃에서 4시간 이상 반응시켰다. 상기 반응시킨 시료 중 300ul를 비드 비팅(bead beating)(5000 rpm에 1분 비팅(beating)함)하고, 시판되는 NucleoSpin Soil kit(Macherey-Nagel)를 이용하여 DNA를 추출하였다. URRT-PCR는 상기 실시예 2에서 확립한 변성 1초-어닐링 2초-중합반응 3초의 최적 조건으로 수행하였다. 초기 기질로 마이코박테리움 보비스의 DNA를 100pg(1×10-10g), 10pg(1×10-11g), 1pg(1×10-12g) 및 100fg(1×10-13g)을 단계적으로 10진 희석하여 주형으로 사용하였으며, 또한, 용해 분석(melting point analysis)은 60-90℃ 구간을 측정하여 Tm값을 결정하였다. 그 결과를 도 2의 (A) 및 (B)에 나타내었다.
도 2 의 (A) 및 (B)에 나타낸 바와 같이, 100fg(1×10-13g) 기질양만으로도 명확하게 마이코박테리움 보비스의 증폭산물을 확인할 수 있음을 확인하였으며(A), 용해분석 결과는 모든 증폭산물이 동일하며, Tm값이 78.3±0.39 임을 확인하였다(B).
실시예 4. 마이코박테리움 보비스의 진단의 교차반응 측정
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트를 이용하고, URRT-PCR을 수행하여 마이코박테리움 보비스에 대한 교차반응을 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 하기 표 2에 나타낸 다양한 종류의 마이코박테리움 균주에 대한 DNA를 추출하여 URRT-PCR을 수행하여 증폭여부를 조사하였다. URRT-PCR은 상기 실시예 2에서 확립한 변성 1초-어닐링 2초-중합반응 3초의 최적 조건으로 수행하였다 그 결과를 하기 표 2에 나타내었다.
표 2에 나타낸 바와 같이, 마이코박테리움 튜버클로시스 H37Rv(M. tuberculosis H37Rv), 마이코박테리움 보비스 AN5(M. bovis AN5) 만이 검출되었으며, 국내 가축에서 흔하게 분리되는 마이코박테리움 파라튜버클로시스 ATCC-19698(M. paratuberculosis ATCC-19698), 마이코박테리움 아비움(M. avium), 마이코박테리움 인트라셀룰라레(M. intracellulare), 마이코박테리움 시미애(M. simiae), 마이코박테리움 스메그마티스(M. smegmatis), 마이코박테리움 칸사시(M. kansasii), 마이코박테리움 스크로푸라시움(M. scrofulaceum), 마이코박테리움 포티텀(M. fortitum) 및 마이코박테리움 채로내(M. chelonae) 등은 검출되지 않음을 확인하였다.
Figure 112014074036245-pat00002
실시예 5. 마이코박테리움 보비스의 진단의 특이도 측정
상기 실시예 1에서 제작한 프라이머 세트를 이용하고, URRT-PCR을 수행하여 마이코박테리움 보비스에 대한 특이도를 확인하기 위하여, 하기와 같은 실험을 수행하였다.
보다 구체적으로, 마이코박테리움 보비스를 특이적으로 진단하는지 확인하기 위하여, 하기 표 2에 나타낸 바와 같이, 마이코박테리움 보비스에 감염된 조직시료 및 감염되지 않은 조직시료를 이용하였다. URRT-PCR는 상기 실시예 2에서 확립한 변성 1초-어닐링 2초-중합반응 3초의 최적 조건으로 수행하였다. 그 결과를 하기 표 3에 나타내었다.
표 3에 나타낸 바와 같이, 마이코박테리움 보비스 균분리가 확인된 가장 표준적인(gold-standard) 양성 시료 6개 중 6개 시료에서 증폭이 되어 우수한 검출효과를 보였다. 또한, 균분리가 되지 않은 음성 조직시료에 대해서는 모두 증폭되지 않음을 확인하여, 마이코박테리움 보비스에 대한 우수한 특이성이 있음을 확인하였다.
Figure 112014074036245-pat00003
<110> Animal and plant quaratine agency <120> Composition for diagnosing Mycobacterium bovis and method for diagnosing the same <130> 1-59 <160> 2 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTC-URRT-Forward Primer <400> 1 gatccttcga aacgaccag 19 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MTC-URRT-123 Reverse primer <400> 2 gctcggtgtc gataagatga 20

Claims (8)

  1. 서열번호 1 및 2로 표시되는 염기서열로 이루어진 초고속실시간중합효소연쇄반응(Ultra-Rapid Real Time PCR, URRT-PCR)용 프라이머 세트를 포함하는 마이코박테리움 보비스(Mycobacterium bovis) 감염 진단용 조성물.
  2. 삭제
  3. 제1항의 조성물을 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 키트.
  4. 제1항의 조성물을 이용하여 초고속실시간중합효소연쇄반응을 수행하는 단계;를 포함하는 마이코박테리움 보비스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  5. 삭제
  6. 제4항에 있어서,
    상기 마이코박테리움 보비스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법은 시료의 게놈 DNA(gDNA)를 분리하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 마이코박테리움 보비스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 시료는 조직, 혈액, 타액, 뇨 및 체액에서 이루어진 군에서 1종 이상인 것을 특징으로 하는, 마이코박테리움 보비스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
  8. 제4항에 있어서,
    상기 초고속실시간중합효소연쇄반응은 93-95℃에서 95-105초간 선변성(pre-denaturation); 93-95℃에서 0.5-1.5초 간 변성(denaturation); 59-61℃에서 1.5-2.5초 간 어닐링(annealing); 및 71-73℃에서 2.5-3.5초간 중합(polymerization)하는 과정을 반복하여 수행하는 것을 특징으로 하는, 마이코박테리움 보비스 감염 진단에 대한 정보를 제공하는 방법.
KR1020140100499A 2014-08-05 2014-08-05 마이코박테리움 보비스 감염 진단용 조성물 및 이를 이용한 진단방법 KR101687156B1 (ko)

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* Cited by examiner, † Cited by third party
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US20100304371A1 (en) * 2009-05-29 2010-12-02 Ana Maria Zarraga Compositions and methods for detecting mycobacteria

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Pathol. Biol. (Paris), Vol. 59, No. 5, pp. 248-255 (2009.11.25.)*

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