JP6325517B2 - 核酸増幅用試料の調製方法 - Google Patents

Description

本願は、２０１２年３月３０日に出願されたＧＢ１２０５７６９．１に基づく優先権を主張し、その内容はすべて引用により本明細書に組み込まれる。

本発明は試料調製の分野に属する。特に本発明は、核酸増幅の実行に先立って試料を調製するための方法に関する。

核酸増幅技術（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）「ＮＡＡＴ」
ＮＡＡＴは試料中の核酸を高い感度と特異性で検出し定量することを可能にする。ＮＡＡＴは、試料中の特定テンプレート核酸の存在（特定ＮＡＡＴの履行後に増幅産物の存在によって示されるもの）を決定するために使用することができる。逆に、増幅産物が何も存在しなければ、それは試料中にテンプレート核酸が存在しないことを示す。このような技法は臨床応用、工業的応用および研究応用において極めて重要である。ＮＡＡＴの応用例には、ある病原体が試料中に存在するかどうかの決定、試料中のウイルス量の定量、試料中の２つ以上の遺伝子の相対レベルの比較、または試料中の特異的マーカーの発現レベルの決定などがあるが、これらに限るわけではない。

従来技術には、核酸を増幅するためのさまざまな熱サイクリング技法および等温技法が記載されている。ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの熱サイクリング技法では、温度サイクリングを使ってＤＮＡ合成の反復サイクルを推進することで、大量の新しいＤＮＡが元のテンプレートＤＮＡの量に比例して合成されることになる。増幅反応を推進するのに熱サイクリングに頼らない等温技法もいくつか開発されている。鎖置換活性を持つＤＮＡポリメラーゼを利用する等温技法が、ＲＮＡ合成工程を伴わない増幅反応のために開発されている。また、ＲＮＡ合成工程を伴わない増幅反応のために、逆転写酵素、ＲＮａｓｅ Ｈおよび／またはＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼを使用しうる等温技法も開発されている（例えば「Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｉｓｏｔｈｅｒｍａｌ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ − Ａ Ｒｅｖｉｅｗ」Ｎｕｃｌｅｏｓｉｄｅｓ， Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ ａｎｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ， Ｖｏｌｕｍｅ ２７， Ｉｓｓｕｅ ３ Ｍａｒｃｈ ２００８， ｐｐ．２２４−２４３参照）。

試料調製はＮＡＡＴに共通する要件である
ＮＡＡＴを使って特定試料における核酸の存在および／またはレベルを決定することが望まれる場合、試料中に存在する核酸を、ＮＡＡＴベースのアッセイが効果的に機能しうる状態でＮＡＡＴに利用できるようにするために、ＮＡＡＴの実行に先立って、試料をある程度の前処理（これを本明細書では「試料調製」という）に付すことが、一般に必要になる。

実際には、試料調製は、熟練者およびインフラストラクチャー、高価な消耗品、多岐にわたる試薬および溶媒（危険なものや有害なものも少なくない）、ならびに遠心分離器や真空マニホールドなどのさまざまな設備を必要とする、手間のかかる多段階プロセスでありうる。このプロセスの複雑な性質は、オペレータエラー（試料汚染を含む）が起こる機会を何重にも生じさせることになり、その結果、高価なロボット／半ロボット試料調製器具の助けを借りずに専門検査室以外で試料調製を実行するのは、困難である。

したがって、試料調製を単純化しそのコストを低減することができる方法は極めて望ましく、専門化した検査室から離れて、より困難な環境的・経済的状況下で、ＮＡＡＴベースの技術を応用することを可能にするであろう。例えば、効果的な試料調製のコストが低く、その試料調製法がアフリカの村落のような状況下で非熟練者でも確実に実行することができるほど簡単であれば、改良された試料調製法は、アフリカの村落においてＨＩＶ検出のためにＮＡＡＴを使用することを可能にするであろう。

試料調製の原理
試料調製に関連しうる一般原理には次の３つがある：
ｉ）核酸をＮＡＡＴに物理的に利用できるようにすること（試料溶解）
ｉｉ）ＮＡＡＴ阻害因子の除去／低減
ｉｉｉ）核酸の濃縮。
ＮＡＡＴが多少なりとも作動するには、試料中の核酸がＮＡＡＴ試薬と物理的に直接接触しなければならない。核酸は一般に細胞内またはウイルスキャプシド内に見出されるものであり、さらにそれらの細胞／ウイルスが複雑なマトリックス内に包埋されている場合もあるので、試料調製プロセスは、核酸をＮＡＡＴに利用できるようにするために、細胞／ウイルスキャプシドとあらゆる関連試料マトリックスをどちらも十分に破壊することができなければならない。

さらに、目的の核酸が内在しているマトリックスには、ＮＡＡＴを阻害する能力を有する物質が含まれている場合があるので、ＮＡＡＴが十分に機能するには、そのような阻害因子を除去または低減することが必要になりうる。

さらにまた、いくつかの例では、試料中の目的の核酸の存在量が、単位体積あたりでは極めて低いこともありうる。そのような場合、大体積から小体積へと核酸を濃縮することができる方法は有益であり、多くの場合、そのような核酸の濃縮は、それ自体が、阻害因子からの核酸の精製を容易にしうる。

試料溶解
核酸を利用可能にするための試料溶解は、機械的手段（Ｊ．Ｂｒｅｎｔ（１９９８）「Ｂｒｅａｋｉｎｇ Ｕｐ Ｉｓｎ’ｔ Ｈａｒｄ Ｔｏ Ｄｏ： Ａ ｃａｃｏｐｈｏｎｙ ｏｆ ｓｏｎｉｃａｔｏｒｓ， ｃｅｌｌ ｂｏｍｂｓ ａｎｄ ｇｒｉｎｄｅｒｓ」Ｔｈｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｓｔ １２（２２）：２３に総説がある）および非機械的技法によって果たすことができる。簡単な機械的アプローチには、ブレンダーの使用や、狭い開口部に細胞を通すことによるホモジナイゼーションなどがある。超音波処理は試料を高周波音波にばく露することに基づき、ビーズアプローチは、細胞をさまざまなビーズの存在下で激しい混合にばく露することに基づく。

試料の化学的破壊は機械的破壊に代わる手段である。洗浄剤は、脂質二重層を破壊し、タンパク質を可溶化し／変性させることによって作用する重要な化学的溶解剤である。イオン洗浄剤であるドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）は、一つには、細胞内の高分子を可溶化しタンパク質を変性させる能力を持つことから、法医学的ＤＮＡ抽出プロトコールによく使用される（Ｊ．Ｌ．Ｈａｉｎｅｓ ｅｔ ａｌ （２００５）「Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ」Ｖｏｌ．２（２００５ Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ， Ｉｎｃ． Ｐｕｂ．））。プロテイナーゼＫは、細胞溶解を容易にするために、洗浄剤に基づく（例えばＳＤＳ、Ｔｗｅｅｎ−２０、Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）溶解プロトコールと並行して使用されることが多い。洗浄剤溶解のもう一つの形態はＦＴＡペーパー（米国特許第６，９５８，３９２号）に基づく。これは、弱塩基、陰イオン洗浄剤、キレート剤、および保存剤が含浸されたセルロースフィルタである。

グアニジン塩酸塩などのカオトロピック剤も効果的な試料溶解剤として作用することができ、好都合なことに、これらは、以下に詳述するように、核酸を精製するための手段にもなる。

さらにもう一つの溶解のためのアプローチは、細胞／ウイルスをこじ開けるための熱の使用である。この物理的アプローチには、要求されるハードウェアが極めて単純（加熱ブロックまたは水浴だけ）という恩恵がある。熱は、一定のグラム陽性菌や芽胞など、溶解が困難な細胞の溶解効率を改善するために、他の化学的溶解試薬と一緒に使用することができる。化学的かつ熱的な溶解法の恩恵は、それらが、目的の核酸を分解しうるヌクレアーゼを、とりわけ効率よく失活させることである。さらに、これらは、ＮＡＡＴに使用される酵素を傷つけうるプロテアーゼを失活させる。

ＮＡＡＴ阻害因子
ＮＡＡＴの活用および有用性は、ＮＡＡＴの実行に負の影響を与えるように作用する広範な物質によって、著しい悪影響を受ける（さまざまな阻害因子問題を概観するには、例えば「Ｃａｐａｃｉｔｙ ｏｆ Ｎｉｎｅ Ｔｈｅｒｍｏｓｔａｂｌｅ ＤＮＡ Ｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｓ Ｔｏ Ｍｅｄｉａｔｅ ＤＮＡ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ Ｐｒｅｓｅｎｃｅ ｏｆ ＰＣＲ−Ｉｎｈｉｂｉｔｉｎｇ Ｓａｍｐｌｅｓ」Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｏｃｔｏｂｅｒ １９９８ ｖｏｌ．６４ ｎｏ．１０ ３７４８−３７５３を参照されたい）。阻害因子の例は、血液からのヘム、植物および土壌に見いだされるフミン酸、ポリフェノール、一定の二価金属およびコラーゲンである。ほとんどすべての生物学的試料がＮＡＡＴ阻害因子を含有しているので、ＮＡＡＴの実行に先立って、阻害因子が除去されるか、そのレベルが低減するように、試料を処理する必要があることは明らかである。阻害性物質の負荷量が極めて高い糞便など、一定の複雑で不均質なマトリックスの場合は、とりわけそうである。

阻害因子除去
ＮＡＡＴ阻害因子の除去または低減は、ｉ）核酸および／または阻害因子の何らかの性質をそれぞれ利用して核酸を阻害因子から能動的に分離すること、ｉｉ）試料を希釈することで、阻害因子の濃度を、使用するＮＡＡＴに悪影響を及ぼす濃度より低くすること、またはｉｉｉ）阻害因子の阻害効果を中和する液相添加物を加えることによって、達成することができる。

例えば、Ｃｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ、カリフォルニア州ハーキュリーズ）は、ＮＡＡＴを阻害しうる多価金属カチオンに効率よく結合する修飾樹脂である（Ｗａｌｓｈ Ｐ．Ｓ． ｅｔ ａｌ．「Ｃｈｅｌｅｘ １００ ａｓ ａ ｍｅｄｉｕｍ ｆｏｒ ｓｉｍｐｌｅ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｆｏｒ ＰＣＲ−ｂａｓｅｄ ｔｙｐｉｎｇ ｆｒｏｍ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｍａｔｅｒｉａｌ」Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ １０（４）：５０６−１３）。

ポリビニルポリピロリドン（ＰＶＰＰ）は、ポリビニルピロリドン（ＰＶＰ）の不溶性高架橋型修飾体であり、ＤＮＡ抽出時にフミン酸などのポリフェノールの除去に使用されている（Ｈｏｌｂｅｎ Ｗ．Ｅ．， Ｊａｎｓｓｏｎ Ｊ．Ｋ．， Ｃｈｅｌｍ Ｂ．Ｋ．， Ｔｉｅｄｊｅ Ｊ．Ｍ．（１９８８）「ＤＮＡ Ｐｒｏｂｅ Ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓｏｉｌ Ｂａｃｔｅｒｉａｌ Ｃｏｍｍｕｎｉｔｙ」Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ５４（３）：７０３−７１１）。

本発明者らは、糞便阻害因子除去に有用な一連のイオン交換樹脂を同定した。これらには、脱色に使用されるアミノ化スチレン−ジビニルベンゼン樹脂であるＯｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２（Ｄｏｗｅｘ）や、弱塩基性高多孔性陰イオン交換樹脂であるＤｉａｉｏｎ ＷＡ３０（三菱化学）などがあるが、これらに限るわけではない。本発明者らは、これらの樹脂が糞便溶解物からのＮＡＡＴ阻害因子の除去においてＰＶＰＰを代替しうることを見出した。活性炭は、ＮＡＡＴ阻害因子を除去するために使用することができるもう一つの材料である。活性炭は、好ましくは、それを保持するために使用されるフリットまたはフィルタを通過することができない形態にあるだろう。例えば活性炭は大きな粒子またはビーズの形態をとりうる。一般に、樹脂とフリットまたはフィルタの組み合わせは、フリットまたはフィルタが、樹脂または使用される他の固相材料を保持しつつも、樹脂によって閉塞されることがないように選択することができる。

これに代わる一つのアプローチは、サイズ排除クロマトグラフィーを使って高分子量の核酸を低分子量のＮＡＡＴ阻害因子から分離することである。例えば、これを実現するために、ＧＥ Ｈｅａｔｈｃａｒｅのｉｌｌｕｓｔｒａ ＭｉｃｒｏＳｐｉｎ（商標）Ｇ−２５スピンカラムを使用することができる。

ＮＡＡＴ阻害因子に対する最も簡単なアプローチは、おそらく、阻害因子濃度が低すぎて特定ＮＡＡＴに悪影響を及ぼさないポイントまで、試料を単純に希釈することであるが、これには、試料中のどの核酸も希釈してしまうという欠点がある。したがって、核酸が制限的でありうる（例えば病原体検出のような）場合、希釈アプローチでは、ＮＡＡＴベースのアッセイで偽陰性結果が得られることにもなりうる。一定の阻害因子を中和する液相試薬を加えることによって、希釈アプローチを、ある程度は、改良することができる。例えば、一定の阻害性二価金属（例えばＣａ^２＋）に結合して、それらがＮＡＡＴに利用されえないようにし、そうすることで、ＮＡＡＴを使用可能にするのに必要な試料の希釈量を低減するために、ＥＤＴＡを試料に加えることができる。実際、ＮＡＡＴによって検出しようとする生物の数が極めて高レベルないくつかの臨床応用の場合、阻害因子濃度は低すぎて増幅を阻害しないが、反応中に存在するターゲットの量は再現性のある検出にとって十分であるような倍率で、試料をＥＤＴＡ含有緩衝液に希釈することができる。しかし、阻害性が非常に高い試料タイプ（例えばヒト糞便）では、ＮＡＡＴを使用することができるポイントまで阻害因子レベルを低減するには、ＥＤＴＡを使っても、５００倍程度の希釈倍率が必要になることが多く、したがって、このアプローチが理想的でないことは明らかである。というのも、そのような大希釈はＮＡＡＴベースの試験の感度に間違いなく悪影響を与えるであろうからである。さらに、ＥＤＴＡは、ＤＮＡ／ＲＮＡポリメラーゼが補因子として必要とするＭｇ^２＋をキレートすることができるので、過剰量のＥＤＴＡは、それがＮＡＡＴベースのアッセイに持ち越された場合には、それ自体がＮＡＡＴにとって阻害性でありうる。

核酸精製
試料調製が核酸の特異的精製を伴う場合は、これにより、ＮＡＡＴ阻害因子が除去されるだけでなく、核酸を試料から濃縮することもできる。

このアプローチでは、核酸のユニークな性質を使って、試料の他の構成成分（阻害因子を含む）から核酸を分離し、選択した緩衝液中に核酸を濃縮することを可能にする。これには、ＮＡＡＴベースの試験の感度を増加させるという、著しい利点がある。例えば、１ｍｌの血液に含まれるＨＩＶからの核酸をちょうど２０μｌに濃縮することができるとすると、試料調製後は、ＨＩＶ核酸の濃度を５０倍まで増加させたことになり、これが、ある特定ＮＡＡＴによってＨＩＶが検出されるか検出されないかの違いをもたらしうる。

最初期の核酸精製法の一つは、フェノール／クロロホルム抽出の使用であった（Ｄ．Ｍ．Ｗａｌｌａｃｅ （１９８７）「Ｌａｒｇｅ ａｎｄ ｓｍａｌｌ ｓｃａｌｅ ｐｈｅｎｏｌ ｅｘｔｒａｃｔｉｏｎｓ」Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ． １５２：３３−４１；Ｍａｎｉａｔｉｓ，Ｔ． ｅｔ ａｌ．「Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ」Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ」第３版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ、ニューヨーク州コールドスプリングハーバー）。この方法では、大半のタンパク質が有機相または有機相−水相界面に移動し、可溶化されたＤＮＡは水相に残る。ＤＮＡ含有相をエタノール沈殿に付し、一連の遠心分離および洗浄工程後に、ＤＮＡを単離することができる。有機抽出アプローチの利点は、これが高品質ＤＮＡ調製物を（比較的少ないタンパク質量および比較的低い分解率で）与え、今なお、現在利用可能な方法の中で最も信頼性の高いものの一つであるという点である。大きな欠点は、この手順が時間集約的かつ労働集約的であり、危険な溶媒および試薬を使用し、扱いにくい設備を必要とし、ハイスループット環境に適合させるのが比較的困難であり、臨床現場即時検査や不熟練オペレータによる使用には間違いなく適していないことである。

核酸精製に代わるアプローチは、シリカとカオトロピック剤の併用である（Ｂｏｏｍ， Ｒ． ｅｔ ａｌ．（１９９０）「Ｒａｐｉｄ ａｎｄ Ｓｉｍｐｌｅ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」Ｊ Ｃｌｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． ２８（３）：４９５−５０３）。カオトロピック剤は、細胞／ウイルスを溶解するように作用するだけでなく、核酸がシリカ粒子に結合する原因になるようにも作用する。次に、低イオン強度緩衝液（または水）を使って、核酸をシリカから溶出させることができる。ブーム法は、幅広く、いくつかの溶解／精製アプローチ（例えばＤＮＡＩＱシステム、Ｐｒｏｍｅｇａ、ウィスコンシン州マディソン）の基礎をなしている。シリカビーズに代わる選択肢はシリカ膜の使用である（ＱＩＡａｍｐ、Ｑｉａｇｅｎ、ドイツ・ヒルデン）。加えて、ＤＮＡ結合がさらに強化されるように、シリカビーズそのものを修飾することもできる。

上記に代わる電荷ベースのアプローチはイオン交換樹脂の使用である。ＤＮＡと他の高分子とを含有する溶液をイオン交換樹脂にばく露する。負に荷電したＤＮＡ（そのリン酸エステル主鎖によるもの）は、所与の塩濃度またはｐＨにおいて、樹脂に相対的に強く結合する。タンパク質、糖質、および他の不純物は（全く結合しないわけではないにしても）相対的に弱く結合し、ビーズから（例えばカラム形式で、または遠心分離によって）洗い流される。次に、精製されたＤＮＡを高イオン強度緩衝液に溶出させることができる。現在使用されている市販の陰イオン交換樹脂はＤＥＡＥ修飾シリカビーズに基づいている（Ｇｅｎｏｍｉｃ−ｔｉｐ、Ｑｉａｇｅｎ）。

イオン交換樹脂のアプローチに関連するアプローチは、所与のｐＨで正味の正電荷を有し、ＤＮＡを結合する能力を有する、修飾固形マトリックスを使用することである（Ｂａｋｅｒ，Ｍ．Ｊ．、米国特許第６，９１４，１３７号）。この修飾体は、高いｐＨでは（イオン性基が中性になるか負に荷電した時に）ＤＮＡ結合が取り消されるような形で、イオン性基を含有する。広く使用されているこのタイプのアプローチは、ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈビーズ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ， Ｉｎｃ．、カリフォルニア州カールズバッド）に基づいている。

オリゴヌクレオチド捕捉
捕捉オリゴヌクレオチドの使用によってターゲット核酸を単離することもできる。この方法では、試料核酸が、ターゲット中の相補的ターゲット配列とハイブリダイズする捕捉オリゴヌクレオチドと共にインキュベートされる。次に、ハイブリダイズしたターゲット−捕捉オリゴヌクレオチド複合体を溶液から取り出し、不純物を除去するために洗浄する。これは、ビオチン−ストレプトアビジン（この場合は捕捉オリゴオリゴヌクレオチドがビオチン化される）などのリガンド−受容体相互作用によって達成することができ、磁気ビーズ、被覆チューブなどを含むいくつかのフォーマットで使用することができる。次に、捕捉されたターゲットを増幅反応にそのまま加えることができる。オリゴヌクレオチド捕捉の使用例の一つはＡＰＴＩＭＡ ＨＩＶアッセイ（Ｇｅｎ−Ｐｒｏｂｅ）である。

免疫磁気分離（ＩＭＳ）
特異的細胞タイプを、それらの特異的表面エピトープに対する抗体が常磁性粒子に結合しているものを使って単離することもできる。ターゲット細胞／ウイルスが磁場の適用によって試料から取り出され、当該生物の検出アッセイに加えられる。ＩＭＳの使用例の一つは、Ｐａｔｈａｔｒｉｘシステム（Ｍａｔｒｉｘ ＭｉｃｒｏＳｃｉｅｎｃｅ Ｌｔｄ）によるサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）の検出である。（Ｏｄｕｍｅｒｕ Ｊ．Ａ． ＆ Ｃａｒｌｏｓ Ｇ．Ｌｅｏｎ−Ｖｅｌａｒｄｅ Ｃ．Ｇ．（２０１２）「Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｆｏｏｄ Ｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓ」Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ −Ａ Ｄａｎｇｅｒｏｕｓ Ｆｏｏｄｂｏｒｎｅ Ｐａｔｈｏｇｅｎ、Ｂａｒａｋａｔ Ｓ．Ｍ．編、Ｍａｈｍｏｕｄ． ＩｎＴｅｃｈ、クロアチア・リエカ）。

磁気ビーズ
ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ、オリゴヌクレオチド捕捉および免疫磁気分離に、磁気ビーズまたは磁気粒子を使用できることは、当業者にはわかるであろう。シリカと磁化酸化鉄とをどちらも含有する磁気粒子または磁気ビーズを使って、ブーム法を履行することもできる（Ｂｅｒｅｎｓｍｅｉｅｒ Ｓ．（２００６）「Ｍａｇｎｅｔｉｃ ｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ａｎｄ ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ」Ａｐｐｌ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ． Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ． ７３（３）：４９５−５０４）。磁気粒子ブーム抽出の一例はＮｕｃｌｉＳＥＮＳシステム（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）である。

試料調製プロトコールの課題
上で論じた試料調製の３つの態様、すなわち抽出、阻害因子除去、核酸精製／濃縮は、必然的に多段階手順をもたらす。この手順の各工程は時間と労力を付加し、複雑さ、コストおよびオペレータエラーを持ち込む。高度な訓練を受けたオペレータがいる専門検査室にとってさえ、現在の試料調製方法の複雑な性質は、手作業によるアプローチがあまりにも煩雑すぎて使用することができず、それゆえに、何らかの形の自動化を必要とすることを意味する。

専門検査室を離れると、試料調製を実行するためのインフラストラクチャーや熟練オペレータは存在しないだろう。この問題に対処するために、非熟練ユーザーでもＮＡＡＴアッセイを実行することができるように、試料調製の個別的自動化を可能にする技術が導入されている。しかしそのようなアプローチは複雑で高額な消耗品を必要とし、そのことが、高価な試料調製方法の購入に経済的制約がある一定の環境から、それらの使用を排除することになりうる。

部分的に自動化された核酸の精製のために、さまざまな検査室用ロボット機器が開発されている。例えばＭａｘｗｅｌｌ １６機器（Ｐｒｏｍｅｇａ）、ｉＰｒｅｐ機器（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）、ＮｕｃｌｉＳＥＮＳ ｅａｓｙＭＡＧ（ｂｉｏＭｅｒｉｅｕｘ）およびＱｉａｇｅｎ ＥＺ１、ＢｉｏＲｏｂｏｔ Ｍ４８およびＱｉａｃｕｂｅシステム（Ｑｉａｇｅｎ）は、一連の臨床および法医学的試料タイプから核酸を精製するように設計されている。これらのシステムの一部は、機器に試料をローディングする前に、手作業による何らかの前処理を必要とする。Ｉｎｎｕｐｒｅｐ（ａｎａｌｙｔｉｋＪｅｎａ、ドイツ・イツェホー）、ＬａｂＴｕｒｂｏ（Ｔａｉｇｅｎ、台湾・台北）、Ｘｉｒｉｌ １５０（Ｘｉｒｉｌ ＡＧ、スイス・ホンブレヒティコン）、およびＱｕｉｃｋｇｅｎｅ（富士フィルム、日本・東京）抽出システムは、いずれも、前述の完全ロボットシステムより多くの手作業によるハンドリングを必要とする。

より完全に自動化されたシステムが臨床検出にも法医学的検出にも使用されている。最も注目に値するのは、Ｃ．ディフィシレ（Ｃ． ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）について、糞便スワブ標本に由来するＤＮＡ抽出およびリアルタイムＰＣＲを実行するＣｅｐｈｅｉｄ（カリフォルニア州サニーベール）ＧｅｎＸｐｅｒｔシステムである。しかし、設備のコストも、試験１回あたりのコストも、多くの機関にとっては手が届かないといっていいほど高い。

圧力を使った試料調製
試料調製プロセスの一部として、圧力または圧力差を使ってコンパートメント間で液体を移動させる方法は、いくつか存在する。例えば以下の文書には、試料調製プロセスの一部として圧力を使用する方法が記載されている。
・ＧＢ２３３７２６１は、加圧下で多孔性膜フィルタを使用する、全細胞からの核酸の精製を論じている。
・ＪＰ２００５０９５００３は、圧力差によって試料溶液を通過させることで核酸を分離、精製するためのカートリッジを教示している。
・ＪＰ２００５１１８０２０は、少なくとも２つの開口部を有する、核酸吸着性多孔性材料が入っているカートリッジと、少なくとも２つの開口部間に圧力差を生じさせるための装置を教示している。
・ＵＳ２００７０２６９８２９は、加圧器具を包含し、固相を介して接続された第１および第２容器部分を含む、核酸単離機器を論じている。
・ＵＳ２００９／００２３９０４は、少なくとも２つの開口部を有し、核酸吸着材固相が入っている、カートリッジを教示している。この固相の両端に圧力差が適用される。
・ＵＳ５８０４６８４には、生物学的試料を、核酸の沈殿を引き起こす核酸結合性マトリックス（懸濁液中のアガロース粒子）と接触させ、マトリックスから溶出させることが教示されている。
・ＵＳ２００８／０２７５２２８には、核酸を単離精製するためのカートリッジに液体を注入し、その液体を、圧力差によって核酸吸着材固相に通過させることが教示されている。
・ＵＳ２００９／００２３２０１は、核酸検出カセットおよび水溶性耐凝集性有機化合物を論じている。

このような方法の利点は、それらが、試料調製プロセスにおける遠心分離器などの設備の使用を回避することができる点である。例えば、試料調製が容易になるように、圧力を使って液体を器具の中で移動させることができる。しかし、そのような方法の欠点は、依然として、試料の処理に複雑な消耗品またはポンプが要求される点である。

試料調製はＮＡＡＴベースのアッセイには不可欠な構成要素である。試料タイプ、阻害因子のレベルおよび試料中の核酸を濃縮するための要件によっては、試料調製が、ＮＡＡＴベースのアッセイを実行する際の、最も面倒で費用のかかる部分になりうる。

専門的設備もしくは人員を利用できない人々または高価な自動システムを購入する余裕がない人々がＮＡＡＴベースのアッセイの恩恵を享受するために、高額でなく、非熟練ユーザーでも実行することができ、精巧なハードウェアを必要としない、より簡単な方法が求められている。圧力を使って器具内で液体を移動させることによって、試料を調製するためのロボット、遠心分離器または真空マニホールドなどの設備の必要を取り除く方法は存在するが、そのような方法は、依然として、圧力差を生じさせるための複雑な消耗品またはハードウェアのいずれかが足手まといになる。さらに、低コストで容易に利用できる物理的方法（特に熱）を利用して試料調製を達成する方法は、まだ十分には活用されていない。穏和な熱の生成は極めて容易であるから、熱で推進することができるが、より洗練された試料調製関連化学を併用することができる試料調製方法があれば、ＮＡＡＴベースのアッセイのための試料の調製を、より低いコストで、はるかに単純なハードウェアを使って、より容易に達成することが可能になるであろう。そのような試料調製方法があれば、より困難な環境で、例えば小さなクリニックにおいて低リソースの状況下で、ＮＡＡＴベースのアッセイを実行することが可能になるであろう。

好ましい実施形態の詳細な説明
本発明者らは、コンテナをそのコンテナから液体を溶出させるのに十分な圧力を生み出す温度まで加熱することによって、密封されたコンテナから液体を溶出させることが可能であることを発見した。したがって本発明は、液体試料を多孔性固形マトリックスに通過させるための方法であって、多孔性固形マトリックスをコンテナの少なくとも一部として含んでいるコンテナ内に液体試料を密封する工程、および温度を上昇させることでコンテナ内部の圧力を増加させ、よって液体が多孔性固形マトリックスを通過するようにする工程を含む方法を提供する。液体を多孔性固形マトリックスに通過させることにより、液体の少なくとも一部をコンテナから取り除くことができる。本発明の方法は、前記コンテナから第２コンテナまたは容器へと液体を移すことも可能にする。

熱を使って液体試料を多孔性固形マトリックスに通過させるプロセスを、本明細書では、「熱溶出（Ｈｅａｔ−Ｅｌｕｔｉｏｎ）」という。

有益なことに、さまざまな異なるコンテナサイズを使っても、１１０℃未満の温度で、液体をコンテナから多孔性固形マトリックスに通過させるのに十分な圧力を生じさせうることを、見出した。これは、室温ではコンテナからの液体の流出を妨げる多孔性固形マトリックスの、コンテナにおける存在にもかかわらず、標準的なプラスチック製消耗品を使って達成することができた。このような穏やかな温度および圧力条件を使用することができるということは、このプロセス中に核酸が損傷を受けることがなく、十分な圧力を獲得したコンテナが破損したり、まして破裂したりする重大な危険もなく、極端に熱く（＞１１０℃に）器具を加熱する必要もないことを意味する。したがって本発明は、改良された試料調製（特にＮＡＡＴベースのアッセイを実行する前の試料調製）法を提供する。

本発明のさらなる利点は、試料調製を実行するために要求される工程（特に液体移送工程）の数が、他の方法と比較してはるかに少ないことである。例えば、ＮＡＡＴ阻害因子を核酸より強く結合する多孔性固形マトリックスを使用する実施形態の場合、オペレータがしなければならないことは、
１）第１コンテナに試料を移すこと、
２）熱溶出を実行すること、および
３）溶出した核酸をＮＡＡＴアッセイにおいて使用すること
だけである。

追加の液体移送が必要になることはない。さらにこれは、コンテナそのものと加熱ブロックを使用するだけで達成することができる。追加の遠心分離器、ポンプまたは真空システムは必要ない。これは、試料調製を実行するために要求されるハードウェアインフラストラクチャーを著しく低減すると共に、試料調製プロセスの複雑さを低減するので、非熟練オペレータでも、それを容易に実行することができるようになる。

温度は最高１１０℃の温度まで増加させることができる。本発明者らは、密封コンテナを１１０℃まで加熱すると、コンテナのサイズに関係なく、液体試料を多孔性固形マトリックスに通過させるのに十分な圧力が生み出されることを見出した。温度は、１１０℃未満である温度まで、例えば１００℃未満、９０℃未満、８０℃未満、または７０℃未満の温度まで増加させることもできる。液体試料を多孔性固形マトリックスに通過させるための最低温度は、コンテナが異なれば異なりうる。それは、例えば少なくとも４０℃、少なくとも５０℃または少なくとも６０℃であることができる。一般に温度は、室温を上回る温度まで増加させることになる。正確な温度は、コンテナをさらす温度を上げていき、液体試料が多孔性固形マトリックスを通過する時の温度を確定することによって、実験的に容易に決定することができる。使用される熱が、細胞またはウイルスキャプシドを溶解するためにも使用される場合は、前記細胞またはウイルスキャプシドを溶解するのに十分な温度を、実験的に容易に決定することができる。ただし一般的には、少なくとも９０℃の温度が必要になるであろう。

本発明では、コンテナに加えた液体試料のすべてを多孔性固形マトリックスに通過させることができる。液体試料の元の体積の少なくとも２０％、少なくとも３０％、少なくとも４０％、少なくとも５０％、少なくとも６０％、少なくとも７０％、少なくとも８０％、または少なくとも９０％を多孔性固形マトリックスに通過させる方法も、本発明の範囲内である。多孔性固形マトリックスに通過させる液体試料は、コンテナに加えられる液体の組成と比較して異なる組成を有しうる。例えば、溶出した試料は、コンテナに加えられた液体試料と比較して、低いＮＡＡＴ阻害因子含量を有しうる。

熱溶出は、コンテナを加熱して到達させようとする温度を有する加熱器具にコンテナをばく露することによって実施することができる。あるいは、所望の温度に到達するまで、コンテナ内の熱を徐々に増加させることも可能である。さらにまた、コンテナを、マイクロ波または赤外線などの放射線に付すこともできるであろう。

液体は、コンテナを加熱することによって生み出される圧力によって多孔性固形マトリックスを通過するので、本発明の熱溶出は、さらなる外力、例えば遠心分離または（例えば真空ポンプによる）真空の適用の非存在下で実行することができると理解される。

本発明ではコンテナが密封されることになる。コンテナを密封する方法は当技術分野では知られている。例えばコンテナは蓋または栓を使って密封することができる。あるいは、コンテナの開口部の縁を融合することによって、例えば開口部を加熱して、縁を押し固めることによって、コンテナを密封することも可能である。これは、コンテナがプラスチックまたは他の熱可塑性材料でできている場合は、開口部を加熱し、圧力の適用によって開口部の縁を融合することが、容易に可能であるだろうから、特に当てはまりうる。これは、例えば加熱した掴み具を使用することによって達成することができる。本発明の熱溶出法は液体が多孔性固形マトリックスを通過することを必要とするので、多孔性固形マトリックスの少なくとも一部または全部は密封されないと理解される。そうでなければ、液体が通過できないからである。

本発明の方法は、コンテナに液体試料を加えるというさらなる一工程を含みうる。

コンテナ（密封された開口部をもう一つ持つもの）に液体試料を添加し；液体を投入したコンテナの開口部を密封し；この第１コンテナからの液体の流出を阻止するであろう何らかの種類のフィルタの反対側にあるコンテナの出口を開き；コンテナからの溶出液を収集することができる収集容器の内部に第１コンテナを入れ；コンテナおよび容器を加熱ブロックに入れ、次いで、液体をコンテナから容器に移らせる原理を示す図である。 図１ａと同様であるが、コンテナには、核酸よりもＮＡＡＴ阻害因子に好んで結合する固相材料が入っている。核酸溶液は熱溶出後の容器中に見いだされる。 図１ｂと同様であるが、固相材料と試料は、コンテナに加える前に混合される。 図１ａと同様であるが、コンテナには、ＮＡＡＴ阻害因子よりも核酸に好んで結合する固相材料が入っている。核酸は、第１容器内の熱溶出後の固相材料に固定化されることになる。 図１ｄと同様であるが、固相材料と試料は、第１容器に加える前に混合される。 図１ｂまたは１ｃと同様であるが、溶出した核酸は、引き続いて、核酸に好んで結合する異なる固相材料を使って濃縮される。この場合、固相材料は、磁石を使って試料から沈降させることができる常磁性ビーズからなる。核酸は、適切な溶出緩衝液で材料から放出させるか、そうでなければ、ＮＡＡＴベースのアッセイにそのまま加えることができる。 実施例１で説明する２つの容器±第１容器中の固相材料での熱溶出を示すデータである。 ターゲット核酸の希釈系列に関して典型的なＢＡＲＴ−ＬＡＭＰアウトプットを示す図である。ＢＡＲＴ技術を使うと、陽性試料では、経時的に光強度が増加した後、減少する。光のピークに到達するまでの時間が、増幅反応中に存在する標的核酸の量に逆比例する。 ＩＳＯチョコレートエンリッチメントからの阻害因子除去に関する加熱および非加熱ＩＭ−ＳＤＶＢの比較。 コーヒーエンリッチメントからＮＡＡＴ阻害を除去するための４級ＳＤＶＢおよび３級ＳＤＶＢの使用。樹脂を使用しないか、ＩＭ−ＳＤＶＢ樹脂（ａ）を使用した場合と比較して、４級ＳＤＶＢ樹脂（ｂ）および３級ＳＤＶＢ樹脂（ｃ）は、インスタントコーヒーが引き起こす阻害を除去するのに、極めて有効であることが示される。 樹脂混合物と、１００℃のホットブロックにおける加熱時間とによる、フミン酸阻害の除去（ａ）；１００℃のホットブロック上で加熱された樹脂混合物の経時的温度プロファイル。 １００℃に設定されたホットブロックからの熱溶出溶出液の経時的温度プロファイル。 熱溶出と、緩衝液への希釈のみとを対比した、キシラン阻害の除去。 さまざまなフリットの使用およびワックスの使用による溶出時間の調節。 Ａ）ＰＶＰＰカラムを介した糞便ＩＭ ＳＤＶＢ−緩衝液混合物の熱溶出、Ｂ）煮沸した糞便ＩＭ ＳＤＶＢ−緩衝液混合物をローディングしたＰＶＰＰカラムの遠心溶出、およびＣ）煮沸した糞便ＩＭ ＳＤＶＢ−緩衝液混合物の遠心清澄化によって抽出されたＣ．ディフィシレ陽性糞便試料間の比較を示すＣ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応に関する増幅プロファイル。 熱溶出糞便抽出物と遠心分離によって溶出された糞便抽出物とを示すＵＶ可視化インターカレーター染色１％アガロースの強度プロファイル。 Ｐｉｅｒｃｅ ８ｍｌカラム中の自社開発樹脂混合物の熱溶出および収集チューブを使ったＣ．ディフィシレ陽性糞便試料およびＣ．ディフィシレ陰性試料の抽出後を示す、Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応に関する増幅プロファイル。 （ａ）熱溶出による方法と希釈法とを対比した、Ｃ．ディフィシレ陽性臨床便試料からのＣ．ディフィシレＬＡＭＰ ＢＡＲＴ検出。（ｂ）熱溶出による方法と希釈法とを対比した、Ｃ．ディフィシレ陽性臨床便試料からの阻害因子対照ＬＡＭＰ ＢＡＲＴプロファイル。 簡略化ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）磁気ビーズ法による濃縮前および濃縮後のＣ．ディフィシレゲノムＤＮＡ検出の比較。 熱溶出を用いるマルチ容器試料調製および増幅の統合。 ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）磁気ビーズを第１容器に組み込んでの熱溶出の実行の有無によるＣ．ディフィシレゲノムＤＮＡ検出の比較。

コンテナ
本明細書に関して「コンテナ（ｃｏｎｔａｉｎｅｒ）」とは、熱溶出に適した容器をいう。

一般に、コンテナは、多孔性固形マトリックスを、コンテナの少なくとも一部として含んでいる。多孔性固形マトリックスは、コンテナの内側とも外側とも連通するように配置することができる。これにより、液体試料を多孔性固形マトリックスに通過させた時に、液体試料をコンテナの内側から外側へと移すことが可能になる。

多孔性固形マトリックスは、コンテナの一体部分であってもよく、例えばコンテナの壁の少なくとも一部を形成することができる。多孔性固形マトリックスがコンテナの一体部分を形成しないことも可能である。これらの実施形態では、コンテナが開口部を含み、多孔性固形マトリックスが、その開口部に対して、多孔性固形マトリックスがコンテナの内側とも外側とも連通するように置かれるであろう。

コンテナは、コンテナに液体試料を加えるのに適した１つ以上の開口部を含むことができる。本発明の方法によれば、これら１つ以上の開口部は、液体試料をコンテナ内に密封するために、密封される必要がある。

「容器（ｖｅｓｓｅｌ）」とは、液体を入れるのに適しているが、熱溶出には適さない、任意の容器をいう。

多孔性固形マトリックス
コンテナは、室温（例えば１８〜２２℃）では液体をコンテナ内に保持することができるが、温度の増加ゆえにコンテナ内の圧力が増加した時は液体が通過することを許す、少なくとも１つの多孔性固形マトリックスを含むであろう。

いくつかの実施形態では、コンテナが、１タイプの固形多孔性マトリックスだけを含む。本発明の方法は、２つ以上の異なる多孔性固形マトリックスを含むコンテナを使って実施することもできる。例えば、コンテナは第１多孔性固形マトリックスと第２多孔性固形マトリックスとを含みうる。第１多孔性固形マトリックスは、好ましくは、コンテナが加熱される前は、液体をコンテナ中に保持する。第１多孔性固形マトリックスはフィルタであることができる。第２多孔性固形マトリックスは、ＮＡＡＴ阻害因子を核酸より強く結合するマトリックスであるか、核酸をＮＡＡＴ阻害因子より強く結合するマトリックスであることができる。第２多孔性固形マトリックスは、液体を加える前にコンテナに加えることができ、かつ／または液体と事前に混合して、液体試料と一緒にコンテナに加えることができる。第２多孔性固形マトリックスはビーズ（例えば磁気ビーズ）の形態をとりうる。

多孔性固形マトリックスはフィルタであることができる。多孔性固形マトリックス（２タイプ以上のマトリックスを使用する場合は、特に第２固形多孔性マトリックス）は、ＮＡＡＴ阻害因子を核酸より強く結合するマトリックスであるか、核酸をＮＡＡＴ阻害因子より強く結合するマトリックスであることができる。そのような多孔性固形マトリックスは好ましい。なぜなら、その場合、本発明の方法は核酸増幅の阻害因子を核酸から除去するように作用するか、逆に、試料から核酸を精製および／または濃縮するように作用しうるからである。

この点において、多孔性固形マトリックスは、本発明の方法における使用に適するために、少なくとも１つの核酸増幅の阻害因子を核酸より強く結合するか、またはその逆である必要がある。ある特定多孔性固形マトリックスが核酸増幅の阻害因子を核酸より強く（または弱く）結合するかどうかは、核酸増幅の阻害因子と核酸とを含む試料を当該マトリックスと接触させ、マトリックスから液体を分離することによって、決定することができる。分離された液体における核酸の相対的減少と比較して阻害因子の相対的減少の方が大きければ、そのマトリックスは阻害因子を、より強く結合する。

多孔性固形マトリックスは樹脂の形態をとるか、ビーズ（例えば磁気ビーズ）の形態をとりうる。

ＮＡＡＴ阻害因子の除去
多孔性固形マトリックスがＮＡＡＴ阻害因子を核酸より強く結合する場合、所望の核酸は、マトリックスから優先的に溶出されることになる。本発明者らは、驚いたことに、
ｉ．多孔性固形マトリックスを、室温で混合するだけでなく、液体試料と共に加熱し、そして
ｉｉ．液体試料が未結合の核酸を含み、それが、マトリックスと液体をまだ加熱している間に、多孔性固形マトリックスから分離される、
のであれば、より効率よくＮＡＡＴ阻害因子を除去できることを発見した。このＮＡＡＴ阻害因子除去能力の改良が必要とするのは上述のように加熱だけであり、熱によって生じた圧力ゆえの溶出には依拠しない。

したがって本発明は、核酸と核酸増幅の阻害因子とを含む液体試料から核酸を精製するための方法であって、（ａ）試料を、核酸増幅の阻害因子を核酸より強く結合する多孔性固形マトリックスと接触させ、この際、多孔性固形マトリックスと液体試料とに熱が適用される工程；および（ｂ）未結合の核酸を含む液体試料を多孔性固形マトリックスから分離する工程を含む方法を提供する。

本発明のこの態様による方法では、ＮＡＡＴ阻害因子の少なくとも一部が多孔性固形マトリックスに結合し、一方、核酸の少なくとも一部は多孔性固形マトリックスには結合しないような条件下で、本方法が実行されることになると理解される。適切な条件は当業者にはわかるであろう。

工程（ｂ）において熱を適用してもよい。

本発明のこの態様の方法は、多孔性固形マトリックスをコンテナの少なくとも一部として含んでいるコンテナを用いる本発明の熱溶出を使って、実施することができる。したがって本方法は、液体試料をコンテナ内に密封する工程、および温度を上昇させることでコンテナ内部の圧力を増加させ、よって液体が多孔性固形マトリックスを通過するようにする工程を含みうる。

熱溶出によって生じる圧力が遠心分離と比較して穏やかであるということは、多孔性固形マトリックス相材料を離れる阻害因子が少なくなることを意味することが、明らかになった。実際、液体を多孔性固形マトリックスに通過させるために遠心分離を使用すると、第２容器内に見いだされる核酸試料は、熱溶出を使った場合よりも多くの核酸増幅の阻害因子を含有するであろう。さらにまた、この阻害因子除去の改良により、試料調製の総希釈倍率を低減できることになる。よって、本発明の方法では、上記の原理ｉ）およびｉｉ）を使用しない方法ほどには、元の試料を希釈する必要がない。

圧力溶出の力は、遠心分離カラム法で見られるゲノムＤＮＡの著しい剪断を引き起こすほどには高くない。したがって、関連試料ＤＮＡ分子のターゲット領域が剪断によって中断され、それゆえに検出を損なうことは、おそらくないであろう。

好ましくは、液体試料がまだ６０℃より高い温度である間に、より好ましくは温度が７０℃より高い間に、さらに好ましくは温度が８０℃より高い間に、最も好ましくは温度が９０℃より高い間に、液体試料を多孔性固形マトリックスから分離する。工程（ａ）では、試料とマトリックスとを１〜１０分間、加熱することができる。

イオン交換樹脂を含む数タイプの多孔性固形マトリックスが、本発明のこの態様による多孔性固形マトリックスとして機能することを見出した。これらの樹脂は、１つ以上のＮＡＡＴ阻害因子を封鎖する能力を有する。これらの多孔性固形マトリックスには、イミノ二酢酸を含有するスチレン−ジビニルベンゼンコポリマー（例えばＣｈｅｌｅｘ １００−Ｂｉｏ−Ｒａｄ）、ＰＶＰＰ（ポリビニルピロリドン）、ポリスチレン−ジメチルアミン塩基系樹脂（Ｄｉａｉｏｎ ＷＡ３０−三菱化学）、３級アミン官能化基を有するマクロポーラススチレンジビニルベンゼンコポリマー（Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ２、Ｄｏｗｅｘ）、および３級アミン官能化基を持つスチレン−ジビニルベンゼンマトリックスからなる高多孔性弱塩基陰イオン交換樹脂（ＳＤＶＢ樹脂ファミリー）などがあるが、これらに限るわけではない。活性炭も使用しうる。このようなマトリックスは、個別に使用するか、互いに組み合わせて使用することができる。本発明の方法を使うことで特定試料マトリックスからＮＡＡＴ阻害因子の最適な除去をもたらすマトリックスまたはマトリックスの混合物を、当業者は選別することができるであろうと理解される。

Ｃｈｅｌｅｘ １００などの一定のマトリックスは二価金属イオンをキレートすることが知られており、他にも、ＰＶＰＰのように、阻害因子ポリフェノール化合物に結合することが知られているものもある。熱溶出後に、核酸がＮＡＡＴ阻害因子から分離されるように、核酸よりもＮＡＡＴ阻害因子に対して高いアフィニティを有するマトリックスを、当業者は選別するであろうと理解される。例えば、ヒト糞便からのクロストリジウム・ディフィシレ（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ ｄｉｆｆｉｃｉｌｅ）ＤＮＡの検出に関して、本発明者らは、次に挙げる樹脂の組み合わせが、ＮＡＡＴ阻害因子を除去するのにとりわけ有効であり、クロストリジウム・ディフィシレＤＮＡへの結合を伴わないので、熱溶出後は、このＤＮＡが第２容器中に都合よく見出されることを、見出した：１．９ｍｌの反応緩衝液中、１０％ ｖ／ｖ Ｃｈｅｌｅｘ １００、２５％ ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２および２５％ ｖ／ｖ Ｄｉａｉｏｎ ＷＡ３０。

ＮＡＡＴ阻害因子は当技術分野では知られており、例えば血液からのヘム、植物および土壌に見いだされるフミン酸、ポリフェノール、一定の二価金属、例えばカルシウム、またはコラーゲンなどがある。

本発明のこの態様によって精製された核酸は、ＮＡＡＴ試薬にそのまま加えてＮＡＡＴアッセイを実行することができる。ＮＡＡＴアッセイを実行する前に、溶出した核酸をさらに処理してもよい。例えば、引き続いて核酸を濃縮し、かつ／または異なる緩衝液中に移すことができる。適切な濃縮方法は当技術分野では周知である。

核酸捕捉戦略
多孔性固形マトリックスが核酸をＮＡＡＴ阻害因子より強く結合する場合、核酸は、熱溶出後にコンテナ中のマトリックスに優先的に保持され、ＮＡＡＴ阻害因子は液体試料と共に多孔性固形マトリックスを優先的に通過する。したがって本発明は、多孔性固形マトリックスをコンテナの少なくとも一部として含んでいるコンテナを使って液体試料から核酸を精製する方法であって、液体試料をコンテナ内に密封する工程、および温度を上昇させることでコンテナ内部の圧力を増加させ、よって液体が多孔性固形マトリックスを通過するようにする工程を含み、多孔性固形マトリックスが核酸を核酸増幅の阻害因子より強く結合する方法を提供する。

そのような多孔性固形マトリックスを使用すると、核酸の少なくとも一部は多孔性固形マトリックスによって保持され、一方、ＮＡＡＴ阻害因子の少なくとも一部を含む液相は、大部分がまたは完全に、溶出されることになると理解される。引き続いて、多孔性固形マトリックスによって保持された核酸は、それをＮＡＡＴに利用できるようにするために、さらに処理することが必要になりうる。これは、例えば容器を開けて、結合している核酸を多孔性固形マトリックスから溶出させる緩衝液を加え、熱溶出を実行して、結合した核酸の少なくとも一部または全部を多孔性固形マトリックスから容器へと溶出させることなどによって行うことができる。容器には溶出した核酸が入っていて、それをＮＡＡＴアッセイに使用することができる。

本発明のこの態様に使用することができる固相材料の例には、シリカ（上記ブーム法ベースの抽出プロセスによる）、Ｃｈａｒｇｅ−Ｓｗｉｔｃｈビーズ、オリゴキャプチャ（ｏｌｉｇｏ−ｃａｐｔｕｒｅ）ビーズ、およびイオン交換樹脂／ビーズなどがある。

多孔性固形マトリックスを使って核酸を捕捉および／または濃縮する場合、本発明は試料調製プロセスの複雑さを低減する。熱溶出後に、液体試料のすべてを第２コンテナまたは容器に移すことができるという事実は、元の液相（阻害因子を含有するもの）からの汚染を最小限に抑えつつ核酸をコンテナから溶出または取り出すことができ、それが、以後の試料の処理を、より容易にすることを意味する。場合によっては、核酸をＮＡＡＴ試薬に直ちに加えることができるように、結合している核酸をマトリックスから溶出させるべく、最初の熱溶出工程後に、溶出緩衝液を多孔性固形マトリックスに直接加えることもできる。いくつかのＮＡＡＴについては（ＷＯ２００４／０６２３３８に記載されているような生物発光レポーター系を使用する場合は特に）、そのような方法が上述の固相材料に耐性を有することから、多孔性固形マトリックスを核酸が結合している状態でそのままＮＡＡＴ試薬に移すことも可能であると理解される。

あるいは、核酸の少なくとも一部または核酸の全部を多孔性固形マトリックスから溶出させるために、第２の熱溶出工程を実行することが可能である。好都合なことに、これにより、同じ原理を使って試料をさらに処理することが可能になる。

液体試料
本発明に従って多孔性固形マトリックスを通過させる試料は液体試料である。「液体試料」という用語は、その試料が何らかの固形構成要素を含みうることを排除するものではなく、試料の体積の大半（例えば少なくとも７０％、少なくとも８５％、少なくとも９５％または少なくとも９９％）が液体であることと理解される。

液体試料は、それ自体が液体試料である、例えば血漿または尿などの出発試料に由来しうる。ＮＡＡＴの実行対象とすることができ、そこから液体試料を得ることができる出発試料は、固形または半固形試料であることもできる。例えば試料は、糞便試料、食品試料または組織試料であることができる。そのような試料の場合は、コンテナへの投入に先立って、液体試料が得られるように、その固形または半固形試料を適切な緩衝液と混合することができる。あるいは、適切な緩衝液が前もって充填されているコンテナに固形または半固形試料を加えることで、液体試料としてもよい。コンテナへの投入前に固形または半固形試料を適切な緩衝液と混合してから、引き続いて、コンテナに前もって充填された第２の適切な緩衝液（または同じ緩衝液）と混合してもよい。

出発材料は、コンテナにそのまま加えることができる液体試料であってもよい。液体試料は、本発明の方法によるコンテナへの投入に先立って、適切な緩衝液と混合することができる。あるいは、適切な緩衝液が前もって充填されているコンテナに液体試料を加えてもよい。コンテナへの投入前に液体試料を適切な緩衝液と混合してから、引き続いて、コンテナに前もって充填された第２の適切な緩衝液（または同じ緩衝液）と混合してもよい。

本発明の方法では、多孔性固形マトリックスをコンテナに前もって充填しておくか、試料そのものと一緒に、または試料そのものの後に投入してもよい。多孔性固形マトリックスは、樹脂またはビーズ（例えば磁気ビーズ）の形態をとりうる。

液体試料は、試料調製および／または核酸精製の有効性を最大限にする緩衝液を含みうる。適切な緩衝液は、例えば核酸を分解から保護し、試料調製を容易にし、かつ／または試料調製物を、続いて使用されるＮＡＡＴ試薬と適合するものにすることができる構成要素を含みうる。例えば緩衝液は、阻害因子除去剤であるＥＤＴＡまたはウシ血清アルブミンを含みうる。また、緩衝液は、試料の溶解を容易にすることができ、ヌクレアーゼなどの酵素を失活させることができる、１つ以上のプロテアーゼも含みうる。緩衝液は、試料調製とその後の核酸増幅をどちらも容易にする洗浄剤または塩（例えばＫＣｌ）も含有しうる。緩衝液は、液体試料のｐＨを試料調製に有用なｐＨに、例えば４．５〜９．５のｐＨ、または約８のｐＨに維持するように構成させてもよい。

試料溶解
本発明の方法において使用される熱は、コンテナ中の試料を溶解することで、核酸をその後のＮＡＡＴベースのアッセイに利用できるようにする機能も果たしうる。したがって本発明の方法は、試料を溶解する工程を含みうる。溶解工程は、液体試料が細菌（例えば芽胞形成細菌）および／またはウイルスを含む場合は、とりわけ好ましい。なぜなら、細菌またはウイルスの溶解は、該細菌またはウイルスを非感染性にし、それゆえに、本発明の好都合な安全特性になるからである。試料を溶解する熱の有効性は、他の試薬の添加によって、かつ／または一定の固相材料によって、著しく増加させることができる。例えば、ＥＤＴＡとＣｈｅｌｅｘは、脂質二重層を安定化する二価イオンを封鎖することによって細胞膜溶解を容易にすることが示されている（Ｂｒｏｗｎ， Ｔ．Ａ．（１９９５）「Ｇｅｎｅ ｃｌｏｎｉｎｇ： ａｎ ｉｎｔｒｏｄｕｃｔｉｏｎ」第３版、Ｃｈａｐｍａｎ ＆ Ｈａｌｌ）。

本発明の方法は、液体試料をコンテナに加える前に溶解された液体試料と共に使用することもできる。これは、熱だけでは溶解することが困難な試料にとってはとりわけ有利である。例えば、一定の芽胞形成細菌では、まず機械的方法を使って芽胞をこじ開けることが有利であるだろう。試料を溶解するための手段は当技術分野では知られており、例えば超音波処理、機械的ホモジナイゼーション（例えば、ブレンダーの使用、狭い開口部に細胞を通すこと、またはさまざまなビーズの存在下で激しく混合することなどによる）、および化学的破壊、例えば洗浄剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）、場合によってはプロテイナーゼＫなどのプロテイナーゼとの併用）またはカオトロピック剤（例えば塩化グアニジニウム）の使用によるものなどがある。

熱溶出プロセスの溶出液がＮＡＡＴ試薬にそのまま加えられる場合は、ＮＡＡＴ試薬に悪影響を及ぼさないように、溶出した液体が十分に冷めていることが重要になりうる。使用する酵素の一部が高温に耐えることができない等温ＮＡＡＴを使用する場合は、これがとりわけ重要である。例えば、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）やローリングサークル増幅（ＲＣＡ）など、いくつかのＮＡＡＴの場合、ＮＡＡＴが作動するには、試料の温度が５０℃未満、あるいは４０℃未満でなければならない。鎖置換型ポリメラーゼ、例えばＢｓｔポリメラーゼまたは関連ポリメラーゼを使用するＮＡＡＴ、例えばループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ）または鎖置換増幅（ＳＤＡ）の場合、ＮＡＡＴが作動するには、試料の温度が９０℃未満、８０℃未満、７０℃未満、あるいは６０℃未満でなければならない。したがって、本発明のいくつかの態様では、溶出した試料をＮＡＡＴ試薬と混合する前に、液体試料が９０℃未満、８０℃未満、７０℃未満、６０℃未満、５０℃未満、あるいは４０℃未満の温度まで冷却される。

熱溶出後は、液体試料を第２コンテナまたは容器中に溶出させることができ、その場合、コンテナまたは容器は、溶出した液体が熱溶出後も加熱され続けるように、熱溶出に使用したコンテナと実質的に同じ温度である。第２コンテナまたは容器は第１コンテナより低い温度であってもよい。例えば、溶出した核酸を分解から保護するのに役立つように容器を４℃で保存する場合などは、温度に最高１００℃の差がありうる。

コンテナまたは容器を熱溶出後に能動的に冷却してもよい。

溶出の制御
コンテナにおける試料の溶解を伴う方法の場合は、試料溶解の物理的プロセスが起こるのに十分な時間、十分な温度に、試料を加熱することが重要である。また、溶出が起こる前に、溶解された試料が、与えられた固相材料と相互作用するのに十分な時間がなければならない。

したがって本発明者らは、要求される温度のコンテナ内で液体試料が十分な時間を費やすように、コンテナからの液体試料の溶出速度を制御する必要がありうることを認識した。これは、コンテナからの液体の流れを制限することによって達成することができ、それはさまざまな手段によって行うことができる。したがって本発明のいくつかの態様では、コンテナが、流量制限器を持たないコンテナと比較して多孔性固形マトリックスを通るコンテナからの液体の流れを低減するように構成された流量制限器を含むであろう。特に、そのような流量制限器は、コンテナが室温を上回る（例えば４０℃を上回るまたは５０℃を上回る）温度に加熱された時に、多孔性固形マトリックスを通るコンテナからの液体の流れを、流量制限器を持たないコンテナと比較して低減することができる。流量制限器は、熱がコンテナに適用された時に、多孔性固形マトリックスを通る液体の流れを一定ではあるが制限された流れにすることによって作用しうる。そのような流量制限器の適切な例はフィルタおよびフリットである。流量制限器は多孔性固形マトリックスを可逆的に密封することもできる。本発明のこの態様では、その封が除去されて初めて、液体試料はコンテナから溶出することができる。これは、例えば機械的、磁気的、または電気的制御システムによって発動させうるバルブによって達成することができる。流量制限器は、室温を上回るが１１０℃未満である温度、例えば４５℃〜１１０℃の温度、５５℃〜１１０℃の温度、または６５℃〜１１０℃の温度で融解する材料の層であってもよい。適切な材料は、熱可塑性ポリマー、またはワックス（すなわち４５℃超で融解して低粘度の液体になる化合物）、例えばパラフィンワックスである。

核酸増幅技法
本発明の方法は、任意のＮＡＡＴ用試料を調製するために使用することができる。したがって、ループ媒介等温増幅（ＬＡＭＰ；Ｎｏｔｏｍｉ ｅｔ ａｌ． Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ， ２０００， ２８； Ｅ６３）と呼ばれている方法とＢＡＲＴ（Ｇａｎｄｅｌｍａｎ ｅｔ ａｌ． Ｐｕｂｌｉｃ Ｌｉｂｒａｒｙ ｏｆ Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｎｏｖｅｍｂｅｒ ２０１０， Ｖｏｌｕｍｅ ５， Ｉｓｓｕｅ １１， ｅ１４１５５）と呼ばれている生物発光レポーター系との組み合わせを使って、本発明を具体的に例示するが、本方法はこのＮＡＡＴに限定されないことを理解すべきである。例えば、本発明に従って調製された核酸試料は、阻害因子の影響をＬＡＭＰより受けやすいことが知られているポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）にも使用できることを、本発明者らは示した。本発明の方法は、テンプレートリプライミング増幅（Ｔｅｍｐｌａｔｅ Ｒｅ−ｐｒｉｍｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＴＲＡ）、自己伸長増幅（Ｓｅｌｆ Ｅｘｔｅｎｄｉｎｇ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ）（ＳＥＡ）、核酸配列ベース増幅（ＮＡＳＢＡ）、鎖置換増幅（ＳＤＡ）およびスマート増幅プロセス（ＳＭａｒｔ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｐｒｏｃｅｓｓ）（ＳＭＡＰ）などといった他のＮＡＡＴ用の試料を調製するためにも使用することができる。

さらなる熱溶出工程
本発明の熱溶出は、１回以上（例えば２回、３回、４回、５回など）、繰り返すことができる。熱溶出を２回以上実行する場合、これは、第１熱溶出工程において使用したコンテナと同じコンテナに液体を適用することによって行うことができる。これは、例えば液体試料の総体積がコンテナの容積を超えている場合に、液体試料中の核酸のすべてを精製するために必要になりうる。また、これは、多孔性固形マトリックスに核酸が結合した後に、その多孔性固形マトリックスを洗浄したい場合にも必要になりうる。あるいは、結合した核酸をマトリックスから溶出させるために、溶出緩衝液を適用することが必要になりうる。これらの方法では、溶出した液体を収集することが要求される場合に、追加のコンテナまたは容器を使用することができる。

熱溶出を２回以上実行する場合は、２つ以上のコンテナを使って、それを実施することもできる。例えば、第１コンテナからの液体を第２コンテナに溶出させることができる。次に、第２コンテナを密封し、温度を上昇させることで、コンテナ内部の圧力を増加させ、よって液体が多孔性固形マトリックスを通過するようにすることができる。第２コンテナから溶出した液体は、次に、捨てるか、容器に収集するか、または第３コンテナに移すことができる。２つ、３つまたはそれ以上のコンテナを使用する場合、１つの消耗品内でいくつかの試料調製プロセスを自動化するには、コンテナからコンテナへと液体を移動させるために、それらを、同時に、タンデムに、または逐次的に加熱することができる。コンテナが同時に加熱される場合は、コンテナ内の試料およびマトリックスが異なる時点で所望の温度に到達するように、壁厚が異なるコンテナを使用することが可能である。

いくつかの態様では、コンテナから熱溶出によって溶出させた液体試料（それが、特定試料調製プロセスの１回目の熱溶出であるか、２回目の熱溶出であるか、３回目の熱溶出であるか、またはそれ以降の熱溶出であるかは問わない）を、供給されたコンテナ内で、そのままＮＡＡＴ試薬と混和することができるので、処理済み試料をＮＡＡＴ試薬に移すために追加の液体ハンドリング工程（例えばピペッティング工程）は要求されない。

こうして、２つ以上のコンテナが入っていることで、オペレータが１つのコンテナに試料を投入するだけで、処理済み試料とＮＡＡＴ試薬との混合を含む試料調製プロセス全体が実行される、単一の装置を想定することができる。そのような装置には、１つのコンテナから別のコンテナに液体を移動させるために複雑なポンプや遠心分離器を必要としない、すなわち簡単な加熱システムを使用することができるであろうという、著しい恩恵がある。

装置
上で論じたように、本発明は、本発明の方法を使用して自動設定で核酸を精製するのに、とりわけ適している。したがって本発明は、本発明の方法に従って核酸を精製するのに適した装置を提供する。例えば本発明は、核酸を精製するための装置であって、（ａ）コンテナの少なくとも一部としての多孔性固形マトリックスとコンテナを密封するための手段とを含むコンテナ、および（ｂ）コンテナを最高１１０℃の温度に加熱するように構成された加熱要素を含む装置を提供する。装置はさらに、多孔性固形マトリックスを通過した液体を受けるための第２コンテナを含んでもよい。上記に加えて、または上記に代えて、装置は、核酸増幅用の試薬を含んでいる容器も含みうる。

本発明の装置は、試料調製を著しく容易にすることができる、試料からの核酸の自動精製を可能にする。特に、核酸増幅用の試薬を含む容器も装置に入っている実施形態では、、以後の工程はすべて自動的に実行させることができるので、オペレータは装置に試料を加えるだけでよいという利点が、本発明の装置にはある。したがって、試料をコンテナに加えてから、増幅そのもののアウトプットを記録するまでの間、人手を介さずに、試料を処理し、増幅させることができる。

装置内のコンテナは、上に詳しく論じたように、核酸を核酸増幅の阻害因子より強く結合する多孔性固形マトリックス、または核酸増幅の阻害因子を核酸より強く結合する多孔性固形マトリックスを含みうる。

装置は、２つ以上（例えば２つ、３つ、４つ、５つ、６つまたはそれ以上）のコンテナを含みうる。多孔性固形マトリックスは、装置内のコンテナのすべてで、同じであってもよい。また、それらは異なってもよく、マトリックスがＮＡＡＴの阻害因子を捕捉する実施形態では、それが有利になりうる。なぜなら、その場合は、異なる阻害因子を異なる強さで結合するマトリックスを用意することが可能になり、それが、阻害因子の除去を改良しうるからである。２つ以上のコンテナが本発明の装置内に存在する場合は、コンテナのそれぞれを、加熱要素によって最高１１０℃の温度に加熱できることが好ましい。なぜなら、そうすれば、これらのさらなるコンテナ内の液体を、熱だけで移すことができるからである。装置は１つの加熱要素または２つ以上の加熱要素を含みうる。装置中の２つ以上のコンテナを、異なる速度でかつ／または異なる温度に加熱することができる。

装置が２つ以上のコンテナを含むか、１つ以上のコンテナと容器とを含む場合、コンテナは、１つのコンテナから溶出した液体がさらなるコンテナまたは容器の開口部に直接滴るように、容器内に置くことができる。チューブなどの通路によって液体を移すことも可能である。さらなるコンテナが本発明の熱溶出に使用される場合、チューブは、例えば、コンテナが加熱される前にコンテナを密封することを可能にするバルブを含みうる。

本発明では、コンテナからの液体を、１つ以上のコンテナの多孔性固形マトリックスに、熱によって通過させることになる。したがって本発明の装置は、コンテナの多孔性固形マトリックスに通過させるために要求される遠心分離器またはポンプを含まないことが好ましい。

本発明の装置は、ＮＡＡＴに必要な試薬の少なくとも一部、または好ましくはそのような試薬の全部を含む容器を含むことが好ましい。容器は、コンテナから溶出した液体が、ＮＡＡＴを含む容器に直接加えられるような形で、装置内に置くことができる。本発明の装置は、あらゆるＮＡＡＴ（ＰＣＲおよびＬＡＭＰを含むが、これらに限るわけではない）と共に使用するのに適している。ＮＡＡＴに必要な試薬は当技術分野では知られており、これには、例えば１つ以上のプライマー、緩衝液、ポリメラーゼおよびヌクレオチド（ｄＮＴＰなど）が含まれる。

通則
数値ｘに関して「約」という用語はオプションであり、例えばｘ±１０％を意味する。「含む」（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）という用語は、「内包する」（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）および「からなる」（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ）を包含し、例えばＸを「含む」組成物は、もっぱらＸのみからなるかもしれないし、何かを追加して含んでいる（例えばＸ＋Ｙ）かもしれない。「ある」または「１つの」（ａまたはａｎ）は「１つ以上」（ｏｎｅ ｏｒ ｍｏｒｅ）を意味する。

具体的に言明する場合を除き、２つ以上の構成要素を混合する工程を含むプロセスは、特別な混合順序を何ら要求しない。したがって構成要素は任意の順序で混合することができる。例えば、構成要素が３つある場合なら、２つの構成要素を互いに混和することができ、その後に、その組み合わせを３つ目の構成要素と混和することができる。

ＢＡＲＴとは、試料中に存在するテンプレートポリ核酸の量を決定するための方法であって、増幅反応に由来する無機リン酸の存在が検出され、それが試料中のテンプレートポリ核酸の量を示す方法を指す。

本発明のさまざまな態様および実施形態を、例示のために、以下に、より詳しく説明する。本発明の範囲から逸脱することなく詳細の変更を行いうることは理解されるであろう。
実施例

標準的なプラスチック製消耗品および固相マトリックスを使った場合、熱は、抵抗力に抗して溶出液をコンテナから追い出すのに十分であり、熱溶出の原理が実証される。
試料調製カラム内の熱は、カラム底面からの試料溶解物の自己溶出を可能にする圧力の増強を許し、これを達成するのに遠心分離器やシリンジの補助を必要としない（図１）。この特徴を（ａ）小さい０．８ｍｌカラムスケールならびに（ｂ）大きい８ｍｌカラムで例証する。

（ａ）０．８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９６８８）に反応緩衝液中の自社開発樹脂混合物を最終体積が６００μｌになるように充填した。この際、排除緩衝液体積（ｅｘｃｌｕｄｅｄ ｂｕｆｆｅｒ ｖｏｌｕｍｅ）は３２７．５μｌであった。キャップを堅く閉じ、ツイストタブを折り取った。カラムを２ｍｌ収集チューブに入れ、カラムとチューブの全体を、９５℃の加熱ブロック上に１０分間置いた。この時間中に、カラム内で圧力が高まり、液体の大部分が、カラムの底面を通って収集チューブ内に徐々に駆出された。

（ｂ）８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９８９７）に反応緩衝液中の自社開発樹脂混合物を最終体積が３．４ｍｌになるように充填した。この際、排除緩衝液体積は１．９６ｍｌであった。キャップを堅く閉じ、ツイストタブを折り取った。カラムを内径１３．５ｍｍの収集チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＦＢ５１５７９）に入れ、カラムとチューブの全体を、挿入深さが８０ｍｍである特製の加熱ブロック上に置いた。これを１００℃で１０分間加熱した。この時間中にカラム内で圧力が高まり、全溶出液がカラムの底面を通って収集チューブ内に徐々に駆出された。

溶出を阻止する背圧を生み出す固相および固相フィルタの存在下で、穏和な熱が熱溶出によって液相を溶出させうることを確認するために、Ｃｈｅｌｅｘ １００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）の存在下で溶液を溶出させた。具体的に述べると、Ｃｈｅｌｅｘ １００の１０％懸濁液を、モレキュラーグレード（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｇｒａｄｅ）の水に、次のようにして作った：１．０９６ｇのＣｈｅｌｅｘを５０ｍｌビーカーに入れ、モレキュラーグレードの水（Ｓｉｇｍａ）１０．９６ｍｌを加えた。これに小さな撹拌子を加えてから磁気撹拌機で撹拌した。スナップタブが既に取り除かれている計量済みのＰｉｅｒｃｅ ８９８６８カラム２本に、８００μｌを加えた。これらのカラムを２ｍｌ収集チューブに入れ、８０００ｒｐｍで１分間遠心分離することで、カラム内のＣｈｅｌｅｘ樹脂から水を除去した。これらのカラム２本と、別の計量済みカラム２本とに、モレキュラーグレードの水２５０μｌを加えた。これらを計量済みの２ｍｌスナップキャップチューブに入れ、５分間、１００℃の熱ブロック上に置くか、または室温に保った。この５分間の終了時にカラムおよび溶出液チューブを計量することで、溶出液の体積およびカラムに残った水の体積を決定した。室温に保持しただけのカラムはどちらも水を一切溶出しなかったが、加熱したカラムではどちらからも溶出が起こり、加熱Ｃｈｅｌｅｘカラムからは１９８．５μｌが、また水だけのカラムからは２２６．４μｌが溶出していた（図２）。

ＢＡＲＴレポーター系
ＢＡＲＴレポーター系は、引用により本明細書に組み込まれるＷＯ２００４／０６２３３８およびＷＯ２００６／０１０９４８に詳しく説明されている。ＢＡＲＴは、等温ＮＡＡＴ用に設計されたレポーター系の一例であり、これは、試料から一タイプのシグナル、すなわち生物発光シグナルを与える。ＢＡＲＴは無機ピロリン酸のホタルルシフェラーゼ依存的検出を利用する。これは、ＮＡＡＴを使って「ターゲット」配列が検出される時に、大量に生成する。したがって、ＢＡＲＴでは、均一相アッセイにおいて閉じたチューブから放出される光を測定するだけで、分子診断を達成することができる（図３）。ＢＡＲＴは、５０〜６３℃で作動するいくつかの異なるＮＡＡＴで実証されている。ＢＡＲＴレポーターは、光出力が即時増幅速度の尺度になるので、ＮＡＡＴの増幅速度を追跡するのにとりわけ有効な手段である（これに対して、例えば蛍光出力はシグナルの蓄積を示すので、増幅速度を得るには測定値を微分しなければならない）。

ＮＡＡＴ阻害因子を除去する固相材料は（熱溶出に伴って自然に生じる）高温で溶出させた時の方が性能が良い
ｉ）異なる温度における固相樹脂「３級（３°）ＳＤＶＢ」のＮＡＡＴ阻害因子除去能力
３級ＳＤＶＢ樹脂を含まない５８０μｌの緩衝液または２０％の３級ＳＤＶＢを含む５８０μｌの緩衝液のいずれかを含有する２セットのＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応緩衝液（１９０ｍＭビシン、ｐＨ８．０）に、２０μｌの１８７．５ｎｇ／μｌフミン酸原液を加えた。１セットをボルテックスで混合し、次に９５℃で５分間加熱してから、２回目のボルテックスを行なった。対照セットはボルテックスした後、この時間、室温に放置し、次に再びボルテックスした。

各上清のうち２０μｌを使って、固定された数（１０^４）の特定ターゲットＤＮＡ分子を含有する凍結乾燥ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応を再構成した（本明細書ではこれを「阻害因子対照」という）。次に二つ一組の反応のピーク時間を比較した。阻害因子の存在は、増幅を遅らせるか、増幅を消滅させ、その場合は、ピーク時間（ＢＡＲＴレポーター系が特徴的な光ピークを与えるまでに要する時間）はそれぞれ増加するか、または全く消失することになる。これにより、加熱なしかつ樹脂なしの場合、フミン酸が存在すると、反応時間は５９．７±０分であることが明らかになった。これが、樹脂の存在下では５７．０±０．５分に改善され、加熱樹脂では３８．４±２．１分へとさらに著しく改善された。

ｉｉ）異なる温度における固相樹脂「ＩＭ−ＳＤＶＢ」の複雑なＮＡＡＴ阻害因子を除去する能力
チョコレートを食品病原体について検査するプロセスでは、２５ｇのチョコレートが、緩衝化ペプトン水を粉乳および色素ブリリアントグリーンと共に含有する２５０ｍｌのエンリッチメントブロス中でインキュベートされる。インキュベーション後は、このエンリッチメントブロスがＮＡＡＴに対して著しく阻害的であることがわかっていた。このブロスを本明細書ではＩＳＯチョコレートエンリッチメントという。阻害因子の実体はわかっていない。２セットのＩＳＯチョコレートエンリッチメント試料２０μｌを、１．５ｍｌ遠心チューブ中の、１０ｍＭ硫酸アンモニウム、０．１５％ Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、０．４ｍｇ／ｍｌポリビニルピロリドンおよび０．０９％アジ化ナトリウムを１０％（ｗ／ｖ）ＩＭ−ＳＤＶＢ（イミノ二酢酸官能化基を持つスチレンジビニルベンゼンコポリマーからなる陽イオン交換樹脂）と共に含有する５８０μｌの２０ｍＭトリス緩衝液ｐＨ８．８に加えた。これらをパルスボルテックスした。１セットのチョコレート試料チューブを加熱ブロック上、１１０℃で、５分間加熱した。他方のセットは同じ時間、室温に保った。５分後に、両方のチューブセットをパルスボルテックスし、冷まし、各チューブからの２０μｌを使って、２００μｌＰＣＲストリップに、３つ一組の凍結乾燥阻害因子対照ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応を再構成した。図４は、加熱チョコレートエンリッチメントが２４．７±１．１５分の平均ピーク時間を与え、それが３２．８±１．６１分という非加熱平均ピーク時間より８．１分早いことを示している。同時に実験したブランク阻害因子対照は、１８．９±１．００分のピーク時間を与えた。したがって、ＩＭ−ＳＤＶＢにおけるチョコレートの加熱は、加熱なしと比較して、ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰの阻害の低減をもたらした。

ｉｉｉ）異なる温度における固相樹脂「ＰＶＰＰ」のＮＡＡＴ阻害因子フミン酸除去能力
２００μｌのＰＶＰＰ懸濁液を２００μｌチューブにピペットで移し、それを遠沈することで密なＰＶＰＰベッドとし、過剰な液体のうち１００μｌを除去した。１００μｌの１．２５μｇ／μｌフミン酸をＰＶＰＰベッドの上に加えた。この添加物をボルテックスによってＰＶＰＰとよく混合した。３本のチューブを９５℃で１５分間加熱し、３本のチューブは１５分間、室温に放置しておいた。すべてのチューブを５分後にボルテックスし、温度を戻した。２０μｌを別のＰＣＲチューブにとり、粒状物を遠沈した。また、ＰＶＰＰ上の室温フミン酸上清の一部を、９５℃で１５分間インキュベートした。それぞれからの５μｌを１５μｌの阻害因子対照ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応に加えた。阻害因子対照ピーク時間は、９５℃で加熱したＰＶＰＰ上のフミン酸、室温でのＰＶＰＰ上のフミン酸、および９５℃で加熱した後者からの上清について、それぞれ３２．８５±７．２０分、４７．６３±８．１７分、および５９．１６±１４．９２分であった。これにより、加熱されたＰＶＰＰは室温のＰＶＰＰよりも多くのフミン酸阻害因子を除去すること、および室温ＰＶＰＰ抽出物からのフミン酸上清を加熱しても、追加の阻害軽減は得られないことが示された。この研究では、水での非阻害ピークが、２３．１１±３．３１分であった。

ｉｖ）異なる温度における固相樹脂「４級（４°）ＳＤＶＢ」および「３級ＳＤＶＢ」の複雑なＮＡＡＴ阻害因子を除去する能力
インスタントコーヒーは強力なＮＡＡＴ阻害因子を含有することを実証することができるので、インスタントコーヒーは有用な阻害因子モデルである。インスタントコーヒー（１ｇ）を１０ｍｌの緩衝化ペプトン水に加え、３７℃で１８時間インキュベートした。樹脂を含有しないか、１０％ＩＭ−ＳＤＶＢ、３００μｌの４級ＳＤＶＢ（４級アミン官能化基を持つスチレンジビニルベンゼンマトリックスからなるマクロポーラス強塩基陰イオン交換樹脂）または３００μｌの３級ＳＤＶＢ（３級アミン官能化基を持つマクロポーラススチレンジビニルベンゼンコポリマー）を含有する５８０μｌのＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ増幅緩衝液のチューブに、２０μｌのエンリッチメントを加えた。すべてのチューブをボルテックスし、１１０℃で５分間加熱した。加熱したチューブをパルスボルテックスし、冷ました。２０μｌを、各条件につき二つ一組にして加えることで、２００μｌＰＣＲストリップに三つ一組の凍結乾燥阻害因子対照ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応を再構成した。樹脂なし、ＩＭ−ＳＤＶＢあり（図５ａ）、４級ＳＤＶＢあり（図５ｂ）および３級ＳＤＶＢあり（図５ｃ）の緩衝液中のコーヒーエンリッチメントは、それぞれ４５．３±８．３分、３７．８±３．８分、１９．７±０．８分および２２．４±１．５分の平均ピーク時間を与えた。したがって、４級ＳＤＶＢと３級ＳＤＶＢはどちらも、コーヒーエンリッチメントから阻害因子を除去することで、緩衝液だけのコーヒーエンリッチメントでは遅延が２８分であるのに対して、１７．１±０．０分という水阻害因子対照ピーク時間からの遅延が６分以下である阻害因子対照ピーク到達を可能にした。

ｖ）阻害因子除去の温度依存性
９本の２ｍｌチューブに、ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応緩衝液中の特定樹脂混合物（１０％ ｖ／ｖ Ｃｈｅｌｅｘ １００、２５％ ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２および２５％ ｖ／ｖ Ｄｉａｉｏｎ ＷＡ３０）を充填した。この際、排除緩衝液体積は６３３．２μｌであった。これらのそれぞれに、１８７．５ｎｇ／μｌのフミン酸原液２１．８μｌを加え、ボルテックスで混合した。各チューブを、０、１、２、３、４、５、８および１０分間、１００℃の加熱ブロック上に置いた後で、それぞれを加熱ブロックから取り出し、直ちにボルテックスし、２００μｌの上清を樹脂から取り出した。また、もう１本のチューブでは、１０分間の加熱中、熱電対を使って３０秒毎に、温度を監視した。６５５μｌの緩衝液のみ（阻害因子対照なし）と６３３．３μｌ中に２１．８μｌのフミン酸（阻害された対照）という、さらに２つの対照を設定した。これらをホットブロック上で１０分間加熱した。それぞれからの上清を使って、凍結乾燥阻害因子対照ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応混合物を二つ一組にして再構成した。これらを６０℃で実行し、時間経過中の反応のピーク時間を比較した。図６ａのデータにより、加熱時間の増加と共に阻害因子除去が増加する傾向にあることが示され、図６ｂではこれが温度増加と相関した。５分間の加熱により、最大の阻害軽減が達成され、この際、記録された樹脂調合物の温度は９３．４℃に達することが実証された。阻害因子対照ピーク時間は、インキュベーション時間０分での４３．２±０．５分から、１０分間の加熱後に１９．７±０．５分まで低減した。

加熱なしの対照として自社開発樹脂混合物およびフミン酸を含む一組のチューブも調製し、室温でインキュベートした。０、１、２、３、４、５、８および１０分の時点後に、それらのそれぞれを直ちにボルテックスし、樹脂から２００μｌの上清を取り出した。それぞれからの上清を使って、凍結乾燥阻害因子対照ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応混合物を二つ一組にして再構成した。これらを６０℃で実行し、時間経過中の反応のピーク時間を比較した。熱電対によって測定された樹脂の温度は２２．７℃であった。これらのチューブでは、インキュベーション時間０分における阻害因子対照ピーク時間が４９．０±１．０分であった。１０分間のインキュベーション後でも、ピーク時間は４４．２±２．７分であったことから、加熱なしの樹脂では著しい阻害の低減はないことが示され、加熱された樹脂の方が阻害因子除去に有効であることが確認された。

ｖｉ）熱溶出の温度動態
８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９８９７）に、ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応緩衝液中の特定樹脂混合物（１０％ ｖ／ｖ Ｃｈｅｌｅｘ １００、２５％ ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２および２５％ ｖ／ｖ Ｄｉａｉｏｎ ＷＡ３０）を充填した。この際、排除緩衝液体積は１．９６５ｍｌであった。ツイストタブを折り取り、熱電対を溶出チップ中に入れた。次にカラムを内径１３．５ｍｍの収集チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＦＢ５１５７９）に入れ、カラムとチューブの全体を、挿入深さが８０ｍｍである特製の加熱ブロック上に置いた。これを１００℃で１０分間加熱し、溶出が始まった３分後から１０分にわたって３０秒毎に溶出液の温度を監視した。最大阻害因子除去と相関する至適温度（図６ａおよび６ｂ）は、この加熱時間枠中に容易に達成されることが確認された。図７は、８分の加熱時間で＞９３℃への溶出液温度の上昇が可能であることを示している。実際、温度は阻害因子除去に関係するので、著しい阻害因子除去は、このフォーマットでは少なくとも３分の加熱と換算される７６℃において起こっているのであろう。

ｖｉｉ）加熱混合試験において、熱い樹脂からの試料溶出液の取り出しは、冷たい樹脂からより、良好な阻害因子除去を示した
多量のＮＡＡＴ阻害因子を含有すると特徴付けられていた便試料からの抽出物の１対５希釈液をＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応緩衝液中に作った。「樹脂なし」対照として５０μｌ（１０ｍｇ）を６５５μｌの緩衝液のみと混合した。別途、各５０μｌを、緩衝液の排除体積がやはり６５５μｌである自社開発樹脂カクテルが入っている６本のチューブに加えた。それぞれを９５℃で１０分間加熱した。チューブを（ａ）加熱前と加熱後の両方に混合するか；（ｂ）混合しないか；（ｃ）加熱前に混合するか；（ｄ）加熱後に混合するか；（ｅ）加熱前と加熱後に混合し、冷却前に熱い上清を取り出すか；（ｆ）加熱前に混合し、加熱後に冷ましてから、混合した。各上清のうち２０μｌを使って、凍結乾燥阻害因子対照ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応混合物を二つ一組にして再構成し、６０℃で実行した。反応のピーク時間を比較した。樹脂なしでは、１２０分の実験時間中に、検出は不可能であった。（ｂ）および（ｃ）でも検出されなかったことから、冷たい樹脂との最初の混合は、阻害因子結合効果を持たないことが示された。（ａ）、（ｄ）および（ｅ）の反応はすべて、２２．４〜２８．８分以内の検出を示し、ここでは効果的な阻害因子除去が起こったことから、加熱直後の熱い樹脂との混合が阻害因子除去には不可欠であることが示された。試料および樹脂を室温まで冷却して混合した場合（ｆ）も、１２０分以内に検出することはできなかった。

試料から阻害因子を除去するための熱溶出法の使用
ｉ）ＮＡＡＴ阻害因子キシランを除去するために熱溶出を使用することができる
２７．３μｌの６０μｇ／μｌキシラン原液を６５５μｌの反応緩衝液に加え、１００℃の加熱ブロック上で６分間加熱した。８１．８μｌの６０μｇ／μｌキシラン原液を、排除体積が１．９６５ｍｌである自社開発樹脂混合物が入っているカラムに加えた。キャップを堅く閉じ、ツイストタブを折り取った。カラムを内径１３．５ｍｍの収集チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＦＢ５１５７９）に入れ、カラムとチューブを沸騰水のコニカルフラスコに６分間入れた。

それぞれからの溶出液を使って、凍結乾燥阻害因子対照ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応混合物を二つ一組にして再構成した。これらを６０℃で実行し、反応のピーク時間を比較した。図８は、樹脂処理なしの場合、キシランの存在下では検出時間が３９．５±２．１分であったことを示している。しかしカラム溶出物は１８．７±０．６分の検出時間を与え、同じ希釈倍率で樹脂によるキシラン阻害因子除去を示した。

溶出の制御
ｉ）溶出を調節するために使用した小孔径フリットおよび高融解温度パラフィンワックス
効率のよい試料阻害因子除去のためには、液相の溶出前に、試料を、加熱された樹脂に十分な時間ばく露させる必要があった。したがって何らかの手段で溶出の速度を制御する必要がある。

カラムからの溶出液の流出を抑制するために樹脂の下に小孔径ポリエチレンフリットおよび高融解温度ワックスを使用することによって溶出速度を調節した。加熱された樹脂への試料の十分なばく露を保証するために、加熱時の溶出の開始を３分遅延させ、１０分までに完了した（図９）。

熱溶出で溶出した核酸の品質
ｉ）阻害因子除去には熱溶出の方が遠心分離より優れている：ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴによる、糞便抽出物の遠心溶出と熱圧力溶出の比較
２７ｍＭジチオスレイトールおよび１３．３ｍＭビシンｐＨ５中の２０％ＩＭ−ＳＤＶＢを、２５０μｌのＣ．ディフィシレ陽性下痢試料に加え、ボルテックスで混合した。各２００μｌのこのボルテックス均一混合物を、ＰＶＰＰのコンパクトベッドが入っている８００μｌスピンカラムまたは２本の１．５ｍｌチューブに加えた。糞便−ＩＭ ＳＤＶＢ−ＤＴＴ−ビシン混合物が入っているＰＶＰＰカラムのキャップを堅く閉じ、カラムの底面を開くためにカラムの下部のプラスチックタブを取り除き、１．５ｍｌ収集チューブに入れ、ホットブロック上、１０５℃で１５分間、加熱した（Ａ）。これにより、収集チューブへの溶出液の熱溶出が起こった。試料が入っている１．５ｍｌチューブを同時に１０５℃で１５分間加熱した。冷却してから、チューブを１４，０００ｒｐｍで５分間遠心分離し、チューブの１つからの上清を、１．５ｍｌ収集チューブ中の、ＰＶＰＰのコンパクトベッドが入っている、下部が開いた８００μｌスピンカラムに移した。このＰＶＰＰカラムを、微量遠心機での８，０００ｒｐｍで２分間の遠心分離によって溶出させた（Ｂ）。他方の１．５ｍｌチューブからの抽出物は、ＰＶＰＰカラムなしで使用した（Ｃ）。各抽出物からの５μｌを、二つ一組にして、ＰＣＲプレートのチューブに入っている反応体積１５μｌのＣ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ試薬に加えた。これらをオイルで覆い、６０℃のＢＡＲＴ増幅検出機器にのせた。図１０は、ＰＶＰＰカラム中で直接溶解した糞便試料のピーク時間が２８．２８±０．７５分であり、チューブ中での熱溶解とＰＶＰＰカラムでの遠心が２８．２８±２．２６分であり、緩衝液における糞便試料の熱溶解と固形物の遠沈が６１．３９±３．７８分を与えたことを示している。したがって、この特定糞便試料の場合、ＰＶＰＰカラム内での試料の熱溶解と熱圧力溶出は、チューブ内で試料を溶解してからＰＶＰＰカラムで溶解物を遠心溶出させるのと同程度に良好であった。遠沈した溶解物は、溶解物中にまだ存在する阻害因子ゆえに、遅い検出をもたらした。

ｉｉ）熱溶出は高分子量ＤＮＡの溶出を容易にする
０．８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９６８８）に自社開発樹脂を充填して、１．５ｍｌチューブに溶出するように開いた状態で最終乾燥体積を５５５μｌにした。緩衝液中の２０％ＩＭ−ＳＤＶＢが入っているもう一つのチューブに３３３μｌの糞便試料を加え、ボルテックスにかけることによって混合した。この混合物のうち２００μｌを上記０．８ｍｌカラムに加え、キャップを堅く閉じてから、その１．５ｍｌチューブに入った状態で、９５℃ホットブロック上で１５分間、熱溶出させた。溶出後に、チューブを冷まし、カラムを新しいチューブに移し、８，０００×ｇで３分間遠心分離した。熱溶出液と遠心溶出液の両方を１５μｌずつ、３μｌのローディング緩衝液と混合した後に、挿入染色剤を含有する１％アガロースゲルで泳動し、ゲル像をトランスイルミネータ上でキャプチャした（図１１）。熱溶出液の強度プロファイルは、染色されたＤＮＡが実質的に高分子量で、ゲルのウェル中に残るものであることを示している。続いて行なった同じカラムの遠心分離溶出は、追加の低分子量染色を示す。遠心分離は高分子量ＤＮＡの剪断を引き起こし、それが低分子量フラグメントをもたらして、増幅のターゲット部位内での切断により、低コピー数検出に影響を及ぼしうることが知られている。ＤＮＡ剪断が存在しないことは、熱圧力抽出溶出の利点である。

熱溶出原理の実証
ｉ）便試料の抽出に続くＣ．ディフィシレの検出のための使用
８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９８９７）に、最終体積が３．４ｍｌになるように反応緩衝液中の自社開発樹脂混合物を充填した。この際、排除緩衝液体積は１．９６５ｍｌであった。滅菌マイクロウルトラファインフロックスワブ（Ｐｕｒｉｔａｎ ＃２５−３３１８ １ＰＮ ５０）を使って、Ｃ．ディフィシレ陽性および陰性糞便試料について、それぞれ１つの試料をサンプリングした。スワブの末端を樹脂混合物内で混合し、スワブの軸を折って、カラムを堅く閉じた。ツイストタブを折り取り、カラムを内径１３．５ｍｍの収集チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＦＢ５１５７９）に入れ、カラムとチューブの全体を挿入深さが８０ｍｍである特製の加熱ブロック上に置いた。これを１００℃で１０分間加熱した。この時間中にカラム内で圧力が高まり、全溶出液が、カラムの底面を通って収集チューブ内に徐々に駆出された。それぞれからの溶出液を使用して、凍結乾燥阻害因子対照ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応混合物を二つ一組にして再構成した。これらを６０℃で実行し、反応のピーク時間を比較した。これは、Ｃ．ディフィシレ陽性試料については２４．０４±０．７５分の検出時間を与えたが、Ｃ．ディフィシレ陰性試料はピークに到達しなかったことから（図１２）、この方法によって便からＣ．ディフィシレをうまく検出できることが示された。

ｉｉ）熱溶出は、過剰な希釈の必要を回避することにより、検出を損なわずに、糞便阻害を除去する
６本の８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９８９７）に、反応緩衝液中の自社開発樹脂混合物を充填した。この際、排除緩衝液体積は１．９６５ｍｌであった。６つの確認済みＣ．ディフィシレ陽性臨床便試料を圧力カラム溶出法によって検査した。反応緩衝液中の各臨床試料（３０ｍｇ）の１対５希釈液１５０μｌを各カラムに加え、混合した。ツイストタブを折り取った。次にカラムを内径１３．５ｍｍの収集チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＦＢ５１５７９）に入れ、カラムとチューブの全体を挿入深さが８０ｍｍである特製の加熱ブロック上に置いた。これらを１００℃で１０分間加熱し、溶出液を室温まで冷却した。溶出液のうち２０μｌを使って、凍結乾燥Ｃ．ディフィシレおよび阻害因子対照ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ試薬を再構成した。

また、６つの便試料を、他の利用可能な市販Ｃ．ディフィシレ検査で使用される程度のレベルに希釈した。これらを、最終６００μｌの体積で反応緩衝液中に１：２００、１：５００、および１：７００になるように調製し、ボルテックスで混合し、２ｍｌチューブに入れて、１００℃に設定した加熱ブロックで１０分間加熱した。チューブを混合してから、溶解物のうちの２０μｌを使って、凍結乾燥Ｃ．ディフィシレおよび阻害因子対照ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ試薬を再構成した。反応を、ＢＡＲＴ検出ハードウェア上、６０℃で９０分間実行した。試料Ａ００１およびＡ００４は、英国公衆衛生試験所（Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）が使用しているＰＣＲ法での高いＣｔ値によって確認された低いＣ．ディフィシレ負荷量を有していた。圧力カラムによる抽出では、希釈法が２００倍希釈と７００倍希釈の間で検出の劣化を示したこれら２つの困難な試料を含めて、すべてのレプリケートの検出が可能であった。これらの方法について、Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴピーク時間を、図１３ａで比較する。熱溶出法は、糞便阻害を十分に除去するのに、樹脂混合物における１：７０を上回る希釈を必要としなかった。

試料Ａ００１は、高い阻害因子負荷量とこのセットの中で最も低いＣ．ディフィシレレベルとを持つ固形便であった。この試料は、熱溶出法ではうまく検出されたが、１対２００での検出は劣化し、１対５００および１対７００では過剰な希釈ゆえに完全に失敗した。図１３ｂは、この試料に関して、１対２００の阻害因子対照が、カラムからの溶出液（１対７０に希釈したもの）より大きな阻害を示したことを示している。実際、阻害を軽減するには試料を１対５００に希釈する必要があった。阻害除去の観点から言えば、樹脂を使った熱溶出カラムは、阻害性の高い試料Ａ００１およびＡ００５の傾向からわかるように、２００倍希釈より有効であった。

ｉｉｉ）熱圧力抽出後のノロウイルスの検出
５０μｌのノロウイルスＧＩＩ−４陽性下痢試料を、１．５ｍｌスクリューキャップに入った２０ｍＭ ＭＥＳ、４０ｍＭ ＤＴＴ中の２０％ＩＭ−ＳＤＶＢ １５０μｌに加えた。これを混合し、キャップをして、９５℃のホットブロック上に１０分間置いてから、氷に２分間入れ、次に１７，０００ｇで５分間遠心分離した。上清のうち１００μｌを８００μｌチューブ中の圧縮ＰＶＰＰベッドに加え、８，０００×ｇで２分間遠心溶出させた。その抽出物から５μｌずつを、二つ一組にして、ブーム技術を使って先に抽出しておいた同じ糞便試料１μｌと一緒に、ＰＣＲプレートのチューブに入っている反応体積１５μｌのノロウイルスＧＩＩ−４逆転写酵素ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ試薬に加えた。これらをオイルで覆い、６０℃のＢＡＲＴ増幅検出機器にのせた。ＩＭ ＳＤＶＢ−ＭＥＳ−ＤＴＴ熱溶解の後、ＰＶＰＰカラム精製によって抽出した糞便試料の場合、ピーク時間は５０．４４±７．５９分であった。これは先にブーム法で抽出された試料からの１μｌについての４３．４６±０．７６分と同等であった。これにより、熱溶出に適合するであろう方法でノロウイルスＲＮＡを抽出できることが示された。

熱溶出後の第２容器からの核酸の濃縮
ｉ）熱溶出後に核酸をさらに濃縮することができる
低コピー数応用のために、反応緩衝液に、すなわち溶出液と同じ試薬組成にスパイクした場合に、ゲノムＣ．ディフィシレＤＮＡレベルの濃縮が可能であることを実証した。

反応緩衝液中に２０μｌあたり１０^３、１０^２、１０および０コピーになるように、Ｃ．ディフィシレゲノムＤＮＡの希釈液を調製した。各希釈液のうち２０μｌを使って、凍結乾燥Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応混合物を二つ一組にして再構成し、６０℃で実行した。

また、８００μｌのスパイクをとり、５μｌのＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）磁気ビーズおよび１６０μｌのキット結合緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１分間混合することにより、各希釈液を濃縮した。ビーズを磁気ラックで沈殿させることによって上清を除去した。ビーズを８０μｌの反応緩衝液に再懸濁し、ビーズを含む粗懸濁液のうち２０μｌを使って、凍結乾燥Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応混合物を二つ一組にして再構成し、６０℃で実行した。

図１４は、濃縮によって、１０^３および１０^２コピー／２０μｌレベルの検出時間が３．２〜４．８分改善し、濃縮なしでは２つのレプリケートのうちの１つしか検出されなかった１０コピー／２０μｌレベルの両レプリケートを５２．３分より前に再現性よく検出できるようになったことを示している。

ｉｉ）熱溶出後の簡略化ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）磁気ビーズ法による陽性糞便からのＣ．ディフィシレの濃縮
Ｃ．ディフィシレ陽性便（反応緩衝液に１対５）を陰性便（反応緩衝液中に１：５で調製）で１対１０に希釈した。１５０μｌ（便３０ｍｇ）の希釈液を、ＢＡＲＴ−ＬＡＭＰ反応緩衝液中の特定樹脂混合物（１０％ ｖ／ｖ Ｃｈｅｌｅｘ １００、２５％ ｖ／ｖ Ｏｐｔｉｐｏｒｅ ＳＤ−２および２５％ ｖ／ｖ Ｄｉａｉｏｎ ＷＡ３０）が入っている８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９８９７）に適用し、手で混合した。排除緩衝液体積は１．９６５ｍｌであった。キャップを堅く閉じ、ツイストタブを折り取った。カラムを内径１３．５ｍｍの収集チューブ（Ｆｉｓｈｅｒ ＃ＦＢ５１５７９）に入れ、カラムとチューブの全体を特製の加熱ブロック上に置いた。これを１００℃で１０分間加熱した。収集した溶出液のうち２０μｌを使って、凍結乾燥Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応を二つ一組にして再構成した。

また、８００μｌの溶出液を、５μｌのＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）磁気ビーズおよび１６０μｌのキット結合緩衝液（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）と１分間混合することによって濃縮した。ビーズを磁気ラックで沈殿させることによって上清を除去した。ビーズを８０μｌの反応緩衝液に再懸濁し、ビーズを含む粗懸濁液のうち２０μｌを使って、凍結乾燥Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応混合物を二つ一組にして再構成した。

ＬＡＭＰ−ＢＡＲＴ反応を、ＢＡＲＴ検出機器上、６０℃で実行した。溶出液の濃縮により、検出時間が２７．２±０．５分（未濃縮）から１９．２±０分（濃縮後）に改善した。

ｉｉｉ）ＣｈａｒｇｅＳｗｉｔｃｈ（登録商標）磁気ビーズを第１コンテナに組み込んでの熱溶出の実行の有無によるＣ．ディフィシレゲノムＤＮＡ検出の比較
２０μｌのＣ．ディフィシレゲノムＤＮＡ（２０μｌあたり１０３コピー）原液を１．９８ｍｌのビシン緩衝液に加えた。このうちの２００μｌを使って、１．８ｍｌビシン緩衝液で、２０μｌあたり１０２および１０１コピーの段階希釈液を作った。

ｇＤＮＡ希釈液を次のように処理した：
セット１：処理なし。２０μｌを使って、Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ ＢＡＲＴアッセイを直接再構成した。
セット２： ４００μｌのＣ．ディフィシレｇＤＮＡ希釈液を、２．７ｍｍフリットと追加のガラス繊維ろ紙（Ｇ／ＦＤ ＦＤ ＃１８２３−０２５ろ紙、Ｗｈａｔｍａｎ）とが入っている１．５ｍｌ熱溶出カラムに、５μｌのＣｈａｒｇｅ Ｓｗｉｔｃｈビーズおよび８０μｌの結合緩衝液と共に加えた。これをピペッティングによって混合した。カラムの蓋を堅く閉め、１００℃の加熱ブロック上に（２ｍｌ収集チューブと共に）６分間置いた。溶出後に、ＧＦ／Ｄ材を、捕捉されたビーズと共に、そのまま４０μｌの再構成Ｃ．ディフィシレＬＡＭＰ ＢＡＲＴアッセイに移した。

熱溶出および磁気ビーズ濃縮を伴う条件は、熱溶出なしと比較して、希釈系列において１ｌｏｇ下を検出するのに役立ったことから、熱溶出コンテナ中の核酸を濃縮するために熱溶出をビーズ捕捉法と一緒に使用できることが実証された（図１６）。

熱溶出を用いるマルチコンテナ試料調製および増幅の統合
熱溶出の原理は、それぞれが試料調製のために異なる機能を果たす２つ以上の関連コンテナを組み合わせるように応用することができる。単一の加熱ブロックを使ってそのようなコンテナの連携体を収容することもできるだろうし、試料が首尾一貫してコンテナを移動するように加熱のタイミングおよび加熱速度ならびに加熱ブロックの最終温度が設計されたいくつかの加熱ブロックを使用することもできるだろう。

さらに、１つの容器にＮＡＡＴ試薬が入っていて、コンテナとその容器との組み合わせが、ＮＡＡＴ試薬に処理済み試料をそのまま添加することを可能にするようになっていてもよい。したがって、加熱ブロックの適当な設計により、試料を第１コンテナに入れさえすれば、熱溶出法が試料調製の全工程を実行して、ＮＡＡＴ試薬に試料を加え、さらに増幅を進行させることを可能にするであろう（図１５）。

熱溶出はＰＣＲの試料を与えることができる
ＰＣＲ検出における溶解物の使用
８ｍｌカラム（Ｐｉｅｒｃｅ ＃８９８９７）に、最終体積が３．４ｍｌになるように、反応緩衝液中の自社開発樹脂混合物を充填した。この際、排除緩衝液体積は１．９６５ｍｌであった。滅菌マイクロウルトラファインフロックスワブ（Ｐｕｒｉｔａｎ ＃２５−３３１８ １ＰＮ ５０）を使って、Ｃ．ディフィシレ糞便試料をサンプリングした。スワブの末端を樹脂混合物内で混合し、スワブの軸を折って、カラムを堅く閉じた。カラムを手で混合し、挿入深さが８０ｍｍである特製の加熱ブロック上に置いた。これを１００℃で１０分間加熱した。カラムを冷ましてから、溶解物をカラムの上部から取り出した。ＩＱ Ｓｕｐｅｒｍｉｘ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ ＃１７０ ８８６２）を使ってＣ．ディフィシレリアルタイムＰＣＲ反応混合物を調製した。４．５μｌの溶解物をＰＣＲ反応に二つ一組にして加え、ＡＢＩ−ＰＲＩＳＭ ７０００上で、Ｃ．ディフィシレゲノムＤＮＡ希釈系列と共に実行し、９５℃で３分間の初回変性工程に続いて、５０サイクルの９４℃、５７℃および７２℃（各３０秒）によって増幅した。溶解物は２９のＣｔ値を与えた。これは、検量線から算出すると１．１８×１０^４のコピー数に相当したことから、カラム溶解物をリアルタイムＰＣＲ検出にも使用できることが示された。

Claims (16)

1. 液体試料を多孔性固形マトリックスに通過させるための方法であって、多孔性固形マトリックスをコンテナの少なくとも一部として含んでいるコンテナ内に液体試料を密封する工程、および温度を上昇させることでコンテナ内部の圧力を増加させ、よってコンテナ内部の圧力を増加させるために遠心分離器、ポンプまたは真空システムの必要なしで、液体が多孔性固形マトリックスを通過するようにする工程を含み、ここで前記液体試料は核酸を含むものである、方法。
2. コンテナが２つ以上の異なる固形多孔性マトリックスを含む、請求項１に記載の方法。
3. 液体試料が核酸および核酸増幅の阻害因子を含む、請求項１または２に記載の方法。
4. コンテナが、核酸を核酸増幅の阻害因子より強く結合する多孔性固形マトリックスを含む、請求項３に記載の方法。
5. コンテナが、核酸増幅の阻害因子を核酸より強く結合する多孔性固形マトリックスを含む、請求項３に記載の方法。
6. 核酸と核酸増幅の阻害因子とを含む液体試料から核酸を精製するための方法であって、（ａ）試料を、核酸増幅の阻害因子を核酸より強く結合する多孔性固形マトリックスと接触させ、この際、多孔性固形マトリックスと液体試料とに熱が適用される工程；および（ｂ）未結合の核酸を含む液体試料を多孔性固形マトリックスから分離する工程を含み、ここで多孔性固形マトリックスをコンテナの少なくとも一部として含んでいるコンテナ内に液体試料を密封する工程、および温度を上昇させることでコンテナ内部の圧力を増加させ、よってコンテナ内部の圧力を増加させるために遠心分離器、ポンプまたは真空システムの必要なしで、液体が多孔性固形マトリックスを通過するようにする工程を含む方法によって、液体試料を多孔性固形マトリックスに通過させるものである、方法。
7. 工程（ｂ）において熱が試料に適用される、請求項６に記載の方法。
8. コンテナが、流量制限器を持たないコンテナと比較して多孔性固形マトリックスを通るコンテナからの液体の流れを低減するように構成された流量制限器を含む、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
9. 流量制限器が、フィルタ、フリット、またはバルブである、請求項８に記載の方法。
10. 流量制限器が、４５℃〜１１０℃の温度で融解する材料の層である、請求項８に記載の方法。
11. 材料の層がワックスである、請求項１０に記載の方法。
12. 試料を溶解する工程をさらに含む、請求項１〜１１のいずれか一項に記載の方法。
13. 請求項３〜１２のいずれかに記載の方法に従って核酸を精製するための装置であって、
    ａ）コンテナの少なくとも一部としての多孔性固形マトリックスとコンテナを密封するための手段とを含むコンテナ、および
    ｂ）コンテナを最高１１０℃の温度に加熱するように構成された加熱要素
    を含み、
    ここで前記装置は、コンテナ内部の圧力を増加させるために遠心分離器、ポンプまたは真空システムの必要なしで、熱によって液体が多孔性固形マトリックスを通過するように構成される、装置。
14. 多孔性固形マトリックスを通過した液体を受けるための第２コンテナをさらに含む、請求項１３に記載の装置。
15. 核酸増幅用の試薬を含む容器をさらに含む、請求項１３または１４に記載の装置。
16. 請求項３〜１２のいずれか一項に記載の方法に従って核酸を精製するための装置の使用であって、装置が
    ａ）コンテナの少なくとも一部としての多孔性固形マトリックスとコンテナを密封するための手段とを含むコンテナ、および
    ｂ）コンテナを最高１１０℃の温度に加熱するように構成された加熱要素、
    を含むものである、使用。

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