ES2622352T3 - Métodos para la preparación de muestras para la amplificación del ácido nucleico - Google Patents

Métodos para la preparación de muestras para la amplificación del ácido nucleico Download PDF

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Abstract

Un método para hacer pasar una muestra de líquido a través de una matriz sólida porosa, que comprende las etapas de sellado de la muestra de líquido dentro de un recipiente que comprende una matriz sólida porosa como al menos una parte del recipiente y elevando la temperatura para aumentar la presión dentro del recipiente, causando con ello que el líquido pase a través de la matriz sólida porosa.

Description

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Metodos para la preparacion de muestras para la amplificacion del acido nucleico
Descripcion
Campo de la invencion
[0001] La presente invencion se situa en el campo de la preparacion de la muestra. En particular, se refiere a metodos para preparar muestras antes de realizar la amplificacion de acido nucleico, como se define en las reivindicaciones.
Fondo
Nucleic Acid Amplification Technologies, "NAATs"
[0002] Los NAAT permiten la deteccion y cuantificacion de un acido nucleico en una muestra con alta sensibilidad y especificidad. Los NAAT pueden usarse para determinar la presencia de un acido nucleico de molde particular en una muestra, como se indica por la presencia de un producto de amplificacion despues de la implementacion de una NAAT particular. A la inversa, la ausencia de cualquier producto de amplificacion indica la ausencia de acido nucleico molde en la muestra. Tales tecnicas son de gran importancia en aplicaciones clmicas, industriales y de investigacion. Ejemplos de la aplicacion de NAAT incluyen, pero no se limitan a: determinar si un patogeno esta presente en una muestra, cuantificar la cantidad de virus en una muestra, comparar los niveles relativos de dos o mas genes en una muestra o determinar el nivel de expresion de un marcador espedfico en una muestra.
[0003] La tecnica anterior ha descrito una variedad de tecnicas de termociclado y isotermicas para la amplificacion de acidos nucleicos. Las tecnicas de termociclado, como la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), usan ciclos de temperatura para impulsar ciclos repetidos de smtesis de ADN, lo que conduce a la smtesis de grandes cantidades de nuevo ADN en proporcion a la cantidad original de ADN molde. Tambien se han desarrollado varias tecnicas isotermicas que no dependen del termociclado para impulsar la reaccion de amplificacion. Se han desarrollado tecnicas isotermicas, que utilizan polimerasas de ADN con actividad de desplazamiento de cadena, para reacciones de amplificacion que no implican una etapa de smtesis de ARN. De manera similar, para reacciones de amplificacion que implican una etapa de smtesis de ARN, se han desarrollado tecnicas isotermicas que pueden usar transcriptasa inversa, ARNasa H y/o una ARN polimerasa dependiente de ADN (vease, por ejemplo, Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies - A Review. Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids, Volumen 27, Edicion 3 marzo 2008, paginas 224 - 243).
La preparacion de la muestra es un requisito comun para los NAAT.
[0004] Cuando se desea determinar la presencia y/o nivel de un acido nucleico en una muestra particular usando una NAAT, se requiere comunmente que antes de realizar la NAAT, la muestra se somete a un cierto grado de pre- procesamiento (denominado en la presente memoria «preparacion de muestras») para hacer que los acidos nucleicos presentes en la muestra esten disponibles para la NAAT en una condicion que permita que un ensayo basado en NAAT funcione eficazmente.
En la practica, la preparacion de muestras puede ser un proceso laborioso y de multiples etapas que requiere personal cualificado e infraestructura, consumibles caros, una amplia gama de reactivos y disolventes (a menudo peligrosos o daninos) y varios equipos tales como centrifugadoras y colectores de vacfo. La naturaleza complicada del proceso ofrece multiples oportunidades para errores del operador (incluidos la contaminacion de la muestra) y como resultado la preparacion de la muestra es diffcil de realizar fuera de los laboratorios especializados sin la ayuda de costosos dispositivos de preparacion de muestras roboticas/semi-roboticas.
[0005] Los metodos que pueden simplificar y reducir el costo de preparacion de muestras, por tanto, son altamente deseables y permitir la aplicacion de las tecnologfas basadas en AEAC lejos de laboratorios especializados en el entorno mas dificil y ajustes economicos. Por ejemplo, los metodos mejorados de preparacion de muestras podnan permitir que los NAAT se utilicen en aldeas de Africa para la deteccion del VIH si el costo de la preparacion efectiva de la muestra es bajo y el metodo de preparacion de la muestra es lo suficientemente simple como para ser confiablemente realizado por un no experto en tal situacion.
Principios de preparacion de la muestra
[0006] Hay tres principios generales que pueden estar asociados con la muestra de preparacion de:
i) Hacer que el acido nucleico este ffsicamente disponible para una NAAT (lisis de la muestra)
ii) Eliminacion/reduccion de inhibidores de NAAT
iii) Concentracion de acidos nucleicos
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Para que una NAAT funcione, los acidos nucleicos de una muestra deben estar en contacto ffsico directo con los reactivos de NAAT. Dado que los acidos nucleicos se encuentran generalmente dentro de las celulas o capsidas de virus y puesto que tales celulas/virus pueden incorporarse adicionalmente dentro de una matriz complicada, el proceso de preparacion de muestras debe ser capaz de interrumpir suficientemente tanto las capsidas de celulas/virus como cualquier matriz de muestra asociada para poner acido nucleico a disposicion dla NAAT.
[0007] Ademas, la matriz en la que el acido nucleico de interes reside pueden contener sustancias capaces de inhibir una NAAT, por lo tanto, puede ser necesario eliminar o reducir tales inhibidores para que la NAAT funcione adecuadamente.
[0008] Mas aun, en un numero de casos, la abundancia de acido nucleico de interes en una muestra puede ser muy baja por unidad de volumen. En tales casos, son ventajosos los metodos que pueden concentrar acidos nucleicos de un gran volumen en un volumen mas pequeno; A menudo tal concentracion de acido nucleico puede, en sf misma, facilitar la purificacion del acido nucleico a partir de inhibidores.
Lisis de la muestra
[0009] El lisis de muestra, para hacer disponibles acidos nucleicos, se puede lograr por medios mecanicos (revisado en J. Brent (1998) Breaking Up Isn't Hard To Do: A cacophony of sonicators, cell bombs and grinders" The Scientist 12(22):23) y tecnicas no mecanicas. Las tecnicas mecanicas simples incluyen el uso de un mezclador y la homogeneizacion forzando a las celulas a traves de aberturas restrictivas.La sonicacion se basa en la exposicion de una muestra a ondas sonoras de alta frecuencia, y los enfoques de perlas se basan en exponer las celulas a mezclas violentas en presencia de diversas perlas.
[0010] La interrupcion qmmica de muestras es una alternativa a la disrupcion mecanica. Los detergentes son agentes ffticos qmmicos importantes que actuan interrumpiendo las bicapas lipfdicas y las protemas solubilizantes/desnaturalizantes. El dodecilsulfato de sodio (SDS), un detergente ionico, se utiliza comunmente en protocolos de extraccion de ADN forenses debido en parte a su capacidad para solubilizar macromoleculas y desnaturalizar protemas dentro de la celula (JL Haines et al. (2005) Current Protocols in Human Genetics Vol. 2, (2005 John Wiley and Sons, Inc. Pub.). La proteinasa K se usa a menudo en combinacion con protocolos a base de detergentes (por ejemplo, SDS, Tween-20, Triton X-100) para facilitar la lisis celular. Otra forma de lisis de detergente se basa en papel de FTA (Patente de EE.UU. N° 6.958.392), que es un filtro de celulosa impregnado con una base debil, un detergente anionico, un agente quelante y conservantes.
[0011] Los agentes caotropicos, tales como hidrocloruro de guanidinio tambien pueden actuar como agentes de lisis de muestra eficaz, convenientemente, estos tambien preven un medio para la purificacion de acidos nucleicos del modo que se discute mas adelante.
[0012] Todavfa otro enfoque a la lisis es el uso de calor para abrir celulas/virus. Este enfoque ffsico tiene el beneficio de requerir hardware muy simple (solo un bloque de calentamiento o un bano de agua). El calor puede usarse junto con otros reactivos de lisis quimica para mejorar la eficacia de lisis de las celulas diffciles de lisar, tales como ciertas bacterias Gram positivas y esporas. El beneficio de los metodos de lisis qmmica y de calor es que son especialmente eficaces en inactivar nucleasas que pueden degradar el acido nucleico de interes. Ademas, inactivan proteasas que pueden danar las enzimas utilizadas en los NAAT.
Inhibidores de NAAT
[0013] La explotacion y la utilidad de NAAT son significativamente y adversamente afectadas por una amplia gama de sustancias que actuan para afectar negativamente al rendimiento de una NAAT (vease, por ejemplo, "Capacity of Nine Thermosta- ble DNA Polymerases To Mediate DNA Amplification in the Presence of PCR-Inhibiting Samples, Appl. Environ. Microbiol. October 1998 vol. 64 no. 10 3748-3753" para una revision de varios problemas de inhibidores. Ejemplos de inhibidores son el hemo de la sangre, el acido humico que se encuentra en las plantas y el suelo, los polifenoles, ciertos metales divalentes y el colageno. Dado que casi todas las muestras biologicas contienen inhibidores de la NAAT, es claramente necesario procesar las muestras antes de realizar una NAAT para eliminar o reducir los inhibidores de nivel. Esto es especialmente cierto con ciertas matrices complicadas y heterogeneas tales como heces que tienen una carga muy alta de sustancias inhibidoras.
Eliminacion del inhibidor
[0014] La eliminacion o reduccion de los inhibidores de NAAT pueden alcanzarse por i) la separacion activa del acido nucleico a partir de inhibidores usando alguna propiedad del acido nucleico y/o inhibidor, respectivamente, ii) dilucion de la muestra para llevar la concentracion de inhibidores por debajo de la que afecta negativamente la NAAT empleada o iii) la adicion de un aditivo en fase lfquida que neutraliza el efecto inhibitorio del inhibidor.
[0015] Por ejemplo, Chelex-100 (Bio-Rad, Hercules, CA) es una resina modificada que une de manera eficiente cationes metalicos multivalentes que pueden inhibir NAAT (Walsh P. S. et al., Chelex 100 as a medium for simple
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extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material. Biotechniques 10(4):506-13).
[0016] La polivinilpolipirrolidona (PVPP) es una modificacion insoluble altamente reticulada de polivinilpirrolidona (PVP) que se ha utilizado para la eliminacion de polifenoles, tales como el acido humico, durante la extraccion de AdN (Holben WE, Jansson JK, Chelm BK, Tiedje JM (1988) ADN Probe Method for the Detection of Specific Microorganisms in the Soil Bacterial Community, Appl. Environ. Microbiol. 54 (3): 703-711).
[0017] Se ha identificado una gama de resinas de intercambio ionico utiles para la eliminacion de inhibidor fecal. Estos incluyen pero no se limitan a: Optipore SD-2 (Dowex), una resina de estireno-divinilbenceno aminada usada para la decoloracion y Diaion WA30 (Mitsubishi Chemical), una resina de intercambio anionico altamente porosa y debilmente basica. Hemos encontrado que estas resinas pueden sustituirse para PVPP en la eliminacion de inhibidores de NAAT de lisados fecales. El carbon activado es otro material que puede usarse para eliminar los inhibidores de NAAT. Preferiblemente, el carbon activado estara en una forma en la que no puede pasar a traves de fritas o filtros usados para retenerlo, por ejemplo, el carbon activado puede estar en forma de partfculas grandes o perlas. En general, se pueden seleccionar combinaciones de resinas y fritas o filtros de tal manera que las fritas o filtros no queden bloqueados por las resinas mientras se retiene la resina u otro material en fase solida usada.
[0018] Un enfoque alternativo consiste en utilizar la cromatograffa de exclusion por tamano para separar acido nucleico de alto peso molecular de inhibidores de bajo peso molecular NAAT. Por ejemplo, las columnas de giro Illustra MicroSpin™ G-25 de GE Heathcare se pueden utilizar para este efecto.
[0019] Mientras que el metodo mas sencillo para los inhibidores de NAAT es quizas simplemente diluir una muestra hasta el punto de que concentraciones de inhibidor sean demasiado bajas para afectar negativamente a una NAAT particular, esto tiene la desventaja de tambien diluir cualquier acido nucleico en la muestra. Por lo tanto, cuando el acido nucleico puede ser limitante (tal como en la deteccion de patogenos), el enfoque de dilucion puede resultar en falsos resultados negativos que se obtienen en los ensayos basados en NAAT. En cierta medida, el enfoque de dilucion puede mejorarse anadiendo reactivos en fase lfquida que neutralizan ciertos inhibidores. Por ejemplo, EDTA puede anadirse a una muestra para unirse a y hacer indisponible para la NAAT, ciertos metales divalentes inhibitorios (por ejemplo, Ca2+) y, de este modo, reducir la cantidad de dilucion de la muestra necesaria para permitir que la NAAT se emplee. De hecho, para algunas aplicaciones clmicas en las que el numero de organismos a detectar por una NAAT esta en un nivel muy alto, las muestras pueden diluirse en tampones que contienen EDTA por un factor en el que la concentracion del inhibidor es demasiado baja para inhibir la amplificacion pero donde la cantidad de objetivo presente en la reaccion es suficiente para la deteccion reproducible. Sin embargo, en tipos de muestras muy inhibitorias (por ejemplo, heces humanas), a menudo se requiere un factor de dilucion del orden de 500 veces incluso con EDTA para reducir los niveles de inhibidor hasta un punto en el que se puede emplear una NAAT; por lo que claramente este enfoque no es ideal ya que tal dilucion sin duda afectana la sensibilidad de una prueba basada en NAAT. Ademas, cantidades excesivas de EDTA pueden por sf mismas ser inhibitorias a NAAT si se transmiten al ensayo basado en NAAT, ya que EDTA puede quelar el Mg2+ requerido como un cofactor de polimerasas ADN/ARN.
Purificacion de acidos nucleicos
[0020] Cuando la muestra-preparacion implica la purificacion espedfica de acidos nucleicos, esto elimina inhibidores NAAT, pero tambien puede concentrar el acido nucleico de la muestra.
[0021] En este enfoque, una propiedad unica de los acidos nucleicos se usa para separarlos de otros constituyentes de la muestra (incluyendo inhibidores) y permitir que los acidos nucleicos se concentren en un tampon de eleccion. Esto tiene la ventaja significativa de aumentar la sensibilidad de las pruebas basadas en NAAT. Por ejemplo, si el acido nucleico del VIH contenido en 1 ml de sangre se puede concentrar en apenas 20 pl, entonces esto podna ofrecer un aumento de hasta 50 veces en la concentracion de acido nucleico del VIH, preparacion post-muestra: esto podna hacer la diferencia entre una NAAT espedfica que detecta o no el VIH.
[0022] Uno de los metodos de purificacion de acido nucleico mas tempranos era el uso de extraccion con fenol/cloroformo (D.M. Wallace (1987) Large and small scale phenol extrac- tions. Methods Enzymol. 152:33-41; Maniatis, T. et al., "Purification of Nucleic Acids" in Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 3rd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). En este metodo, la mayona de la protema se desplaza a la fase organica o a la interfase organico-acuosa, y el ADN solubilizado permanece en la fase acuosa. La fase que contiene ADN puede someterse a precipitacion con etanol y ADN aislado despues de una serie de etapas de centrifugacion y lavado. La ventaja del metodo de extraccion organica es que produce preparaciones de ADN de alta calidad (con cantidades relativamente bajas de protema y relativamente baja degradacion) y sigue siendo uno de los metodos mas confiables disponibles hoy en dfa. Las principales desventajas son que el procedimiento es intensivo en tiempo y mano de obra, utiliza disolventes y reactivos peligrosos, requiere equipo engorroso y es relativamente diffcil de adaptar a configuraciones de alto rendimiento y ciertamente no es adecuado para pruebas cercanas al paciente, o para su uso por un operador no cualificado.
[0023] Un enfoque alternativo para la purificacion de acido nucleico es el uso de sflice en combinacion con un
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agente caotropico (Boom, R. et al., (1990) "Rapid and Simple method for purification of nucleic acids," J Clin Microbiol. 28(3):495-503). El agente caotropico actua tanto para lisar celulas/virus como para actuar tambien para que los acidos nucleicos se unan a las partfculas de sflice. El acido nucleico puede eluirse posteriormente a partir de la sflice usando un tampon de baja fuerza ionica (o agua). El metodo de Boom forma la base de un numero de enfoques de lisis/purificacion (por ejemplo, DNAIQ Systems, Promega, Madison, WI). Una alternativa a las perlas de sflice es el uso de membranas de sflice (QIAamp, Qiagen Hilden, DE). Ademas, las propias perlas de sflice pueden modificarse para mejorar adicionalmente la union al ADN.
[0024] Un enfoque basado en la carga alternativa es el uso de resinas de intercambio ionico. Una solucion que contiene ADN y otras macromoleculas se expone a la resina de intercambio ionico. El ADN cargado negativamente (debido a su esqueleto de fosfato) se une relativamente fuertemente a la resina a una concentracion o pH de sal dado. Protema, hidrocarburo, y otras impurezas se unen relativamente debilmente (si lo hacen) y se lavan de las perlas (por ejemplo, en un formato de columna o por centrifugacion). El ADN purificado puede entonces eluirse en un tampon de alta fuerza ionica. Una resina de intercambio anionico comercialmente disponible que se utiliza actualmente se basa en perlas de sflice modificadas con DEAE (Genomic-tip, Qiagen).
[0025] Un enfoque relacionado con el de resinas de intercambio ionico consiste en utilizar matrices solidas que tienen una carga positiva neta a un pH dado y son capaces de union a ADN (Baker, MJ, patente de EE.UU. n° 6.914.137). La modificacion contiene un grupo ionizable, tal que el enlace del ADN se invierte a un pH mas alto (cuando el grupo ionizable es neutro o cargado negativamente). Un enfoque ampliamente utilizado de este tipo se basa en la perla ChargeSwitch (Life Technologies, Inc. Carlsbad, CA).
Captura de oliaonucleotidos
[0026] Los acidos nucleicos diana pueden aislarse tambien mediante el uso de oligonucleotidos de captura. En esta muestra de metodo, el acido nucleico se incuba con un oligonucleotido de captura que hibrida con la secuencia diana complementaria en el blanco. Los complejos de oligocleotido de captura diana hibridado se extraen de la solucion y se lavan para eliminar las impurezas. Esto puede lograrse mediante la interaccion ligando-receptor, tal como estreptavidina de biotina donde esta biotinilado el oligonucleotido de captura oligo, y se puede utilizar en un numero de formatos, incluyendo perlas magneticas, tubos recubiertos, etc. La diana capturada puede entonces anadirse directamente a la reaccion de amplificacion. Un ejemplo del uso de captura de oligonucleotidos es el ensayo APTIMA HIV (Gen-Probe).
Reparacion inmunomaanetica (IMS)
[0027] Tipos celulares espedficos tambien se pueden aislar usando anticuerpos unidos a partfculas paramagneticas dirigidas hacia sus epftopos de superficie espedficos. Las celulas diana/virus se eliminan de la muestra mediante la aplicacion de un campo magnetico y se anaden a un ensayo de deteccion para el organismo. Un ejemplo de la utilizacion de IMS es la deteccion de Salmonella por el sistema Pathatrix (Matrix Micro-Science Ltd). (Odumeru JA, y Carlos G. Leon-Velarde CG (2012) Salmonella Detection Methods for Food and Food Ingredients. in Salmonella - A Dangerous Foodborne Pathogen, Ed. Barakat S. M. Mahmoud. InTech, Rijeka, Croatia.)
Perlas maaneticas
[0028] Un experto en la tecnica reconocera que las perlas magneticas o partfculas pueden utilizarse para ChargeSwitch, captura de oligonucleotido y separacion inmunomagnetica. El metodo Boom tambien se puede implementar usando partfculas magneticas o perlas que contienen tanto sflice como oxido de hierro magnetico (Berensmeier S. (2006) Magnetic particles for the separation and purification of nucleic ac- ids. Appl. Microbiol. Biotechnol. 73(3):495-504). Un ejemplo de extraccion Boom de partfcula magnetica es el sistema Nucli-SENS (bioMerieux).
Problemas del protocolo de preparacion de muestras
[0029] Los tres aspectos discutidos de de preparacion de muestras, extraccion, eliminacion de inhibidor, purificacion/concentracion de acido nucleico, resultan inevitablemente en procedimientos de multiples pasos. Cada paso en el procedimiento agrega tiempo y esfuerzo e introduce complejidad, coste y errores de operador. Incluso para los laboratorios especializados con operadores altamente capacitados, la naturaleza complicada de los actuales metodos de preparacion de muestras significa que los metodos manuales son simplemente demasiado engorrosos, y se requiere, por lo tanto, alguna forma de automatizacion.
[0030] Lejos de laboratorios especializados, puede no haber la infraestructura ni los operadores cualificados para realizar la preparacion de muestras. Para abordar esta necesidad, se han introducido tecnologfas que permiten la automatizacion discreta de la preparacion de muestras para que los ensayos NAAT puedan realizarse por usuarios no expertos. Sin embargo, tales enfoques requieren consumibles complicados y costosos que pueden excluir su uso para ciertos ambientes en los que hay limitaciones economicas en la compra de costosos metodos de preparacion de muestras.
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[0031] Una variedad de instrumentos roboticos de laboratorio se han desarrollado para la purificacion parcialmente automatizada de acidos nucleicos. Por ejemplo, el instrumento Maxwell 16 (Promega) instrumento iPrep (Life Technologies), Nucli-SENS easyMAG (bioMerieux) y Qiagen EZ1, sistemas BioRobot M48 y Qiacube (Qiagen) estan disenados para purificar los acidos nucleicos de una gama de tipos de muestras clmicas y forenses. Algunos de estos sistemas requieren algun procesamiento previo manual antes de cargar las muestras en el instrumento. Los sistemas de extraccion de Innuprep (analytikJena, Itzehoe, DE), LabTurbo (Taigen, Taipei, TW), Xiril 150 (Xiril AG, Hombrechtikon, CH) y Quickgene (FujiFilm Corp., Tokyo, JP) requieren mas gestion manual que los sistemas completamente robotizados antes mencionados.
[0032] Los sistemas mas completamente automatizados se han utilizado para la deteccion tanto clmica como forense. Lo mas notable es el sistema Cepheid (Sunnyvale, CA) GeneXpert que para C. difficile realiza la extraccion de ADN y PCR a tiempo real procedente de una muestra de torunda fecal. Sin embargo, el costo tanto del equipo como de una sola prueba puede ser prohibitivamente alto para muchas organizaciones.
Uso de presion para preparar muestras
[0033] Existe un numero de metodos que la presion del uso o de las diferencias de presion para mover lfquidos entre compartimentos como parte del proceso de preparacion de la muestra. Por ejemplo, los siguientes documentos describen metodos que utilizan la presion como parte del proceso de preparacion de la muestra:
• GB2337261 discute la purificacion de acidos nucleicos de celulas enteras usando un filtro de membrana porosa bajo presion.
• El documento JP 2005095003 ensena un cartucho para separar y purificar acidos nucleicos haciendo pasar la solucion de muestra a traves de una diferencia de presion.
• El documento JP 2005118020 muestra un cartucho que contiene un material poroso adsorbente de acido nucleico que tiene al menos dos aberturas y un aparato para generar una diferencia de presion entre al menos dos aberturas.
• El documento US 20070269829 describe un instrumento de aislamiento de acido nucleico que incluye un dispositivo de presurizacion y comprende porciones de recipiente primera y segunda que estan conectadas a traves de una fase solida.
• El documento US 2009/0023904 muestra un cartucho que incluye un recipiente que tiene al menos dos aberturas y que contiene una fase solida adsorbente de acido nucleico. La diferencia de presion se aplica a traves de la fase solida.
• El documento US 5804684 describe el contacto de una muestra biologica con una matriz de union a acido nucleico (partfculas de agarosa en suspension lfquida) que hace que el acido nucleico se precipite; y se eluye desde la matriz.
• El documento US 2008/0275228 ensena la inyeccion de lfquido en el cartucho para el aislamiento y purificacion de acidos nucleicos y pasar el lfquido a traves de una fase solida adsorbente de acido nucleico mediante una diferencia de presion.
• El documento US 2009/0023201 describe un casete de deteccion de acido nucleico y compuestos organicos resistentes a la aglomeracion solubles en agua.
• Los documentos WO 2004/005553 y WO 03/033740 ambos se refieren a bombas mecanicas para dirigir fluido a traves de un soporte posible.
[0034] Una ventaja de tales metodos es que pueden evitar el uso de equipos tales como centrifugadoras en el proceso de preparacion de la muestra. Por ejemplo, se puede usar presion para mover lfquidos alrededor de un dispositivo para facilitar la preparacion de la muestra. Sin embargo, una desventaja de tales metodos es que se requieren aun consumibles o bombas complicadas para procesar la muestra.
Resumen
[0035] La preparacion de muestra representa un componente esencial de ensayos basados en NAAT. Dependiendo del tipo de muestra, el nivel de inhibidores y cualquier requerimiento para concentrar los acidos nucleicos en la muestra, la preparacion de la muestra puede representar la parte mas onerosa y costosa de realizar un ensayo basado en NAAT.
Para que los beneficios de los ensayos basados en NAAT sean disfrutados por aquellos que no tienen acceso a equipo o personal especializado o a aquellos que no pueden costear sistemas automaticos costosos, existe la necesidad de metodos mas sencillos que no sean costosos, puedan realizarse por usuarios no expertos, y que no requieren hardware sofisticado. Aunque existen metodos que eliminan la necesidad de equipos tales como robots, centnfugas o colectores de vacfo para preparar muestras mediante el uso de presion para mover lfquidos dentro de un dispositivo, tales metodos todavfa estan obstruidos con consumibles complicados o hardware para generar diferencias de presion. Ademas, los metodos que aprovechan los metodos ffsicos de bajo coste y de facil acceso para efectuar la preparacion de la muestra (en particular el calor) aun no se han aprovechado plenamente. Al ser la generacion de calor moderado extremadamente facil, un metodo de preparacion de muestras que puede conducirse
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por calor aun combinando qmmicas mas sofisticadas asociadas con la preparacion de muestras podna hacer que la preparacion de muestras para ensayos basados en NAAT se logre mas facilmente a un menor coste y con hardware mucho menos complicado. Tal metodo de preparacion de muestras podna permitir que los ensayos basados en NAAT se realicen en entornos mas desafiantes, por ejemplo en clmicas pequenas en contextos de bajos recursos.
Descripcion detallada de las realizaciones preferidas
[0036] Los inventores han descubierto que es posible eluir un lfquido de un recipiente sellado mediante el calentamiento del recipiente a una temperatura que crea suficiente presion para eluir el lfquido desde el recipiente. La invencion proporciona asf un metodo para hacer pasar una muestra lfquida a traves de una matriz solida porosa, que comprende las etapas de sellar la muestra lfquida dentro de un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente y elevar la temperatura para aumentar la presion dentro del recipiente, para hacer que el lfquido pase a traves de la matriz solida porosa. Al pasar el lfquido a traves de la matriz solida porosa, al menos parte del lfquido puede retirarse del recipiente. Los metodos de la invencion tambien permiten que el lfquido sea transferido desde el recipiente a un segundo recipiente o a un recipiente.
[0037] El proceso de usar calor para pasar una muestra lfquida a traves de la matriz solida porosa se denomina aqrn como "elucion de calor".
[0038] Se encontro ventajosamente que la presion suficiente se podna generar para pasar un lfquido a traves de una matriz solida porosa de un recipiente a temperaturas de menos de 110°C, incluso con una variedad de diferentes tamanos de recipientes. Esto podna lograrse utilizando consumibles de plastico estandar a pesar de la presencia de una matriz solida porosa en el recipiente que bloquea el flujo de lfquido fuera del recipiente a temperatura ambiente. El hecho de que se utilicen tales condiciones de temperatura y presion suaves significa que los acidos nucleicos no se danan en el proceso ni existe peligro significativo de que el recipiente reciba suficiente presion para fallar o incluso explotar, ni se requieren dispositivos de calentamiento extremadamente calientes (>110°C). Por consiguiente, la invencion proporciona metodos mejorados de preparacion de muestras como se reivindica, en particular antes de realizar un ensayo basado en NAAT.
[0039] Una ventaja adicional de los metodos de la intervencion es que el numero de pasos (en particular las medidas de transferencia de lfquido) que se requieren para llevar a cabo la muestra-preparacion es mucho mas reducida en comparacion con otros metodos. Por ejemplo, en realizaciones que utilizan matrices solidas porosas que unen a los inhibidores de NAAT mas fuertemente que los acidos nucleicos, el operador debe simplemente
1) transferir la muestra al primer recipiente,
2) realizar la elucion por calor, y
3) utilizar los acidos nucleicos eluidos en un ensayo de NAAT.
[0040] No se requieren transferencias lfquidas adicionales. Ademas, esto se puede conseguir con solo el uso del propio recipiente y un bloque de calentamiento. No se requieren centrifugadoras, bombas o sistemas de vacfo adicionales. Esto reduce en gran medida la infraestructura de hardware necesaria para realizar la preparacion de la muestra, asf como la reduccion de la complejidad del proceso de preparacion de la muestra de tal manera que pueda ser facilmente realizada por un operador no experto.
[0041] La temperatura se puede aumentar a temperaturas de hasta 110°C. Los inventores han encontrado que el calentamiento del recipiente sellado hasta 110°C crea presion suficiente para pasar la muestra lfquida a traves de la matriz solida porosa, independientemente del tamano del recipiente. La temperatura tambien puede aumentarse a temperaturas que estan por debajo de 110°C, por ejemplo a una temperatura por debajo de 100°C, por debajo de 90°C, por debajo de 80°C o por debajo de 70°C. La temperatura minima para pasar la muestra lfquida a traves de la matriz solida porosa puede diferir entre diferentes recipientes y puede ser, por ejemplo, al menos 40°C, al menos 50°C o al menos 60°C. En general, la temperatura se incrementara a temperaturas por encima de la temperatura ambiente. La temperatura precisa puede determinarse facilmente experimentalmente sometiendo un recipiente a temperaturas crecientes y estableciendo la temperatura a la cual la muestra lfquida se hace pasar a traves de la matriz solida porosa. Cuando el calor empleado se utilizara tambien para lisar celulas o capsidas virales, entonces la temperatura que es suficiente para lisar dichas celulas o capsidas virales puede determinarse facilmente experimentalmente. Sin embargo, en general sena necesaria una temperatura de al menos 90°C.
[0042] De acuerdo con la invencion, la totalidad de la muestra lfquida que se anadio al recipiente puede pasar a traves de la matriz solida porosa. 6. Los metodos como se reivindica, en los que al menos el 20%, al menos el 30%, al menos el 40%, al menos el 50%, al menos el 60%, al menos el 70%, al menos el 80% o al menos el 90% del volumen original de la muestra lfquida se hace pasar a traves de la matriz solida porosa estan tambien dentro del alcance de la invencion. La muestra lfquida que se hace pasar a traves de la matriz solida porosa puede tener una composicion diferente en comparacion con la composicion de la muestra lfquida que se anade al recipiente. Por ejemplo, la muestra eluida puede tener un contenido mas bajo de inhibidores de NAAT en comparacion con la muestra lfquida que se anadio al recipiente.
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[0043] La elucion de calor puede ser practicada mediante la exposicion del recipiente a un dispositivo de calentamiento que tiene la temperatura a la que se ha de calentar el recipiente. Alternativamente, tambien es posible aumentar gradualmente el calor en el recipiente hasta alcanzar la temperatura deseada. Ademas, el recipiente podna someterse a radiacion tal como microondas o infrarrojo.
[0044] Al pasarse el lfquido a traves de la matriz solida porosa por la presion creada por el calentamiento del recipiente, se entiende que la elucion de calor de acuerdo con la invencion puede realizarse en ausencia de otras fuerzas externas, tal como centrifugacion o la aplicacion de un vacfo (por ejemplo a traves de una bomba de vacfo).
[0045] De acuerdo con la invencion, se sello el recipiente. Las formas de sellar un recipiente son conocidas en la tecnica. Por ejemplo, el recipiente se puede sellar usando una tapa, o un tapon. Alternativamente, tambien es posible sellar el recipiente por fusion de los bordes de una abertura en el recipiente, por ejemplo calentando la abertura y presionando los bordes juntos. Esto puede ser particularmente relevante cuando el recipiente esta hecho de plastico u otros materiales termoplasticos, ya que sena facilmente posible calentar la abertura y fundir los bordes de la abertura mediante la aplicacion de presion. Esto se puede lograr, por ejemplo, usando mandfbulas calentadas. Al requerir los metodos de elucion por calor de la invencion que el lfquido pase a traves de la matriz solida porosa, se entiende que al menos parte o la totalidad de la matriz solida porosa no sera sellada, ya que de otro modo el lfquido no podna pasar.
[0046] Los metodos de la invencion pueden comprender una etapa adicional de anadir la muestra de lfquido al recipiente.
El recipiente
[0047] En el contexto de esta memoria descriptiva, un "recipiente" es un recipiente que es adecuado para elucion de calor.
[0048] En general, el recipiente comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente. La matriz solida porosa puede disponerse de tal manera que esta en comunicacion con tanto el interior como el exterior del recipiente. Esto permite que la muestra de lfquido se transfiera del interior hacia el exterior del recipiente cuando la muestra de lfquido se hace pasar a traves de la matriz solida porosa.
[0049] La matriz solida porosa puede ser una parte integral del recipiente y puede formar, por ejemplo, al menos parte de una pared del recipiente. Tambien es posible que la matriz solida porosa no forme una parte integral del recipiente. En estas realizaciones, el recipiente comprendera una abertura y la matriz solida porosa sera posicionado respecto a la abertura de manera que la matriz solida porosa este en comunicacion con el interior y el exterior del recipiente.
[0050] Un recipiente puede comprender una o mas aberturas que son adecuadas para la adicion de la muestra de lfquido al recipiente. De acuerdo con los metodos de la invencion, estas una o mas aberturas deben sellarse con el fin de sellar la muestra de lfquido dentro del recipiente.
[0051] Un "recipiente" es cualquier recipiente que es adecuado para contener un lfquido, pero que no es adecuado para la elucion de calor.
Matriz solida porosa
[0052] El recipiente comprendera por lo menos una matriz solida porosa que puede retener el lfquido dentro del recipiente a temperatura ambiente (por ejemplo a 18-22°C) pero permite que el lfquido pase cuando la presion aumente en el envase debido al aumento de la temperatura.
[0053] En algunas realizaciones, el recipiente comprende un solo tipo de matriz porosa solida. Los metodos de la invencion tambien se pueden practicar con los envases que comprenden dos o mas matrices solidas porosas diferentes. Por ejemplo, el recipiente puede comprender una primera matriz solida porosa y una segunda matriz solida porosa. La primera matriz solida porosa retiene preferiblemente el lfquido en el recipiente antes de que se calienta el recipiente. La primera matriz solida porosa puede ser un filtro. La segunda matriz solida porosa puede ser una matriz que une inhibidores NAAT mas fuertemente que los acidos nucleicos, o que une acidos nucleicos mas fuertemente que los inhibidores de NAAT. La segunda matriz solida porosa puede anadirse al recipiente antes de anadir el lfquido y/o se puede mezclar previamente con el lfquido y se anade al recipiente junto con la muestra de lfquido. La segunda matriz solida porosa puede estar en forma de perlas, por ejemplo perlas magneticas.
[0054] La matriz solida porosa puede ser un filtro. La matriz solida porosa (en particular, la segunda matriz porosa solida donde se utiliza mas de un tipo de matriz) puede ser una matriz que une inhibidores NAAT mas fuertemente que los acidos nucleicos, o que une acidos nucleicos mas fuertemente que los inhibidores de NAAT. Se prefieren tales matrices solidas porosas ya que los metodos de la invencion pueden entonces o bien actuar para eliminar los inhibidores de amplificacion de acido nucleico a partir de acidos nucleicos o bien, a la inversa, pueden actuar para
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purificar y/o concentrar los acidos nucleicos de una muestra.
[0055] A este respecto, las matrices solidas porosas necesitan unir al menos un inhibidor de amplificacion de acido nucleico mas fuertemente que los acidos nucleicos o viceversa con el fin de ser adecuadas para su uso en los metodos de la invencion. La cuestion de si una matriz solida porosa particular une inhibidores de amplificacion de acido nucleico mas (o menos) fuertemente que los acidos nucleicos, se puede determinar mediante la puesta en contacto de una muestra que comprende inhibidores de la amplificacion de acidos nucleicos y acidos nucleicos con la matriz y separando el lfquido de la matriz. Si la disminucion relativa de los inhibidores en comparacion con la disminucion relativa de los acidos nucleicos en el lfquido separado es mas alta, la matriz une los inhibidores mas fuertemente.
[0056] La matriz solida porosa puede estar en la forma de una resina o en forma de perlas, por ejemplo perlas magneticas.
Eliminacion de los inhibidores de NAAT
[0057] Cuando la matriz solida porosa une inhibidores NAAT mas fuertemente que los acidos nucleicos, los acidos nucleicos deseados se eluyeron preferentemente de la matriz. Los inventores han descubierto sorprendentemente que pueden eliminar los inhibidores NAAT mas eficientemente si
i. la matriz solida porosa se calienta con la muestra lfquida en lugar de mezclarse a temperatura ambiente solo, y
ii. la muestra lfquida comprende acidos nucleicos no unidos que estan separadas de la matriz solida porosa, mientras que la matriz y el lfquido son todavfa calientes.
La capacidad mejorada para eliminar los inhibidores NAAT solo requiere calentamiento como se describe anteriormente y no se basa en la elucion debido a la presion generada por el calor.
[0058] Por lo tanto, la invencion proporciona un metodo para purificar acidos nucleicos a partir de una muestra lfquida que comprende acidos nucleicos y los inhibidores de amplificacion de acido nucleico, en el que el metodo comprende las etapas de (a) poner en contacto la muestra con una matriz solida porosa que une Inhibidores de amplificacion de acido nucleico mas fuertemente que los acidos nucleicos, en el que se aplica calor a la matriz solida porosa y la muestra de lfquido; y (b) separar la muestra lfquida que comprende acidos nucleicos no unidos de la matriz solida porosa; donde la muestra de lfquido se hace pasar a traves de la matriz solida porosa por un metodo que comprende las etapas de sellado de la muestra de lfquido dentro de un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente y elevando la temperatura para aumentar la presion dentro del recipiente, de este modo para hacer que el lfquido pase a traves de la matriz solida porosa.
[0059] En los metodos de acuerdo con este aspecto de la invencion, se entiende que el metodo se realizara bajo condiciones en las que al menos algunos de los inhibidores de NAAT se unen a la matriz solida porosa mientras que al menos algunos de los acidos nucleicos no se uniran a la matriz solida porosa. Las condiciones adecuadas seran conocidas por expertos en la tecnica.
[0060] Se puede aplicar calor en la etapa (b).
[0061] Se ha demostrado que la presion suave generada por elucion de calor, en comparacion con la centrifugacion, significa que un menor numero de inhibidores se retiran del material de fase matriz solida porosa. De hecho, si la centrifugacion se utiliza para pasar un lfquido a traves de la matriz solida porosa, la muestra de acido nucleico que se encuentra en el segundo recipiente contienen mas inhibidores de amplificacion de acido nucleico que cuando se usa calor de elucion. Ademas, la eliminacion mejorada de inhibidores significa que el factor general de dilucion de la muestra-preparacion puede reducirse. Como tales, los metodos de la invencion no requieren la dilucion de la muestra original tanto como los metodos que no emplean principios i) y ii) anteriores.
[0062] La fuerza de la elucion de presion es suficientemente alta como para causar cizallamiento significativo de ADN genomico que se ve con metodos columnas centnfugas. En consecuencia, es poco probable que la region diana en las moleculas de ADN de muestra pertinentes se interrumpira por el cizallamiento y, por lo tanto, dificultara la deteccion. Preferiblemente, la muestra lfquida se separa de la matriz solida porosa, mientras que la muestra de lfquido todavfa tiene una temperatura de mas de 60°C, mas preferiblemente la temperatura es de mas de 70°C, incluso mas preferiblemente la temperatura es de mas de 80°C, y lo mas preferiblemente la temperatura es de mas de 90°C. La muestra y la matriz en el paso (a) se pueden calentar durante 1 a 10 minutos.
[0063] Existen varios tipos de matrices solidas porosas, incluyendo resinas de intercambio ionico, que se han demostrado funcionar como la matriz solida porosa de acuerdo con este aspecto de la invencion. Estas resinas son capaces de secuestrar uno o mas inhibidores NAAT. Estas matrices solidas porosas incluyen, pero no se limitan a copolfmeros de estireno-divinilbenceno que contienen acido iminodiacetico (tal como Chelex 100-Bio-Rad), PVPP (polivinilpirrolidona), resinas a base de dimetilamina de poliestireno-base (Diaion WA30-Mitsubishi Chemical), copolfmeros de divinilbenceno de estireno macroporosos con grupos funcionalizados de amina terciaria (Optipore
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SD2, Dowex) y resinas de intercambio anionico debil de base altamente porosa que consisten en una matriz de estireno-divinilbenceno con grupos funcionalizados de amina terciaria (familia de resinas SDVB). El carbon activado tambien puede utilizarse. Tales matrices se pueden utilizar individualmente o en combinacion unos con otros. Se entiende que una persona experta en la tecnica sena capaz de examinar matrices o mezclas de matrices que daran la mejor eliminacion de los inhibidores de NAAT a partir de una matriz de muestra particular usando los metodos de la presente invencion.
[0064] Ciertas matrices tales como Chelex 100, se conocen para quelar iones metalicos divalentes, se sabe que otros, tales como PVPP, se unen a compuestos de polifenol inhibidores. Se entiende que una persona experta en la tecnica intentana detectar matrices que tienen una mayor afinidad por inhibidores NAAT que para los acidos nucleicos de tal manera que, tras la elucion de calor, acidos nucleicos se separan de los inhibidores de NAAT. Por ejemplo, para la deteccion de ADN Clostridium difficile a partir de heces humanas, los presentes inventores han encontrado que la siguiente combinacion de resinas es particularmente eficaz para la eliminacion de inhibidores de NAAT sin unirse a ADN Clostridium difficile de manera que este ADN se encuentra convenientemente en el segundo recipiente tras la elucion de calor es 10% v/v Chelex 100, 25% v/v Optipore SD-2 y 25% v/v Diaion WA30 en 1,9 mL de tampon de reaccion.
[0065] Los inhibidores de NAAT son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, hemo de la sangre, el acido humico se encuentra en plantas y el suelo, polifenoles, y ciertos metales divalentes, tales como calcio o colageno.
[0066] Los acidos nucleicos purificados de acuerdo con este aspecto de la invencion se pueden anadir directamente a los reactivos NAAT para llevar a cabo un ensayo de NAAT. Los acidos nucleicos eluidos tambien pueden procesarse adicionalmente antes de realizar un ensayo de NAAT. Por ejemplo, los acidos nucleicos pueden concentrarse y/o transferirse a un tampon diferente. Metodos de concentracion adecuados son bien conocidos en la tecnica.
Estrategias de captura de acido nucleico
[0067] Cuando la matriz solida porosa une a los acidos nucleicos con mas fuerza que los inhibidores de NAAT, los acidos nucleicos son retenidos preferentemente en la matriz en el recipiente tras elucion de calor y los inhibidores NAAT se pasan preferentemente a traves de la matriz solida porosa con la muestra de lfquido. Por lo tanto la invencion proporciona un metodo de purificacion de acidos nucleicos a partir de una muestra lfquida usando un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente, en el que el metodo comprende las etapas de sellado de la muestra de lfquido dentro del recipiente y elevar la temperatura para aumentar la presion dentro del recipiente, para causar de ese modo que el lfquido pase a traves de la matriz solida porosa, en el que la matriz solida porosa une a los acidos nucleicos con mas fuerza que los inhibidores de amplificacion de acido nucleico
[0068] Se entiende que, mediante el uso de tales matrices solidas porosas, al menos algunos de los acidos nucleicos seran retenidos por la matriz solida porosa, mientras que la fase lfquida, incluyendo al menos algunos de los inhibidores de NAAT, sera en gran parte o completamente eluidos. Posteriormente, puede ser necesario procesar aun mas los acidos nucleicos que fueron retenidos por la matriz solida porosa para hacerlos disponibles para una NAAT. Esto puede hacerse, por ejemplo, mediante la apertura del recipiente y adicion de un tampon para eluir los acidos nucleicos unidos de la matriz solida porosa y la realizacion de elucion de calor para eluir al menos algunos o la totalidad de los acidos nucleicos unidos a partir del solido poroso matriz en un recipiente. El recipiente contiene acidos nucleicos eluidos que se pueden utilizar en un ensayo de NAAT.
[0069] Ejemplos de materiales de fase solida que se pueden utilizar para este aspecto de la invencion incluyen sflice (mediante el proceso de extraccion a base de Boom descrito), perlas de carga-interruptor, perlas de oligo-captura y resinas/perlas de intercambio ionico.
[0070] Cuando se usan matrices solidas porosas para capturar y/o concentrar los acidos nucleicos, la invencion reduce la complejidad del proceso de preparacion de muestras. El hecho de que, tras la elucion de calor, toda la muestra de lfquido puede ser transferida a un segundo recipiente o un contenedor significa que los acidos nucleicos pueden eluirse o eliminarse del recipiente con una contaminacion minima de la fase lfquida original (que contiene inhibidores) que hace que mas facil el tratamiento posterior de la muestra. En algunos casos, un tampon de elucion se puede anadir directamente a la matriz solida porosa despues de la etapa inicial de elucion de calor con el fin de eluir los acidos nucleicos unidos de la matriz de modo que los acidos nucleicos se puedan anadir inmediatamente a reactivos NAAT. Se entiende que para algunos NAAT (en particular donde sistemas de informador bioluminiscentes se utilizan tal como se describe en el documento WO 2004/062338) la matriz solida porosa con los acidos nucleicos unidos se pueden transferir directamente en reactivos NAAT al ser tales metodos tolerantes a tal material en fase solida.
[0071] Alternativamente, es posible llevar a cabo una segunda etapa de elucion de calor para eluir al menos algunos de los acidos nucleicos o la totalidad de los acidos nucleicos a partir de la matriz solida porosa. Esto permite convenientemente el posterior procesamiento de la muestra usando el mismo principio.
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Muestra liquids
[0072] La muestra que se hace pasar a traves de la matriz solida porosa de acuerdo con la invencion es una muestra lfquida. El termino "muestra de lfquido" no excluye que la muestra pueda comprender algunos de los componentes solidos, pero se entiende que la mayona del volumen de la muestra (por ejemplo al menos 70%, al menos 85%, al menos 95% o al menos 99%) es lfquido.
[0073] La muestra lfquida puede derivarse de una muestra de partida que es una muestra lfquida, tal como por ejemplo plasma u orina. La muestra de partida en la que NAAT puede llevarse a cabo y de la que la muestra lfquida puede derivarse puede ser tambien una muestra solida o semi-solida. Por ejemplo, la muestra puede ser una muestra fecal, muestra de alimento o muestra de tejido. Para este tipo de muestras, la muestra solida o semi-solida se puede mezclar con un tampon adecuado antes de introducirse en el recipiente para proporcionar la muestra lfquida. Alternativamente, la muestra solida o semi-solida se puede anadir a un recipiente que ha sido pre-cargado con un tampon adecuado que resulta en una muestra lfquida. La muestra solida o semi-solida tambien se puede mezclar con un tampon adecuado antes de la introduccion en el recipiente y despues se mezcla posteriormente con un segundo tampon adecuado (o el mismo tampon) pre-cargado en el recipiente.
[0074] El material de partida puede ser tambien una muestra lfquida que se puede anadir directamente al recipiente. La muestra lfquida se puede mezclar con un tampon adecuado antes de introducirse en un recipiente de acuerdo con los metodos de la invencion. Alternativamente, la muestra de lfquido se puede anadir a un recipiente que ha sido pre-cargado con un tampon adecuado. La muestra lfquida tambien se puede mezclar con un tampon adecuado antes de la introduccion en el recipiente y despues se mezcla posteriormente con un segundo tampon adecuado (o el mismo tampon), que fue pre-cargado en el recipiente.
[0075] En los metodos de la invencion, la matriz solida porosa puede ser pre-cargada en el recipiente o se introducen en el recipiente junto con o despues de la muestra. La matriz solida porosa puede estar en la forma de una resina o perlas, tales como perlas magneticas.
[0076] La muestra de lfquido puede comprender un tampon que maximiza la eficacia de la preparacion de la muestra y/o la purificacion de acido nucleico. Los tampones adecuados pueden comprender componentes que pueden, por ejemplo, proteger los acidos nucleicos de la degradacion, facilitar la preparacion de la muestra y/o hacer que la preparacion de muestras sea compatible con los reactivos NAAT que se utilizan posteriormente. Por ejemplo, el tampon puede comprender EDTA o albumina de suero bovino que son agentes de eliminacion de inhibidor. Tambien puede comprender uno o mas de las proteasas que pueden facilitar la lisis de la muestra y que pueden inactivar las enzimas, tales como las nucleasas. Tambien puede contener detergentes o sales (tales como KCl) que facilitan tanto la muestra-preparacion como amplificacion de acido nucleico posterior. El tampon tambien puede estar configurado para mantener el pH de la muestra lfquida a un pH que es util para la preparacion de la muestra, por ejemplo a un pH de 4,5 a 9,5, o un pH de aproximadamente 8.
Lisis de la muestra
[0077] El calor empleado en los metodos de la presente invencion tambien puede funcionar para lisar muestras en el recipiente y asf hacer disponibles los acidos nucleicos para un ensayo basado en NAAT posterior. Por lo tanto, los metodos de la invencion pueden incluir una etapa de lisis de la muestra. Una etapa de lisis se prefiere particularmente cuando la muestra lfquida comprende bacterias (tales como bacterias formadoras de esporas) y/o virus porque la lisis de bacterias o virus tambien pueden hacer que dichas bacterias o virus no infecciosas y por lo tanto representa una caractenstica de seguridad conveniente de la presente invencion. La eficacia de calor para lisar muestras puede aumentarse significativamente por la adicion de otros reactivos y/o por ciertos materiales en fase solida. Por ejemplo, EDTA y Chelex se han demostrado para facilitar la lisis de la membrana celular mediante el secuestro de los iones divalentes que estabilizan bicapas lipfdicas (Brown, TA (1995) Gel cloning: an introduction 3a Ed. Chapman & Hall).
[0078] Los metodos de la invencion tambien se pueden utilizar con muestras lfquidas que han sido lisadas antes de anadir la muestra de lfquido al recipiente. Esto es particularmente ventajoso para las muestras que son diffciles de lisar solo por calor. Por ejemplo, para ciertas bacterias formadoras de esporas, puede ser ventajoso utilizar primero un metodo mecanico para romper las esporas. Los medios para lisar muestras son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, sonifiicacion, homogeneizacion mecanica (por ejemplo, mediante el uso de mezcladores, forzando a las celulas por aberturas restrictivas, o de mezcla violenta en presencia de diversas perlas), y la alteracion qmmica, por ejemplo, mediante el uso de detergentes (tales como sulfato de dodecilo sodico (sDs), opcionalmente en combinacion con proteinasas tales como Proteinasa K) o agentes caotropicos (tales como hidrocloruro de guanidinio).
[0079] Cuando se anade el eluato del proceso de elucion de calor directamente a los reactivos NAAT, puede ser importante que el lfquido eluido se enfne lo suficiente para que no afecte adversamente a los reactivos NAAT. Esto es especialmente importante cuando se utiliza NAAT isotermicas en las que algunas de las enzimas utilizadas no
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pueden tolerar temperaturas mas altas. Por ejemplo, para algunos NAAT, tal como amplificacion basada en secuencia de acido nucleico (NASBA) y la amplificacion por drculo rodante (RCA), la temperatura de la muestra debe estar por debajo de 50°C, o incluso por debajo de 40°C para que trabajen las NAAT. Para NAAT utilizando polimerasas de hebra desplazada tales como Bst polimerasa o polimerasas relacionadas, por ejemplo, amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP) o amplificacion por desplazamiento de cadena (SDA), la temperatura de la muestra debe estar por debajo de 90°C, 80°C, 70°C o incluso 60°C para que trabajen las NAAT. Asf, en algunos aspectos de la invencion la muestra de lfquido se enfna a temperaturas por debajo de 90°C, por debajo de 80°C, por debajo de 70°C, por debajo de 60°C, por debajo de 50°C o incluso por debajo de 40°C antes de que la muestra eluida se mezcle con reactivos de NAAT.
[0080] Despues de elucion de calor, la muestra lfquida se puede eluir en un segundo recipiente o un contenedor, en el que el recipiente o contenedor estan a sustancialmente la misma temperatura que el recipiente que se utilizo para elucion de calor, tal que el lfquido eluido sigue calentado despues de elucion de calor. El segundo recipiente o el contenedor tambien pueden estar a una temperatura mas baja que el primer recipiente. Por ejemplo, la temperatura puede diferir hasta en 100°C, por ejemplo, cuando un recipiente se mantiene a 4°C para ayudar a preservar los acidos nucleicos eluidos de la degradacion.
[0081] El recipiente o el contenedor tambien puede enfriarse activamente tras la elucion de calor.
Control de la elucion
[0082] Cuando los metodos implican la lisis de la muestra en el recipiente, es importante que la muestra se caliente a una temperatura suficiente durante un tiempo suficiente para el proceso ffsico de la lisis de la muestra que se produzca. Del mismo modo, debe haber tiempo suficiente para que la muestra lisada interactue con el material de fase solida proporcionada antes de que ocurra la elucion.
[0083] Como tal, los inventores se han dado cuenta de que puede ser necesario controlar la velocidad de elucion de la muestra de lfquido desde el recipiente de tal manera que la muestra de lfquido pase una cantidad de tiempo suficiente en el recipiente a la temperatura requerida. Esto puede lograrse mediante la restriccion del flujo de lfquido desde el recipiente, que se puede hacer por una variedad de medios. Asf, en algunos aspectos de la invencion, el recipiente comprendera un limitador de flujo que esta configurado para reducir el flujo de lfquido desde el recipiente a traves de la matriz solida porosa en comparacion con un recipiente que no tiene el reductor de flujo. En particular, tales limitadores de flujo pueden reducir el flujo de lfquido desde el recipiente a traves de la matriz solida porosa en comparacion con un recipiente que no tiene el restrictor de flujo cuando el recipiente se calienta a una temperatura por encima de la temperatura ambiente (por ejemplo por encima de 40°C o por encima de 50°C). Los restrictores de flujo pueden actuar ya sea permitiendo el flujo constante pero limitada de flujo de lfquido a traves de la matriz solida porosa cuando se aplica calor al recipiente. Ejemplos adecuados de dichos limitadores de flujo son filtros y fritas. El restrictor de flujo tambien puede sellar de forma reversible la matriz solida porosa. En este aspecto de la invencion, el sello se retirara antes de que la muestra de lfquido se pueda eluir del recipiente. Esto puede lograrse, por ejemplo, por medio de valvulas que pueden ser accionadas por un sistema de control mecanico, magnetico o electrico. El restrictor de flujo puede ser tambien una capa de material que se funde a una temperatura superior a la temperatura ambiente pero por debajo de 110°C, por ejemplo a una temperatura entre 45°C y 110°C., Entre 55°C y 110°C o entre 65°C y 110°C. Los materiales adecuados son polfmeros termoplasticos o ceras (es decir, compuestos que se funden por encima de 45°C para dar un lfquido de baja viscosidad), por ejemplo, cera de parafina.
Tecnicas de amplificacion de acido nucleico
[0084] Los metodos de la invencion se pueden usar para preparar las muestras para cualquier NAAT. Asf, aunque la invencion ha sido particularmente ejemplificada usando el metodo conocido como amplificacion isotermica mediada por bucle (LAMP;. Notomi et al. Nucleic Acid Research, 2000, 28; E63) en conjuncion con un sistema informador bioluminiscente conocido como BART (Gandelman et al. Public Library of Science, noviembre de 2010, Volumen 5, numero 11, e14155) es de entenderse que los procedimientos no estan limitados a estas NAAT. Por ejemplo, los inventores han demostrado que las muestras de acidos nucleicos preparados de acuerdo con la invencion tambien se pueden utilizar en la reaccion en cadena de la polimerasa (PCR), que es conocida por ser mas sensible a los inhibidores que la lampara. Los metodos de la invencion tambien se pueden utilizar para preparar las muestras para otras NAAT, como Template Re-priming Amplification (TRA), Self Extending Amplification (SEA), Nucleic acid sequence based amplification (NASBA), strand displacement amplification (SDA) y SMart Amplficiation Process (SMAP).
Otros pasos de elucion de calor
[0085] La elucion de calor de acuerdo con la invencion se puede repetir mas de una vez, por ejemplo dos veces, tres veces, cuatro veces, cinco veces, etc. Cuando la elucion de calor se realiza mas de una vez, esto se puede hacer por aplicacion del lfquido al mismo recipiente que se uso en el primer paso de calor de elucion. Esto puede ser necesario, por ejemplo, cuando el volumen total de la muestra de lfquido supere el volumen del recipiente con el fin de purificar todos los acidos nucleicos en la muestra lfquida. Tambien puede ser necesario cuando se desee lavar la
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matriz solida porosa despues de que los acidos nucleicos se han unido a la misma, o puede ser necesario aplicar un tampon de elucion con el fin de eluir los acidos nucleicos unidos de la matriz. En estos metodos contenedores o recipientes adicionales pueden ser utilizados cuando sean necesarios para recoger el lfquido eluido.
[0086] Cuando la elucion de calor se realice mas de una vez, tambien puede ponerse en practica utilizando mas de un recipiente. Por ejemplo, el lfquido desde un primer recipiente puede eluirse en un segundo recipiente. El segundo recipiente puede entonces sellarse y la temperatura se puede elevar para aumentar la presion dentro del recipiente, de ese modo para hacer que el lfquido pase a traves de la matriz solida porosa. El lfquido eluido del segundo recipiente puede entonces desecharse, recogerse en un recipiente o transferirse a un tercer recipiente. Cuando se utilizan dos, tres o mas recipientes que se pueden calentar o bien simultaneamente, en tandem o en secuencia para mover la muestra de lfquido de un recipiente a fin de automatizar una serie de procesos de preparacion de muestras dentro de un solo consumible. Cuando los recipientes se calientan simultaneamente, es posible utilizar recipientes con diferente pared de espesor de manera que la muestra y las matrices en los recipientes alcancen la temperatura deseada en diferentes puntos temporales.
[0087] En algunos aspectos, la muestra de lfquido eluido por elucion de calor desde el recipiente (si esto es la primera, segunda, tercera o mas elucion de calor de un particular proceso de muestra-preparacion) se pueden combinar directamente con reactivos NAAT dentro de una recipiente suministrado de tal manera que ningun paso de tratamiento de lfquidos adicional (por ejemplo, se requiere una etapa de pipeteo) para transferir la muestra procesada a reactivos de NAAT.
[0088] De esta manera, un solo aparato puede contemplarse que contiene dos para mas recipientes mediante el cual un operador solo tiene que introducir una muestra en un recipiente para llevar a cabo todo el proceso de preparacion de muestras incluyendo la mezcla de la muestra procesada con reactivos de NAAT. Tal aparato tendna la ventaja significativa de que no requiere bombas complicadas y centnfugas para mover lfquido desde un recipiente a otro: un sistema de calentamiento simple podna utilizarse.
Aparatos
[0089] Como se ha discutido anteriormente, la invencion es particularmente adecuada para la purificacion de acidos nucleicos en un ajuste automatizado utilizando los metodos de la invencion. Por lo tanto, la invencion proporciona aparatos como se reivindica que son adecuados para la purificacion de acidos nucleicos de acuerdo con los metodos de la invencion. Por ejemplo, la invencion proporciona un aparato para purificar acidos nucleicos segun los metodos de la invencion, que comprende (a) un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente y medios para sellar el recipiente, y (b) un elemento de calentamiento configurado para calentar el recipiente a una temperatura de hasta 110°C, en el que el aparato esta configurado para pasar lfquido a traves de la matriz solida porosa por el calor. El aparato puede comprender ademas un segundo recipiente para recibir el lfquido pasado a traves de la matriz solida porosa. Ademas, o alternativamente, tambien puede comprender un recipiente que comprende reactivos para la amplificacion de acido nucleico.
[0090] Los aparatos de la invencion permiten la purificacion automatizada de acidos nucleicos a partir de muestras que pueden facilitar en gran medida la preparacion de muestras. En particular, en realizaciones en las que el aparato tambien contiene un recipiente que comprende reactivos para la amplificacion de acido nucleico, los aparatos de la invencion tienen la ventaja de que el operador solo tiene que anadir la muestra al aparato porque todas las etapas posteriores se pueden realizar automaticamente. Por lo tanto, una muestra se puede procesar y amplificar sin intervenciones manuales entre la adicion de la muestra al recipiente y el registro de la salida de la amplificacion en sL
[0091] El recipiente en el aparato puede comprender una matriz solida porosa que une a los acidos nucleicos con mas fuerza que los inhibidores de amplificacion de acido nucleico, o que une inhibidores de amplificacion de acido nucleico con mas fuerza que los acidos nucleicos como se discutio en detalle anteriormente.
[0092] El aparato puede comprender dos o mas (dos, tres, cuatro, cinco, seis o mas, por ejemplo) recipientes. Las matrices solidas porosas pueden ser el mismo en todos los recipientes en el aparato. Tambien pueden ser diferentes, lo cual puede ser ventajoso en realizaciones en las que la matriz captura inhibidores de NAAT porque entonces sena posible tener matrices que unen los inhibidores diferentes con diferentes puntos fuertes, que pueden mejorar la eliminacion de los inhibidores. Cuando mas de un recipiente este presente en los aparatos de la invencion, se prefiere que cada uno de los recipientes se pueda calentar a temperaturas de hasta 110°C por un elemento de calentamiento, porque entonces el ifquido en estos otros recipientes puede transferirse por calor solo. El aparato puede comprender un elemento de calentamiento o mas de un elemento de calentamiento. Los dos o mas recipientes en el aparato pueden ser calentados a diferentes velocidades y/o a diferentes temperaturas. Cuando el aparato comprende mas de un recipiente, o uno o mas recipientes y un recipiente, los recipientes pueden estar colocados dentro del aparato de manera que el lfquido eluido a partir de un recipiente gotee directamente en una abertura de un recipiente adicional o un vaso. Tambien es posible transformar el lfquido por una via, tal como un tubo. Si el recipiente adicional se ha de utilizar para elucion de calor de acuerdo con la invencion, el tubo puede contener, por ejemplo, una valvula que permite que el recipiente se selle antes de que se calienta.
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[0093] De acuerdo con la invencion, el Ifquido desde el recipiente se pasara a traves de las matrices solidas porosas de uno o mas recipientes por el calor. De acuerdo con esto, se prefiere que los aparatos de la invencion no comprendan una centnfuga o una bomba requerida para pasar el lfquido a traves de la matriz solida porosa del recipiente.
[0094] Se prefiere que los aparatos de la invencion comprendan un recipiente que comprende al menos algunos de los reactivos, o preferiblemente todos los reactivos, que son necesarios para NAAT. El recipiente se puede colocar dentro del aparato de tal manera que se anade el lfquido eluido a partir de un recipiente directamente al recipiente que comprende la NAAT. Los aparatos de la invencion son adecuados para el uso con todos NAAT, incluyendo, pero no limitado a PCR y LAMP. Los reactivos que son necesarios para la NAAT son conocidos en la tecnica e incluyen, por ejemplo, uno o mas cebadores, un tampon, una polimerasa y nucleotidos (tales como dNTPs).
General
[0095] El termino "aproximadamente" en relacion con un valor numerico x es opcional y significa, por ejemplo, x+10%.
El termino "que comprende" abarca "que incluye" asf como "que consiste en", por ejemplo una composicion "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional por ejemplo X + Y.
El termino "un" o "una" significa "uno o mas".
[0096] A menos que se indique espedficamente, un proceso que comprende una etapa de mezclar dos o mas componentes no requiere ningun orden espedfico de mezcla. De este modo los componentes se pueden mezclar en cualquier orden. Donde hay tres componentes a continuacion, dos componentes se pueden combinar entre sf, y entonces la combinacion puede combinarse con el tercer componente, etc.
[0097] BART se refiere a un metodo para determinar la cantidad de acido polinucleico de molde presente en una muestra en la que la presencia de fosfato inorganico que se deriva de la reaccion de amplificacion se detecta y es indicativo de la cantidad de acido polinucleico molde en la muestra.
[0098] A continuacion se describiran diversos aspectos y realizaciones de la presente invencion en mas detalle a modo de ejemplo. Se apreciara que la modificacion de detalle se puede hacer sin apartarse del alcance de las reivindicaciones.
Descripcion de las figuras
[0099]
Figura 1
La Figura 1a muestra el principio de anadir una muestra lfquida a un recipiente que contiene otra abertura sellada; sellando la abertura en el recipiente en el que se introduce el lfquido; abriendo una salida al recipiente en el otro lado de algun tipo de filtro que resistira el flujo de lfquido fuera de este primer recipiente; colocando el primer recipiente dentro de un recipiente de recogida que puede recoger el eluato del recipiente; colocando el recipiente y el contenedor en un bloque de calentamiento y, posteriormente, teniendo lfquido transferido desde el recipiente al contenedor.
La Figura 1b, como para 1a, pero con el recipiente que contiene un material en fase solida que se une preferentemente a inhibidores NAAT en lugar de acido nucleico. La solucion de acido nucleico se encuentra en el recipiente tras elucion de calor.
La Figura 1c, como para 1b pero el material en fase solida y la muestra se mezclan antes de anadirse al recipiente.
La Figura 1d, como para 1a, pero con el recipiente que contiene un material en fase solida que se une preferentemente a los acidos nucleicos en lugar de inhibidores NAAT. El acido nucleico se puede inmovilizar sobre el material tras elucion de calor de fase solida dentro de la primera embarcacion.
La Figura 1e, como para 1d, pero el material en fase solida y la muestra se mezclan antes de anadirse al primer recipiente.
La Figura 1f, como por 1b o 1c, pero el acido nucleico eluido posteriormente se concentra, utilizando un material de fase solida diferente que se une preferentemente a un acido. En este caso, el material en fase solida consta de perlas paramagneticas que se pueden sedimentar de una muestra usando un iman. Los acidos nucleicos pueden liberarse a partir del material con un tampon de elucion adecuado, de lo contrario, las perlas se pueden anadir directamente a un ensayo a base de NAAT.
Figura 2
Los datos que muestran elucion de calor entre dos vasos mas y menos un material en fase solida en el primer recipiente como se describe en el Ejemplo 1.
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Figura 3
Mostrando salidas BART-LAMP tfpicas para una serie de dilucion de acido nucleico diana. Usando la tecnologfa de BART, las muestras positivas dan un aumento y luego disminuyen en intensidad la luz con el tiempo. El tiempo para alcanzar el pico de luz es inversamente proporcional a la cantidad del acido nucleico presente diana en la reaccion de amplificacion.
Figura 4
Comparacion de IM-SDVB calentada y no calentada para la eliminacion de inhibidor de enriquecimiento de chocolate ISO.
Figura 5
Utilizacion de 4°SDVB y 3°SDVB para eliminar inhibicion NAAT del enriquecimiento de cafe. En comparacion con el uso sin resina o con la resina IM-SDVB (a), las resinas de 4°SDVB (b) y 3°SDVB (c) se muestran extremadamente eficaces en la eliminacion de la inhibicion causada por cafe.
Figura 6
Eliminacion de inhibicion del acido humico por la mezcla de resina con el tiempo de calentamiento en el bloque caliente a 100°C (a); Perfil de temperatura con el tiempo de la mezcla de resina calentada en el bloque caliente a 100°C (b).
Figura 7
Perfil de temperatura con el tiempo de eluato de elucion de calor a partir de un bloque caliente a 100°C.
Figura 8
Eliminacion de la inhibicion Xylan por elucion de calor vs. dilucion solo en el tampon.
Figura 9
Modulacion de tiempos de elucion mediante el uso de diferentes fritas y el uso de cera.
Figura 10
Perfil de amplificacion para reacciones C. difficile LAMP-BART que muestran una comparacion entre muestra fecal positiva C. difficile extrafda por A) elucion de calor de una mezcla IM SDVB-tampon fecal a traves de una columna de PVPP, B) elucion hilada de una columna PVPP cargada con mezcla IM SDVB-tampon fecal hervida y C) clarificacion hilada de una mezcla IM SDVB-tampon fecal hervida
Figura 11 Perfil de intensidad de 1% de agarosa manchada por intercalador de UV visualizada que muestra un extracto fecal de elucion de calor y un extracto fecal centnfugamente eluido.
Figura 12 Perfil de amplificacion para reacciones C. difficile LAMP-BART que muestran tras la extraccion de una muestra fecal positiva C. difficile y una muestra negativa C. difficile usando elucion de calor de una mezcla de resina patentada en una columna 8 ml Pierce y un tubo de recogida.
Figura 13
(a) Deteccion C. difficile LAMP BART desde muestras de heces clmica positivas C. difficile por elucion de calor contra los metodos dilutivos;
(b) Perfil de control inhibidor LAMP BART desde muestras de heces clmica positivas C. difficile por elucion de calor contra los metodos dilutivos.
Figura 14
Comparacion de deteccion de ADN genomica C difficile pre y post concentracion por un metodo de perla magnetica simplificada ChargeSwitch®.
Figura 15
Integracion de la preparacion y amplificacion de muestras de multiples vasos usando elucion de calor Figura 16
Comparacion de deteccion de ADN genomica C difficil con y sin realizar elucion de calor con perlas magneticas ChargeSwitch® incorporadas en el primer recipiente.
Ejemplos
Ejemplo 1: El calor es suficiente para conducir eluato de recipiente contra una fuerza de resistencia utilizando consumibles de plastico estandar y matrices en fase solida demostrando el principio de elucion de calor.
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[0100] El calor dentro de la columna de la preparacion de la muestra permite una acumulacion de presion que permite la autoelucion del lisado de la muestra a traves de la base de la columna, y no requiere la asistencia de una centnfuga o jeringa para lograrlo (Figura 1). Esta caractenstica se ejemplifica en una (a) pequena escala de columna de 0,8 ml, asf como (b) una columna mas grande 8 ml.
(a) una columna de 0,8 ml (Pierce n° 89688) se lleno con una mezcla de resina patentada en tampon de reaccion a un volumen final de 600 pl, cuando el volumen de tampon excluido era 327,5 pl. La tapa se cerro hermeticamente y la pestana de giro se rompio. La columna se coloco en un tubo de recogida de 2 ml y toda la columna y el tubo se coloco sobre un bloque de calentamiento a 95°C durante 10 min. Durante este tiempo la presion se habfa acumulado dentro de la columna y la mayona del lfquido gradualmente se condujo a traves de la base de la columna en el tubo de recogida.
(b) una columna de 8 ml (Pierce # 89897) se lleno con una mezcla de resina patentada en tampon de reaccion a un volumen final de 3,4 ml en el que el volumen de tampon excluido era de 1,96 mL. La tapa se cerro hermeticamente y la pestana de giro se rompio. La columna se coloco en un tubo de recogida de diametro interno de 13,5 mm (Fisher n° FB51579) y toda la columna y el tubo se coloco sobre un bloque de calentamiento a medida que tiene una profundidad de insercion de 80 mm. Esto se calento a 100°C durante 10 minutos. Durante este tiempo la presion se habfa acumulado dentro de la columna y todo el material eluido se condujo gradualmente a traves de la base de la columna en el tubo de recogida.
[0101] Para confirmar que el calor moderado pueda eluir fase lfquida a traves del metodo de elucion de calor en la presencia de una fase solida y filtro de fase solida que crea elucion que resiste contrapresion, una solucion se eluyo en la presencia de Chelex 100 (Bio-Rad). Espedficamente, una suspension al 10% de Chelex 100 en agua de calidad molecular se preparo de la siguiente manera: 1,096 g de Chelex se coloco en un vaso de precipitados de 50 ml y se anadio 10,96 ml de agua de grado molecular (Sigma). Esto se agito en un agitador magnetico tras adicion de una pequena pulga. 800 pl se anadio a dos columnas Pierce 89868 pesadas previamente tras la retirada de sus pestanas de giro. Estas columnas se colocaron en un tubo de recogida de 2 ml y se centrifugaron a 8000 rpm durante 1 minuto para eliminar el agua de la resina Chelex en la columna. 250 pl de agua de grado molecular se anadio a estas dos columnas y otras dos columnas previamente pesadas. Estas se colocaron en tubos con pestanas de giro pesadas previamente de 2 ml y se colocan en un bloque de calor de 100°C o se mantienen a temperatura ambiente durante 5 minutos. Al final de los 5 minutos, columnas y tubos de eluato se pesaron para determinar el volumen de eluido y el volumen de agua que queda en la columna. Ninguna de las columnas mantenidas solamente a temperatura ambiente eluyeron agua, mientras que las dos columnas con calefaccion habfan eluido con 198,5 pl eluido de la columna calentada Chelex y 226,4 pl de la columna solo de agua (Figura 2).
Ejemplo 2: El sistema informador de BART
[0102] El sistema informador de BART se ha explicado en detalle en el documento WO 2004/062338 y WO2006/010948. BART es un ejemplo de un sistema informador disenado para NAAT isotermica que da un unico tipo de senal de una muestra, una senal bioluminiscente. BART utiliza la deteccion dependiente de luciferasa de la luciernaga de pirofosfato inorganico. Esto se produce en grandes cantidades cuando las secuencias diana ”se detectan usando una NAAT. Como tales, diagnosticos moleculares se pueden lograr con BART mediante la simple medicion de la luz emitida desde tubos cerrados, en un ensayo de fase homogenea (Figura 3). BART se demuestra con varios diferentes NAAT, que operan entre 50-63°C. El informador de BART es un medio particularmente eficaz para seguir la tasa de amplificacion de una NAAT ya que la salida de luz representa una medicion de la velocidad instantanea de amplificacion (mientras que, por ejemplo, salidas fluorescentes muestran la acumulacion de una senal y por lo tanto las mediciones tienen que ser diferenciadas para obtener las velocidades de amplificacion).
Ejemplo 3: Materiales de fase solida que eliminan inhibidores NAAT se realizan mejor cuando se eluyen a temperatura mas alta (que se realiza de forma natural con elucion de calor).
i) Capacidad de la resina en fase solida "3°SDVB" para eliminar inhibidores NAAT a diferentes temperaturas
[0103] 20 pl de una solucion madre acida humica de 187,5 pg/m se anadio a tampon de reaccion BART-LAMP (190mm bicina, pH 8,0) en dos conjuntos que contienen o bien 580 pl de tampon sin resina 3°SDVB o bien 580 pl de tampon con 3°SDVB a 20%. Un conjunto se mezclo en vortice, despues se calento a 95°C durante 5 minutos, seguido de un segundo vortice. El conjunto de control se sometio a vortice y se dejo a temperatura ambiente durante este tiempo, entonces se agito de nuevo con vortice. 20 pl de cada sobrenadante se utilizo para reconstituir una reaccion de BART-LAMP liofilizada que contiene un numero fijo (104) de una molecula de ADN diana particular (denominada en este documento como 'control Inhibidor’). Los tiempos de los picos de reacciones duplicadas se compararon posteriormente. La presencia de inhibidores pueden ralentizar o abolir la amplificacion, en cuyo caso las horas punta (el tiempo que tarda el sistema reportero de BART para dar el pico de luz caracteristico) aumentaran o desapareceran por completo respectivamente. Esto demostro que sin calor y sin resina los tiempos de reaccion con acido humico eran 59,7+0 min. Estos mejoraron a 57,0+0,5 min en presencia de resina y mejoraron aun mas significativamente con la resina calentada a 38,4+2,1 min.
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ii) Capacidad de la resina en fase solida "IM-SDVB" para eliminar los complejos de inhibidores NAAT a diferentes temperaturas.
[0104] El proceso de prueba de chocolate para los patogenos de alimentacion implica la incubacion de 25 g de chocolate en 250 ml de un caldo de enriquecimiento que contiene agua de peptona tamponada con leche en polvo y el colorante verde brillante. Despues de la incubacion se habfa encontrado que este caldo de enriquecimiento era altamente inhibidor a NAAT; este caldo se denomina aqu como enriquecimiento de chocolate ISO. La identidad del inhibidor es desconocida. Dos conjuntos de muestras de 20 pl de un enriquecimiento de chocolate ISO se anadieron a 580 pl de tampon Tris 20 mM de pH 8,8 que contiene sulfato de amonio 10 mM, 0,15% de Triton X-100, 0,4 mg/ml polivinilpirrolidona y 0,09% de azida de sodio con 10% (p/v) IM-SDVB (una resina de intercambio cationico que consiste en un copolfmero de divinilbenceno de estireno con grupos funcionalizados de iminodiacetato.) en tubos de centnfuga de 1,5 ml. Estos se sometieron a vortice de pulso. Un conjunto de tubos de muestra de chocolate se calentaron a 110°C en un bloque de calentamiento durante 5 minutos. El otro conjunto se mantuvo a temperatura ambiente durante el mismo tiempo. Despues de 5 minutos ambos conjuntos de tubos se agitaron en vortice de pulso, se dejaron enfriar y 20 pl de cada tubo utilizado para reconstituir reacciones BART-LAMP de control inhibidor liofilizadas en triplicado en 200 pl de tiras de PCR. La Figura 4 muestra que el enriquecimiento de chocolate calentado dio un tiempo pico medio de 24,7+1,15 min, que es 8,1 min mas rapido que el tiempo pico medio de 32,8+1,61 min. El control de inhibidor en blanco se ejecuto simultaneamente y dio un tiempo pico de 18,9+1,00 min. Por lo tanto, la calefaccion del chocolate en IM-SDVB resulto en una reduccion de la inhibicion de BART-LAMP en comparacion con la no calefaccion.
iii) Capacidad de la resina en fase solida "PVPP' para eliminar el acido humico NAAT-inhibidor a diferentes temperaturas.
[0105] 200 pl de la suspension de PVPP se pipeteo a tubos 200 pl que se centrifugaron para dar un lecho PVPP denso y 100 pl del lfquido exceso se elimino. 100 pl de 1,25 pg/pl de acido humico se anadio a la parte superior del lecho PVPP. La adicion se mezclo en vortice en todo el PVPP. Tres tubos se calentaron a 95°C durante 15 minutos y tres tubos se dejaron a temperatura ambiente durante 15 minutos. Todos los tubos se agitaron con vortice despues de 5 minutos y volvieron a la temperatura. 20 pl se llevo a tubos de PCR separados y las partfculas se centrifugaron. Parte del acido humico de temperatura ambiente sobre sobrenadante PVPP tambien se calento a 95°C durante 15 min. 5 pl de cada uno se anadio a 15 pl reacciones de control de inhibidor BART-LAMP. Tiempo pico de control de inhibidor para el acido humico en PVPP se calento a 95°C, el acido humico en PVPP a temperatura ambiente y el sobrenadante de esta ultima se calento a 95°C fueron 32,85+7,20 minutos, 47,63+8,17 minutos y 59,16+14,92 minutos, respectivamente. Esto mostro que PVPP calentada elimino mas acido humico de PVPP a temperatura ambiente y que el calentamiento del sobrenadante de acido humico a partir del extracto de PVPP a temperatura ambiente no dio ningun alivio de inhibicion adicional. En este estudio picos no inhibidos con agua estaban en 23,11+3,31 mins.
iv) Capacidad de las resinas en fase solida "4°SDVB" y "3°SDVB" para eliminar inhibidores NAAT complejos a diferentes temperaturas.
[0106] Se puede demostrar que el cafe instantaneo contiene inhibidores de NAAT potentes, por lo que tanto el cafe instantaneo representa un modelo inhibidor util. Se anadio cafe instantaneo (1 g) a 10 ml de agua de peptona tamponada y se incubo a 37°C durante 18 horas. 20 pl del enriquecimiento se anadio a tubos de 580 pl de tampon de amplificacion de BART-LAMP que no contiene resina, 10% IM-SDVB, 300 pl de 4°SDVB (una resina de intercambio anionico de base fuerte macroporosa de una matriz de estireno-divinilbenceno con grupos funcionalizados de amina cuaternaria) o 300 pl de 3°SDVB (un copohmero de estireno-divinilbenceno macroporoso con grupos funcionalizados de amina terciaria). Todos los tubos se agitaron con vortice y se calentaron a 110°C durante 5 min. Tubos calentados se agitaron en vortice de pulso y se dejaron enfriar. 20 pl se anadio por duplicado para cada condicion para reconstituir reacciones BART-LAMP de control inhibidor liofilizado en triplicado en tiras de PCR de 200 pl de pCr. El enriquecimiento de cafe en tampon sin resina, con IM-SDVB (figura 5a), 4°SDVB (figura 5b) y 3°SDvB (figura 5c) dio un tiempo promedio de pico de 45,3+8,3 min, 37,8+3,8 min, 19,7+0,8 min y 22,4+1,5 min, respectivamente. Asf, tanto 4°SDVB como 3°SDVB han eliminado inhibidores del enriquecimiento de cafe, lo que permite el control inhibidor de maximino de no mas de 6 min mas lento que un tiempo pico de control de inhibidor de agua de 17,1+0,0 min, comparado con un retardo de 28 min para el enriquecimiento de cafe en tampon solo.
v) Dependencia de la temperatura de eliminacion de inhibidor
[0107] Nueve tubos de 2 ml se llenaron con una mezcla de resina particular (10% v/v Chelex 100, 25% v/v Optipore SD-2 y 25% v/v Diaion WA30) en el tampon de reaccion de BART-LAMP donde el volumen de tampon excluido era 633,2 pl. En cada uno de estos 21,8 pl de un 187,5 pg/pl madre de acido humico se anadieron y se mezclo en vortice. Cada tubo se coloco en un bloque de calentamiento a 100°C para los puntos de tiempo 0, 1,2, 3,4, 5, 8 y 10 min, tras lo cual fueron eliminados del bloque de calentamiento, y a continuacion se sometieron a vortice inmediatamente y 200 pl del sobrenadante se retiro de las resinas. La temperatura en otro tubo tambien se controlo cada 30 seg con un termopar en toda la calefaccion de 10 min. Dos controles adicionales eran de configuracion de
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[0108] Un conjunto de tubos con la mezcia de resina patentada y acido humico se preparo tambien como controies sin calefaccion y se incubo a temperatura ambiente. Despues de ios puntos de tiempo 0, 1, 2, 3,4, 5, 8 y 10 min, cada uno inmediatamente se agitaron con vortice y 200 pi de sobrenadante se retiro de las resinas. Los sobrenadantes de cada uno se utiiizaron para reconstituir mezclas de reaccion de inhibidor de control de LAMP- BART iiofiiazado por dupiicado. Estos se reaiizaron a 60°C y ios tiempos pico de las reacciones se compararon durante el curso del tiempo. La temperatura medida de las resinas por un termopar era 22,7°C. En estos tubos el tiempo pico de control de inhibidor a 0 min de incubacion era de 49,0+1,0 min. Inciuso despues de 10 min de incubacion, el tiempo pico era de 44,2+2,7 min no mostrando ninguna reduccion significativa en la inhibicion con resinas no caientadas, y confirmando que las resinas caientadas fueron mas eficaces en la eliminacion de inhibidor.
vi) Cinetica de temperatura de elucion de calor
[0109] Una coiumna de 8 mi (Pierce n° 89897) se lleno con una mezcia de resina en particular ((10% v/v Cheiex 100, 25% v/v Optipore SD-2 y 25% v/v Diaion WA30) en tampon de reaccion BART-LAMP en el que el voiumen de tampon exciuido era 1,965 mi. La pestana de giro se desprendio y el termopar se coioco en la punta de elucion. La coiumna se coioca en un tubo de recogida de diametro interno de 13,5 mm (Fisher n° FB51579) y toda la coiumna y el tubo se coiocaron sobre un bioque de calentamiento a medida que tiene una profundidad de insercion de 80 mm. Esto se caiento a 100°C y la temperatura del eiuato se controlo despues de 3 min, momento en el que comienza la elucion, cada 30 segundos durante 10 min. Se confirmo que la temperatura optima en correlacion con eliminacion inhibidora maxima (figuras 6a y 6b) se logro facilmente durante el penodo de tiempo de calentamiento. La Figura 7 muestra que un tiempo de calentamiento de 8 min permitio un aumento de temperatura de eiuato a > 93°C. De hecho, ai estar la temperatura reiacionada con la eliminacion inhibidora, eliminacion significativa inhibidora se estana dando por 76°C que se traduce en ai menos 3 min de calentamiento en este formato.
vii) La eliminacion del eluato de muestra a partir de resina caliente mostro mejor eliminacion inhibidora que de estudio fro, en un calor y de mezcla.
[0110] Una dilucion de 1 en 5 de un extracto de una muestra de heces, que habfa sido caracterizado por contener una gran cantidad de inhibidores de NAAT, se realizo en tampon de reaccion LAMP-BART. 50 pi (10 mg) se mezclo con tampon de 655 pi solo como un control 'sin resina’. Otras cantidades de 50 pi se anadieron a seis tubos que contienen un coctel de resina patentada del que el voiumen exciuido de tampon tambien era 655 pi. Cada uno se caiento a 95°C durante 10 min. Los tubos o bien (a) se mezciarn antes y despues del calentamiento; (b) no se mezciaron; (c) se mezciaron antes del calentamiento; (d) se mezciaron despues del calentamiento; (e) se mezciaron antes y despues del calentamiento y el sobrenadante caliente se retiro antes de enfriarse; (f) se mezciaron antes del calentamiento y se dejaron enfriar despues de caientarse y iuego se mezciaron. 20 pi de cada sobrenadante se utilizo para reconstituir mezclas de reaccion LAMP-BART de control inhibidor iiofiiizado por dupiicado y se ejecuto a 60°C. Se compararon ios tiempos pico de las reacciones. Sin resinas, la deteccion no era posibie en el tiempo de ejecucion 120 min. Con (b) y (c) no hubo tampoco deteccion que indica la mezcia iniciai con la resina fna no tema efecto de union del inhibidor. Las reacciones de (a), (d) y (e) mostraron deteccion dentro de 22,4 a 28,8 min donde la eliminacion de inhibidor eficaz se produjo mostrando la mezcia inmediata tras calentamiento con resina caliente era esenciai para la eliminacion de inhibidor. Si la muestra y las resinas se enfriaron a temperatura ambiente y se mezciaron, (f) la deteccion tambien fallo dentro de 120 min.
Ejemplo 4: Uso del metodo de elucion de calor para eliminar los inhibidores de las muestras
i) La elucion de calor se puede utilizar para eliminar el inhibidor NAAT Xylan
[0111] 27,3 pi de un 60 pg/pi Xylan se anadio a 655 pi de tampon de reaccion y se caiento en un bioque de calentamiento a 100°C durante 6 min. 81,8 pi de un 60 pg/pi Xylan madre se anadio a una coiumna que contiene una mezcia de resina patentada con un voiumen exciuido de 1,965 mi. La tapa se cerro hermeticamente y la pestana de giro se rompio. La coiumna se coioco en un tubo de recogida de diametro interno 13,5 mm (Fisher n° FB51579) y la coiumna y ei tubo se coiocaron en un matraz conico de agua hirviendo durante 6 min.
[0112] Los eiuatos de cada uno fueron utiiizados para reconstituir mezclas de reaccion BART-LAMP de control inhibidor iiofiiizado por dupiicado. Estos se reaiizaron a 60°C y ios tiempos pico de las reacciones se compararon. La Figura 8 muestra que sin tratamiento con resina ios tiempos de deteccion eran 39,5+2,1 min en presencia de xiiano.
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Sin embargo, los eluatos de columna dieron tiempos de deteccion de 18,7+0,6 min indicando la eliminacion de inhibidor de xilano por las resinas en el mismo factor de dilucion.
Ejemplo 5: Control de elucion
i) Pequenas fritas de tamano de poro y alta temperatura de fusion de cera de parafina utilizada para modular elucion
[0113] Para la eliminacion de inhibidor de muestra eficiente era necesario que la muestra se expusiera a las resinas de calefaccion para una suficiencia de tiempo antes de la elucion de la fase lfquida. Como tal, es necesario controlar la velocidad de elucion por algun medio.
[0114] La velocidad de elucion se modula mediante el uso de una pequena frita de polietileno de tamano de poro y una alta temperatura de fusion de cera debajo de las resinas para constrenir el flujo de material eluido de la columna. El inicio de la elucion durante el calentamiento se retraso durante 3 min y se completo antes de los 10 min para asegurar una exposicion suficiente de muestra a las resinas con calefaccion, (Figura 9).
Ejemplo 6: Calidad de acidos nucleicos eluidos con elucion de calor
i) Elucion de calor puede ser mejor que la centrifugacion para la eliminacion inhibidora: comparacion entre elucion hilada y la elucion de presion en caliente de un extracto fecal por BART-LAMP
[0115] 20% de IM-SDVB en 27 mM ditiotreitol y 13,3 mM BICINE pH 5 se anadio a 250 pl de un muestra diarreica positiva C. difficile y se mezclo en vortice. Volumenes de 200 pl de esta mezcla homogenea de vortice se anadieron a una columna hilada de 800 pl que contiene un lecho compacto de PVPP o a dos tubos de 1,5 mL. La columna PVPP que contiene la mezcla fecal IM SDVB-TDT-BICINE se tapo hermeticamente, la pestana de plastico en la parte inferior de la columna se elimino para abrir la base de la columna, se coloco en un tubo de recogida de 1,5 ml y se calento en un bloque caliente durante 15 min a 105°C (A). Esto resulto en eluato siendo elucion de calor en el tubo de recogida. Los tubos de 1,5 ml que contienen muestras se calentaron simultaneamente durante 15 min a 105°C. Cuando se enfna, los tubos se centrifugaron a 14.000 rpm durante 5 min y el sobrenadante de uno de los tubos se transfirio a una columna de centrifugacion abierta en la parte inferior de 800 pl que contiene un lecho compacto de PVPP en un tubo de recogida de 1,5 ml. Esta columna PVPP se eluyo mediante centrifugacion a 8000 rpm durante 2 min en una microcentnfuga (B). El extracto del otro tubo de 1,5 ml se uso sin columna de PVPP (C). Volumenes de 5 ml de cada extracto se anadieron por duplicado a volumenes de reaccion 15 pl de reactivos de LAMP-BART C. difficile en los tubos de una placa de PCR. Estos se cubrieron con aceite y se colocaron en el instrumento de deteccion de amplificacion de BART a 60°C. La Figura 10 muestra los tiempos pico para la muestra fecal lisada directamente en la columna de la PVPP era de 28,28+0,75 min, la lisis de calor en el tubo y se hace girar en la columna PVPP era 28,28+2,26 min y la lisis de calor de de la muestra fecal en tampon y centrifugacion de los solidos dio 61,39+3,78 min. Por lo tanto, para esta muestra fecal en particular, el calor de lisis de la muestra y el calor de elucion de presion dentro de una columna PVPP era tan bueno como la lisis de la muestra en un tubo y la elucion centrifugada del lisado en una columna de PVPP. El lisado centrifugado dio deteccion mas lenta debido a los inhibidores todavfa presentes en el lisado.
ii) La elucion de calor facilita la elucion de ADN de alto peso molecular
[0116] Una columna de 0,8 ml (Pierce n° 89688) se lleno con una resina patentada a un volumen seco final de 555 pl abierto para la elucion en un tubo de 1,5 mL. 333 pl de una muestra fecal se anadio a otro tubo que contiene 20% IM-SDVB en tampon y se mezcla mediante agitacion con vortice. 200 pl de esta mezcla se anadio a la columna de 0,8 mL, se tapo hermeticamente y se eluyo a calor sentado en su tubo de 1,5 ml en un bloque caliente de 95°C durante 15 minutos. Despues de la elucion, el tubo se dejo enfriar y la columna se transfirio a un tubo nuevo y se centrifugo a 8000 x g durante 3 min. 15 pl de eluatos tanto de calor como de centrifugacion se ejecuto en un gel de agarosa al 1% que contema una mancha intercalante despues de la mezcla con 3 pl de tampon de carga, e imagen de gel capturada en un transiluminador (figura 11). El perfil de intensidad de eluato de calor muestra que el ADN manchada es el peso molecular sustancialmente alto que permanece en el pozo del gel. La elucion centnfuga posterior de la misma columna muestra la tincion de bajo peso molecular adicional. La centrifugacion es conocida por causar el cizallamiento del ADN de alto peso molecular que resulta en fragmentos de bajo peso molecular y puede afectar a la deteccion de bajo numero de copias a traves de la rotura en el sitio diana para amplificacion. La ausencia de cizallamiento de ADN es la ventaja de elucion de extraccion a presion de calor.
Ejemplo 7: Demostracion del principio de elucion de calor
i) Uso para la deteccion de C. difficile despues de la extraccion de muestras de heces
[0117] Columnas de 8 ml (Pierce # 89897) se llenaron con una mezcla de resina patentada en tampon de reaccion a un volumen final de 3,4 ml en el que el volumen de tampon excluido era 1,965 ml. Una muestra de cada una muestra fecal positiva y negativa C. difficile se muestreo utilizando una torunda flocada esteril micro ultrafina (Puritan n° 253318 1PN 50). El extremo de torunda se mezclo dentro de la mezcla de resina, el vastago de la torunda se rompio
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de la columna y se cerro hermeticamente. La pestana de centrifugacion se rompio y la columna se coloco en un tubo de recogida de diametro interno 13,5 mm (Fisher n° FB51579) y toda la columna y el tubo se coloco sobre un bloque de calentamiento que tiene una profundidad de insercion de 80 mm. Esto se calento a 100°C durante 10 min. Durante este tiempo la presion se habfa acumulado dentro de la columna y todo el material eluido es impulsado gradualmente a traves de la base de la columna en el tubo de recogida. Los eluatos de cada uno se utilizaron para reconstituir mezclas de reaccion LAMP-BART de control inhibidor liofilizado por duplicado. Estos se realizaron a 60°C y los tiempos pico de las reacciones comparadas. Esto dio un tiempo de deteccion para la muestra positiva C. difficile de 24,04+0,75 min mientras que la muestra negativa C. difficile no llegaron al pico (Figura 12), mostrando con ello que el metodo permite la deteccion exitosa de C. difficile a partir de las heces.
ii) La elucion de calor elimina inhibicion fecal sin comprometer la deteccion, evitando la necesidad de dilucion excesiva.
[0118] Columnas de 6 x 8 ml (Pierce n° 89897) se llenaron con una mezcla de resina patentada en tampon de reaccion, donde los volumenes de tampon excluidos eran 1,965 ml. Seis muestras de heces clmicas positivas C. difficile confirmadas se examinaron mediante el metodo de presion de la columna de elucion. 150 pl de una dilucion de 1 en 5 de cada muestra clmica en tampon de reaccion (30 mg) se anadieron a cada columna y se mezclaron. Las pestanas de giro se rompieron. Las columnas se colocaron entonces en tubos de recogida de diametro interno de 13,5 mm (Fisher n° FB51579) y las columnas y tubos se colocaron en un bloque de calentamiento a medida que tema una profundidad de insercion de 80 mm. Estos se calentaron a 100°C durante 10 minutos y los eluatos se enfriaron a temperatura ambiente. 20 pl de los eluatos se utilizaron para reconstituir C. difficile liofilizado y el reactivo LAMP-BART de inhibidor de control.
[0119] Las seis muestras de heces tambien se diluyeron a los niveles en el orden de los utilizados en otras pruebas comerciales disponibles de C. difficile. Estos se prepararon en tampon de reaccion a 1 en 200, 1 en 500 y 1 en 700 en volumes finales de 600 pl, se mezclo en vortice y se calento en tubos de 2 ml en un bloque de calentamiento fijado a 100°C durante 10 min. Los tubos se mezclan y despues 20 pl de los lisados se utilizaron para reconstituir C. difficile liofilizado y el reactivo inhibidor de control LAMP-BART. Las reacciones se realizaron a 60°C durante 90 min en el hardware de deteccion BART. Las muestras A001 y A004 teman uan baja carga de C. difficile, confirmada por valores altos de Ct en el metodo de PCR utilizado por el Laboratorio de Salud Publica. La extraccion por la columna de presion habfa permitido la deteccion de todas las repeticiones, incluyendo estas dos muestras diffciles donde los metodos dilutivos entre dilucion de 200x y 700x mostraron un compromiso en la deteccion. Tiempos pico C. difficile LAMP-BART para los metodos se compararon en la figura 13a. El metodo de elucion de calor requiere dilucion de no mas de 1 en 70 en la mezcla de resina para eliminar suficientemente la inhibicion fecal.
[0120] La muestra de A001 eran heces solidas con una alta carga inhibidora y con el nivel mas bajo C. difficile en el conjunto. Esta muestra se detecta con exito por el metodo de elucion de calor, donde la deteccion en 1 en 200 se comprometio y 1 en 500 y 1 en 700 completamente fracasaron debido a la dilucion excesiva. La Figura 13b muestra para esta muestra, el control inhibidor a 1 en 200 mostro mas inhibicion que el eluato de la columna (diluido a 1 en 70). De hecho, era necesario diluir la muestra 1 en 500 para aliviar la inhibicion. En terminos de eliminacion de la inhibicion, la columna de elucion de calor con las resinas era mas eficaz que una dilucion de 200 veces, como se ve por las tendencias de las muestras mas inhibitorias A001 y A005.
iii) Deteccion de norovirus tras extraccion de presion de calor
[0121] 50 pl de una muestra diarreica positiva Norovirus GII-4 se anadio a 150 pl de 20% de IM-SDVB en 20 mM MES, 40 mM DTT en un tubo con tapon de giro 1,5 ml. Esto se mezclo, se tapo y se coloco en un bloque caliente a 95°C durante 10 min y despues se aplico a hielo durante 2 min y luego se centrifugo a 17.000 g durante 5 min. 100 pl del sobrenadante se anadio a un lecho PVPP compactado en un tubo 800 pl y se centrifugo a elucion a 8000 x g durante 2 min. Volumenes de 5 pl se anadio a partir del extracto por duplicado a volumenes de reaccion de 15 pl de reactivo de transcriptasa inversa LAMP-BART norovirus GII-4 en los tubos de una placa de PCR junto con 1 pl de la misma muestra fecal extrafda previamente usando tecnologfa de pluma. Estos se cubrieron con aceite y se colocaron en instrumento de deteccion de amplificacion BART a 60°C. Los tiempos de pico para la muestra fecal se extrae por lisis de calor IM SDVB-MES-TDT seguido por purificacion de columna del PVPP era 50,44+7,59 min. Esto se comparo a 43,46+0,76 min para 1 pl de la muestra previamente extrafda por metodo Boom. Esto demostro que la ARN de Noroviral podna extraerse con un metodo que sena compatible con elucion de calor.
Ejemplo 8: Concentracion de acido nucleico del segundo recipiente tras la elucion de calor
i) Elucion post-calor, los acidos nucleicos pueden concentrarse adicionalmente.
[0122] Para aplicaciones de bajo numero de copias, se demostro que la concentracion de niveles de ADN genomicos C. difficile eran posibles cuando se enriquecio en tampon de reaccion es decir, la misma composicion de reactivo como el eluato. Las diluciones de ADN genomico C. difficile se prepararon a 103, 102, 10 y 0 copias por 20 pl en tampon de reaccion. 20 pl de cada dilucion se utilizo para reconstituir mezclas de reaccion LAMP-BART C. difficile liofilizadas por duplicado y funcionar a 60°C.
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[0123] Cada dilucion tambien se concentro mediante la adopcion de 800 pi de los picos y la mezcla con 5 pl de perlas magneticas ChargeSwitch® y 160 pl del tampon de union kit (Invitrogen) durante 1 min. El sobrenadante se elimino por decantacion de las perlas en una rejilla magnetica. Las perlas fueron re suspendidas en 80 pl de tampon de reaccion y 20 pl de la suspension cruda, incluyendo perlas que se utilizaron para reconstruir mezclas de reaccion C. difficile BART-LaMP liofilizadas por duplicado y funcionan a 60°C.
[0124] La Figura 14 muestra que la concentracion mejoraron los tiempos de deteccion de las copias 103 y 102/20 pl niveles de 3,2 a 4,8 min, y se permitieron de forma reproducible en la deteccion de las dos repeticiones en las 10 copias/20 pl nivel antes de 52,3 min, donde se detectaron solamente 1 de 2 repeticiones sin concentracion.
ii) Concentracion de C. difficile a partir de heces positivas con un metodo de perla magnetica simplificada ChargeSwitch® tras elucion de calor
[0125] Heces positivas C. difficile (1 en 5 en tampon de reaccion) se diluyo 1 en 10 con heces negativas (preparadas 1 en 5 en tampon de reaccion). 150 pl (30 mg de heces) de la dilucion se aplico a una columna de 8 ml (Pierce n° 89897) que contiene una mezcla de resina particular (10% v/v Chelex 100, 25% v/v Optipore SD-2 y 25% v/v Diaion WA30) en tampon de reaccion BART-LaMP y se mezclaron a mano. El volumen de tampon excluido era 1,965 ml. La tapa se cerro hermeticamente y la pestana de giro se rompio. La columna se coloco en un tubo de 13,5 mm de diametro interno de recogida (Fisher n° FB51579) y toda la columna y el tubo se colocaron sobre un bloque de calentamiento a medida. Esto se calento a 100°C durante 10 min. 20 pl del eluato recogido se utilizo para volver a constituir reacciones LAMP-BART C. difficile liofilizadas en duplicado.
[0126] 800 pl del eluato tambien se concentro por mezcla con 5 pl de perlas magneticas ChargeSwitch® y 160 pl del tampon de union kit (Invitrogen) durante 1 min. El sobrenadante se elimino por decantacion de las perlas en una rejilla magnetica. Las perlas se resuspendieron en 80 pl de tampon de reaccion y 20 pl de la suspension en bruto, incluyendo perlas que se utilizaron para reconstituir mezclas de reaccion LAMP-BARt C. Difficile liofilizadas por duplicado.
[0127] Las reacciones LAMP-BART se realizaron a 60°C en el instrumento de deteccion de BART. La concentracion del eluato mejoro el tiempo de deteccion de 27,2+0,5 min (no concentrado) a 19,2+0 min (tras concentracion).
iii) Comparacion de deteccion de ADN genomica C. difficile con y sin realizar elucion de calor con perlas magneticas ChargeSwitch® incorporadas en el primer recipiente.
[0128] 20pl de ADN genomico C. difficile (103 copias por 20 pl) madre fue anadido a 1,98ml de tampon de bicina. 200 pl de esto se utiliza para hacer diluciones en serie con tampon de 1,8 ml de tampon de BICINE en 102 y 101 copias por 20 pl. Las diluciones ADNg se trataron de la siguiente manera:
Conjunto 1: No hay tratamiento. 20 pl se utilizo para reconstituir directamente ensayos de LAMP BART C difficile. Conjunto 2: 400 pl de dilucion ADNg C. difficile se anadio a una columna de 1,5 ml elucion de calor con una frita de 2,7 mm con filtro de vidrio adicional (G/FD FD n° 1823-025 papel, Whatman) con 5 pl de parlas Charge Switch y 80 pl de tampon de union. Esto se mezclo mediante pipeteo. La tapa columna fue asegurada hermeticamente y se coloco en el bloque de calentamiento (con un tubo de recogida de 2 mL) a 100°C para 6min. Despues de la elucion, el material Gf/D con las perlas capturadas se transfiere directamente a 40 pl de ensayo de lAmP BART C difficile reconstituido. Las condiciones con concentracion de elucion de calor y perla magnetica ayudaron para detectar 1 log menor en serie de dilucion en comparacion con ninguna elucion de calor, por lo que demuestra que la elucion de calor se puede utilizar en conjuncion con los metodos de perlas de captura para concentrar los acidos nucleicos en el recipiente de elucion de calor (Figura 16).
Ejemplo 9: Integracion de preparacion de muestra de recipientes multiples y amplificacion usando elucion de calor
[0129] El principio de elucion de calor se puede aplicar para combinar dos o mas recipientes asociados que realizan una funcion diferente para la preparacion de la muestra. Un solo bloque de calentamiento podna utilizarse para alojar tal asociacion de recipientes, o un numero de bloques de calentamiento podna utilizarse cuando la sincronizacion y la velocidad de calentamiento y la temperatura final del bloque de calentamiento esta disenada para conducir la muestra de una manera coherente a traves de los recipientes.
[0130] Ademas, un recipiente podna contener reactivos NAAT tal que la combinacion de los recipientes y el recipiente permite la adicion directa de muestra procesada a reactivos NAAT. Como tal, diseno adecuado de bloques de calor, una vez que se anade la muestra al primer recipiente, el metodo de elucion de calor podna realizar todas las etapas de preparacion de la muestra y permitir la adicion de muestra para reactivos NAAT y permitiendo que continuara una amplificacion adicional (Figura 15).
Ejemplo 10: Elucion de calor puede proporcionar muestras para PCR
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Uso de lisado en la deteccion de PCR
[0131] Una columna de 8 ml (Pierce n° 89897) se lleno con una mezcla de resina patentada en tampon de reaccion a un volumen final de 3,4 ml en el que el volumen de tampon excluido era 1,965 ml. Una muestra fecal C. difficile se muestreo utilizando una torunda ultrafina micro esteril flocada (Puritan n° 25-3318 1PN 50). El extremo de la torunda se mezclo dentro de la mezcla de resina, el vastago de la torunda se partio y la columna se cerro. La columna se mezclo a mano y se coloco sobre un bloque de calentamiento a medida que tiene una profundidad de insercion de 80 mm. Esta se calento a 100°C durante 10 min. La columna se dejo enfriar y el lisado se retiro de la parte superior de la columna. Una mezcla de reaccion C. difficile en tiempo real de la de PCR se preparo usando el IQ Supermix (Bio-Rad n° 170 8862). 4,5 pl de lisado se anadio a las reacciones de PCR por duplicado y se ejecuto en ABI PRISM-7000 junto con una serie de dilucion de ADN genomica C. difficile y se amplifico despues de una etapa de desnaturalizacion inicial a 95°C durante 3 min por 50 ciclos de 94°C, 57°C y 72°C con cada uno en 30 segundos. El lisado dio un valor Ct de 29, lo que correspondfa a un numero de copias de 1,18x104 cuando se calculo a partir de la curva de calibracion, indicando que el lisado de la columna tambien se puede utilizar para deteccion PCR en tiempo real.

Claims (15)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    55
    60
    65
    Reivindicaciones
    1. Un metodo para hacer pasar una muestra de Ifquido a traves de una matriz solida porosa, que comprende las etapas de sellado de la muestra de lfquido dentro de un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente y elevando la temperatura para aumentar la presion dentro del recipiente, causando con ello que el lfquido pase a traves de la matriz solida porosa.
  2. 2. El metodo de la reivindicacion 1, en el que el recipiente comprende dos o mas diferentes matrices porosas solidas.
  3. 3. El metodo de cualquier reivindicacion precedente, en el que la muestra de lfquido comprende acidos nucleicos e inhibidores de amplificacion de acido nucleico.
  4. 4. El metodo de la reivindicacion 3, caracterizado porque el recipiente comprende una matriz solida porosa que une acidos nucleicos mas fuertemente que los inhibidores de amplificacion de acido nucleico.
  5. 5. El metodo de la reivindicacion 3, caracterizado porque los el recipiente comprende una matriz solida porosa que une inhibidores de amplificacion de acido nucleico mas fuertemente que los acidos nucleicos.
  6. 6. Un metodo para la purificacion de acidos nucleicos a partir de una muestra lfquida que comprende acidos nucleicos e inhibidores de amplificacion de acido nucleico, en el que el metodo comprende las etapas de (a) poner en contacto la muestra con una matriz solida porosa que une inhibidores de amplificacion de acido nucleico mas fuertemente que acidos nucleicos, aplicandose calor a la matriz solida porosa y la muestra de lfquido; y (b) separar la muestra lfquida que comprende acidos nucleicos no unidos de la matriz solida porosa; haciendose pasar la muestra de lfquido a traves de la matriz solida porosa por un metodo que comprende las etapas de sellado de la muestra de lfquido dentro de un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente y elevando la temperatura para aumentar la presion dentro del recipiente, causando con ello que el lfquido pase a traves de la matriz solida porosa.
  7. 7. El metodo de la reivindicacion 6, en el que se aplica calor a la muestra en la etapa (b).
  8. 8. El metodo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, en el que el recipiente comprende un restrictor de flujo que se configura para reducir el flujo de lfquido desde el recipiente a traves de la matriz solida porosa en comparacion con un recipiente que no tiene el restrictor de caudal.
  9. 9. El metodo de la reivindicacion 8, en el que el restrictor de flujo es
    a) un filtro, una frita, o una valvula; o
    b) una capa de material que se funde a una temperatura entre 45°C y 110°C.
  10. 10. El metodo de la reivindicacion 9 (b) en el que la capa de material es una cera.
  11. 11. El metodo de cualquier reivindicacion anterior, comprendiendo ademas un paso de lisis de la muestra.
  12. 12. Un aparato para la purificacion de acidos nucleicos de acuerdo con el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 3-11, que comprende
    a) un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente y medios para sellar el recipiente, y
    b) un elemento de calentamiento configurado para calentar el recipiente a una temperatura de hasta 110°C; en el que el aparato esta configurado para pasar lfquido a traves de la matriz solida porosa por el calor.
  13. 13. El aparato de la reivindicacion 12, en el que el aparato comprende ademas un segundo recipiente para recibir lfquido pasado a traves de la matriz solida porosa.
  14. 14. El aparato de la reivindicacion 12 o 13, en el que el aparato comprende ademas un recipiente que comprende recipientes para la amplificacion de acido nucleico.
  15. 15. El uso de un aparato para purificar los acidos nucleicos de acuerdo con el metodo de cualquiera de las reivindicaciones 3-11, en el que el aparato comprende:
    a) un recipiente que comprende una matriz solida porosa como al menos una parte del recipiente y medios para sellar el recipiente, y
    b) un elemento de calentamiento configurado para calentar el recipiente a una temperatura de hasta 110°C.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3059312A1 (en) * 2015-02-20 2016-08-24 QIAGEN GmbH Nucleic acid extraction method
GB201519565D0 (en) * 2015-11-05 2015-12-23 Alere San Diego Inc Sample preparation device
WO2018061365A1 (ja) * 2016-09-28 2018-04-05 株式会社フジミインコーポレーテッド 表面処理組成物
WO2018185908A1 (ja) * 2017-04-06 2018-10-11 株式会社島津製作所 磁性体粒子操作用デバイス
KR102071058B1 (ko) * 2017-10-27 2020-03-02 주식회사 창 헬스케어 유전자 증폭을 위한 핵산의 추출 및 전달 자동화 장치 및 방법
CN107586774A (zh) * 2017-11-01 2018-01-16 上海涛济医药科技有限公司 一种常温下长时间口腔拭子dna保存和提取方法
WO2020014458A1 (en) * 2018-07-11 2020-01-16 Monsanto Technology Llc Extraction of polynucleotides
EP3663619B1 (en) * 2018-12-07 2022-03-16 Danfoss Power Solutions Aps Thermal relief device
CN110724633A (zh) * 2019-11-11 2020-01-24 浙江汇泽医药科技有限公司 一种微量细胞核酸提取与扩增系统及工艺
EP3978125A1 (en) * 2020-09-30 2022-04-06 iCare Diagnostics International Co. Ltd. Nucleic acid detection kit and nucleic acid detection device
CL2020002629A1 (es) * 2020-10-12 2021-01-15 Taag Genetics S A Nuevo dispositivo de biología molecular para extracción y purificación de ácidos nucleicos desde diferentes tipos de muestras biológicas que comprende resinas de adsorción
CN113637723B (zh) * 2021-07-09 2024-03-29 江苏康为世纪生物科技股份有限公司 一种粪便样本核酸保存液及其制备方法
EP4163369A1 (en) * 2021-10-08 2023-04-12 AXAGARIUS GmbH & Co. KG Use of mixtures of polyvinylpyrrolidone and ammonium sulfate in the isolation of nucleic acids
CN118510910A (zh) * 2022-01-10 2024-08-16 塞提斯生物技术有限公司 用于处理含核酸样品的方法
WO2024123951A2 (en) * 2022-12-06 2024-06-13 Darwin Biosciences, Inc. System and apparatus for the hand-held amplification and detection of nucleic acids
CN117025379B (zh) * 2023-10-09 2023-12-15 迪飞医学科技(南京)有限公司 一种rapid恒温扩增核酸检测装置以及检测方法

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US555500A (en) 1896-03-03 Josef denk
US1994323A (en) 1930-08-27 1935-03-12 Inez H Pelrce Coffee extracting device
EP0653951A1 (en) 1992-08-07 1995-05-24 Akzo Nobel N.V. Process and apparatus for removing bottoms from a mixture
GB2337261B (en) 1998-05-15 2002-09-18 Fsm Technologies Ltd Separation of nucleic acids
US7217513B2 (en) 2001-07-10 2007-05-15 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample
US7258873B2 (en) 2002-04-11 2007-08-21 Medimmune Vaccines, Inc. Preservation of bioactive materials by spray drying
US20040126783A1 (en) * 2002-07-10 2004-07-01 Massachusetts Institute Of Technology Apparatus and method for isolating a nucleic acid from a sample
CA2521999A1 (en) * 2002-12-20 2004-09-02 Biotrove, Inc. Assay apparatus and method using microfluidic arrays
JP2005095003A (ja) * 2003-09-03 2005-04-14 Fuji Photo Film Co Ltd 核酸の分離精製方法
JP4399304B2 (ja) 2004-03-29 2010-01-13 富士フイルム株式会社 自動核酸分離精製方法およびその装置
JP2007306867A (ja) 2006-05-19 2007-11-29 Hitachi High-Technologies Corp 核酸抽出装置及び核酸抽出方法
US20080153096A1 (en) * 2006-11-02 2008-06-26 Vectrant Technologies Inc. Cartridge for conducting diagnostic assays
JP5011012B2 (ja) 2007-07-18 2012-08-29 株式会社日立ハイテクノロジーズ 核酸抽出装置
US9163228B2 (en) 2010-04-08 2015-10-20 Qiagen Gmbh Method for isolating and purifying nucleic acids

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