JP4399304B2 - 自動核酸分離精製方法およびその装置 - Google Patents

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Description

本発明は、核酸を分離精製する自動核酸分離精製方法及びその装置に関し、より詳細には、圧力発生手段を用いた圧力差により液体を移動させる工程において、液体の移動の終了を判定する技術に関する。
広く知られた核酸の分離精製方法の一つに、核酸を二酸化珪素、シリカポリマー、珪酸マグネシウム等の固相に吸着させ、引き続く洗浄、脱着等の操作によって分離精製する方法がある（例えば、特許文献１）。この方法は、分離性能としては優れているが、簡便性、迅速性、自動化および小型化適性においては十分でなく、同一性能の吸着媒体の工業的大量生産が困難であり、かつ取扱いが不便で、種々の形状に加工しがたい等の問題点がある。
上記問題点を解決し、簡便かつ効率よく核酸を分離精製する方法の一つとして、多孔性膜に核酸を吸着させる溶液及び多孔性膜から核酸を脱着させる溶液をそれぞれ用いて、表面に水酸基を有する有機高分子から成る多孔性膜に核酸を吸着及び脱着させることによって、核酸を加圧による自動分離精製する方法が開示されている（特許文献２）。
また、フィルタを内部に備えた分離器に加圧空気を供給する加圧装置に関して、加圧空気の供給装置と、圧力センサと、圧力センサによる検出圧力が設定値以上になった時に加圧を停止する装置が開示されている（特許文献３）。
特公平７−５１０６５号公報 特開２００３−１２８６９１号公報 特開平１０−１９８８３号
しかしながら、上記の特許文献１には、核酸を精製する各工程が終了するタイミングを知る具体的方法については一切記載がない。また、上記の特許文献２の装置については、その目的は、血球分離時に圧力を掛けすぎると溶血するため、溶血させないようにするため加圧を停止し、圧力のコントロールを行っているものであり、工程の終了時点を判定するアルゴリズムについての記載は無い。さらに、たとえこの技術を用いたとしても、フィルタを内部に備えた分離器の個体差、フィルタの種類、フィルタの製造ロットによる個体差、用いる液体種の違い等により、液体の通過にかかる時間や分離に必要な圧力、圧力変化のパターンが異なるため、工程が終了した時点を設定圧力１点の前後で判定することは事実上不可能であった。
以上のように、フィルタを容器に注入した液体を、加圧により容器外に排出する工程において、排出完了にかかる時間や分離に必要な圧力、圧力の変化のパターンが、その容器に収容する核酸吸着性の固相の種類差やロット間差、容器自体のロット間差やロット内差、使用する液体の種類等により異なるため、排出が終了した時点を精度良く迅速に自動的に判定することは困難であった。
本発明は、このような従来の問題に鑑みてなされたもので、核酸吸着性の固相を収容した容器に液体を注入し、この液体を、容器内外の圧力差により核酸吸着性の固相を通して容器外に排出する際に、精度良く迅速に液体の排出が終了したことを自動判定することのできる自動核酸分離精製方法及びその装置を提供することを目的としている。
本発明者らは上記課題を解決するために鋭意検討した結果、核酸吸着性の固相を収容した二個の開口を有する容器内に、液体を一方の開口から注入した後、加圧して他の開口より容器外に排出する工程において、圧力センサを用いて圧力変化途中での容器内の圧力パラメータの時間変化のパターンを複数組み合わせて検出することにより、排出終了を自動判定できることを見出し、本発明を完成したものである。
即ち、本発明は、下記の構成よりなるものである。
１． 少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジの容器内外に圧力差を発生させる圧力発生手段とを備え、一方の前記開口から注入した液体を、該圧力発生手段により発生させる圧力差によって、前記核酸吸着性の固相を通して他方の前記開口から前記容器外に排出する工程を有し、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製方法であって、前記圧力発生手段による前記容器内の圧力を測定し、この圧力測定値から圧力変化速度、圧力変化加速度を求め、前記測定された圧力、前記圧力変化速度、前記圧力変化加速度の少なくともいずれかの時間的変化のパターンを用いて、前記液体の前記容器からの排出終了のタイミングを、次のいずれか１つのタイミングで判定することを特徴とする自動核酸分離精製方法。
（１）前記圧力発生手段により前記核酸分離精製カートリッジ内を加圧する途中で、前記容器内の圧力が所定の設定値に達した場合に、前記圧力発生手段による加圧を停止し、その後に前記容器内の圧力変化加速度が極小となった時点を前記排出終了のタイミングと判断する。
（２）前記圧力発生手段により前記核酸分離精製カートリッジ内を加圧する途中で、前記容器内の圧力が所定の設定値に達しない場合に、その後に前記容器内の圧力が極大となり且つ前記容器内の圧力変化速度が零以下となった時点、前記容器内の圧力が極大となり且つ前記容器内の圧力変化加速度が極小となった時点の少なくともいずれかの時点を前記排出終了のタイミングと判断する。
（３）前記圧力発生手段により前記核酸分離精製カートリッジ内を加圧する途中で、前記容器内の圧力が所定の設定値に達せずに、且つ前記容器内の圧力が極大とならない場合に、前記容器内の圧力変化速度が所定の閾値よりも小さくなった時点を前記排出終了のタイミングと判断する。
２． 少なくとも、（１）前記容器の一方の開口より核酸を含む試料液を注入し加圧して、他方の開口より試料液を排出し試料液中の核酸を前記核酸吸着性の固相に吸着させる吸着工程、（２）次に前記容器の一方の開口より洗浄液を分注し加圧して、他方の開口より排出し不純物を除去する洗浄工程、（３）次に前記容器の一方の開口より回収液を分注し加圧して、他方の開口より前記核酸吸着性の固相に吸着した核酸を分離・排出して、回収液とともに回収する抽出工程、を実施することを特徴とする第１項記載の自動核酸分離精製方法。
３． 前記判定手段により判定された液体の排出終了のタイミングを受けて、次工程への移行を開始することを特徴とする第１項又は第２項記載の自動核酸分離精製方法。
４． 少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジの容器内外に圧力差を発生させる圧力発生手段とを備え、一方の前記開口から注入した液体を、該圧力発生手段により発生させる圧力差によって、前記核酸吸着性の固相を通して他方の前記開口から前記容器外に排出する工程を有し、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置であって、第１項〜第３項のいずれか１項記載の自動核酸分離精製方法に基づいて前記液体を前記容器外に排出する制御部を備えたことを特徴とする自動核酸分離精製装置。
５． 前記核酸吸着性の固相が、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔質体であることを特徴とする第４項記載の自動核酸分離精製装置。
６． 前記有機高分子からなる多孔質体が、水酸基を有する有機高分子からなることを特徴とする第５項記載の自動核酸分離精製装置。
７． 前記核酸吸着性の固相が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなることを特徴とする第４項〜第６項のうちいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
８． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上であることを特徴とする第７項記載の自動核酸分離精製装置。
９． 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、第７項又は第８項記載の自動核酸分離精製装置。
１０． 前記核酸吸着性の固相が、表裏非対称性の多孔性膜であることを特徴とする第４項〜第９項のうちいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
本発明によれば、核酸吸着性の固相を収容した容器に液体を注入し、この液体を、容器内外に圧力差を発生させることにより核酸吸着性の固相を通して容器外に排出する際に、液体の排出が終了したことを、容器に収容する核酸吸着性の固相の種類差やロット間差、容器自体のロット間差やロット内差、使用する液体の種類等によらず、精度良く迅速に自動判定することができるため、分離性能に優れた核酸吸着性の固相を用いた核酸分離精製の各工程の自動化において、効率が飛躍的に高まってタクトアップし、分離精製の処理能力を一層向上させることができる。
以下、本発明に係る自動核酸分離精製方法およびその装置の好適な実施の形態について、図面を参照して詳細に説明する。
図１は本発明に係る核酸分離精製処理の液排出工程の終了を自動判定する要部構成の概略ブロック図である。
本装置は、核酸吸着性の固相の一つである多孔質性フィルタ１１ｂを内部に収容した核酸分離精製カートリッジ（以下単にカートリッジと略称する）１１に対して、着脱可能に結合できる加圧ヘッド４０を、図示しない位置センサの検出に伴う制御により昇降移動可能に備えてなる。加圧ヘッド４０は、開閉バルブである電磁弁４５を介してポンプ４３に接続されている。また、接続された配管７４の途中には圧力センサ４６が介装されており、配管７４内の圧力を測定する。制御部７０には、前記の位置センサと圧力センサ４６の測定結果が入力され、加圧ノズルの位置情報ならびに圧力、圧力変化速度、圧力変化加速度が演算され、予めプログラムされた吐出工程の終了を自動判定するアルゴリズムにより、ポンプ４３、電磁弁４５、加圧ヘッド４０の動作を制御する。即ち、制御部７０が、圧力変化速度、圧力変化加速度を演算する演算手段、及びこれらの情報から液排出終了のタイミングを判定する判定手段として機能する。
上記の制御部７０に入力される圧力信号は、ノイズによるアルゴリズムの誤判定を避けるために、所定時間間隔でサンプリングして、常時1秒間当たりの平均値を算出している。所定時間間隔は0.5sec以下であることが好ましい。また、圧力の時間微分である圧力変化速度dP/dt、さらに圧力変化速度の時間微分である圧力変化加速度d2P/dt2についても、常時1秒間当たりの平均値を算出し、アルゴリズムの判定に用いられる。
次に、液体の排出工程の終了を自動判定するアルゴリズムを、核酸吸着性の固相を収容したカートリッジ１１に注入した液体１６を吐出するときのカートリッジ１１内の圧力、圧力変化速度、圧力変化加速度の時間的変化の特徴を基に説明する。
カートリッジ１１に収容する核酸吸着性の固相の種類と扱う検体の種類により、圧力、圧力変化速度、圧力変化加速度の時間的変化は大きく異なるため、ここでは代表的な３つのパターンに分類する。
（第１のパターン）
図２は第１のパターンにおける圧力（ａ）、圧力変化速度（ｂ）、圧力変化加速度（ｃ）の時間的変化を表すグラフで、設定時間内に設定圧力に達した場合のプロファイルである。また、図３に第１のパターンを呈する場合の工程終了判断手順をフローチャートで示した。
まず、核酸を含む検体をカートリッジ１１に注入した後、カートリッジ１１に加圧ヘッド４０を装着する。そして、ポンプ４３によりカートリッジ１１内の加圧を開始する（ステップ１１、以降はＳ１１と略記する）。なお、圧力は電磁弁４５の調整により設定され、圧力センサ４６により測定される。加圧開始後、カートリッジ１１内の圧力が上昇し、予め設定した設定時間t1以内に所定の設定圧力Ｐ1に達すると（Ｓ１２）、ポンプ４３の加圧を停止する（Ｓ１３）。すると、カートリッジ１１内の検体は、圧力によって核酸吸着性の固相であるフィルタ１１ｂを通過し、カートリッジ１１外部に排出される。そして、カートリッジ１１内の検体が減少するに従い、カートリッジ１１内の圧力ＰはＰaからＰbに減少する。
カートリッジ１１内の検体が全て排出された後に、加圧空気がカートリッジ１１外部に押し出される際、カートリッジ１１内部の圧力Ｐは急激に減少する。そのとき、圧力加速度d2P/dt2は極小ａ1となるため、ポンプ停止以降に圧力加速度d2P/dt2が極小となった時点が検出されたら（Ｓ１４）、それを排出終了、即ち工程が終了したと判断する（Ｓ１５）。また、設定時間t2以内に圧力加速度d2P/dt2が極小とならない場合は、目詰まりエラーと判定し（Ｓ１６）、電磁弁４５を操作してカートリッジ１１内の圧力を大気圧に開放する等の制御を行う。上記設定時間t1、t2、設定圧力Ｐ1は任意に設定することができる。
なお、加圧開始後、カートリッジ１１内の圧力が上昇したが、予め設定した設定時間t1以内に所定の設定圧力Ｐ1に達しなかった場合は、他の判定処理を実施するようにする（Ｓ１７）。
（第２のパターン）
図４は第２のパターンにおける圧力（ａ）、圧力変化速度（ｂ）、圧力変化加速度（ｃ）の時間的変化を表すグラフで、設定時間t1以内に設定圧力Ｐ1に達せず、かつ設定時間t1以内に圧力Ｐが極大となる場合のプロファイルである。また、図５に第２のパターンを呈する場合の工程終了判断手順をフローチャートで示した。
前述同様に、まず核酸を含む検体をカートリッジに注入した後、カートリッジ１１に加圧ヘッド４０を装着し、ポンプ４３による加圧を開始すると（Ｓ２１）、カートリッジ１１内の検体が核酸吸着性の固相であるフィルタ１１ｂを通過してカートリッジ１１外部に排出される。そして、カートリッジ１１内の圧力が上昇していくが、時間と共に圧力変化速度が減少し、圧力Ｐは極大Ｐcとなる。そのとき、圧力速度が０、圧力加速度は極小ａ2となる。そこで、圧力Ｐが設定時間t1以内に極大となり（Ｓ２２）、かつ圧力速度が０以下、又は圧力加速度が極小となったかを判定して（Ｓ２３）、これらの条件を満たした時点を排出終了、即ち、工程が終了したと判断する（Ｓ２４）。そしてポンプ４３を停止させる（Ｓ２５）。なお、ポンプ停止のタイミングは排出終了と判断した時点以降であればいつでも良い。
なお、加圧開始後、カートリッジ１１内の圧力が上昇したが、圧力Ｐが設定時間t1以内に極大とならなかった場合は、他の判定処理を実施するようにする（Ｓ２６）。
（第３のパターン）
図６は第３のパターンにおける圧力（ａ）、圧力変化速度（ｂ）、圧力変化加速度（ｃ）の時間的変化を表すグラフで、設定時間t1以内に上記設定圧力Ｐ1に達せず、かつ上記設定時間t1以内に圧力Ｐが極大とならない場合のプロファイルである。また、図７に第３のパターンを呈する場合の工程終了判断手順をフローチャートで示した。
前述同様に、まず核酸を含む検体をカートリッジに注入した後、カートリッジ１１に加圧ヘッド４０を装着し、ポンプ４３による加圧を開始すると（Ｓ３１）、カートリッジ内の検体が核酸吸着性の固相を通過してカートリッジ１１外部に排出されながらカートリッジ１１内の圧力は上昇する。しかしこの場合には、時間と共に圧力変化速度が徐々に減少する。このように、設定時間t1以内に圧力が極大を持たない場合（Ｓ３２）は、圧力変化速度に設けられた閾値Ｐ'1以下となった時点を（Ｓ３３）排出終了、即ち、工程が終了したと判断する（Ｓ３４）。そしてポンプ４３を停止する（Ｓ３５）。なお、ポンプ停止のタイミングは排出終了と判断した時点以降であればいつでも良い。予め設定する圧力変化速度の閾値Ｐ'1は任意の値に設定できる。
以上のように、核酸吸着性の固相であるフィルタ１１ｂを収容したカートリッジに液体を注入し、その液体を加圧により排出する工程が終了したことを自動判定させるには、まず、上記３つのどのパターンであるかを判定し、上記３つの判定アルゴリズムのうち、適合する判定アルゴリズムを選択するようプログラムしておくことが好ましい。その一例を次に説明する。
（全パターンの自動判定）
図８は、図３，５，７に示す判定アルゴリズムを組み合わせたフローチャートである。
先ず、加圧を開始してから設定時間t1以内に圧力Ｐが設定値Ｐ1以上になったかを判定する。圧力Ｐが設定値Ｐ1以上であれば、前述の図２，３の説明に従って工程の終了を判定する。圧力Ｐが設定値Ｐ1よりも小さければ、設定時間t1以内に圧力Ｐが極大となることがあったかを判定する。また、圧力Ｐが極大となっていたら前述の図４，５の説明に従って工程の終了を判定する。また、設定時間t1までに、圧力Ｐが極大となっていない場合は前述の図６，７の説明に従って工程の終了を判定する。
これによれば、前述の第１、第２、第３のパターンのいずれに対しても適切な工程終了の判定が行えるようになり、適合するパターンに応じた適切なアルゴリズムが使用されて、正確な工程終了の判定を行うことができる。その結果、工程中に無駄に加圧を続けることなく、必要最小限の時間で液体の吐出を完了させることができ、タクトアップが図られる。
以上説明したように、ここでは、第１、第２、第３の代表的なパターンを例示して、これらパターンに対する判定アルゴリズムを説明したが、仮に、ここにない他のパターンが生じても、前述の判定アルゴリズムを適宜組み合わせることで、同様にして正確で迅速な工程終了の判定を実施できる。
次に、以上説明した液体の排出工程終了の判定を核酸分離精製方法に適用した一例を説明する。
まず、本核酸分離精製方法は、(1)核酸を含む試料溶液を核酸吸着性多孔質体（核酸吸着性多孔性膜）に通過させて、該多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、(2)該核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、及び(3)回収液を、該核酸吸着性多孔性膜に通過させて、該多孔性膜内から核酸を脱着させる工程を少なくとも含むものである。
好ましくは、上記(1)、(2)、及び(3)の各工程において、核酸を含む試料溶液、洗浄液、DNase溶液又は回収液を、加圧状態で核酸吸着性多孔性膜に通過させるものであり、より好ましくは、上記(1)、(2)、及び(3)の各工程において、少なくとも二個の開口を有する容器内に該核酸吸着性多孔性膜を収容したカートリッジ１１の一の開口に、核酸を含む試料溶液、洗浄液、又は回収液を注入し、カートリッジ１１の上記一の開口に結合された圧力差発生装置を用いてカートリッジ１１内を加圧状態にして、該注入した各液を通過させ、他の開口より排出させるものである。核酸を含む試料溶液、洗浄液、又は回収液を加圧状態で上記多孔性膜に通過させることにより、装置をコンパクトに自動化することができ、好ましい。加圧は、好ましくは１０〜２００ｋＰａ、より好ましくは４０〜１００ｋＰａの程度で行われる。
上記の核酸分離精製の工程では、最初の核酸を含む試料液を注入からカートリッジ外に核酸を得るまでの工程を１０分以内、好適な状況では２分以内で終了することが可能である。また、上記の核酸分精製の工程では核酸を検体中に含まれる全量に対して５０質量％以上、好適な状況では９０質量％以上の収率で得る事が可能である。
また、上記工程において、圧力差発生装置としては、注射器、ピペッタ、あるいはペリスタポンプのような加圧が可能なポンプ等、或いは、エバポレーター等の減圧可能なものが挙げられる。これらの内、手動操作には注射器が、自動操作にはポンプが適している。また、ピペッタは片手操作が容易にできるという利点を有する。好ましくは、圧力差発生装置は、カートリッジの一方の開口に着脱可能に結合されている。
本発明において使用できる検体に制限はないが、例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（又はその一部）、動物（またはその一部）、細菌、ウイルス等、あるいはそれらの溶解物およびホモジネート等の生物材料から調製された溶液が対象となる。
最初にこれらの検体について細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化する試薬を含む水溶液（核酸可溶化試薬）で処理する。これにより細胞膜および核膜が溶解されて、核酸が水溶液内に分散し、核酸を含む試料溶液を得る。
以下に、細胞膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程について説明する。本発明で、細胞膜を溶解して核酸を可溶化するには、核酸可溶化試薬を用いる。核酸可溶化試薬としては、カオトロピック塩、および、界面活性剤を含む溶液が挙げられる。
細胞膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る方法としては、(Ｉ)細胞又はウイルスを含む検体を容器に注入する工程、(ＩＩ)上記容器に、カオトロピック塩と界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液を添加し、検体と核酸可溶化試薬溶液を混合する工程、(ＩＩＩ)上記で得られた混合液に水溶性有機溶媒を添加する工程を含む方法を挙げることができる。
上記の細胞膜を溶解し、核酸を可溶化して、検体から核酸を含む試料溶液を得る工程において、検体をホモジナイズ処理することで、自動化処理適正が向上する。ホモジナイズ処理は、例えば、超音波処理、鋭利な突起物を用いる、高速攪拌処理を用いる、微細空隙から押し出す処理、ガラスビーズを用いる処理等で行うことができる。
検体とカオトロピック塩および界面活性剤を含む核酸可溶化試薬溶液とを混合する方法は、特に限定されない。
混合する際、攪拌装置により３０から３０００ｒｐｍで１秒から３分間混合することが好ましい。これにより、分離精製される核酸収量を増加させることができる。または、転倒混和を５から３０回行うことで混合することも好ましい。また、ピペッティング操作を、１０から５０回行うことによっても混合することができる、この場合、簡便な操作で分離精製される核酸収量を増加させることができる。
以下に、本発明で用いる核酸吸着性多孔性膜および吸着工程について説明する。本発明の核酸吸着性多孔性膜は、溶液が内部を通過可能なものである。ここで「溶液が内部を通過可能」とは、膜の一方の面が接する空間と膜の他方の面が接する空間の間に圧力差を生じさせた場合に、高圧の空間側から低圧の空間側へと、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。または、膜に遠心力を掛けた場合に、遠心力の方向に、膜の内部を溶液が通過することが可能であることを意味する。
また、本発明の核酸吸着性多孔性膜は、イオン結合が実質的に関与しない相互作用で核酸が吸着する多孔性膜であることを特徴とする。これは、多孔性膜側の使用条件で「イオン化」していないことを意味し、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜が引き合うようになると推定される。これにより分離性能に優れ、しかも洗浄効率よく、核酸を単離精製することができる。好ましくは、核酸吸着性多孔性膜は、親水基を有する多孔性膜であり、環境の極性を変化させることで、核酸と多孔性膜の親水基同士が引きあるようになると推定される。ここで、親水基を有する多孔性膜とは、多孔性膜を形成する材料自体が、親水性基を有する多孔性膜、または多孔性膜を形成する材料を処理またはコーティングすることによって親水基を導入した多孔性膜を意味する。多孔性膜を形成する材料は有機物、無機物のいずれでも良い。例えば、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する有機材料である多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜、多孔性膜を形成する材料自体が親水基を有する無機材料である多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜を処理して親水基を導入した多孔性膜、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に対し親水基を有する材料でコーティングして親水基を導入した多孔性膜等を、使用することができるが、加工の容易性から、多孔性膜を形成する材料は有機高分子等の有機材料を用いることが好ましい。
親水基とは、水との相互作用を持つことができる有極性の基（原子団）を指し、核酸の吸着に関与する全ての基（原子団）が当てはまる。親水基としては、水との相互作用の強さが中程度のもの（化学大事典、共立出版株式会社発行、「親水基」の項の「あまり親水性の強くない基」参照）が良く、例えば、水酸基、カルボキシル基、シアノ基、オキシエチレン基等を挙げることができる。好ましくは水酸基である。
親水基を有する多孔性膜としては、水酸基を有する有機材料の多孔性膜を挙げることができる。水酸基を有する有機材料としては、特開２００３−１２８６９１号公報に記載の、アセチルセルロースの表面鹸化物が挙げられる。アセチルセルロースしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースの何れでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。この場合、鹸化処理の程度（鹸化率）で固相表面の水酸基の量（密度）をコントロールすることができる。核酸の分離効率を挙げるためには、水酸基の量（密度）が多い方が好ましい。例えば、トリアセチルセルロース等のアセチルセルロースの場合には、鹸化率（表面鹸化率）が約５〜１００％であることが好ましく、１０〜１００％であることが更に好ましい。また、水酸基を有する有機高分子の表面積を大きくするために、アセチルセルロースの多孔性膜を鹸化処理することが好ましい。この場合、多孔性膜は、表裏対称性の多孔性膜であってもよいが、裏非対称性の多孔性膜を好ましく使用することができる。
鹸化処理とは、アセチルセルロースを鹸化処理液(例えば水酸化ナトリウム水溶液)に接触させることを言う。これにより、鹸化処理液に接触したアセチルセルロースの部分に、再生セルロースとなり水酸基が導入される。
鹸化率を変えるには、水酸化ナトリウムの濃度を変えて鹸化処理を行えば良い。鹸化率は、ＮＭＲ、ＩＲ又はＸＰＳにより、容易に測定することができる（例えば、カルボニル基のピーク減少の程度で定めることができる）。
水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物等で、形成された多孔性膜を挙げることができるが、特に多糖構造を有する有機材料の多孔性膜を好ましく使用することができる。
特に、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物から成る有機高分子の多孔性膜を好ましく使用することができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物として、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物を好ましく使用する事ができる。
特にトリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物を好ましく使用することができる。トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜５０：５０である事が好ましい。
また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなる多孔性膜を好ましく用いることができる。アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料としては、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物、ジアセチルセルロースとモノアセチルセルロースの混合物の鹸化物も好ましく使用する事ができる。特に、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物を好ましく使用することができる。
トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合比（質量比）は、９９：１〜５０：５０である事が好ましい。
また、水酸基を有する有機材料の多孔性膜としては、セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。セルロースの多孔性膜としては、再生セルロースの多孔性膜を好ましく使用する事ができる。再生セルロースとは、アセチルセルロースの固体の表面または全体を、鹸化処理によりセルロース化したもので、本来のセルロースとは、結晶状態等の点で異なっている。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法として、ポリマー鎖内または側鎖に親水基を有すグラフトポリマー鎖を多孔性膜に結合することができる。
有機材料の多孔性膜にグラフトポリマー鎖を結合する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、多孔性膜を起点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させグラフトポリマー鎖とする２つの方法がある。
まず、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる方法においては、ポリマーの末端または側鎖に多孔性膜と反応する官能基を有するポリマーを使用し、この官能基と、多孔性膜の官能基とを化学反応させることでグラフトさせることができる。多孔性膜と反応する官能基としては、多孔性膜の官能基と反応し得るものであれば特に限定はないが、例えば、アルコキシシランのようなシランカップリング基、イソシアネート基、アミノ基、水酸基、カルボキシル基、スルホン酸基、リン酸基、エポキシ基、アリル基、メタクリロイル基、アクリロイル基等を挙げることができる。
ポリマーの末端、または側鎖に反応性官能基を有するポリマーとして特に有用な化合物は、トリアルコキシシリル基をポリマー末端に有するポリマー、アミノ基をポリマー末端に有するポリマー、カルボキシル基をポリマー末端に有するポリマー、エポキシ基をポリマー末端に有するポリマー、イソシアネート基をポリマー末端に有するポリマーが挙げられる。この時に使用されるポリマーとしては、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、具体的には、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン等を挙げることができる。
多孔性膜を基点として重合可能な二重結合を有する化合物を重合させ、グラフトポリマー鎖を形成させる方法は、一般的には表面グラフト重合と呼ばれる。表面グラフト重合法とは、プラズマ照射、光照射、加熱等の方法で基材表面上に活性種を与え、多孔性膜と接するように配置された重合可能な二重結合を有する化合物を重合によって多孔性膜と結合させる方法を指す。基材に結合しているグラフトポリマー鎖を形成するのに有用な化合物は、重合可能な二重結合を有しており、核酸の吸着に関与する親水基を有するという、２つの特性を兼ね備えていることが必要である。これらの化合物としては、分子内に二重結合を有していれば、親水基を有するポリマー、オリゴマー、モノマーのいずれの化合物をも用いることができる。特に有用な化合物は親水基を有するモノマーである。
特に有用な親水基を有するモノマーの具体例としては、次のモノマーを挙げることができる。例えば、２−ヒドロキシエチルアクリレート、２−ヒドロキシエチルメタクリレート、グリセロールモノメタクリレート等の水酸性基含有モノマーを特に好ましく用いることができる。また、アクリル酸、メタアクリル酸等のカルボキシル基含有モノマー、もしくはそのアルカリ金属塩及びアミン塩も好ましく用いることができる。
親水基を持たない有機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物等を挙げることができるが、多糖構造を有するポリマーが好ましい。
また、親水基を持たない有機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を有する無機材料である多孔性膜としては、シリカ化合物を含有する多孔性膜を挙げることができる。シリカ化合物を含有する多孔性膜としては、ガラスフィルタを挙げることができる。また、特許公報第３０５８３４２号に記載されているような、多孔質のシリカ薄膜を挙げることができる。この多孔質のシリカ薄膜とは、二分子膜形成能を有するカチオン型の両親媒性物質の展開液を基板上に展開した後、基板上の液膜から溶媒を除去することによって両親媒性物質の多層二分子膜薄膜を調整し、シリカ化合物を含有する溶液に多層二分子膜薄膜を接触させ、次いで前記多層二分子膜薄膜を抽出除去することで作製することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する方法としては、多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法と、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する２つの方法がある。
多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合にて付着させる場合は、グラフトポリマー鎖の末端の官能基と反応する官能基を無機材料に導入し、そこにグラフトポリマーを化学結合させる。また、分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを使用して、多孔性膜を起点として、グラフトポリマー鎖を重合する場合は、二重結合を有する化合物を重合する際の起点となる官能基を無機材料に導入する。親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーとしては、上記、親水基を持たない有機材料の多孔性膜とグラフトポリマー鎖とを化学結合させる方法において、記載した親水性基を持つグラフトポリマー、および分子内に二重結合を有している親水基を有するモノマーを好ましく使用することができる。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜に親水基を導入する別の方法として、親水基を有する材料をコーティングすることができる。コーティングに使用する材料は、核酸の吸着に関与する親水基を有するものであれば特に限定はないが、作業の容易さから有機材料のポリマーが好ましい。ポリマーとしては、ポリヒドロキシエチルアクリル酸、ポリヒドロキシエチルメタアクリル酸及びそれらの塩、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、ポリアクリル酸、ポリメタクリル酸及びそれらの塩、ポリオキシエチレン、アセチルセルロース、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物等を挙げることができる。
また、親水基を持たない無機材料の多孔性膜に、アセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物をコーティングした後に、コーティングしたアセチルセルロースまたは、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理することもできる。この場合、鹸化率が約５％以上であることが好ましい。さらには、鹸化率が約１０％以上であることが好ましい。
親水基を持たない無機材料の多孔性膜としては、アルミニウム等の金属、ガラス、セメント、陶磁器等のセラミックス、もしくはニューセラミックス、シリコン、活性炭等を加工して作製した多孔性膜を挙げることができる。
核酸分離精製カートリッジは、少なくとも二個の開口を有する容器内に、上記のような溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する以外、その他の部材を収容していないことが好ましい。上記の容器の材料としては、ポリプロピレン、ポリスチレン、ポリカーボネート、ポリ塩化ビニル等のプラスチックを使用することができる。また、生分解性の材料も好ましく使用することができる。また、上記の容器は透明であっても、着色してあっても良い。
核酸分離精製カートリッジとして、個々のカートリッジを識別する手段を備えている核酸分離精製カートリッジを使用する事ができる。個々のカートリッジを識別する手段としては、バーコード、磁気テープ等が挙げられる。
また、少なくとも二個の開口を有する容器内から核酸吸着性多孔性膜を容易に取り出す事が可能になっている構造を有したカートリッジを使用することもできる。
上記に記載した、各々の溶液が内部を通過可能な核酸吸着性多孔性膜を収容する核酸分離精製カートリッジを用いて、以下の工程で核酸を分離精製することができる。
即ち、
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一方の開口に注入する工程、
(b)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジト内を加圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(c)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に洗浄液を注入する工程、
(d)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
(e)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に回収液を注入する工程、
(f)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を加圧状態にし、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程が挙げることができる。
また、別の態様としては、
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一方の開口に注入する工程、
(b)核酸分離精製カートリッジの他の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの上記他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(c)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に洗浄液を注入する工程、
(d)核酸分離精製カートリッジの上記他方の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
(e)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に回収液を注入する工程、
(f)核酸分離精製カートリッジの上記他方の開口に結合された圧力差発生装置を用いて核酸分離精製カートリッジ内を減圧状態にし、又は核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、上記他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行うことができる。
また、別の核酸分離精製工程としては、
(a)核酸を含む試料溶液を、少なくとも二個の開口を有する容器内に、溶液が内部を通過可能な、核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジの一方の開口に注入する工程、
(b)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した核酸を含む試料溶液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、核酸分離精製カートリッジの他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内に核酸を吸着させる工程、
(c)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に洗浄液を注入する工程、
(d)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した洗浄液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜を、核酸が吸着した状態で、洗浄する工程、
(e)核酸分離精製カートリッジの上記一方の開口に回収液を注入する工程、
(f)核酸分離精製カートリッジに遠心力を作用させ、注入した回収液を、核酸吸着性多孔性膜を通過させ、他方の開口より排出することによって、核酸吸着性多孔性膜内から核酸を脱着させ、核酸分離精製カートリッジ容器外に排出する工程を行うこともできる。
上記の、少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性多孔性膜を収容した核酸分離精製カートリッジと圧力発生手段を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する各工程は、各工程を自動で行う自動装置を用いて行うことが好ましい。それにより、操作を簡便化及び迅速化するだけでなく、作業者の技能によらず一定の水準の、核酸を得ることが可能になる。
以下に、核酸分離精製カートリッジと圧力発生手段を用いて、核酸を含む検体から核酸を分離精製する工程を、自動核酸抽出装置を用いて説明する。
自動核酸抽出装置１は、図９及び図１０に示すように、装置本体２に、複数のカートリッジ１１、廃液容器１２及び回収容器１３を保持する搭載機構３と、核酸分離精製カートリッジ１１に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、カートリッジ１１に洗浄液Ｗ及び回収液Ｒを分注する分注機構５などを備えてなる。次に各機構３〜５を具体的に説明する。
＜搭載機構＞
搭載機構３は、装置本体２の前方下部に搭載台２１を備え、この搭載台２１上に複数のカートリッジ１１、廃液容器１２及び回収容器１３を保持したラック６が載置される。ラック６は、図４にも示すように、スタンド６１とカートリッジホルダー６２と容器ホルダー６３とを備える。
スタンド６１は両側の柱状部６１ａに上下移動可能にカートリッジホルダー６２を保持し、柱状部６１ａの間の下部の底板６１ｂ上に前後移動可能に容器ホルダー６３を保持している。
カートリッジホルダー６２は、前後のプレート材の接合による２分割構造に構成され、横方向に延びる保持部６２ａの両端に上下方向に延びる支持脚６２ｂを備える。その支持脚６２ｂがスタンド６１の柱状部６１ａの上下方向の摺動溝６１ｃに上下移動可能に挿入され、この支持脚６２ｂがスタンド６１に内蔵された付勢部材（不図示）によって上方に付勢されている。保持部６２ａには複数の保持孔６２ｃが並設され、上方よりカートリッジ１１が挿入され、カートリッジ１１の筒状本体１１ａの側部両側に形成された突起１１ｄ（図１４参照）の下端がカートリッジホルダー６２内の係合部材（不図示）に係合保持される。係合部材は移動可能で、移動時には突起１１ｄとの係合を解除してカートリッジ１１を全部同時に下方に落下廃棄するようになっている。
このカートリッジホルダー６２は上面の両側にピン孔６２ｄを備え、使用状態では後述の位置決め手段としての押えピン４９（図９参照）の先端４９ａが係合して下方に押し下げられる。図１１のようにカートリッジホルダー６２が上昇した位置では、カートリッジホルダー６２に保持されたカートリッジ１１の排出部１１ｃの下端は容器ホルダー６３にセットされた廃液容器１２及び回収容器１３より上方に位置しているが、図１２に示すように、カートリッジホルダー６２が下降した際にはカートリッジ１１の排出部１１ｃが廃液容器１２又は回収容器１３の内部に所定量挿入されるように設定されている。
容器ホルダー６３は、横方向に延びる廃液容器保持孔６３ａと回収容器保持孔６３ｂとを平行２列に備え、後側の廃液容器保持孔６３ａに複数の廃液容器１２が、前側の回収容器保持孔６３ｂに複数の回収容器１３がそれぞれ列状に保持される。廃液容器保持孔６３ａ及び回収容器保持孔６３ｂはカートリッジホルダー６２の保持孔６２ｃと等ピッチで等位置に配設され、保持された各カートリッジ１１の下方にそれぞれ廃液容器１２及び回収容器１３が位置するように設定されている。この廃液容器１２と回収容器１３とは混同防止のためにサイズ、形状等が異なったものを使用するのが好ましい。
上記容器ホルダー６３はスタンド６１に内蔵された不図示の付勢部材によって前方に付勢されている。容器ホルダー６３の容器交換移動（前後動）は、搭載台２１に設置された作動部材３１（図１０参照）が、スタンド６１の底板６１ｂに形成された開口を通して、容器ホルダー６３の底部の係合孔（不図示）に係合されて行われる。容器交換モータ３２（ＤＣモータ）の駆動に応じた作動部材３１の移動動作に応じて容器ホルダー６３が後退移動され、カートリッジホルダー６２の下方に回収容器１３が位置するように作動する。非作動時には廃液容器１２がカートリッジホルダー６２の下方に位置するように不図示の付勢部材で付勢されている。上記容器交換モータ３２の作動は位置センサ３３ａ，３３ｂの検出に応じて制御される。
＜加圧エア供給機構＞
加圧エア供給機構４は、図９及び図１０に示すように、前記搭載機構３のラック６に対して昇降移動する加圧ヘッド４０と、該加圧ヘッド４０に１列に並んで設置された複数（図の場合８個）のエアノズル４１と、加圧エアを発生するエアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、各エアノズル４１に設置され個別に開閉する開閉バルブ４５と、各エアノズル４１に設置された圧力センサ４６を備え、順次カートリッジ１１に加圧エアを送給する。そして、エアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、各エアノズル４１はそれぞれ制御部７０からの制御指令に基づいて動作する。
前記加圧ヘッド４０は、装置本体２の中間フレーム２２と上フレーム２３との間に上下方向に設置されたガイドロッド２４に上下移動可能に保持されている。同様に上下方向に設置されたボールネジ２５に加圧ヘッド４０に設置されたボールナット４０ａが螺合し、昇降モータ４７（パルスモータ）の駆動に伴うタイミングベルト、プーリを介したボールネジ２５の回転により加圧ヘッド４０が、フォトセンサ４８ａ〜４８ｃの検出に伴う制御により昇降移動される。加圧ヘッド４０の両側には押えピン４９を有し、この押えピン４９はスプリング４９ｂで下方に付勢されて上下移動可能で、先端４９ａがカートリッジホルダー６２の上面のピン孔６２ｄに係合して位置を規制して押えるようになっている。
上記押えピン４９は、カートリッジホルダー６２を押圧作動している状態で、後述の洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒの横方向移動と干渉しないように、カートリッジホルダー６２の前側位置を押えるように配設されている。
エアノズル４１は加圧ヘッド４０にそれぞれ上下移動可能にかつ下方に付勢されて設置され、その下方にはエアノズル４１に対応した連通孔４２ａ（図１０参照）が開口されたシート状のシール材４２が配設され、加圧ヘッド４０が下降移動した際に、カートリッジホルダー６２にセットされたカートリッジ１１の上端開口を、エアノズル４１先端でシール材４２を介して押圧して密閉し、連通孔４２ａを通してカートリッジ１１内へ加圧エアが送給可能となる。
リリーフバルブ４４はエアポンプ４３と開閉バルブ４５との間の通路のエアを排出する際に大気開放作動される。開閉バルブ４５は選択的に開作動されて、エアポンプ４３からの加圧エアを対応するエアノズル４１を経てカートリッジ１１内に導入するようにエア回路が構成されている。つまり、エアポンプ４３からカートリッジ１１までの間に吸気流路１４が形成されている。加圧エアは、制御部７０からの指令により供給される。圧力センサ４６は各エアノズル４１に設置され、カートリッジ１１の内圧を個別に検出するものであり、圧力の変化のパターンに応じて前述したアルゴリズムに基づいて液排出終了を判定する制御などが制御部７０と協働して行われる。
＜分注機構＞
分注機構５は、ラック６上を横方向に移動可能なノズル移動台５０に設置された洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒと、洗浄液ボトル５６ｗに収容された洗浄液Ｗを洗浄液分注ノズル５１ｗに給送する洗浄液供給ポンプ５２ｗと、回収液ボトル５６ｒに収容された回収液Ｒを回収液分注ノズル５１ｒに給送する回収液供給ポンプ５２ｒと、搭載台２１に載置された廃液ボトル５７などを備える。
ノズル移動台５０は、装置本体２の縦壁２６に水平方向に設置されたガイドレール２７に保持されて横方向に移動可能であり、その移動が不図示のノズル移動モータ（パルスモータ）によって各カートリッジ１１上で順次停止し、復帰状態では廃液ボトル５７上に停止するように駆動制御される。洗浄液分注ノズル５１ｗ及び回収液分注ノズル５１ｒは先端が下方に向けて屈曲され、洗浄液分注ノズル５１ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液供給ポンプ５２ｗに接続され、洗浄液供給ポンプ５２ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液ボトル５６ｗに接続され、回収液分注ノズル５１ｒは切替弁５５ｒを介して回収液供給ポンプ５２ｒに接続され、回収液供給ポンプ５２ｒは切替弁５５ｒを介して回収液ボトル５６ｒに接続されている。洗浄液ボトル５６ｗ及び回収液ボトル５６ｒはそれぞれ装置本体２の側部に装着される。洗浄液供給ポンプ５２ｗ及び回収液供給ポンプ５２ｒはシリンジポンプで構成され、そのピストン部材がそれぞれポンプモータ５３ｗ，５３ｒ（パルスモータ）によってセンサ５４ｗ，５４ｒの位置検出に基づいて所定量の洗浄液Ｗ及び回収液Ｒを分注するように駆動制御される。これら、ポンプモータ５３ｗ，５３ｒ、及び切替弁５５ｗ，５５ｒは、制御部７０からの指令に基づいて動作する。
洗浄液Ｗ又は回収液Ｒを分注する場合には、切替弁５５ｗ又は５５ｒを洗浄液ボトル５６ｗ又は回収液ボトル５６ｒ側に切り替え、ポンプモータ５３ｗ又は５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を後退作動させる。これにより、洗浄液Ｗ又は回収液Ｒを洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの内部に吸引収容される。続いて切替弁５５ｗ又は５５ｒを洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒ側へ切り替え、ポンプモータ５３ｗ又は５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を押込作動させる。そして、廃液ボトル５７に対して通路内のエアを排出するまで洗浄液又は回収液を洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒより吐出させた後、洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの駆動を停止させる。その後、洗浄液分注ノズル５１ｗ又は回収液分注ノズル５１ｒをカートリッジ１１上に移動させてから、洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの駆動量を制御して所定量の洗浄液Ｗ又は回収液Ｒをカートリッジ１１へ分注する。
前記洗浄液ボトル５６ｗ及び回収液ボトル５６ｒは、容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂとキャップ５６ｗｕ，５６ｒｕよりなり、両キャップ５６ｗｕ，５６ｒｕにはそれぞれ細パイプ状の吸引チューブ５８ｗ，５８ｒが設置され、該吸引チューブ５８ｗ，５８ｒの下端が容器本体５６ｗｂ，５６ｒｂの底部近傍に開口して、洗浄液供給ポンプ５２ｗ又は回収液供給ポンプ５２ｒの作動に応じて洗浄液Ｗ、回収液Ｒを吸い上げるようになっている。
上記のような各機構３〜５は、装置本体２の上部に設置された操作パネル７の入力操作に対応して、連係された制御部７０によって、制御部７０に接続された記憶部７２に予め記憶されているプログラムに基づいて駆動制御される。
ここで、上記核酸抽出装置１による抽出動作を具体的に説明する。まず搭載機構３のラック６におけるカートリッジホルダー６２にカートリッジ１１をセットし、容器ホルダー６３に廃液容器１２及び回収容器１３をそれぞれセットし、このラック６を装置本体２の搭載台２１に載置して準備を行う。次に、溶解処理された試料液Ｓをピペット等によって各カートリッジ１１に順次注入する。なお、装置１に搭載する前のラック６にセットした後又はセットする前のカートリッジ１１に試料液Ｓを先に注入するようにしてもよい。
その後、操作パネル７の操作によって装置を作動させると、加圧エア供給機構４の昇降モータ４７の駆動によって加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端４９ａがカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけて、このカートリッジホルダー６２を下降させて位置を規制すると共に、カートリッジ１１の下端排出部１１ｃを図５のように廃液容器１２内に所定量挿入させて、排出液が飛散等によって外部に漏れてコンタミネーションの原因とならないようにする。さらに加圧ヘッド４０が下降移動してシール材４２を介して各エアノズル４１の下端部がカートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉する。このとき、前記押えピン４９がカートリッジホルダー６２の位置を規制していることで、各カートリッジ１１に対し各エアノズル４１が正確に圧接して確実な密閉を確保することができる。
その後、加圧エアの供給が行われる。制御部７０の指令により、全部の開閉バルブ４５が閉状態でエアポンプ４３が駆動され、まず１番目の開閉バルブ４５が開作動される。そして、１番目のエアノズル４１を通して１番目のカートリッジ１１にエアポンプ４３からの加圧エアが、所定量供給される。
次いで、１番目の開閉バルブ４５を閉作動するのに続いて、２番目の開閉バルブ４５が開作動されて２番目のエアノズル４１を通して２番目のカートリッジ１１に加圧エアが供給される。この動作を順に繰り返して全てのカートリッジ１１に圧力を加える。圧力が作用した試料液Ｓは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通って核酸が吸着保持され、その他の液状成分は下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。試料液Ｓが全て核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過すると、前述の図２，４，６に示すような圧力変化が生じ、これを検出することで液排出完了が判定される。以上のようにして、各圧力センサ４６によって全部のカートリッジ１１で抽出終了が検出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動される。
次に、洗浄処理に移行するが、上記加圧エア供給後の加圧ヘッド４０の上昇は、エアノズル４１がカートリッジ１１より離れ、ノズル移動台５０の移動が許容できる高さまで上昇した位置で停止し、押えピン４９がカートリッジホルダー６２を押さえつけ、カートリッジ１１の下端が廃液容器１２内に挿入されている図１２の状態を保持して行う。そして、ノズル移動台５０を移動させて洗浄液分注ノズル５１ｗを１番目のカートリッジ１１上に停止させて洗浄液Ｗを所定量分注し、ノズル移動台５０を次のカートリッジ１１に移動させて順次洗浄液Ｗを分注する。全部のカートリッジ１１への洗浄液Ｗの分注が終了すると、加圧ヘッド４０が下降移動し、各エアノズル４１の下端部がシール材４２を介してカートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉してから、前述と同様に開閉バルブ４５が順次開作動されて各カートリッジ１１に加圧エアが、前述同様に供給される。圧力が作用した洗浄液Ｗは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通って核酸以外の不純物の洗浄除去を行い、洗浄液Ｗは下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。全部のカートリッジ１１における洗浄液Ｗが全て核酸吸着性多孔膜１１ｂを通過して排出されると、加圧ヘッド４０が初期の位置まで上昇作動される。洗浄処理を複数回行う場合には上記動作を繰り返す。
次に、回収処理に移行する。まず洗浄処理後の前記加圧ヘッド４０の上昇により、押えピン４９が上昇してラック６のカートリッジホルダー６２も上昇移動し、カートリッジ１１の下端排出部１１ｃが廃液容器１２より上方へ移動した後、搭載機構３の作動部材３１を作動させて容器ホルダー６３を後退移動させ、カートリッジ１１の下方に回収容器１３を位置させる容器交換を行う。
続いて、加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端がカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけ、カートリッジ１１の下端が回収容器１３内に挿入されている状態を保持する。そして、ノズル移動台５０を移動させて回収液分注ノズル５１ｒを１番目のカートリッジ１１上に停止させて回収液Ｒを所定量分注し、ノズル移動台５０を次のカートリッジ１１に移動させて順次回収液Ｒの分注を行う。全部のカートリッジ１１への回収液Ｒの分注が終了すると、前述と同様にさらに加圧ヘッド４０が下降し、各エアノズル４１の下端部をシール材４２を介してカートリッジ１１の上端開口に圧接させて密閉してから、開閉バルブ４５が順次開作動されて各カートリッジ１１に加圧エアが、前述同様に供給される。圧力が作用した回収液Ｒは、核酸吸着性多孔膜１１ｂを通ってそれに吸着されている核酸を離脱させて、回収液Ｒとともに核酸が下端部の排出部１１ｃより回収容器１３に排出される。全部のカートリッジ１１における回収液Ｒが全て回収容器１３に排出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動され、一連の動作が終了する。
抽出動作が終了したラック６は搭載台２１より下ろされ、カートリッジ１１及び廃液容器１２はカートリッジホルダー６２及び容器ホルダー６３より取り出されて廃棄され、一方、回収容器１３は容器ホルダー６３より取り出され、必要に応じて蓋がされて、次の核酸分析処理等が施される。
なお、本実施形態では、核酸分離精製カートリッジ１１を複数搭載しているが、これに限定されるものではなく、核酸分離精製カートリッジ１１を１本としても適用が可能である。
また、エアポンプ４３から核酸分離精製カートリッジ１１に供給するエアは、液体１６の性状に影響を及ぼさなければ、他のいかなる気体であってもよい。
本発明に係る核酸分離精製処理の液排出工程の終了を自動判定する要部構成の概略ブロック図である。 第１のパターンにおける圧力（ａ）、圧力変化速度（ｂ）、圧力変化加速度（ｃ）の時間的変化を表すグラフで、設定時間内に設定圧力に達した場合のプロファイルである。 第１のパターンを呈する場合の工程終了判断手順を示すフローチャートである。 第２のパターンにおける圧力（ａ）、圧力変化速度（ｂ）、圧力変化加速度（ｃ）の時間的変化を表すグラフで、設定時間t1以内に設定圧力Ｐ1に達せず、かつ設定時間t1以内に圧力Ｐが極大となる場合のプロファイルである。 第２のパターンを呈する場合の工程終了判断手順を示すフローチャートである。 第３のパターンにおける圧力（ａ）、圧力変化速度（ｂ）、圧力変化加速度（ｃ）の時間的変化を表すグラフで、設定時間t1以内に上記設定圧力Ｐ1に達せず、かつ上記設定時間t1以内に圧力Ｐが極大とならない場合のプロファイルである。 第３のパターンを呈する場合の工程終了判断手順を示すフローチャートである。 図３，５，７に示す判定アルゴリズムを組み合わせたフローチャートである。 核酸抽出装置の一実施形態であってカバーを除去した状態を示す斜視図である。 核酸抽出装置の概略ブロック構成図である。 搭載機構におけるラックの斜視図である。 ラックの使用状態を示す斜視図である。 抽出動作の工程図である。 核酸分離精製カートリッジの斜視図である。
符号の説明
１ 核酸抽出装置（核酸分離精製装置）
２ 装置本体
３ 搭載機構
４ 加圧エア供給機構
５ 分注機構
６ ラック
１１ 核酸分離精製カートリッジ
１１ｂ 核酸吸着性多孔膜
１１ｃ 排出部（他方の開口）
１１ｅ 上部開口（一方の開口）
１２ 廃液容器
１３ 回収容器
１６ 液体
１４ 吸気流路
１８ エア
４０ 加圧ヘッド
４１ エアノズル
４３ エアポンプ（圧力発生装置）
４５ 開閉バルブ
４６ 圧力センサ
５１ｗ，５１ｒ 分注ノズル
５２ｗ，５２ｒ 供給ポンプ
５６ｗ，５６ｒ ボトル
７０ 制御部
Ｓ 試料液
Ｗ 洗浄液
Ｒ 回収液

Claims (10)

  1. 少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジの容器内外に圧力差を発生させる圧力発生手段とを備え、一方の前記開口から注入した液体を、該圧力発生手段により発生させる圧力差によって、前記核酸吸着性の固相を通して他方の前記開口から前記容器外に排出する工程を有し、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製方法であって、
    前記圧力発生手段による前記容器内の圧力を測定し、この圧力測定値から圧力変化速度、圧力変化加速度を求め、前記測定された圧力、前記圧力変化速度、前記圧力変化加速度の少なくともいずれかの時間的変化のパターンを用いて、前記液体の前記容器からの排出終了のタイミングを、次のいずれか１つのタイミングで判定することを特徴とする自動核酸分離精製方法。
    （１）前記圧力発生手段により前記核酸分離精製カートリッジ内を加圧する途中で、前記容器内の圧力が所定の設定値に達した場合に、前記圧力発生手段による加圧を停止し、その後に前記容器内の圧力変化加速度が極小となった時点を前記排出終了のタイミングと判断する。
    （２）前記圧力発生手段により前記核酸分離精製カートリッジ内を加圧する途中で、前記容器内の圧力が所定の設定値に達しない場合に、その後に前記容器内の圧力が極大となり且つ前記容器内の圧力変化速度が零以下となった時点、前記容器内の圧力が極大となり且つ前記容器内の圧力変化加速度が極小となった時点の少なくともいずれかの時点を前記排出終了のタイミングと判断する。
    （３）前記圧力発生手段により前記核酸分離精製カートリッジ内を加圧する途中で、前記容器内の圧力が所定の設定値に達せずに、且つ前記容器内の圧力が極大とならない場合に、前記容器内の圧力変化速度が所定の閾値よりも小さくなった時点を前記排出終了のタイミングと判断する。
  2. 少なくとも、
    （１）前記容器の一方の開口より核酸を含む試料液を注入し加圧して、他方の開口より試料液を排出し試料液中の核酸を前記核酸吸着性の固相に吸着させる吸着工程、
    （２）次に前記容器の一方の開口より洗浄液を分注し加圧して、他方の開口より排出し不純物を除去する洗浄工程、
    （３）次に前記容器の一方の開口より回収液を分注し加圧して、他方の開口より前記核酸吸着性の固相に吸着した核酸を分離・排出して、回収液とともに回収する抽出工程、
    を実施することを特徴とする請求項１記載の自動核酸分離精製方法。
  3. 前記判定手段により判定された液体の排出終了のタイミングを受けて、次工程への移行を開始することを特徴とする請求項１又は請求項２記載の自動核酸分離精製方法。
  4. 少なくとも二個の開口を有する容器内に核酸吸着性の固相を収容した核酸分離精製カートリッジと、該核酸分離精製カートリッジの容器内外に圧力差を発生させる圧力発生手段とを備え、一方の前記開口から注入した液体を、該圧力発生手段により発生させる圧力差によって、前記核酸吸着性の固相を通して他方の前記開口から前記容器外に排出する工程を有し、この核酸分離精製カートリッジに注入される核酸を含む検体から核酸を分離精製する自動核酸分離精製装置であって、
    請求項１〜請求項３のいずれか１項記載の自動核酸分離精製方法に基づいて前記液体を前記容器外に排出する制御部を備えたことを特徴とする自動核酸分離精製装置。
  5. 前記核酸吸着性の固相が、イオン結合が関与しない弱い相互作用で核酸が吸着する、有機高分子からなる多孔質体であることを特徴とする請求項４記載の自動核酸分離精製装置。
  6. 前記有機高分子からなる多孔質体が、水酸基を有する有機高分子からなることを特徴とする請求項５記載の自動核酸分離精製装置。
  7. 前記核酸吸着性の固相が、アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料からなることを特徴とする請求項４〜請求項６のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
  8. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物の鹸化率が、５％以上であることを特徴とする請求項７記載の自動核酸分離精製装置。
  9. 前記アセチル価の異なるアセチルセルロースの混合物を鹸化処理した有機材料が、トリアセチルセルロースとジアセチルセルロースの混合物の鹸化物である、請求項７又は請求項８記載の自動核酸分離精製装置。
  10. 前記核酸吸着性の固相が、表裏非対称性の多孔性膜であることを特徴とする請求項４〜請求項９のいずれか１項記載の自動核酸分離精製装置。
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