JP2005110671A - 抽出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】 短時間で効率よく試料液の核酸などの特定物質を抽出する際に、液のキャリーオーバーの防止を図る。
【解決手段】 フィルター部材11ｂを備えた抽出カートリッジ11を用い、特定物質を含む試料液Ｓを注入し特定物質を吸着させるもので、抽出カートリッジ11を振動させて液の残留を抑制する。吸着後、洗浄液Ｗで不純物を洗浄除去し、さらに回収液Ｒで吸着物を回収する抽出方法で、抽出カートリッジ11を振動させて洗浄液Ｗを残留させることなく排出して回収処理へ移行する。洗浄処理の後、回収処理を行う前に、抽出カートリッジ11に回収液Ｒを微量分注し加圧し、洗浄液Ｗを排出してもよい。
【選択図】 図１

Description

本発明は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用いて試料液の特定物質例えば核酸を抽出する抽出方法に関し、特に洗浄処理後の回収処理などにおいて、抽出カートリッジ内に洗浄液等の前の液が残留しないようにする抽出方法に関するものである。

従来の抽出法、例えば核酸抽出法としては、遠心法によるもの、磁気ビーズを用いるもの、フィルターを用いるものなどがある。

フィルターを用いた抽出装置としては、フィルターを収容したフィルターチューブをラックに多数セットし、これに試料液を分注し、上記ラックの底部の周囲をシール材を介してエアチャンバーで密閉して内部を減圧し、全フィルターチューブを同時に排出側より吸引して試料液を通過させて核酸をフィルターに吸着し、その後、洗浄液および溶出液を分注して、同様に減圧吸引して洗浄・溶出するようにした機構が提案されている（例えば、特許文献１参照）。

また、フィルターを用いた他の抽出方法として、試料液の核酸を吸着させた後、離脱させて回収する特定のフィルターを備えた分離精製ユニットに、試料液を注入し加圧して抽出する方式が採用されたものがある（例えば、特許文献２参照）。
特許第２８３２５８６号公報 特開２００３−１２８６９１号公報

上記のような特許文献１および２に記載されたものでは、本発明の対象とする抽出方法としては次のような問題がある。

引用文献１では、減圧方式による核酸抽出を示しており、全体を同時に吸引するものでは、減圧容積が大きいために装置が大型化し、減圧を作用させるまでの時間が掛かり、また、液が全部排出されたことの検出が困難で、時間設定が長く、処理効率の向上の障害となる。特に、全体の真空吸引では、１つの抽出カートリッジへの試料液注入不良、抽出カートリッジの装填ミス等によってエア抵抗がないものがあると、正常な作動を確保することができず、また、多数の抽出カートリッジを個別に吸引する機構を構成することも困難である。

一方、特許文献２では、加圧方式によりフィルターを使って、核酸抽出物を吸着させ、回収する方式が示されているが、具体的な抽出装置については示されておらず、この加圧方式を採用した抽出方法では、その加圧コントロール方法や、加圧時の排出液の飛散によるコンタミネーションの発生、密閉性の確保、キャリーオーバー等が問題となることが予想される。

特に、上記キャリーオーバーは、複数種類の液を順に抽出カートリッジに注入し、排出させる際に、前の液が抽出カートリッジに残留することに伴う問題である。例えば、前記特許文献２による核酸抽出においては、核酸吸着後の洗浄処理で抽出カートリッジに洗浄液を分注し、加圧して洗浄液で抽出カートリッジのフィルター部材に吸着した核酸以外の不純物を洗浄除去するものであるが、この洗浄処理後には抽出カートリッジに回収液を分注して、フィルター部材に吸着した核酸の結合力を弱めて核酸を回収液とともに回収する。しかし、この回収処理において前記洗浄処理で抽出カートリッジ内に残留した洗浄液が混入するすなわちキャリーオーバーが発生すると、回収処理およびその後の核酸処理に影響を及ぼし例えば、回収率が低下するなどの問題が発生する。

上記洗浄液の残留は、抽出カートリッジの壁面およびフィルター部に付着するもの、先端に液滴状に付着するものなどがあり、これを有効に除去しキャリーオーバーを防止する必要があることが判明した。

本発明はこのような点に鑑みなされたもので、短時間で効率よく試料液の核酸等の特定物質を抽出できるとともに液のキャリーオーバーの防止を図った抽出方法を提供することを目的とするものである。

特に、特許文献２のフィルター方式による核酸抽出を良好に実現できる抽出方法を提供するものである。

本発明の抽出方法は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに特定物質を含む試料液を注入して該試料液中の特定物質を前記フィルター部材に吸着させる抽出方法において、前記抽出カートリッジを振動させて液の残留を抑制することを特徴とするものである。

本発明の他の抽出方法は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させる吸着処理の後、前記抽出カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去する洗浄処理を行い、さらに、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧して前記フィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する回収処理を行う抽出方法であって、前記抽出カートリッジを振動させ、前記洗浄液の残留を抑制することを特徴とするものである。

その際、前記洗浄処理の少なくとも最終工程で、前記抽出カートリッジを振動させつつ加圧し、前記洗浄液を排出するのが好適である。

また、本発明のさらに他の抽出方法は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに特定物質を含む試料液を注入して該試料液中の特定物質を前記フィルター部材に吸着させる抽出方法において、前記抽出カートリッジに他の液を微量注入し前の液の残留を抑制することを特徴とするものである。

本発明の他の抽出方法は、フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させる吸着処理の後、前記抽出カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去する洗浄処理を行い、さらに、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧して前記フィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する回収処理を行う抽出方法であって、前記洗浄処理の後、前記回収処理を行う前に、洗浄処理後の前記抽出カートリッジに回収液を微量分注し加圧し、洗浄液を前記抽出カートリッジに残留させることなく排出することを特徴とするものである。

その際、残留洗浄液を回収液で置換するか、残留洗浄液を回収液とともに排出させることによって洗浄液のキャリーオーバーを防止するものである。

上記のような本発明の抽出方法によれば、フィルター部材を備えた抽出カートリッジに特定物質、例えば核酸を含む試料液を注入して特定物質をフィルター部材に吸着させる抽出動作を短時間で効率よく行って試料液の核酸などの特定物質を抽出できるとともに、抽出カートリッジを振動させて液の残留を抑制することにより、液がキャリーオーバーすることがなく、良好な抽出処理が実行できる。

また、他の抽出方法では、フィルター部材を備えた抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して核酸をフィルター部材に吸着させた後、洗浄液を分注して不純物を洗浄排出した後、回収液を分注してフィルター部材に吸着した核酸を分離して回収する抽出動作を行って短時間で効率よく試料液の核酸を抽出できるとともに、抽出カートリッジを振動させて洗浄液の残留を抑制し、該抽出カートリッジに洗浄液を残留させることなく排出して回収処理へ移行することにより、洗浄液が回収処理へキャリーオーバーすることがなく、良好な回収処理が実行できる。

特に、洗浄処理の少なくとも最終工程で、抽出カートリッジを振動させつつ加圧し、洗浄液を排出させると、キャリーオーバーを確実に防止できる。

また、本発明の他の抽出方法によれば、抽出カートリッジに他の液を微量注入し前の液
の残留を抑制することにより、同様に、液がキャリーオーバーすることがなく、良好な抽出処理が実行できる。

また、他の抽出方法では、洗浄処理の後、回収処理を行う前に、洗浄処理後の抽出カートリッジに回収液を微量分注し加圧し、洗浄液を抽出カートリッジに残留させることなく排出することにより、同様に、洗浄液が回収処理へキャリーオーバーすることがなく、良好な回収処理が実行できる。

以下、本発明の実施の形態を図面に沿って説明する。図１は本発明の抽出方法の一つの実施の形態における核酸抽出方法の工程図、図２は他の実施形態の核酸抽出方法の追加工程を示す工程図、図３は一実施形態の核酸抽出装置のカバーを除去した状態を示す斜視図、図４は核酸抽出装置の概略機構図、図５は搭載機構におけるラックの斜視図、図６は抽出カートリッジの斜視図である。

一実施形態の核酸抽出方法を説明する。この核酸抽出方法は、図６に示すような抽出カートリッジ１１（フィルターカートリッジ）を用いて試料液中の特定物質としての核酸を抽出するものである。この抽出カートリッジ１１は、上端が開口した筒状本体１１ａの底部にフィルター部材１１ｂが保持され、筒状本体１１ａのフィルター部材１１ｂより下方部位はロート状に形成され、下端中心部に細管ノズル状の排出部１１ｃが所定長さに突出形成され、筒状本体１１ａの側部両側に縦方向の突起１１ｄが形成されてなる。上部開口より後述の試料液、洗浄液、回収液が分注され、上部開口より加圧エアが導入され、各液をフィルター部材１１ｂを通して排出部１１ｃより後述の廃液容器１２または回収容器１３に流下排出する。なお、図示の場合、筒状本体１１ａは上部と下部に分割され嵌着する構造となっている。

そして、核酸抽出方法は、図１(ａ)〜(ｇ)に示すような抽出工程によって核酸の抽出精製を行う。まず図１(ａ)工程で、廃液容器１２上に位置する抽出カートリッジ１１に溶解処理された核酸を含む試料液Ｓを注入する。次に図１(ｂ)工程で、抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂを通して試料液Ｓを通過させ、このフィルター部材１１ｂに核酸を吸着させ、通過した液状成分は廃液容器１２に排出する。

次に図１(ｃ)工程で抽出カートリッジ１１に洗浄液Ｗを自動分注し、(ｄ)工程で抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂに核酸を保持したままその他の不純物の洗浄除去を行い、通過した洗浄液Ｗは廃液容器１２に排出される。この(ｃ)工程および(ｄ)工程を複数回繰り返してもよい。

そして、上記(ｄ)工程の洗浄処理の少なくとも最終工程で、抽出カートリッジ１１を振動させつつ加圧し、前記洗浄液Ｗを抽出カートリッジ１１に残留させることなく排出して、次の回収処理へ移行させる。

なお、上記抽出カートリッジ１１の振動は、加圧終了後に行ってもよい。また、抽出カートリッジ１１の振動は、後述の核酸抽出装置１における抽出カートリッジ１１を保持するラック６の加振、または、抽出カートリッジ１１に加圧エアを供給するエアノズル４１を介しての加振などによって行う。

その後、回収処理に移行する。つまり、(ｅ)工程で抽出カートリッジ１１の下方の廃液容器１２を回収容器１３に交換してから、(ｆ)工程で抽出カートリッジ１１に回収液Ｒを自動分注し、(ｇ)工程で抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、フィルター部材１１ｂと核酸の結合力を弱め、吸着されている核酸を離脱させて、核酸を含む回収液Ｒを回収容器１３に排出し回収する。

次に、図２は他の実施形態に掛かる核酸抽出方法の追加工程を示す図である。この追加工程(１)，(２)は、図１における(ｄ)工程の洗浄処理と、(ｅ)工程の回収処理の間に挿入されるものである。

(ｄ)工程の洗浄処理の後、(ｅ)工程の回収処理を行う前に、追加工程(１)は、洗浄処理後の抽出カートリッジ１１に回収液Ｒを微量分注し、追加工程(２)で抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入して加圧し、この抽出カートリッジ１１内に残留している洗浄液Ｗを排出させるものである。

その際、残留洗浄液Ｗを回収液Ｒで置換するか、残留洗浄液Ｗを回収液Ｒとともに排出させることによって洗浄液Ｗのキャリーオーバーを防止するものである。

なお、本実施形態では、回収処理前に回収液Ｒを微量注入することによりフィルター部材１１ｂに吸着している核酸の一部を分離させて排出することになるが、その影響は少ない。つまり、回収処理における初期段階での核酸回収率は低く、回収液量も微量であることから核酸回収量の低下も微量で最終的な核酸回収量に与える影響は少なく問題とはならない。また、その回収低下量が問題となる場合には、試料液量の増加を図ることが好ましい。

上記抽出カートリッジ１１におけるフィルター部材１１ｂは、基本的には核酸が通過可能な多孔性であり、その表面は試料液中の核酸を化学的結合力で吸着する特性を有し、洗浄液による洗浄時にはその吸着を保持し、回収液による回収時に核酸の吸着力を弱めて離すように構成されてなる。その一例の具体的構成は、特開２００３−１２８６９１号の核酸の分離精製方法に詳述されているように、例えば、上記フィルター部材１１ｂは表面に水酸基を有する有機高分子で構成されている。表面に水酸基を有する有機高分子としては、アセチルセルロースの表面鹸化物が好ましい。アセチルセルロースとしては、モノアセチルセルロース、ジアセチルセルロース、トリアセチルセルロースのいずれでもよいが、特にはトリアセチルセルロースが好ましい。その表面が鹸化処理液（例えば、ＮａＯＨ）との接触により鹸化され、その構造体はアセチルセルロースのままである。表面鹸化処理の程度（表面鹸化度）で表面の水酸基の量（密度）がコントロールでき、水酸基の数が多い方が核酸の吸着効果が高くなる。例えば、トリアセチルセルロースなどのアセチルセルロースの場合には、表面鹸化率が約５％以上であることが好ましく、１０％以上であることがさらに好ましい。アセチルセルロースは多孔性膜が好適である。

前記「核酸を含む試料液Ｓ」は、細胞またはウィルスを含む検体を溶解処理することにより核酸を液中に分散させた溶液に水溶性有機溶媒を添加したものである。例えば診断分野においては、検体として採取された全血、血漿、血清、尿、便、精液、唾液等の体液、あるいは植物（またはその一部）、動物（またはその一部）など、あるいはそれらの溶解物およびホモジネートなどの生物材料から調製された溶液が対象となる。「溶解処理」は、細胞膜および核膜を溶解して核酸を可溶化する試薬（例えば、グアニジン塩、界面活性剤およびタンパク質分解酵素を含む溶液）を含む水溶液で処理するもので、例えば、対象となる試料が全血の場合、フィルター部材１１ｂへの非特異吸着および目詰まりを防ぐために赤血球および各種タンパク質を分解、低分子化し、抽出の対象である核酸を可溶化させるために白血球および核膜の溶解を行う。「水溶性有機溶媒」としてはエタノール、イソプロパノールまたはプロパノールなどが挙げられ、中でもエタノールが好ましい。水溶性有機溶媒の濃度は好ましくは５〜９０重量％であり、さらに好ましくは２０〜６０重量％である。エタノールの添加濃度は、凝集物を生じない程度でできるだけ高くすることが特に好ましい。

「洗浄液Ｗ」は、核酸と一緒にフィルター部材１１ｂに付着した試料液中の不純物を洗い流す機能を有し、核酸の吸着はそのままで不純物を離脱させる組成を有する。主剤と緩衝剤、および必要に応じて界面活性剤を含む水溶液からなる。主剤としてはメタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−イソプロパノール、ブタノール、アセトン等の約１０〜１００重量％（好ましくは２０〜１００重量％、さらに好ましくは４０〜８０重量％）の水溶液が挙げられる。

「回収液Ｒ」は、塩濃度が低いことが好ましく、特には０．５Ｍ以下の塩濃度の溶液、例えば、精製蒸留水、ＴＥバッファ等が使用される。

次に、上記のような核酸抽出方法を実施する核酸抽出装置１を説明する。図３および図４に示すように、核酸抽出装置１は装置本体２に、複数の抽出カートリッジ１１、廃液容器１２および回収容器１３を保持する搭載機構３と、抽出カートリッジ１１に加圧エアを導入する加圧エア供給機構４と、抽出カートリッジ１１に洗浄液Ｗおよび回収液Ｒを分注する分注機構５などを備えてなる。次に各機構３〜５を具体的に説明する。

＜搭載機構＞
搭載機構３は、装置本体２の前方下部に搭載台２１を備え、この搭載台２１上に複数の抽出カートリッジ１１、廃液容器１２および回収容器１３を保持したラック６が載置される。ラック６は、図５にも示すように、スタンド６１とカートリッジホルダー６２と容器ホルダー６３とを備える。

スタンド６１は両側の柱状部６１ａに上下移動可能にカートリッジホルダー６２を保持し、柱状部６１ａの間の下部の底板６１ｂ上に前後移動可能に容器ホルダー６３を保持している。

カートリッジホルダー６２は、前後のプレート材の接合による２分割構造に構成され、横方向に延びる保持部６２ａの両端に上下方向に延びる支持脚６２ｂを備える。その支持脚６２ｂがスタンド６１の柱状部６１ａの上下方向の摺動溝６１ｃに上下移動可能に挿入され、この支持脚６２ｂがスタンド６１に内蔵された付勢部材（不図示）によって上方に付勢されている。保持部６２ａには複数の保持孔６２ｃが並設され、上方より抽出カートリッジ１１が挿入され、抽出カートリッジ１１の筒状本体１１ａの側部両側に形成された突起１１ｄ（図６参照）の下端がカートリッジホルダー６２内の係合部材（不図示）に係合保持される。係合部材は移動可能で、移動時には突起１１ｄとの係合を解除して抽出カートリッジ１１を全部同時に下方に落下廃棄するようになっている。

このカートリッジホルダー６２は上面の両側にピン孔６２ｄを備え、使用状態では後述の押えピン４９（図３参照）の先端４９ａが係合して下方に押し下げられる。図５のようにカートリッジホルダー６２が上昇した位置では、カートリッジホルダー６２に保持された抽出カートリッジ１１の排出部１１ｃの下端は容器ホルダー６３にセットされた廃液容器１２および回収容器１３より上方に位置しているが、カートリッジホルダー６２が下降した際には抽出カートリッジ１１の排出部１１ｃが廃液容器１２または回収容器１３の内部に所定量挿入されるように設定されている。

容器ホルダー６３は、横方向に延びる廃液容器保持孔６３ａと回収容器保持孔６３ｂとを平行２列に備え、後側の廃液容器保持孔６３ａに複数の廃液容器１２が、前側の回収容器保持孔６３ｂに複数の回収容器１３がそれぞれ列状に保持される。廃液容器保持孔６３ａおよび回収容器保持孔６３ｂはカートリッジホルダー６２の保持孔６２ｃと等ピッチで等位置に配設され、保持された各抽出カートリッジ１１の下方にそれぞれ廃液容器１２および回収容器１３が位置するように設定されている。この廃液容器１２と回収容器１３とは混同防止のためにサイズ、形状等が異なったものを使用するのが好ましい。

上記容器ホルダー６３はスタンド６１に内蔵された不図示の付勢部材によって前方に付勢されている。容器ホルダー６３の容器交換移動（前後動）は、搭載台２１に設置された作動部材３１（図４参照）が、スタンド６１の底板６１ｂに形成された開口を通して、容器ホルダー６３の底部の係合孔（不図示）に係合されて行われる。容器交換モータ３２（ＤＣモータ）の駆動に応じた作動部材３１の移動動作に応じて容器ホルダー６３が後退移動され、カートリッジホルダー６２の下方に回収容器１３が位置するように作動する。非作動時には廃液容器１２がカートリッジホルダー６２の下方に位置するように不図示の付勢部材で付勢されている。上記容器交換モータ３２の作動は位置センサ３３ａ，３３ｂの検出に応じて制御される。

なお、廃液容器保持孔６３ａおよび回収容器保持孔６３ｂは有底に設けられ、廃液容器１２または回収容器１３がセットされていない状態で誤って液が滴下しても外部に流出して機器を汚染しないようになっている。

＜加圧エア供給機構＞
加圧エア供給機構４は、図３および図４に示すように、前記搭載機構３のラック６に対して昇降移動する加圧ヘッド４０と、この加圧ヘッド４０に１列に並んで設置された複数（図の場合８個）のエアノズル４１と、加圧エアを発生するエアポンプ４３と、リリーフバルブ４４と、各エアノズル４１に設置され個別に開閉する開閉バルブ４５と、各エアノズル４１に設置された圧力センサ４６を備え、順次抽出カートリッジ１１に加圧エアを送給する。

前記加圧ヘッド４０は、装置本体２の中間フレーム２２と上フレーム２３との間に上下方向に設置されたガイドロッド２４に上下移動可能に保持されている。同様に上下方向に設置されたボールネジ２５に加圧ヘッド４０に設置されたボールナット４０ａが螺合し、昇降モータ４７（パルスモータ）の駆動に伴うタイミングベルト、プーリを介したボールネジ２５の回転により加圧ヘッド４０が、フォトセンサ４８ａ〜４８ｃの検出に伴う制御により昇降移動される。加圧ヘッド４０の両側には押えピン４９を有し、この押えピン４９はスプリング４９ｂで下方に付勢されて上下移動可能で、先端４９ａがカートリッジホルダー６２の上面のピン孔６２ｄに係合して位置を規制して押えるようになっている。

上記押えピン４９は、カートリッジホルダー６２を押圧作動している状態で、後述の洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒの横方向移動と干渉しないように、カートリッジホルダー６２の前側位置を押えるように配設されている。

エアノズル４１は加圧ヘッド４０にそれぞれ上下移動可能にかつ下方に付勢されて設置され、その下方にはエアノズル４１に対応した連通孔４２ａ（図４参照）が開口されたシート状のシール材４２が配設され、加圧ヘッド４０が下降移動した際に、カートリッジホルダー６２にセットされた抽出カートリッジ１１の上端開口を、エアノズル４１先端でシール材４２を介して押圧して密閉し、連通孔４２ａを通して抽出カートリッジ１１内へ加圧エアが送給可能となる。

リリーフバルブ４４はエアポンプ４３と開閉バルブ４５との間の通路のエアを排出する際に大気開放作動される。開閉バルブ４５は選択的に開作動されて、エアポンプ４３からの加圧エアを対応するエアノズル４１を経て抽出カートリッジ１１内に導入するようにエア回路が構成されている。圧力センサ４６は各エアノズル４１に設置され、抽出カートリッジ１１の内圧を個別に検出するものであり、検出圧力が所定圧力範囲（例えば５０〜２００ｋＰａ、好ましくは８０〜１２０ｋＰａ）となったときに対応する開閉バルブ４５を閉作動して加圧エアの送給を停止したり、また、圧力が所定値以下に低下したことの検出により液排出終了を判定する制御などが行われる。

前記実施形態で挙げているエアポンプ４３は、ダイヤフラム型ポンプの例であるが、プランジャ型ポンプ、シリンジポンプ等の加圧エアー源となるものであれば採用可能である。

＜分注機構＞
分注機構５は、ラック６上を横方向に移動可能なノズル移動台５０に設置された洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒと、洗浄液ボトル５６ｗに収容された洗浄液Ｗを洗浄液分注ノズル５１ｗに給送する洗浄液供給ポンプ５２ｗと、回収液ボトル５６ｒに収容された回収液Ｒを回収液分注ノズル５１ｒに給送する回収液供給ポンプ５２ｒと、搭載台２１に載置された廃液ボトル５７などを備える。

ノズル移動台５０は、装置本体２の縦壁２６に水平方向に設置されたガイドレール２７に保持されて横方向に移動可能であり、その移動が不図示のノズル移動モータ（パルスモータ）によって各抽出カートリッジ１１上で順次停止し、復帰状態では廃液ボトル５７上に停止するように駆動制御される。洗浄液分注ノズル５１ｗおよび回収液分注ノズル５１ｒは先端が下方に向けて屈曲され、洗浄液分注ノズル５１ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液供給ポンプ５２ｗに接続され、洗浄液供給ポンプ５２ｗは切替弁５５ｗを介して洗浄液ボトル５６ｗに接続され、回収液分注ノズル５１ｒは切替弁５５ｒを介して回収液供給ポンプ５２ｒに接続され、回収液供給ポンプ５２ｒは切替弁５５ｒを介して回収液ボトル５６ｒに接続されている。洗浄液ボトル５６ｗおよび回収液ボトル５６ｒはそれぞれ装置本体２の側部に装着される。洗浄液供給ポンプ５２ｗおよび回収液供給ポンプ５２ｒはシリンジポンプで構成され、そのピストン部材がそれぞれポンプモータ５３ｗ，５３ｒ（パルスモータ）によってセンサ５４ｗ，５４ｒの位置検出に基づいて所定量の洗浄液Ｗおよび回収液Ｒを分注するように駆動制御される。

すなわち、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを分注する場合には、切替弁５５ｗまたは５５ｒを洗浄液ボトル５６ｗまたは回収液ボトル５６ｒ側に切り替え、ポンプモータ５３ｗまたは５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を後退作動させ、洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの内部に吸引収容し、続いて切替弁５５ｗまたは５５ｒを洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒ側へ切り替え、ポンプモータ５３ｗまたは５３ｒを駆動して洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒのピストン部材を押込作動させ、廃液ボトル５７に対して通路内のエアを排出するまで洗浄液または回収液を洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒより吐出させた後、洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの駆動を停止させる。その後、洗浄液分注ノズル５１ｗまたは回収液分注ノズル５１ｒを抽出カートリッジ１１上に移動させてから、洗浄液供給ポンプ５２ｗまたは回収液供給ポンプ５２ｒの駆動量を制御して所定量の洗浄液Ｗまたは回収液Ｒを抽出カートリッジ１１へ分注するものである。

そして、上記のような各機構３〜５は、装置本体２の上部に設置された操作パネル７の入力操作に対応し、連係された不図示の制御ユニットにより内蔵されたプログラムに基づいて駆動制御される。

上記のような核酸抽出装置１において、前述の図１の抽出方法における洗浄工程の最終段階で抽出カートリッジ１１を振動させる機構としては、次のような機構が付設される。第１例としては、ラック６を介して抽出カートリッジ１１を振動させるものとして、容器ホルダー６３の前後運動を微少ストロークで短時間に運動させるように、容器交換モータ３２を駆動して振動させる。第２例としては、ラック６を介して抽出カートリッジ１１を振動させるものとして、搭載台２１を加振する圧電素子（不図示）を設置し、この搭載台２１の振動で搭載したラック６を振動させる。第３例としては、エアノズル４１を介して抽出カートリッジ１１を振動させるものとして、加圧ヘッド４０を加振する圧電素子（不図示）を設置し、この加圧ヘッド４０の振動でエアノズル４１を振動させる。第４例としては、エアノズル４１を介して抽出カートリッジ１１を振動させるものとして、加圧ヘッド４０の上下運動を微少ストロークで短時間に運動させるように、昇降モータ４７を駆動して振動させる。

なお、上記抽出カートリッジ１１の振動においては、加圧エアの供給におけるエアノズル４１との密閉シール性を損なわないように、振幅、加振力を調整して行う必要がある。

上記核酸抽出装置１による抽出動作を具体的に説明する。まず搭載機構３のラック６におけるカートリッジホルダー６２に抽出カートリッジ１１をセットし、容器ホルダー６３に廃液容器１２および回収容器１３をそれぞれセットし、このラック６を装置本体２の搭載台２１に載置して準備を行う。次に、溶解処理された試料液Ｓをピペット等によって各抽出カートリッジ１１に順次注入する。なお、装置１に搭載する前のラック６にセットした後またはセットする前の抽出カートリッジ１１に試料液Ｓを先に注入するようにしてもよい。

その後、操作パネル７の操作によって装置を作動させると、加圧エア供給機構４の昇降モータ４７の駆動によって加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端４９ａがカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけて、このカートリッジホルダー６２を下降させて位置を規制すると共に、抽出カートリッジ１１の下端排出部１１ｃを廃液容器１２内に所定量挿入させて、排出液が飛散等によって外部に漏れてコンタミネーションの原因とならないようにする。さらに加圧ヘッド４０が下降移動してシール材４２を介して各エアノズル４１の下端部が抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉する。前記押えピン４９がカートリッジホルダー６２の位置を規制していることで、各抽出カートリッジ１１に対し各エアノズル４１が正確に圧接して確実な密閉が確保できる。

その後、加圧エアの供給が行われるもので、全部の開閉バルブ４５が閉状態でエアポンプ４３が駆動され、まず１番目の開閉バルブ４５が開作動される。そして、１番目のエアノズル４１を通して１番目の抽出カートリッジ１１にエアポンプ４３からの加圧エアが供給され、その圧力センサ４６の検出によって所定圧力に上昇すると１番目の開閉バルブ４５を閉作動するのに続いて、２番目の開閉バルブ４５が開作動されて２番目のエアノズル４１を通して２番目の抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。この動作を順に繰り返して全ての抽出カートリッジ１１に圧力を加える。圧力が作用した試料液Ｓは、フィルター部材１１ｂを通って核酸が吸着保持され、その他の液状成分は下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。試料液Ｓが全てフィルター部材１１ｂを通過すると圧力が液排出完了圧力以下に低下し、各圧力センサ４６によって全部の抽出カートリッジ１１で抽出終了が検出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動される。

次に、洗浄処理に移行するが、上記加圧エア供給後の加圧ヘッド４０の上昇は、エアノズル４１が抽出カートリッジ１１より離れ、ノズル移動台５０の移動が許容できる高さまで上昇した位置で停止し、押えピン４９がカートリッジホルダー６２を押さえつけ、抽出カートリッジ１１の下端が廃液容器１２内に挿入されている状態を保持して行う。そして、ノズル移動台５０を移動させて洗浄液分注ノズル５１ｗを１番目の抽出カートリッジ１１上に停止させて洗浄液Ｗを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の抽出カートリッジ１１に移動させて順次洗浄液Ｗを分注する。全部の抽出カートリッジ１１への洗浄液Ｗの分注が終了すると、加圧ヘッド４０が下降移動し、各エアノズル４１の下端部がシール材４２を介して抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接して密閉してから、前述と同様に開閉バルブ４５が順次開作動されて各抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。圧力が作用した洗浄液Ｗは、フィルター部材１１ｂを通って核酸以外の不純物の洗浄除去を行い、洗浄液Ｗは下端部の排出部１１ｃより廃液容器１２に排出される。全部の抽出カートリッジ１１における洗浄液Ｗが全てフィルター部材１１ｂを通過して排出されると、加圧ヘッド４０が初期の位置まで上昇作動される。洗浄処理を複数回行う場合には上記動作を繰り返す。

そして、洗浄処理後の抽出カートリッジ１１内に洗浄液Ｗが残留して回収処理にキャリーオーバーしないように、洗浄工程で抽出カートリッジ１１を振動させるか、残留洗浄液Ｗを回収液Ｒで置換するか、回収液とともに排出させる。

次に、回収処理に移行する。まず洗浄処理後の前記加圧ヘッド４０の上昇により、押えピン４９が上昇してラック６のカートリッジホルダー６２も上昇移動し、抽出カートリッジ１１の下端排出部１１ｃが廃液容器１２より上方へ移動した後、搭載機構３の作動部材３１を作動させて容器ホルダー６３を後退移動させ、抽出カートリッジ１１の下方に回収容器１３を位置させる容器交換を行う。

続いて、加圧ヘッド４０が下降移動し、押えピン４９の先端がカートリッジホルダー６２のピン孔６２ｄに係合して押さえつけ、抽出カートリッジ１１の先端排出部１１ｃが回収容器１３内に挿入されている状態を保持する。そして、ノズル移動台５０を移動させて回収液分注ノズル５１ｒを１番目の抽出カートリッジ１１上に停止させて回収液Ｒを所定量分注し、ノズル移動台５０を次の抽出カートリッジ１１に移動させて順次回収液Ｒの分注を行う。全部の抽出カートリッジ１１への回収液Ｒの分注が終了すると、前述と同様にさらに加圧ヘッド４０が下降し、各エアノズル４１の下端部をシール材４２を介して抽出カートリッジ１１の上端開口に圧接させて密閉してから、開閉バルブ４５が順次開作動されて各抽出カートリッジ１１に加圧エアが供給される。圧力が作用した回収液Ｒは、フィルター部材１１ｂを通ってそれに吸着されている核酸を離脱させて、回収液Ｒとともに核酸が下端部の排出部１１ｃより回収容器１３に排出される。全部の抽出カートリッジ１１における回収液Ｒが全て回収容器１３に排出されると、加圧ヘッド４０が上昇作動され、一連の動作が終了する。

抽出動作が終了したラック６は搭載台２１より下ろされ、抽出カートリッジ１１および廃液容器１２はカートリッジホルダー６２および容器ホルダー６３より取り出されて廃棄され、一方、回収容器１３は容器ホルダー６３より取り出され、必要に応じて蓋がされて、次の核酸分析処理等が施される。

なお、本実施形態では、抽出カートリッジ１１を複数搭載しているが、これに限定されるものではなく、抽出カートリッジ１１を１本としても適用が可能である。

なお、本実施形態では、洗浄液Ｗによる洗浄処理を実施しているが、フィルター部材１１ｂの濾過能力によっては必ずしも必要とするものではない。

また、上記実施形態では、核酸の抽出装置について記載しているが、本発明はこれに限定されるものではなく、種々の特定物質をフィルター部材に接触させる方法にも適用可能であり、また、必ずしも回収液を用いて回収する必要はなく、フィルター部材に特定物質を接触させたまま分析したり、処理液を入れて反応色を分析することも可能である。

本発明の一つの実施の形態における核酸抽出方法の工程図 他の実施形態の核酸抽出方法の追加工程を示す工程図 一つの実施の形態にかかる核酸抽出装置のカバーを除去した状態を示す斜視図 核酸抽出装置の概略機構図 搭載機構におけるラックの斜視図 抽出カートリッジの斜視図

符号の説明

１ 抽出装置（核酸抽出装置）
２ 装置本体
３ 搭載機構
４ 加圧エア供給機構
５ 分注機構
６ ラック
11 抽出カートリッジ
11b フィルター部材
12 廃液容器
13 回収容器
21 搭載台
40 加圧ヘッド
41 エアノズル
43 エアポンプ
45 開閉バルブ
46 圧力センサ
50 ノズル移動台
51w,51r 分注ノズル
62 カートリッジホルダー
63 容器ホルダー
Ｓ 試料液
Ｗ 洗浄液
Ｒ 回収液

Claims (5)

1. フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに特定物質を含む試料液を注入して該試料液中の特定物質を前記フィルター部材に吸着させる抽出方法において、
   前記抽出カートリッジを振動させて液の残留を抑制することを特徴とする抽出方法。
2. フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させる吸着処理の後、前記抽出カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去する洗浄処理を行い、さらに、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧して前記フィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する回収処理を行う抽出方法であって、
   前記抽出カートリッジを振動させ、前記洗浄液の残留を抑制することを特徴とする抽出方法。
3. 前記洗浄処理の少なくとも最終工程で、前記抽出カートリッジを振動させつつ加圧し、前記洗浄液を排出することを特徴とする請求項２に記載の抽出方法。
4. フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに特定物質を含む試料液を注入して該試料液中の特定物質を前記フィルター部材に吸着させる抽出方法において、
   前記抽出カートリッジに他の液を微量注入し前の液の残留を抑制することを特徴とする抽出方法。
5. フィルター部材を備えた抽出カートリッジを用い、該抽出カートリッジに核酸を含む試料液を注入し加圧して該試料液中の核酸を前記フィルター部材に吸着させる吸着処理の後、前記抽出カートリッジに洗浄液を分注し加圧して不純物を除去する洗浄処理を行い、さらに、前記抽出カートリッジに回収液を分注し加圧して前記フィルター部材に吸着した核酸を分離して回収液とともに回収する回収処理を行う抽出方法であって、
   前記洗浄処理の後、前記回収処理を行う前に、洗浄処理後の前記抽出カートリッジに回収液を微量分注し加圧し、洗浄液を前記抽出カートリッジに残留させることなく排出することを特徴とする抽出方法。

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