CN104487573A - 制备用于核酸扩增的样品的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于样品制备领域，特别是，它涉及在进行核酸扩增之前制备样品的方法。

Description

制备用于核酸扩增的样品的方法
本申请要求2012年3月30日提交的GB1205769.1的优先权，其完整内容通过引用并入。
发明领域
本发明属于样品制备领域。特别是，本发明涉及在进行核酸扩增之前制备样品的方法。
背景技术
核酸扩增技术，“NAAT”
NAAT允许以高敏感度和特异性检测和定量样品中的核酸。NAAT可用于确定样品中的特定模板核酸的存在，如实施特定NAAT之后扩增产物的存在所指示的。相反，不存在任何扩增产物则指示样品中不存在模板核酸。这样的技术在临床、工业和研究应用中非常重要。NAAT的应用实例包括但不限于：确定样品中是否存在病原体、定量样品中病毒的量、比较样品中两种或更多种基因的相对水平或确定样品中的具体标志物的表达水平。
现有技术中已经描述了用于扩增核酸的各种各样的热循环和等温技术。热循环技术，诸如聚合酶链式反应(PCR)，使用温度循环来驱动DNA合成的重复循环，从而与模板DNA的初始量成比例地合成大量新DNA。也已经开发许多等温技术，其不依赖于热循环来驱动扩增反应。等温技术，其利用具有链置换活性的DNA聚合酶，已经被开发用于不涉及RNA合成步骤的扩增反应。类似地，对于涉及RNA合成步骤的扩增反应，已经开发了可以使用逆转录酶、核糖核酸酶H和/或DNA-依赖性RNA聚合酶的等温技术(参见例如，Nucleic Acid Isothermal Amplification Technologies-AReview.Nucleosides,Nucleotides and Nucleic Acids，第27卷，第3期，2008年3月第224-243页)。
样品制备是NAAT的常规要求
当希望使用NAAT确定特定样品中核酸的存在和/或水平时，通常需要在进行NAAT之前使样品经受某种程度的预处理(在本文中称为“样品制备”)以使得在允许基于NAAT的检测有效地发挥作用的条件下样品中存在的核酸可以为NAAT所用。
在实践中，样品制备可能是费力的、多步骤的工艺，需要熟练的技术人员和基础设施、昂贵的消耗品、一系列试剂和溶剂(通常是危险或有害的)以及各种不同设备诸如离心机和真空歧管。所述工艺的复杂性为操作失误带来多个机会(包括样品污染)，因此，在没有昂贵的自动/半自动样品制备装置的帮助之下，在专业实验室外进行样品制备是具有挑战性的。
因此，可以简化样品制备并减少样品制备成本的方法是非常需要的，并且在更具挑战性的环境和经济背景下将使得基于NAAT的技术的应用能够脱离专门实验室。例如，如果有效样品制备的成本低并且样品制备方法简单得足以在这样的背景下由非专业人员可靠地进行，那么改进的样品制备方法可使得NAAT能够在非洲村庄中用于HIV检测。
样品制备的原则
有三个与样品制备相关的一般原则：
i)使得核酸物理上可用于NAAT(样品溶解)
ii)NAAT抑制剂的去除/减少
iii)核酸的浓缩
为了使得NAAT可以运行，样品中的核酸必须与NAAT试剂直接物理接触。因为核酸通常存在于细胞或病毒衣壳内，并且因为这些细胞/病毒通常会还会包埋在复杂的基质中，因此样品制备工艺必须能够充分地破坏细胞/病毒衣壳两者以及任何相关联的样品基质，以使得核酸可用于NAAT。
进一步地，感兴趣的核酸所在的基质可能含有能够抑制NAAT的物质，因此，去除或减少这样的抑制剂以使NAAT充分发挥作用可能是必须的。
更进一步，在许多情况下，每单位体积中，样品中感兴趣的核酸的丰度可能非常低。在这种情况下，能够将核酸从大体积浓缩为较小体积的方法是有利的；核酸的这种浓缩常常，在其本身，可能有利于从抑制剂纯化核酸。
样品溶解
样品溶解，以使得核酸可用，可以通过机械手段(综述于J.Brent(1998).Breaking Up Isn't Hard To Do:A cacophony of sonicators,cell bombs andgrinders"The Scientist 12(22):23)和非机械技术来实现。简单的机械方式包括使用搅拌器以及通过强制细胞经过限制性开口的均化。超声处理基于将样品暴露于高频声波，而珠法(bead approach)基于在各种珠的存在下将细胞暴露于剧烈搅拌。
样品的化学破碎是机械破碎的可替代方案。去污剂是重要的化学溶解剂，其通过破坏脂质双层以及使蛋白增溶/变性起作用。十二烷基硫酸钠(SDS)，是离子型去污剂，部分由于其在细胞内使大分子增溶和使蛋白变性的能力而常用于法医DNA提取程序(J.L.Haines et al(2005)CurrentProtocols in Human Genetics Vol.2,(2005John Wiley and Sons,Inc.Pub.)。蛋白酶K通常与基于去污剂(例如SDS、Tween-20、Triton X-100)的溶解程序串联使用，以有利于细胞溶解。去污剂溶解的另一种形式基于FTA纸(美国专利第6,958,392号)。这是用弱碱、阴离子去污剂、螯合剂和防腐剂浸渍的纤维素过滤器。
离液剂诸如盐酸胍也可以作为有效的样品溶解剂起作用，方便地，这些也允许用于如下文进一步讨论的纯化核酸的手段。
另一个溶解方法是使用高温来破碎打开细胞/病毒。这一物理方法的好处是需要非常简单的硬件(只是加热块或水浴)。高温可以与其他化学溶解试剂相结合使用以提高难以溶解的细胞诸如某些革兰氏阳性细菌和孢子的溶解效率。化学溶解和高温溶解方法的好处在于它们特别有效地使得可降解感兴趣的核酸的核酸酶失活。此外，它们使得可损害NAAT中使用的酶的蛋白酶失活。
NAAT抑制剂
NAAT的开发与利用受到对NAAT的进行起到负面作用的各种各样的物质的显著并且有害的影响(参见，例如对各种抑制剂问题的综述“Capacity of Nine Thermostable DNA Polymerases To Mediate DNAAmplification in the Presence of PCR-Inhibiting Samples,Appl.Environ.Microbiol.October 1998vol.64no.103748-3753”)。样品抑制剂是来自血液的血红素、植物和土壤中存在的腐殖酸、多酚类、某些二价金属和胶原蛋白。因为几乎所有的生物样品均含有NAAT抑制剂，显然，在进行NAAT之前处理样品以便去除或减少抑制剂水平是必要的。这对于某些复杂并且非均质的基质诸如具有非常高的抑制性物质负载的排泄物来说尤其如此。
抑制剂去除
NAAT抑制剂的去除或减少可以通过以下来实现：i)分别使用核酸和/或抑制剂的某些特性主动从抑制剂分离核酸；ⅱ)稀释样品以使得抑制剂的浓度在对所采用的NAAT有不利影响的浓度之下；或iii)添加中和抑制剂的抑制作用的液相添加剂。
例如，Chelex-100(Bio-Rad,Hercules,CA)是有效结合可以抑制NAAT的多价金属阳离子的改性树脂(Walsh P.S.et al.，Chelex 100as a mediumfor simple extraction of DNA for PCR-based typing from forensic material.Biotechniques 10(4):506-13)。
聚乙烯聚吡咯烷酮(PVPP)是不溶的高度交联的改性聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，已用于在DNA提取过程中去除多酚类，诸如腐殖酸(HolbenW.E.,Jansson J.K.,Chelm B.K.,Tiedje J.M.(1988)DNA Probe Method forthe Detection of Specific Microorganisms in the Soil Bacterial Community.Appl.Environ.Microbiol.54(3):703–711)。
我们已经鉴定了对于排泄物抑制剂去除有用的一系列离子交换树脂。这些包括但不限于Optipore SD-2(Dowex)，用于脱色的胺化的苯乙烯-二乙烯基苯树脂和Diaion WA30(Mitsubishi Chemical)，一种弱碱性的高度多孔性的阴离子交换树脂。我们已经发现，这些树脂可在从排泄物溶解物去除NAAT抑制剂时替代PVPP。活性炭是可用于去除NAAT抑制剂的另一种材料。优选地，活性炭应是不能穿过用于保持其的釉料或过滤器的形式，例如，活性炭可以是大颗粒或小珠的形式。通常，可以选择树脂和釉料或过滤器的组合，以使得釉料或过滤器不会逐渐被树脂堵塞，同时保留所使用的树脂或其它固相材料。
一种可替代的方法是使用尺寸排阻层析从低分子量的NAAT抑制剂分离高分子量核酸。例如来自GE Heathcare的illustra MicroSpinTMG-25旋转柱可以用于这一作用。
虽然也许对于NAAT抑制剂来说最简单的方法是将样品简单地稀释至抑制剂浓度过低而不能对特定NAAT的产生不利影响的点，但是这具有同时稀释样品中任意核酸的缺点。因此，当核酸可能受到限制时(诸如在病原体检测中)，稀释方法可能会导致在基于NAAT的实验中获得的假阴性结果。在某种程度上，稀释方法可以通过添加中和某些酶抑制剂的液相试剂来改进。例如，也可以将EDTA添加至样品以结合某些抑制性的二价金属(例如Ca2+)并使得其对于NAAT来说无效用，并且在这样做的同时，减少允许NAAT使用而必需的样品稀释的量。事实上，对于有待通过NAAT检测的生物体的量处于非常高水平的某些临床应用来说，样品可以使得如果抑制剂浓度太低而不能抑制扩增，而反应中存在的靶标的量足以可重复性检测，则可以在含有EDTA的缓冲液中将样品稀释一倍。然而，在非常抑制性的样品类型(例如人类排泄物)中，常常需要500倍数量级的稀释系数，甚至与EDTA一起，以将降低抑制剂水平至可以使用NAAT的点；所以显然这种做法是不理想的，因为这么大的稀释肯定会影响基于NAAT的测试的灵敏度。另外，过量的EDTA如果带入基于NAAT的检测那么其本身对NAAT来说也可以是抑制性的，因为EDTA可螯合DNA/RNA聚合酶所需的作为辅因子的Mg2+。
核酸纯化
当样品制备涉及特别纯化核酸时，这两种都去除NAAT抑制剂，但也可以从样品浓缩核酸。
在这一方法中，核酸的独特特性用于被将它们与样品的其他组分(包括抑制剂)分开并使得核酸能够被浓缩到所选择的缓冲液中。这具有增加基于NAAT的测试的灵敏度的显著优点。例如，如果来自于1ml血液所含有的HIV的核酸可以被浓缩为仅20μl，那么这可以在样品制备之后提供HIV核酸浓度高达50倍的增加：这可能在检测HIV的特定NAAT之间产生差别或者未产生差别。
最早的核酸纯化方法之一是使用苯酚/氯仿萃取(D.M.Wallace(1987)Large and small scale phenol extractions.Methods Enzymol.152:33-41；Maniatis,T等人，"Purification of Nucleic Acids"in Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd Ed.Cold Spring Harbor Laboratory,Cold SpringHarbor,NY)。在这一方法中，大部分的蛋白质转移到有机相中或者有机-水界面，而溶解的DNA留在水相中。可以使含DNA的相可以经受乙醇沉淀，并在一系列离心和洗涤步骤后DNA分离。有机萃取法的优点在于，它产生高质量的DNA制备物(具有相对低量的蛋白质和相对低的降解)，并且至今仍然是最可靠的方法之一。主要的缺点在于，这一过程耗时耗力，使用危险的溶剂和试剂，需要笨重的设备并且相对难以适应高通量环境，并且当然不适合于病人近旁测试或供不熟练的操作人员使用。
核酸纯化的可替换方法是与离液剂相结合使用二氧化硅(Boom,R.etal.,(1990)"Rapid and Simple method for purification of nucleic acids,"J ClinMicrobiol.28(3):495-503)。离液剂对溶解细胞/病毒均起作用但也起到导致核酸结合硅颗粒的作用。核酸随后可以使用低离子强度缓冲液(或水)从二氧化硅洗脱。Boom方法广泛形成了许多溶解/纯化方法(例如DNAIQSystems,Promega,Madison,WI)的基础。硅珠的可替换方案是使用硅胶膜(QIAamp,Qiagen Hilden,DE)。此外，硅珠自身可以被改性以进一步增强DNA结合。
可替换的基于电荷的方法是使用离子交换树脂。将含有DNA和其他大分子的溶液暴露于离子交换树脂。在给定的盐浓度或pH值，带负电荷的DNA(由于其磷酸主链)相对强地结合到树脂。蛋白质、碳水化合物和其它杂质相对弱地结合(如果有的话)，并从珠清洗掉(例如，以柱的形式或通过离心)。然后纯化的DNA可以在高离子强度缓冲液中洗脱。如今使用的商业上可获得的阴离子交换树脂基于DEAE-改性的硅珠(Genomic-tip,Qiagen)。
与离子交换树脂方法相关的方法是使用在给定的pH下具有净正电荷并且能够结合DNA的改性的固体基质(Baker,M.J.，美国专利第6,914,137号)。所述改性含有可电离基团，使得DNA结合在较高pH值时被逆转(当可离子化基团是中性或带负电时)。广泛使用的这种类型的方法基于ChargeSwitch珠(Life Technologies,Inc.Carlsbad,CA)。
寡核苷酸捕获
靶核酸也可以通过使用捕获寡核苷酸来分离。在该方法中，将样品核酸和与靶标中互补靶序列杂交的捕获寡核苷酸一起孵育。之后将杂交的靶标-捕获寡核苷酸络合物从溶液取出，并洗涤以去除杂质。这既可以通过配体-受体相互作用诸如生物素-链霉亲和素来实现，其中捕获寡聚物寡核苷酸是生物素化的并且可以多种形式使用，包括磁珠，包被的管等。之后，可以将捕获的靶标直接加至扩增反应。使用寡核苷酸捕获的实例是APTIMA HIV测定(Gen-Probe)。
免疫磁性分离(IMS)
特定的细胞类型也可以使用与针对它们的特定表面抗原决定簇的顺磁性颗粒结合的抗体来分离。靶细胞/病毒通过应用磁场从样品中去除并添加至对生物体的检测测定。利用IMS的实例是通过Pathatrix系统(MatrixMicroScience Ltd)检测沙门氏菌(Salmonella)。(Odumeru J.A.,&Carlos G.León-Velarde C.G.(2012)Salmonella Detection Methods for Food and FoodIngredients.于Salmonella-A Dangerous Foodborne Pathogen中,Barakat S.M.Mahmoud编辑，InTech,Rijeka,Croatia.)
磁珠
本领域技术人员应认识到，磁珠或颗粒可用于ChargeSwitch、寡核苷酸捕获和免疫磁性分离。Boom法也可以使用含有二氧化硅和磁性氧化铁两者的磁性颗粒或磁珠来实施(Berensmeier S.(2006)Magnetic particles forthe separation and purification of nucleic acids.Appl.Microbiol.Biotechnol.73(3):495-504)。磁性颗粒Boom提取的实例是NucliSENS系统(bioMérieux)。
样品制备程序质疑
所讨论的核酸纯化/浓缩的三个方面即样品制备、提取、抑制剂去除，难免造成多步骤过程。所述过程中的每个步骤增加了时间和精力，并导致复杂性、成本和操作失差。即使对于拥有训练有素的操作者的专业实验室来说，现有样品制备方法的复杂性意味着人工方实在太繁琐而难用，并且因此需要某种形式的自动化。
远离专业实验室，可能没有基础设施或熟练的操作人员进行样品制备。为了满足这一需求，已经引入使样品制备能够离散自动化的技术，从而使NAAT检测可以由非专业用户来进行。然而，这些方法需要复杂且昂贵的耗材，所述耗材在对寻求昂贵的样品制备方法有经济限制的某些环境中不能使用。
已经开发了各种实验室机器人仪，用于核酸的部分自动化纯化。例如，设计了Maxwell 16仪器(Promega)、iPrep仪器(Life Technologies)、NucliSENS easyMAG(bioMérieux)和Qiagen EZ1，BioRobot M48和Qiacube系统(Qiagen)来从一系列临床和法医样品类型纯化核酸。这些系统中的一些在将样品装载到仪器上前需要一些人工预处理。Innuprep(analytikJena,Itzehoe,DE)、LabTurbo(Taigen,Taipei,TW)、Xiril 150(XirilAG,Hombrechtikon,CH)和Quickgene(FujiFilm Corp.,Tokyo,JP)提取系统都需要比上述全机器人系统更多的人工操作。
更完全自动化的系统已被用于临床和法医检测两者。最值得注意的是Cepheid(Sunnyvale,CA)GeneXpert系统，其用于对来源于排泄物拭子样品的艰难梭菌(C.difficile)进行DNA提取和实时PCR。然而，设备和单次测试两者的成本可能高得令许多组织望而却步。
使用压力制备样品
存在使用压力或压力差在隔间之间移动液体作为样品制备工艺的一部分的许多方法。例如，下面的文献描述了使用压力作为样品制备工艺的一部分的方法：
·GB2337261讨论了压力下使用多孔膜过滤从全细胞纯化核酸。
·JP 2005095003教导了用于通过由压力差使样品溶液通过来分离和纯化核酸的套盒(cartridge)。
·JP 2005118020教导了含有具有至少两个开口的核酸吸附多孔材料和在至少两个开口之间产生压力差的装置的套盒。
·US 20070269829讨论了包括加压装置并且包含经由固相连接的第一和第二容器部分的核酸分离仪器。
·US 2009/0023904教导了包括容器的套盒，所述容器具有至少两个开口并含有核酸吸附固相。将压力差应用于固相两侧。
·US 5804684教导将生物样品与核酸结合基质(悬浮液中的琼脂糖颗粒)接触，导致核酸沉淀；以及从基质洗脱。
·US 2008/0275228教导将液体喷射至用于分离和纯化核酸的套盒并且通过压力差使得液体通过核酸吸附固相。
·US 2009/0023201讨论了核酸检测盒和水溶性抗附聚有机化合物。
这些方法的优点在于它们能避免在样品制备工艺中使用设备诸如离心机。例如，压力可用于在装置周围移动液体以便促进样品制备。然而，这些方法的缺点在于仍然需要复杂的消耗品或泵来处理样品。
概述
样品制备是基于NAAT的检测的重要组成部分。取决于样品类型、抑制剂的水平和对浓缩样品中核酸的任何要求，样品制备可能是进行基于NAAT的检测的最繁琐和昂贵的部分。
为了那些没有专业设备或人员的那些人或买不起昂贵的自动化系统的那些人能够享受到基于NAAT的检测的益处，有对不昂贵的、可以由非专业用户进行并且无需精密硬件的更简单的方法的需要。虽然存在消除了对设备诸如机器人，离心机或真空歧管的需要而通过使用压力移动装置内液体来制备样品的方法，但这些方法仍然被复杂消耗品或产生压力差的硬件拖累。此外，利用低成本的、容易获得的物理方法产生样品制备物(尤其是高温)的方法还没有被充分利用。由于中温的产生极其容易，因此可以被热驱动但是仍然联合与样品制备相关的更精密的化学物质的样品制备方法可使得用于基于NAAT的检测的样品制备更容易地以较低的成本和简单得多的硬件实现。这样的样品制备方法会使得基于NAAT的检测在更具挑战性的环境例如资源匮乏的小诊所中能够进行。
优选实施方案的详细描述
本发明人已经发现，通过将容器加热至产生足以从容器洗脱液体的压力的温度来从密封容器洗脱液体是可能的。因此本发明提供使液体样品穿过多孔固体基质的方法，包括以下步骤：将液体样品密封在包含作为容器的至少一部分的多孔固体基质的容器中，并且升高温度以增加容器内部的压力，由此致使液体穿过所述多孔固体基质。通过使液体穿过多孔固体基质，至少部分液体可以从容器中去除。本发明的方法还允许将液体从容器转移至第二容器或器皿。
使用加热使得液体样品穿过多孔固体基质的工艺在本文中被称为“热洗脱”。
有利地发现，在低于110℃的温度下，可以生成足够的压力以使得液体穿过来自容器的多孔固体基质，即使使用各种不同尺寸的容器。这可以使用标准的塑料消耗品来实现，尽管在室温下容器中多孔固体基质的存在阻断液体流出容器。这种温和的温度和压力条件下都可以使用，意味着核酸在该工艺中不被损坏，也不存在取得足够压力的容器失效甚至爆炸的任何显著危险，也未要求极其高温的加热装置(>110℃)。因此，本发明提供了改进的样品制备的方法，尤其是在进行基于NAAT的检测之前。
本发明的方法的另一优点在于，与其它方法相比，进行样品制备所需的步骤(特别是液体转移步骤)的数目大大减少。例如，在使用可比结合核酸更牢固地结合NAAT抑制剂的多孔固体基质的实施方案中，操作者必须简单地
1)将样品转移到第一容器中，
2)进行热洗脱，并且
3)在NAAT测定中使用洗脱的核酸。
不需要额外的液体转移。此外，这可以仅使用容器本身和加热块来实现。不需要额外的离心分离机、泵或真空系统。这大大减少了进行样品制备所需的硬件基础设施，并且减小了样品制备工艺的复杂性，使得其可以容易地由非专业操作者进行。
可以将温度增加至高达110℃的温度。本发明人已经发现，将密封的容器加热至110℃产生足以使得液体样品穿过多孔固体基质的压力，无论容器的尺寸如何。也可以将温度增加至低于110℃的温度，例如低于100℃、低于90℃、低于80℃或低于70℃的温度。使液体样品穿过多孔固体基质的最低温度在不同容器之间可能是不同的，并且可以是例如至少40℃、至少50℃或至少60℃。一般来说，会将温度增加至高于室温的温度。精确的温度可容易地通过使容器经受增加的温度并且确立液体样品穿过多孔固体基质的温度来容易地实验确定。当所用的加热也将被用于溶解细胞或病毒衣壳时，那么足以溶解所述细胞或病毒衣壳的温度可以容易地实验确定。然而，通常至少90℃的温度是必要的。
根据本发明，可以使被加至容器的所有的液体样品穿过多孔固体基质。液体样品的原始体积的至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％或至少90％穿过多孔固体基质的方法也在本发明的范围之内。与被加至容器的液体样品的组成相比较，穿过多孔固体基质的液体样品可具有不同的组成。例如，与被加至容器的液体样品相比较，洗脱的样品可具有较低的NAAT抑制剂含量。
热洗脱可以通过使容器暴露于具有容器有待被加热至的温度的加热装置来实施。可选地，逐步增加容器中的热量直到已达到所需的温度也是可能的。更进一步地，容器可以经受辐射诸如微波或红外线。
当液体因由加热容器产生的压力而穿过多孔固体基质时，可以理解的是，根据本发明的热洗脱可以在没有另外的外力诸如离心或真空的应用(例如通过真空泵)的情况下进行。
根据本发明，容器将被密封。密封容器的方法是现有技术已知的。例如，容器可以使用盖子或塞子密封。可选地，通过熔融容器中开口的边缘，例如通过加热开口并将边缘压在一起，来密封容器也是可能的。当容器由塑料或其它的热塑性材料制成时这是特别适合的，因为加热开口并通过施加压力熔融开口的边缘将是非常容易做到的。这可以例如通过使用加热的夹爪(jaw)来实现。由于本发明的热洗脱的方法需要液体穿过多孔固体基质，因此可以理解的是，多孔固体基质的至少一部分或全部将不会被密封，否则液体将不能穿过。
本发明的方法可包括将液体样品加至容器的另外步骤。
容器
在本说明书的上下文中，“容器”是适用于热洗脱的器皿。
一般来说，容器包含作为容器的至少一部分的多孔固体基质。所述多孔固体基质可以布置成使得它与所述容器的内部和外部都是连通的。这使得当液体样品穿过多孔固体基质时，液体样品从容器的内部转移到外部。
所述多孔固体基质可以是容器的组成部分并且可以形成，例如，容器壁的至少一部分。多孔固体基质不形成所述容器的组成部分也是可能的。在这些实施方案中，容器将包括开口，而所述多孔固体基质将相对于所述开口定位，以使得多孔固体基质与所述容器的内部和外部都是连通的。
容器可以包括适合于将液体样品加至容器的一个或多个开口。根据本发明的方法，这些一个或多个开口需要被密封，以便密封容器内的液体样品。
“器皿”是适合于容纳液体但不适合于热洗脱的任何器皿。
多孔固体基质
容器应包含在室温(例如在18-22℃)下能将液体保留在容器内但在容器中的压力由于温度的增加而增加时允许液体穿过的至少一种多孔固体基质。
在一些实施方案中，容器包括仅一种类型的固体多孔基质。本发明的方法也可使用包含两种或更多种不同的多孔固体基质的容器来实施。例如，所述容器可以包括第一多孔固体基质和第二多孔固体基质。第一多孔固体基质优选在容器被加热之前将液体保留在容器中。第一多孔固体基质可以是过滤器。第二多孔固体基质可以是与结合核酸相比更牢固地结合NAAT抑制剂或者与结合NAAT抑制剂相比更牢固地结合核酸的基质。第二多孔固体基质可以在加入液体之前加至容器和/或它可以与液体预先混合并与液体样品一起加至容器。第二多孔固体基质可以是珠的形式，例如磁珠。
多孔固体基质可以是过滤器。多孔固体基质(尤其是当使用多于一种类型的基质时的第二固体多孔基质)可以是与结合核酸相比更牢固地结合NAAT抑制剂或者与结合NAAT抑制剂相比更牢固地结合核酸的基质。这种多孔固体基质是优选的，因为本发明的方法之后可起到从核酸除去核酸扩增抑制剂的作用，或者相反，它们可起到从样品纯化和/或浓缩核酸的作用。
在这方面，多孔固体基质需要与结合核酸相比更牢固地结合至少一种核酸扩增抑制剂，或反之亦然，以便适于在本发明的方法中使用。多孔固体基质是否比结合核酸更牢固(或更少)地结合核酸扩增抑制剂，可以通过使包含核酸扩增抑制剂和核酸的样品与基质接触并从基质分离液体来确定。如果与所分离的液体中核酸的相对减少相比抑制剂相对减少更高，则基质更牢固地结合抑制剂。
多孔固体基质可以是树脂的形式或珠的形式，例如磁珠。
去除NAAT抑制剂
当多孔固体基质与结合核酸相比更牢固地结合核酸扩增抑制剂，所期望的核酸将被优先从基质洗脱。本发明人已经令人惊讶地发现，本发明人可以更有效地去除NAAT抑制剂，只要
i.所述多孔固体基质与液体样品一起加热而不是在室温下单独混合，和
ii.液体样品包含从多孔固体基质分离的未结合的核酸，尽管基质和液体仍然被加热。
提高去除NAAT抑制剂的能力仅需要如上文所述加热，而不依赖于归因于由加热生成的压力的洗脱。
因此，本发明提供了从包含核酸和核酸扩增抑制剂的液体样品纯化核酸的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)将样品与与结合核酸相比更牢固地结合核酸扩增抑制剂的多孔固体基质接触，其中将加热应用于多孔固体基质和液体样品；和(b)从多孔固体基质分离包含未结合的核酸的液体样品。
在根据本发明的这一方面的方法中，可以理解的是，所述方法应在NAAT抑制剂中的至少一些结合多孔固体基质而核酸中的至少一些不会结合多孔固体基质的条件下进行。合适的条件是本领域技术人员已知的。
加热可应用于步骤(b)。
本发明的这一方面的方法可以使用包括作为容器的至少一部分的多孔固体基质的容器，使用本发明的热洗脱来实施。因此，所述方法可以包括将液体样品密封在容器内并升高温度以增加容器内压力从而使液体穿过多孔固体基质的步骤。
已经显示，与离心相比，由热洗脱生成的温和压力意味着较少的抑制剂离开多孔固体基质相材料。事实上，如果用离心使液体穿过多孔固体基质，那么第二器皿中存在的核酸样品将包含比使用热洗脱时更多的核酸扩增抑制剂。此外，改进的抑制剂去除意味着样品制备的总稀释倍数可以被减少。因此，本发明的方法并不要求与未利用上文原理i)和ii)的方法一样多的原始样品稀释。
压力洗脱的力未高至产生使用离心柱方法时见到的对基因组DNA的显著剪切。因此，有关样品DNA分子中靶区域将因剪切而中断并因此损害检测是不可能的。
优选地，液体样品从多孔固体基质分离，而液体样品的温度仍然大于60℃，更优选地大于70℃，甚至更优选地大于80℃，最优选地大于90℃。可以将步骤(a)中的样品和基质加热1-10分钟。
几种类型的多孔固体基质，包括离子交换树脂，已经发现起到本发明的这一方面的多孔固体基质的作用。这些树脂能够遮蔽一种或多种NAAT抑制剂。这些多孔固体基质包括但不限于含有亚氨基二乙酸的苯乙烯二乙烯基苯共聚物(诸如Chelex 100-Bio-Rad)，PVPP(聚乙烯吡咯烷酮)，聚苯乙烯-碱二甲胺基树脂(Polystyrene-Base Dimethylamine based resins)(Diaion WA30-Mitsubishi Chemical)，具有叔胺官能团的大孔苯乙烯二乙烯基苯共聚物(Optipore SD2，Dowex)和由具有叔胺官能团的苯乙烯-二乙烯基苯基质组成的高度多孔的弱碱性阴离子交换树脂(SDVB树脂家族)。也可使用活性炭。这样的基质可以单独或相互组合使用。应当理解的是，本领域技术人员将能够筛选使用本发明的方法将获得从特定样品基质中最好地去除NAAT抑制剂的基质或基质混合物。
某些基质，诸Chelex 100，已知螯合二价金属离子，其他基质诸如PVPP已知结合抑制剂多酚化合物。应当理解的是，本领域技术人员会筛选与对核酸的亲和性相比对NAAT抑制剂具有较高的亲和性的基质，以使得热洗脱之后核酸与NAAT抑制剂分离。例如，对于从人排泄物检测艰难梭菌(Clostridium difficile)DNA，本发明人已经发现，下列树脂组合对去除NAAT抑制剂而不结合艰难梭菌DNA特别有效，使得在热洗脱之后方便地存在于第二器皿中，所述热洗脱为1.9ml反应溶液中的10％v/v Chelex100、25％v/v Optipore SD-2和25％v/v Diaion WA30。
NAAT抑制剂是本领域已知的，并且包括，例如来自血液的血红素、植物和土壤中存在的腐殖酸、多酚以及某些二价金属诸如钙，或胶原蛋白。
根据本发明的这一方面纯化的核酸可以直接加至NAAT试剂以进行NAAT分析。洗脱的核酸还可以在进行NAAT测定之前被进一步处理。例如，核酸随后可浓缩和/或转移到不同的缓冲液中。合适的浓缩方法是本领域中熟知的。
核酸捕获策略
当多孔固体基质与结合NAAT抑制剂相比更牢固地结合核酸时，热洗脱之后核酸优先保留在容器中的基质上，而NAAT抑制剂优先与液体样品一起穿过多孔固体基质。因此，本发明提供了使用包括作为容器的至少一部分的多孔固体基质的容器从液体样品纯化核酸的方法，其中所述方法包括以下步骤：将液体样品密封在容器中，并且升高温度以增加容器内部的压力，由此致使液体穿过所述多孔固体基质，其中所述多孔固体基质与结合核酸扩增抑制剂相比更牢固地结合核酸。
应理解的是，使用这样的多孔的固体基质，核酸中的至少一些将被多孔固体基质保留，而液相，包括NAAT抑制剂中的至少一些，将在很大程度上或完全地洗脱。随后，进一步处理被多孔固体基质保留的核酸以使它们可用于NAAT可能是必需的。这可以通过以下方式进行，例如，打开容器，并加入会从所述多孔固体基质洗脱结合的核酸的缓冲液，并进行热洗脱以将所结合的核酸中的至少一些或所有从所述多孔固体基质洗脱至器皿中。所述器皿含有可以在NAAT测定中使用的所洗脱的核酸。
可用于本发明的这一方面的固相材料的实例包括二氧化硅(经由基于Boom的提取工艺)、Charge-Switch珠、寡聚物捕获珠和离子交换树脂/珠。
当多孔固体基质被用于捕获和/或浓缩核酸时，本发明降低了样品制备工艺的复杂度。热洗脱之后，所有的液体样品可以被转移至第二个容器或器皿中，这一事实意味着核酸可以从容器洗脱或取出，同时来自原始液相的污染(含有抑制剂)最小，这使得样品的进一步处理更容易。在某些情况下，可将洗脱缓冲液在初始热洗脱步骤之后直接加至多孔固体基质，以便从基质洗脱结合的核酸，以使得核酸可以立即加至NAAT试剂。应理解的是，对于某些NAAT来说(特别是在使用生物发光性报告系统时，诸如WO2004/062338中所描述的)，当这些方法耐受这些固相材料时，可将具有所结合的核酸的多孔固体基质直接转移至NAAT试剂中。
可选地，进行第二热洗脱步骤以从多孔固体基质洗脱至少一些核酸或全部核酸是可能的。这方便地允许方便使用相同原理对样品进行进一步的处理。
液体样品
根据本发明，穿过多孔固体基质的样品是液体样品。术语“液体样品”不排除可以包括一些固体组分的样品，但应该理解的是样品的大部分体积(例如，至少70％、至少85％、至少95％或至少99％)是液体。
液体样品可以来源于本身是液体样品的起始样品，诸如例如血浆或尿。可在其上进行NAAT和液体样品可能来源于其的起始样品，还可以是固体或半固体样品。例如，样品可以是排泄物样品、食品样品或组织样品。对于这样的样品，固体或半固体样品可在引入到容器中之前与适合的缓冲液混合以提供液体样品。可选地，固体或半固体样品可以加入到已经预先装载适合的缓冲液的容器，由此产生液体样品。固体或半固体样品也可以在引入容器之前与适合的缓冲液混合，并且随后与容器中预先装载的第二适合的缓冲液(或相同的缓冲液)混合。
起始材料也可以是可被直接加至容器的液体样品。液体样品可以在引入根据本发明的方法的容器中之前与适合的缓冲液混合。可选地，液体样品可以加至已经预先装载适合的缓冲液的容器中。液体样品也可以在引入容器之前与适合的缓冲液混合，并且随后与容器中预先装载的第二适合的缓冲液(或相同的缓冲液)混合。
在本发明的方法中，多孔固体基质可以预装载在容器中，或与样品本身一起或在样品本身之后引入容器中。多孔固体基质可以是树脂或珠的形式，诸如磁珠的形式。
液体样品可包含将样品制备和/或核酸纯化的有效性最大化的缓冲器。适合的缓冲液可以包含可以例如保护核酸不被降解，有利于样品制备和/或使得样品制备与随后使用的NAAT试剂相容的组分。例如，缓冲液可包含为抑制性去除剂的EDTA或牛血清白蛋白。它也可以包含可有利于样品溶解并且能够使酶诸如核酸酶失活的一种或多种蛋白酶。它也可以含有有利于样品制备和随后的核酸扩增两者的去污剂或盐(诸如KCl)。缓冲液还可以配置为保持液体样品的pH值在对样品制备来说有用的pH值，例如4.5-9.5的pH值或约8的pH值。
样品溶解
在本发明的方法中所用的加热也可以起到溶解容器中样品并以此制备可用于随后基于NAAT的检测的核酸的作用。因此，本发明的方法可以包括溶解样品的步骤。当液体样品包含细菌(诸如产芽孢细菌)和/或病毒时，溶解步骤是特别优选的，因为细菌或病毒的溶解也可以使得所述细菌或病毒变为非感染性的，并因此成为本发明的方便的安全特征。加热溶解样品的有效性可以通过加入其它试剂和/或通过某些固相材料来显著增加。例如，EDTA和Chelex已显示因掩蔽稳定脂质双层的二价离子而有利于细胞膜溶解(Brown,T.A.(1995)Gene cloning:an introduction.第3版.Chapman&Hall)。
本发明的方法还可以与在液体样品加入容器之前已经被溶解的液体样品一起使用。这对于仅加热难以溶解的样品特别有利。例如，对某些产芽孢细菌，首先用机械方法打破孢子可能是有利的。用于溶解样品的手段是本领域已知的，并且包括例如超声处理、机械均质化(例如，通过使用搅拌机，强制细胞通过限制性开口或在各种珠存在的情况下剧烈搅拌)和化学破碎，例如通过使用去污剂(诸如十二烷基硫酸钠(SDS)，任选与蛋白酶诸如蛋白酶K组合)或离液剂(诸如盐酸胍)。
当将热洗脱工艺的洗脱液直接加至NAAT试剂时，所洗脱的液体充分冷却也以便不对NAAT试剂产生不利影响，可能是重要的。当使用其中所用的酶中的一些不能耐受较高温度的等温NAAT时，这是特别重要的。例如，对于一些NAAT而言，诸如基于核酸序列的扩增(NASBA)和滚环扩增(RCA)，样品的温度必须低于50℃或甚至低于40℃，以便使NAAT工作。使用链置换聚合酶诸如Bst聚合酶或相关聚合酶的NAAT而言，例如，环介导等温扩增(LAMP)或链置换扩增(SDA)，样品的温度必须低于90℃、80℃、70℃或甚至60℃，以便使NAAT工作。因此，在本发明的一些方面中，将洗脱的样品与NAAT试剂混合之前，将液体样品冷却到低于90℃、低于80℃、低于70℃、低于60℃、低于50℃或甚至低于40的℃温度。
热洗脱之后，可以将液体样品洗脱至第二容器或器皿中，其中所述容器或所述容器器皿处于与用于热洗脱的容器大致相同的温度，使得热洗脱之后所洗脱的液体保持是热的。第二容器或器皿也可以处于比所述第一容器低的温度。例如，温度可以相差高达100℃，例如其中器皿保持在4℃，以帮助防止所洗脱的核酸降解。
容器或器皿也可以在热洗脱之后主动冷却。
洗脱的控制
这些方法涉及溶解容器中样品时，加热样品一段足够长的时间至足够的温度，以便样品溶解的物理过程发生，这是很重要的。同样的，洗脱发生前，必须有足够长的时间以便溶解的样品与所提供的固相物质相互作用。
因此，本发明人已经意识到，必须控制液体样品从容器的洗脱速度，以使得液体样品在处于所需温度下在容器中度过足够量的时间。这可以通过限制来自容器的液体的流动来实现，它可以通过各种手段完成。因此，在本发明的一些方面中，容器将包含限流器，其配置为与没有限流器的容器相比减少来自容器的液体穿过多孔固体基质的流动。特别是，与没有限流器的容器相比，这样的限流器可以减少在容器被加热至高于室温的温度(例如40℃以上或50℃以上)时来自容器的液体穿过多孔固体基质的流动。限流器可以通过在对容器应用加热时允许恒定的但有限的液体流动穿过多孔固体基质来起作用。这样的限流器的合适的实例是过滤器和釉料。限流器可以可逆地密封多孔固体基质。在本发明的这一方面中，密封将在液体样品可以从容器洗脱之前去除。这可以通过例如，可由机械、磁性或电力控制系统驱动实现。限流器也可以是在高于室温但低于110℃例如在45℃和110℃之间，在55℃和110℃之间或65℃和110℃之间的温度融化的材料层，适合的材料是热塑性聚合物或蜡(即化在45℃以上熔化产生低粘度液体的化合物)，例如固体石蜡。
核酸扩增技术
本发明的方法可用于制备用于任何NAAT的样品。因此，当已经组合使用已知为环介导等温扩增(LAMP；notomi et al.,Nucleic Acid Research,2000,28；E63)与已知为BART的生物发光报告系统(Gandelman et al.,Public Library of Science,November 2010,Volume 5,Issue 11,e14155)特别示例说明本发明时，可以理解的是所述方法不限于这一NAAT。例如，本发明人已经证明，根据本发明制备的核酸样品也可以用于众所周知比LAMP对抑制剂更敏感的聚合酶链式反应(PCR)。本发明的方法也可用于制备用于其他NAAT诸如模板重引发扩增(TRA)、自扩张扩增(SEA)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)和智能扩增过程(SMAP)的样品。
另外的热洗脱步骤
根据本发明的热洗脱可以重复一次以上，例如两次、三次、四次、五次等等。当热洗脱进行一次以上时，这可以通过将液体应用于与第一热洗脱步骤所用的相同的容器来完成。为了纯化液体样品中的所有核酸这可能是必要的，例如当液体样品的总体积超过容器的体积时。当期望在核酸已经结合至多孔固体基质后清洗所述多孔固体基质时，它也可能是必要的，或者应用洗脱缓冲液以便基质洗脱结合的核酸可能是必要的。在这些方法中，当需要收集的洗脱的液体时，可以使用另外的容器或器皿。
当进行一次以上热洗脱时，也可以使用一个以上的容器来实施。例如，可以将来自第一容器的液体洗脱至第二容器。之后可以密封第二容器，并且提高温度以增加容器内部的压力，从而致使液体穿过多孔固体基质。来自第二容器的洗脱液体之后可被丢弃、收集于器皿中或转移到第三个容器中。当使用两个、三个或多个容器时，它们可以被同时、先后或依次加热以将液体样品在容器间转移，以便在单次消耗中将一些样品制备工艺自动化。当容器被同时加热时，使用具有壁厚不同的容器以使得容器中的样品和基质在不同时间点达到所需要的温度是可能的。
在一些方面中，通过热洗脱从容器中洗脱的液体样品(无论这是具体样品制备工艺中的第一、第二、第三还是更多次热洗脱)可以直接与所提供的容器中的NAAT试剂组合而不需要额外的液体处理步骤(例如，移液步骤)来将处理过的样品转移至NAAT试剂。
以这种方式，可以预期，单个设备包含两个或更多个容器，从而操作者只需要将样品引入一个容器来进行整个样品制备工艺，包括将处理过的样品与NAAT试剂混合。这样的设备会具有不需要复杂的泵和离心机来将液体从一个容器移至另一个容器的显著益处：可使用简单的加热系统。
设备
如上文所讨论的，本发明特别适用于使用本发明的方法以自动设置纯化核酸。因此，本发明提供了适于根据本发明的方法纯化核酸的设备。例如，本发明提供了一种用于纯化核酸的设备，包括(a)包含作为容器的至少一部分的多孔固体基质的容器和用于密封容器的工具，和(b)配置为将容器加热至高达110℃的温度的加热元件。所述设备可以进一步包括第二容器以接收穿过多孔固体基质的液体。此外，或可选地，它也可以包括包含用于核酸扩增的试剂的器皿。
本发明的设备使得能够从样品自动纯化核酸，这能够大大促进样品制备。特别是，在设备还包含含有用于核酸扩增的试剂的器皿的实施方案中，本发明的设备具有操作者仅需要将样品加至所述设备的优点，因为所有的后续步骤都可以自动进行。因此，样品可以被处理并扩增，而在将样品加至容器和记录扩增本身的输出之间没有人工干预。
设备中的容器可以包含与结合核酸扩增抑制剂相比更牢固地结合核酸或与结合核酸相比更牢固地结合核酸扩增抑制剂的多孔固体基质，如上文详细讨论的。
设备可以包括两个或更多个(例如两个、三个、四个、五个、六个或更多个)容器。多孔固体基质在设备的所有容器中可以是相同的。它们也可以是不同的，这在基质捕获NAAT抑制剂的实施方案中可能是有利的，因为之后具有以不同强度结合不同抑制剂的基质将是可能的，这可以改进抑制剂的去除。当不止一个容器存在于本发明的设备中时，优选的是，可以将每一个容器通过加热元件加热至高达110℃的温度，因为之后这些另外的容器中的液体可仅通过加热来转移。设备可以包括一个加热元件或不止一个加热元件。设备中的两个或更多个容器可以以不同的速率加热和/或加热至不同的温度。
当设备包含不止一个容器，或一个或多个容器和器皿时，容器可定位在设备内，使得从一个容器洗脱的液体直接滴入另外的容器或器皿的开口中。通过通路诸如管转移液体也是可能的。如果另外的容器将被用于本发明的热洗脱，则管可以包含，例如，使得容器能够在其被加热之前被密封的阀。
根据本发明，来自容器的液体会通过加热穿过一个或多个容器中的多孔固体基质。因此，优选的是，本发明的设备将不包含使液体穿过容器的多孔固体基质所需的离心机或泵。
优选的是，本发明的设备包括包括NAAT所需的试剂中的至少一些或优选地全部试剂的器皿。器皿可以使得从容器洗脱的液体直接加至包含NAAT的器皿的方式定位在设备内。本发明的设备适于与所有的NAAT一起使用，包括但不限于PCR和LAMP。NAAT所需的试剂是本领域已知的，并且包括例如一种或多种引物、缓冲液、聚合酶和核苷酸(诸如dNTP)。
通则
与数值x相关的术语“约”是可选的并且意指，例如X±10％。
术语“包含”涵盖“包括”以及“由...组成”，例如“包含”X的组合物可以仅由X组成或可以包括其它物质例如X+Y。
术语“一个/种(a)”或“一个/种(an)”意指“一个/种或多个/种”。
除非特别说明，包括混合两种或更多种组分的步骤的工艺不要求任何特定的混合顺序。因而组分可以以任何顺序混合。当有三种组分时，那么两种组分可以相互组合，并且之后该组合可与第三组分组合，等等。
BART是指用于确定样品中存在的模板多聚核酸的量的方法，其中来源于扩增反应的无机磷酸盐的存在被检测到并指示样品中模板多聚核酸的量。
现在将通过实施例的方式更详细地描述本发明的各个方面和实施方案。应当理解的是可以进行细节的修改而不脱离本发明的精神和范围。
附图说明
图1：图1a显示将液体试样加至包含另一个密封开口的容器的原理；密封引入了液体的容器的开口；打开抵制液体流出这一第一容器的某种过滤器另一侧上的容器的出口；将第一容器放在能够从所述容器收集洗脱液的收集器皿内；将所述容器和所述器皿放在加热块中并随后将液体从容器转移至所述器皿。
图1b，如同1a，但容器有含有优选结合NAAT抑制剂而不是核酸的固相材料。热洗脱后核酸溶液存在于器皿中。
图1c，如同1b，但在加至容器之前，混合固相材料和样品。
图1d，如同1a，但容器具有含有优选结合核酸而不是NAAT抑制剂的固相材料。第一器皿内进行热洗脱之后，将核酸固定在固相材料上。
图1e，如同1d，但在被加至第一器皿中前混合固相材料和样品。
图1f，如同1b或1c，但所洗脱的核酸随后使用优选结合核酸的不同的固相材料来浓缩。在这种情况下，固相材料由可以使用磁体从样品沉降的顺磁珠组成。核酸可以用适合的洗脱缓冲液从所述材料释放，否则，可将珠直接加至基于NAAT的检测。
图2显示如实施例1中所述第一器皿中加上和减去固相材料的两个器皿之间的热洗脱的数据。
图3显示用于稀释系列靶核酸的典型的BART-LAMP法的输出。使用BART技术，阳性样品获得随时间增加但之后减小的光强度。到达光峰值的时间与扩增反应中存在的靶核酸的量成反比。
图4比较用于从ISO巧克力浓缩物去除抑制剂的加热和未加热IM-SDVB。
图5使用4°SDVB和3°SDVB从咖啡浓缩物去除NAAT抑制。与不使用树脂或使用树脂IM-SDVB(a)相比，树脂4°SDVB(b)和3°SDVB(c)显示在去除速溶咖啡所造成的抑制上极为有效。
图6在100℃的热块上随着加热时间的通过树脂混合物的腐殖酸抑制去除(a)；在100℃的热块上随树脂混合物的加热时间的温度概况(b)。
图7随着来自设定在100℃下的热块的热洗脱洗脱液的时间的温度概况。
图8通过热洗脱去除木聚糖抑制对比仅在缓冲液中稀释。
图9通过使用不同的釉料以及使用蜡调节洗脱时间。
图10显示通过以下方式提取的艰难梭菌(C.difficile)阳性排泄物样品之间的比较的艰难梭菌LAMP-BART反应的扩增概况：A)排泄物IMSDVB缓冲液混合物经由PVPP柱热洗脱或，B)负载有沸腾的排泄物IMSDVB缓冲液混合物的PVPP柱的纺丝洗脱和C)沸腾的排泄物IM SDVB缓冲液混合物的水旋澄清。
图11显示热洗脱排泄物提取物和离心洗脱的排泄物提取物的UV可视插入剂染色的1％琼脂糖的强度概况。
图12显示使用Pierce 8ml柱中专用树脂混合物和收集管提取艰难梭菌阳性排泄物样品和艰难梭菌阴性排泄物样品后的艰难梭菌LAMP-BART反应的扩增曲概况。
图13：(a)对照稀释方法，通过热洗脱由艰难梭菌阳性临床粪便样品(stool sample)进行艰难梭菌LAMP BART检测；
(b)对照稀释方法，通过热洗脱，来自艰难梭菌阳性临床粪便样品的抑制剂对照LAMP BART概况
图14：使用简化的磁珠方法比较浓缩前后艰难梭菌基因组DNA检测。
图15：使用热洗脱的多器皿样品制备和扩增的集成
图16：有和没有使用合并至第一器皿的磁珠进行热洗脱的艰难梭菌基因组DNA检测的比较。
实施例
实施例1：加热足以使用标准塑料消耗品和固相基质抗阻力驱动来自容器的洗脱液，证实热洗脱原理。
样品制备柱内的加热使得压力能够建立，这使得样品溶解物穿过柱基自我洗脱，并且不需要离心机或注射器的辅助来实现这些(图1)。这一特征示例于(a)小的0.8ml柱规模以及(b)较大的8ml柱上。
(a)用反应缓冲液中的专用树脂混合物填充0.8ml柱(Pierce#89688)至600μl的终体积，此时缓冲液的已占体积为327.5μl。紧闭盖子并分离(break off)扭动片(twist tab)。将柱放在2ml收集管中并且将全部的柱和试管置于95℃的加热块上10分钟。在此期间，压力已经在柱内建立，而逐渐驱动大部分的液体穿过柱基部进入收集管中。
(b)用反应缓冲液中的专用树脂混合物填充8ml柱(Pierce#89897)至3.4ml的终体积，此时缓冲液的已占体积为1.96ml。紧闭盖子并分离扭动片。将柱放在13.5mm内径的收集管(Fisher#FB51579)中，并且将全部的柱和试管置于具有80mm插入深度的定制加热块上。将其于100℃加热10分钟。在此期间，压力已经在柱内建立，而逐渐驱动大部分的液体穿过柱基进入收集管中。
为了确认，在产生抵抗洗脱的背压的固相和固相过滤器存在的情况下，中度加热可以经由热洗脱方法洗脱液相，在Chelex 100(Bio-Rad公司)存在的情况下，洗脱溶液。具体而言，按如下制备分子级水中Chelex100的10％悬浮液：将1.096g Chelex置于50ml烧杯中并加入10.96ml分子级水(Sigma)。其再加入小搅拌子之后于磁力搅拌器上搅拌。将800μl加至已经除去卡扣片(snap tab)的两个预先称重的Pierce 89868柱。将这些柱置于2ml收集管中，并以8000rpm离心1分钟以从柱中的Chelex树脂除去水。将250μl的分子级水加至这两个柱和另两个预称重的柱。将这些置于预先称重的2ml扣盖管中并置于100℃热块上或在室温下保持5分钟。5分钟结束时，将柱和洗脱液管称重，以确定洗脱液的体积和留在柱上的水的体积。仅保持在室温下的两个柱均未洗脱任何水，然而，两个加热的柱已经洗脱，从加热的Chelex柱上洗脱198.5μl而从只有水的柱洗脱226.4μl(图2)。
实施例2：BART报告系统
BART报告系统已经在WO2004/062338和WO2006/010948中进行了详细说明，其通过引用并入本文。BART是设计用于等温NAAT的报告系统的实例，其产生来自样品的单一类型的信号，一种生物发光信号。BART利用无机焦磷酸盐的萤火虫荧光素酶依赖性检测。这是在使用NAAT检测到“靶”序列时大量产生的。因此，分子诊断可以在均相测定中简单地用BART通过测量封闭管所发射的光来实现(图3)。BART由在50-63℃之间操作的多个不同的NAAT证明。BART报告是追踪NAAT的扩增速率的特别有效的手段，因为光输出表示扩增的瞬时速率的测量值(而例如荧光输出显示信号的积累，并且因此必须区分测量结果以获得扩增速率)。
实施例3：去除NAAT抑制剂的固相材料在它们于更高的温度被洗脱时(这随着热洗脱自然发生)表现更好。
ⅰ)固相树脂“3°SDVB”在不同温度下去除NAAT抑制剂的能力
将20μl的187.5ng/μl腐殖酸原液加至含有无3°SDVB树脂的580μl缓冲液和有20％的3°SDVB的580μl缓冲液的两组BART-LAMP反应缓冲液(190mM Bicine，pH 8.0)中。一组涡旋混合，然后在95℃加热5分钟，随后第二次涡旋。对照组涡旋并在室温下静置这一时间，然后再次涡旋。
20μl的每种上清液用于重构含有固定数量(104)的特定靶DNA分子(在本文中称作“抑制剂对照”)的冷冻干燥的BART-LAMP反应物。随后比较重复反应的峰值时间。抑制剂的存在可减缓或废止扩增，在这种情况下，峰值时间(BART报告系统产生特征光峰值所花费的时间)会分别共同增加或消失。这表明，在没有加热和没有树脂的情况下，具有腐殖酸的反应时间为59.7±0分钟。这在树脂存在时改善至57.0±0.5分钟，并在采用加热的树脂时进一步显著改善至38.4±2.1分钟。
ii)固相树脂“IM-SDVB”在不同温度下去除复杂NAAT抑制剂的能力。
测试巧克力的食品病原体的工艺包括，在含有缓冲蛋白胨水以及奶粉和染料艳绿的250ml富集培养基中孵育25g巧克力。孵育后发现这种富集培养基对NAAT是高度抑制的；这一培养基在本文中称为ISO巧克力富集物。抑制剂的特性是未知的。将两组ISO巧克力富集物的20μl样品加至1.5ml的离心管中的580μl的pH 8.8的20mM Tris缓冲液以及10％(w/v)IM-SDVB(由具有亚氨基二乙酸官能团的苯乙烯二乙烯基苯共聚物组成的阳离子交换树脂)，所述缓冲液含有10mM硫酸铵、0.15％TritonX-100、0.4mg/ml聚乙烯吡咯烷酮和0.09％叠氮钠。将这些脉冲涡旋。将一组巧克力样品管于110℃在加热块上加热5分钟。而将另一组在室温下保持同样的时间。5分钟后，两组管都被脉冲涡旋，使得能够冷却，并且来自每支管的20μl被用于在200μl的PCR条带中一式三份重构冷冻干燥的抑制剂对照BART-LAMP反应物。图4显示加热的巧克力富集物产生24.7±1.15分钟的平均峰值时间，这比32.8±1.61分钟的未加热的平均峰值时间快8.1分钟。同时运行的空白抑制剂对照产生18.9±1.00分钟的峰值时间。因此，在IM-SDVB中加热巧克力与未加热相比导致BART-LAMP抑制的减少。
iii)固相树脂“PVPP”在不同温度下去除NAAT抑制剂腐殖酸的能力。
200μl的PVPP悬浮液用移液管移至200μl的管中，其旋转沉淀以产生密实的PVPP床，并且除去100μl的过量液体。将100μl的1.25μg/μl腐殖酸加至PVPP床的顶部。加入物被涡流混合遍布PVPP。将三支管在95℃加热15分钟而三支管在室温下放置15分钟。5分钟后涡旋所有管被并放回至温度。取20μl至单独的PCR管，并且颗粒被旋转沉淀。PVPP上清液上的室温腐殖酸中的一些也在95℃下加热15分钟。将来自每支管的5μl加至15μl抑制剂对照BART-LAMP反应物。在95℃下加热的PVPP上腐殖酸、室温下PVPP上腐殖酸以及来自后者的上清液的抑制剂对照峰值时间分别是32.85±7.20分钟、47.63±8.17分钟和59.16±14.92分钟。这表明，加热的PVPP比室温PVPP去除更多的腐殖酸抑制剂，而加热来自室温PVPP提取物的腐殖酸上清液没有产生额外的抑制减轻。在这项研究中，具有水的未抑制的峰值在23.11±3.31分钟。
iv)在不同温度下固相树脂“4°SDVB”和“3°SDVB”去除复杂NAAT抑制剂的能力。
速溶咖啡可被证明含有强效NAAT抑制剂，因此，速溶咖啡是有用的抑制剂模型的代表。将速溶咖啡(1g)加至10ml缓冲的蛋白胨水并在37℃孵育18小时。将20μl的富集物加至580μl BART-LAMP扩增缓冲液的管中，所述缓冲液不含有树脂，含有10％的IM-SDVB、300μl的4°SDVB(由具有季胺官能化基团的苯乙烯二乙烯基苯基质组成的大孔强碱阴离子交换树脂)或300μl的3°SDVB(具有叔胺官能化基团的大孔苯乙烯二乙烯苯共聚物)。将所有的管涡旋并在110℃下加热5分钟。加热的管被脉冲涡旋并使之冷却。对每个条件一式两份加入20μl溶液中以在200μl的PCR条带中一式三份重构冷冻干燥的抑制剂对照BART-LAMP反应物。无树脂但具有IM-SDVB(图5a)、4°SDVB(图5b)和3°SDVB(图5c)的缓冲液中的咖啡富集物分别产生了45.3±8.3分钟、37.8±3.8分钟、19.7±0.8分钟和22.4±1.5分钟的平均峰值时间。因此，4°SDVB和3°SDVB两者都从咖啡富集物去除了抑制剂，从而与仅缓冲液中的咖啡富集物的28分钟延迟相比，允许抑制剂对照峰值比17.1±0.0分钟的水抑制剂对照峰值时间慢不超过6分钟。
v)抑制剂去除的温度依赖性
将九支2ml试管用溶于BART-LAMP反应缓冲液的特定树脂混合物(10％v/v Chelex 100、25％v/v Optipore SD-2和25v/v Diaion WA30)填充，其中缓冲液已占体积是633.2μl。向这些试管中的每一支中，加入21.8μl的187.5ng/μl腐殖酸原液并涡旋混合。将每支试管置于100℃的加热块上0、1、2、3、4、5、8和10分钟的时间点，之后将它们每一支从加热块移走，然后立即涡旋并且从所述树脂取出200μl上清液。在整个10分钟的加热中，也用热电偶每30秒监测另一支试管中的温度。另外两个对照分别具有655μl仅缓冲液(无抑制剂对照)和633.3μl中21.8μl腐植酸(抑制对照)的设置。将这些试管在热块上加热10分钟。来自每支的上清液被用于一式两份重构冷冻干燥抑制剂对照LAMP-BART反应混合物。这些在60℃运行并且在将所述时间过程中反应的峰值时间相比较。图6a中的数据表明，抑制剂去除有随加热时间的增加而增加的趋势，而在图6b中这与温度增加相关。通过5分钟的加热，证实了当所记录的树脂制剂温度达到93.4℃时，达到了最大的抑制减轻。抑制剂对照峰值时间从0分钟孵育的43.2±0.5分钟缩短至10分钟的加热后的19.7±0.5分钟。
同样制备了具有专用树脂混合物和腐殖酸的一组试管，作为不加热的对照，并在室温下孵育。0、1、2、3、4、5、8和10分钟的时间点之后，将它们每一个分别立即涡旋，并从树脂取出200μl上清液。来自每一个的上清液被一式两份用于重构冷冻干燥的抑制剂对照LAMP-BART反应混合物。这些在60℃运行并且将所述时间过程中反应的峰值时间相比较。由热电偶测得的树脂温度为22.7℃。在这些试管中，在0分钟孵育时的抑制剂对照峰值时间为49.0±1.0分钟。即使在10分钟孵育之后，峰值时间为44.2±2.7分钟，表明使用未加热的树脂时抑制上无显著降低，并确认加热的树脂在抑制剂去除上是更有效的。
vi)热洗脱的温度动力学
将8ml柱(Pierce#89897)用溶于BART-LAMP反应缓冲液的特定的树脂混合物((10％v/v Chelex 100、25％v/v Optipore SD-2和25％v/vDiaion WA30)填充，其中缓冲液已占体积为1.965ml。分离扭动片而将热电偶放入洗脱头。之后将柱放入13.5mm内径的收集管(Fisher#FB51579)并且将全部的柱和管置于具有80mm插入深度的定制加热块上。将其于100℃加热，并且3分钟后每30秒监测洗脱液的温度，从洗脱开始时进行10分钟。与最大抑制剂去除相关联的最佳的温度(图6a和6b)在加热时间期限内很容易达到得到证实。图7显示8分钟的加热时间使得洗脱温度能够上升至>93℃。事实上，因为温度是与抑制剂去除相关的，那么显著的抑制剂去除会在76℃发生，这意味着以这种形式加热至少3分钟。
vii)在加热和混合研究中，从热树脂去除样品洗脱液表现出比从冷树脂去除更好的抑制剂去除。
在LAMP-BART反应缓冲液中制备已被表征为含有一定丰度的NAAT抑制剂的来自粪便样品的提取物的1比5稀释液。将50μl(10mg)与仅655μl缓冲液混合，作为“无树脂”对照。将另一个50μl的量加至含有专用树脂混合物的六支试管中，其中缓存液的已占体积也是655μl。将每支试管于95℃加热10分钟。试管(a)在加热之前和之后都进行混合；(b)不混合；(c)在加热前混合；(d)在加热后混合；(e)加热之前和之后进行混合并且热的上清液在冷却前被取出；(f)加热之前混合并在加热之后静置冷却，之后混合。将20μl的每种上清液一式两份用于重构冷冻干燥的抑制剂对照LAMP-BART反应混合物并在60℃运行。比较反应的峰值时间。无树脂时，在120分钟的运行时间内检测是不可能的。在(b)和(c)中，同样没有检测，这表明与冷树脂的初始混合物没有抑制剂结合作用。(a)、(d)和(e)的反应物都在22.4至28.8分钟内显示检测，其中发生有效的抑制剂去除，这表明，加热后立即与热树脂混合对于去除抑制剂来说是必不可少的。如果将样品和树脂冷却至室温并混合(f)，则在120分钟内检测同样失败了。
实施例4：使用热洗脱方法从样品去除抑制剂
ⅰ)热洗脱可用于去除NAAT抑制剂木聚糖
将27.3μl的60μg/μl木聚糖原液加至655μl的反应缓冲液并在100℃加热块上加热6分钟。将81.8μl的60μg/μl木聚糖原液加至含有专用树脂混合物的具有1.965ml的已占体积的柱。紧闭盖子，并分离扭动片。将柱置于13.5mm内径的收集管(Fisher#FB51579)中，并且将柱和试管放入装有沸水的锥形瓶中6分钟。
来自每一试管的洗脱液被一式两份用于重构冷冻干燥的抑制剂对照BART-LAMP反应混合物。将这些在60℃运行并且将比较反应的峰值时间。图8显示，在木聚糖存在时，在没有树脂处理的情况下，检测时间为39.5±2.16分钟。然而，柱洗脱液产生18.7±0.66分钟的检测时间，这表明，在相同稀释倍数，树脂去除木聚糖抑制剂。
实施例5：洗脱的控制
i)小孔径釉料和高融化温度石蜡用于调节洗脱
为了有效去除样品抑制剂，必须在液相洗脱前将样品暴露于加热的树脂一段足够的时间。因此，必须通过一些手段控制洗脱的速率。
通过在树脂下使用小孔径聚乙烯釉料和高融化温度固体石蜡来调节洗脱速率，以限制从柱流出的洗脱液。加热期间洗脱的开始被延迟了3分钟，并且在10分钟之前完成，以确保样品充分暴露于加热的树脂(图9)。
实施例6：热洗脱所洗脱的核酸的质量
i)对于抑制剂去除来说，热洗脱可能比离心更好：通过LAMP-BART比较排泄物提取物的纺丝洗脱和热压力洗脱
将27mM二硫苏糖醇中20％的IM-SDVB和13.3BICINE pH 5加至250μl艰难梭菌阳性的腹泻样品中，并且涡旋混合。将200μl体积的这种涡旋的均质混合物加至含有压实的PVPP床的800μl离心柱或加入2支1.5ml的试管中。将含有排泄物-IM SDVB-DTT-BICINE混合物的PVPP柱盖紧，移除柱底部的塑料片以打开柱的基部，放置在1.5ml收集管中，并在105℃的热块上加热15分钟(A)。这使得洗脱液被热洗脱至收集管中。将含有样品的1.5ml试管同时在105℃加热15分钟。当冷却后，将试管在14,000rpm离心5分钟，并将来自其中一支试管的上清液转移至1.5ml收集管中底部打开的含有密实的PVPP床的800μl旋转柱中。这一PVPP柱通过在微型离心机上以8,000rpm离心2分钟来洗脱(B)。使用来自其他1.5ml试管的提取物，而不使用PVPP柱(C)。将来自每种提取物的5μl体积一式两份加至PCR板的试管中15μl反应体积的艰难梭菌LAMP-BART试剂。这些用油覆盖并放置在60℃的BART扩增检测仪上。图10显示直接在PVPP柱中溶解的排泄物样品的峰值时间为28.28±0.75分钟，在管中热溶解并且在PVPP柱上旋转的为28.28±2.26分钟，而在缓冲液中热溶解排泄物样品并旋降沉淀的为61.39±3.78分钟。因此，对于这一特定的排泄物样品，在PVPP柱内热溶解样品并热压力洗脱与在管中溶解样品并且之后在PVPP柱上旋转洗脱溶解物一样好。所旋出的溶解物产生较慢的检测，归因于抑制剂依然存在于溶解物中。
ii)热洗脱促进了高分子量的DNA洗脱
用专用树脂填充0.8ml柱(Pierce#89688)至555μl的对于在1.5ml试管中洗脱开放的最终无水体积。将333μl排泄物样品加至含有缓冲液中的20％IM-SDVB的另一个试管并且通过涡旋混合。将200μl的这一混合物加至0.8ml柱，盖紧并且之后于其1.5ml试管中在95℃热块上加热15分钟。洗脱之后，将试管冷却，并将柱转移至新试管并且以8,000×g离心3分钟。将15μl的加热和旋转洗脱液在与3μl加样缓冲液混合后在包含嵌入性染料的1％琼脂糖凝胶上运行，并且在投射仪上捕获凝胶图像(图11)。热洗脱液的强度概况显示，染色的DNA基本上是残留在凝胶孔中的高分子量。随后同一柱的离心洗脱显示另外的低分子量染色。已经知道离心会导致对高分子量DNA的剪切，这产生低分子量片段并可以通过扩增靶位点内的破损影响低拷贝数检测。没有DNA剪切是热压提取洗脱的优点。
实施例7:热洗脱原理的证明
i)粪便样品提取之后用于艰难梭菌检测
用反应缓冲液中的专用树脂混合物填充8ml柱(Pierce#89897)至3.4ml的终体积，其中缓冲液已占体积为1.965ml。使用无菌微超细植绒取样拭子(Puritan#25-33181PN 50)对艰难梭菌阳性和阴性排泄物样品各取一份样品。拭子的末端在树脂混合物中混合，将拭子的柄折断并紧闭柱。使分离扭动片脱落，并且将柱放入13.5mm内径的收集管(Fisher#FB51579)中，并且将全部的柱和试管置于具有80mm插入深度的定制加热块上。将其在100℃加热10分钟。在此期间压力已经在柱内建立，并且全部洗脱液被逐渐驱动穿过柱基部进入收集管中。来自每个的洗脱液被一式两份用于重构冷冻干燥的抑制剂对照LAMP-BART反应混合物。这些在60℃运行并比较反应的峰值时间。这产生24.04±0.75的艰难梭菌阳性样品检测时间，而艰难梭菌阴性样品没有产生峰值(图12)，因此这表明所述方法能够成功从粪便检测艰难梭菌。
ii)热洗脱除去排泄物抑制而因避免了对过度稀释的需要而不影响检测。
用反应缓冲液中的专用树脂混合物填充6×8ml柱(Pierce#89897)，其中缓冲液的已占体积为1.965ml。通过压力柱洗脱法测试六个确认的艰难梭菌阳性临床粪便样品。将150μl的每种临床样品在反应缓冲液中的1比5稀释液(30mg)加至每个柱并混合。分离扭动片。然后将柱放入13.5mm内径的收集管(Fisher#FB51579)并且将全部的柱和试管都置于具有80mm插入深度的定制加热块上。这些在100℃加热10分钟，并且将洗脱液冷却至室温。用20μl洗脱液重构冷冻干燥的艰难梭菌和抑制剂对照LAMP-BART试剂。
将六份粪便样品也稀释至其他可用的艰难梭菌测试中所用的那些的量级水平。这些在反应缓冲液中以最终600μl体积制备至1比200、1比500和1比700，涡旋混合，并在2ml试管中于设定在100℃加热块上加热10分钟。将试管混合并且之后用20μl的溶解物重构冷冻干燥的艰难梭菌和抑制剂对照LAMP-BART试剂。反应在BART检测硬件上于60℃运行90分钟。样品A001和A004具有低艰难梭菌负载，由公共卫生实验室(Public Health Laboratory)所用的PCR方法中的高Ct值证实。压力柱提取已经检测所有重复，包括这两个具有挑战性的样品，其中200x倍和700x倍稀释之间稀释方法显示检测受损。在图13a中比较了所述方法的艰难梭菌LAMP-BART峰值时间。热洗脱法需要树脂混合物中不超过70倍稀释以充分去除排泄物抑制。
样品A001是所述组中具有高抑制剂负载并具有最低艰难梭菌水平的固体粪便。这一样品成功通过热洗脱法检测，其中1比200时的检测已受损，而1比500和1比700由于过度稀释而完全失败。图13b显示对于这一样品，1比200的抑制剂对照显示出比来自柱(70倍稀释)更多的抑制。事实上，将样品以1比500稀释以减轻抑制是必要的。就抑制去除而言，如通过更高抑制性的样品A001和A005的趋势所观察到的，具有树脂的热洗脱柱比200倍稀释更有效。
iii)热压提取之后对诺如病毒(Norovirus)的检测
将50μl诺如病毒GII-4阳性的腹泻样品加至1.5ml螺旋盖试管中150μl的溶于20mM MES，40mM DTT的20％的IM-SDVB。将其混合、加盖并置于95℃热块上10分钟，之后被带至冰上2分钟，并且之后以17,000rpm离心5分钟。将100μl上清液加至800μl试管中压实的PVPP床并以8,000×g旋转洗脱2分钟。将来自提取液的5μl体积，以及之前使用Boom技术提取的1μl相同的排泄物样品，一式两份加至PCR板的试管中15μl反应体积的诺如病毒GII-4逆转录酶LAMP-BART试剂。将这些用油覆盖并置于60℃的BART扩增检测仪上。IM SDVB-MES-DTT热溶解以及之后的PVPP柱纯化提取的排泄物样品的峰值时间为50.44±7.59分钟。这可与1μl来自之前Boom法提取的样品的43.46±0.76相比较。这表明诺如病毒RNA可用可与热洗脱相容的方法来提取。
实施例8：热洗脱后从第二器皿浓缩核酸
i)热洗脱后，核酸可以进一步浓缩
对于低拷贝数的应用来说，已经证明，基因组艰难梭菌DNA水平的浓缩在掺入反应缓冲液即与洗脱液相同的试剂组合物时是可能的。
将艰难梭菌基因组DNA的稀释液在反应缓冲液中制备为每20μl，103、102、10和0个拷贝。20μl每种稀释液被用来一式两份重构冷冻干燥的艰难梭菌LAMP-BART反应混合物并在60℃运行。
每种稀释液也通过取800μl的混合物并与5μl的磁珠和160μl的试剂盒结合缓冲液(Invitrogen)混合1分钟来浓缩。通过在磁架上沉降珠来除去上清液。将珠重悬浮于80μl的反应缓冲液而20μl的粗悬浮液，包括珠，被用来一式两份重构冷冻干燥的艰难梭菌LAMP-BART反应混合物并在60℃运行。
图14显示浓缩将103和102个拷贝/20μl水平的检测时间提高3.2至4.8分钟，并允许在52.3分钟之前可再现地检测10个拷贝/20μl水平的两个重复，其中，当没有浓缩时仅检测到2个重复中的1个。
ii)热洗脱后用简化的磁珠法从阳性排泄物浓缩艰难梭菌
将艰难梭菌阳性粪便(1比5溶于反应缓冲液)用阴性粪便(1比5溶于反应缓冲液所制备的)1比10稀释。将150μl(30mg粪便)的稀释液加在含有溶于BART-LAMP反应缓冲液的特定的树脂混合物(10％v/vChelex 100、25％v/v Optipore SD-2和25％v/v Diaion WA30)的8ml柱(Pierce#89897)上并手动混合。缓冲液已占体积为1.965ml。紧闭盖子并分离扭动片。将柱置于13.5mm内径的收集管(Fisher#FB51579)中并且将全部的柱和试管置于定制加热块上。将其于100℃加热10分钟。将20μl收集到的洗脱液一式两份用于重构冷冻干燥的艰难梭菌LAMP-BART反应物。
将800μl的洗脱物通过与5μl的磁珠和160μl的试剂盒结合缓冲液(Invitrogen)混合1分钟来浓缩。通过在磁架上沉降珠来除去上清液。将小珠重悬浮于80μl的反应缓冲液，而20μl的粗悬浮液，包括珠，被用来一式两份重构冷冻干燥的艰难梭菌LAMP-BART反应混合物。
LAMP-BART反应物于60℃在BART检测仪上运行。洗脱液的浓缩将检测时间从27.2±0.5分钟(未浓缩的)改进至19.2±0分钟(浓缩后)。
iii)有和没有进行使用包含在第一容器中磁珠进行热洗脱的艰难梭菌基因组DNA检测的比较
将20μl艰难梭菌基因组DNA(103个拷贝，每20μl)原液加至1.98ml的Bicine缓冲液。
将200μl的原液用于使用1.8ml BICINE缓冲液以102和101个拷贝每20μl制得系列稀释液。
按如下处理gDNA稀释液：
第1组：无处理。20μl被用于直接重构艰难梭菌LAMP BART测定。
第2组：将400μl艰难梭菌gDNA稀释液加至具有2.7mm釉料以及另外的玻璃过滤器(G/FD FD#1823-025纸，Whatman)以及5μl ChargeSwitch珠和80μl结合缓冲液的1.5ml热洗脱柱。将其通过移液混合。紧紧固定柱盖并置于100℃的加热块(具有2ml收集管)上6分钟。洗脱后，将具有捕获的珠的GF/D材料直接转移至40μl的重构艰难梭菌LAMPBART测定。
与没有热洗脱相比，使用热洗脱和磁性小珠浓缩的条件有助于检测稀释系列中低于1个对数的，从而证明了热洗脱可以与珠捕获法结合使用来浓缩热洗脱容器中的核酸(图16)。
实施例9：使用热洗脱的多容器样品制备和扩增的集成
热洗脱的原理可以被应用于诸如将各自执行用于样品制备的不同功能的两个或更多个相关联的容器。单个加热块可以用于容纳容器的这样的关联，或者当加热的时间和速度以及加热快的最终温度被设计为以连贯的方式驱动样品穿过容器时，可使用许多加热块。
此外，一个器皿可以包含NAAT试剂，使得容器和器皿的组合允许向NAAT试剂直接加入处理过的样品。像这样，但加热块被适当设计，一旦样品被加至第一容器中，热洗脱方法可以进行样品制备的所有步骤，并允许将样品加至NAAT试剂并进一步允许扩增进行(图15)。
实施例10：热洗脱可以为PCR提供样品
在PCR检测中使用溶解物
用溶于反应缓冲液的专用树脂填充8ml柱(Pierce#89897)至3.4ml的终体积，缓冲液已占体积为1.965ml。使用无菌微超细植绒拭子(Puritan#25-33181PN 50)对艰难梭菌排泄物样品取样。将拭子的末端在树脂混合物中混合，将拭子的柄折断并紧闭柱。将柱手动混合并置于具有80mm插入深度的定制加热块上。将其在100℃加热10分钟。将柱静置冷却，之后从柱的顶部移出溶解物。使用IQ Supermix(Bio-Rad#1708862)制备了艰难梭菌实时PCR反应混合物。将4.5μl的溶解物一式两份加至PCR反应，与艰难梭菌基因组DNA稀释系列一起在ABI-PRISM 7000上运行，并且在95℃3分钟的初始变性步骤之后以94℃，57℃和72℃每个30秒的50个循环扩增。溶解物产生29的CT值，当从校准曲线计算时这相应于1.18x104个拷贝数，这表明柱溶解物可用于实时PCR检测。

Claims (16)

1.一种使液体样品穿过多孔固体基质的方法，包括以下步骤：将所述液体样品密封在包含作为容器的至少一部分的多孔固体基质的所述容器中，并且升高温度以增加所述容器内部的压力，由此使所述液体穿过所述多孔固体基质。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述容器包含两种或更多种不同的固体多孔基质。
3.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述液体样品包含核酸和核酸扩增抑制剂。
4.如权利要求3所述的方法，其中所述容器包含比结合核酸扩增抑制剂更牢固地结合核酸的多孔固体基质。
5.如权利要求3所述的方法，其中所述容器包含比结合核酸更牢固地结合核酸扩增抑制剂的多孔固体基质。
6.一种从包含核酸和核酸扩增抑制剂的液体样品纯化核酸的方法，其中所述方法包括以下步骤：(a)将所述样品与与结合核酸相比更牢固地结合核酸扩增抑制剂的多孔固体基质接触，其中将加热应用于所述多孔固体基质和所述液体样品；和(b)从所述多孔固体基质分离包含未结合的核酸的所述液体样品。
7.如权利要求6所述的方法，其中步骤(b)中将加热应用于所述样品。
8.如权利要求6或7所述的方法，其中使所述液体样品通过包括以下步骤的方法穿过所述多孔固体基质：将所述液体样品密封在包含作为容器的至少一部分的多孔固体基质的所述容器中，并且升高温度以增加所述容器内部的压力，由此致使所述液体穿过所述多孔固体基质。
9.如权利要求1-5或8中任一项所述的方法，其中所述容器包含限流器，其配置为与没有所述限流器的容器相比减少来自所述容器的液体穿过所述多孔固体基质的流动。
10.如权利要求9所述的方法，其中所述限流器是过滤器、釉料或阀。
11.如权利要求9所述的方法，其中所述限流器是在45℃和110℃之间的温度融化的材料层。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述材料层是蜡。
13.如任一前述权利要求所述的方法，还包括溶解所述样品的步骤。
14.一种用于纯化核酸的设备，包括
(a)包含作为容器的至少一部分的多孔固体基质的所述容器和用于密封所述容器的工具，和
(b)配置为将所述容器加热至高达110℃的温度的加热元件。
15.如权利要求14所述的设备，其中所述设备还包括第二容器以接收穿过所述多孔固体基质的液体。
16.如权利要求14或15所述的设备，其中所述设备还包括包含用于核酸扩增的试剂的器皿。
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