JPWO2018096961A1 - 改変された耐熱性dnaポリメラーゼ - Google Patents
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Abstract
Description
項1.逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
項2.逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
項3.逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
項4.逆転写活性を有し、かつ、配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
項5.逆転写活性を有し、かつ、配列番号2のアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
項6.逆転写活性を有し、かつ、配列番号2のアミノ酸配列を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
項7.配列番号1または配列番号2における509位または744位に相当するアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたものである項1から6のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
項8.配列番号1または配列番号2における509位に相当するアミノ酸の改変が、アルギニンに置換されたものである項7に記載のDNAポリメラーゼ。
項9.逆転写反応が5分以下で完了する項1から8のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
項10.逆転写反応が1分以下で完了する項9に記載のDNAポリメラーゼ。
項11.1kbあたりの伸長時間が30秒以下である項1から10のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
項12.項1〜11のいずれかに記載のDNAポリメラーゼを使用して、精製工程を経ていない生体試料を増幅することを特徴とする核酸増幅方法。
項13.前記生体試料が、血液由来試料、唾液、髄液、尿および乳からなる群より選ばれた少なくとも1種の試料である項12に記載の核酸増幅方法。
純化されたDNAポリメラーゼは以下に示す方法で活性を測定することができる。酵素活性が強い場合には、保存緩衝液(50mM Tris−HCl(pH8.0),50mM KCl,1mM ジチオスレイトール,0.1% Tween20,0.1% Nonidet P40,50% グリセリン)でサンプルを希釈して測定を行う。(1)下記のA液25μl、B液5μl、C液5μl、滅菌水10μl、及び酵素溶液5μlをマイクロチューブに加えて、75℃にて10分間反応する。(2)その後氷冷し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。(3)この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N 塩酸およびエタノールで十分洗浄する。(4)フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製Tri−Carb2810 TR)で計測し、鋳型DNAのヌクレオチドの取り込みを測定する。酵素活性の1単位はこの条件で30分当りの10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分(即ち、D液を添加したときに不溶化する画分)に取り込む酵素量とする。
A:40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)16mM 塩化マグネシウム15mM ジチオスレイトール100μg/ml BSA(牛血清アルブミン)
B:1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C:1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D:20% トリクロロ酢酸(2mM ピロリン酸ナトリウム)
E:1mg/ml 仔牛胸腺DNA
本発明における核酸増幅方法においては、精製工程を経ていない生体試料内の核酸を精製することなく増幅することができる。ここで、精製とは、生体試料の組織、細胞壁などの夾雑物質と生体試料中のDNAを分離する方法をいうものであり、具体的にはフェノールあるいはフェノール・クロロホルム等を用いて、DNAを分離する方法や、イオン交換樹脂、ガラスフィルターあるいはタンパク凝集作用を有する試薬によってDNAを分離する方法などが挙げられる。
本発明の核酸増幅方法に適用する生体試料は、生体から採取された試料であれば特に限定されない。例えば、動植物組織、体液、排泄物、細胞、細菌、ウイルス等をいう。体液には血液や唾液が含まれ、細胞には血液から分離した白血球が含まれるが、これらに限定されるものではない。
DNAポリメラーゼプラスミドの作製
人工合成により作成したThermus thermophilus HB8由来のDNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号3)、Themus sp Z05由来のDNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号4)、およびThermus aquaticus由来の耐熱性DNAポリメラーゼ遺伝子(配列番号5)をpBluescriptにクローニングし、それぞれ野生型Tth、Z05、Taq DNAポリメラーゼを組み込んだプラスミドを作製した(それぞれpTth、pZ05、pTaq)。変異をもつプラスミドの作製には、pTth、pZ05、pTaqを鋳型に、KOD −Plus− Mutagenesis Kit(Toyobo製)を用いて、方法は取扱い説明書に準じて行った。二重変異の一部については作製した変異プラスミドを鋳型に、同様のキットを用いてさらに変異を入れることで作製した。作製したプラスミド及びその際に使用した鋳型・プライマーを表1に示す。得られたプラスミドはエシェリシア・コリJM109を形質転換し、酵素調製に用いた。
DNAポリメラーゼの作製
実施例1で得られた菌体の培養は、以下のようにして実施した。まず、滅菌処理した100μg/mlのアンピシリンを含有するTB培地(Molecular cloning 2nd edition、p.A.2)80mLを、500mL坂口フラスコに分注した。この培地に予め100μg/mlのアンピシリンを含有する3mlのLB培地(1%バクトトリプトン、0.5%酵母エキス、0.5%塩化ナトリウム;ギブコ製)で37℃、16時間培養したエシェリシア・コリJM109(プラスミド形質転換株)(試験管使用)を接種し、37℃にて16時間通気培養した。培養液より菌体を遠心分離により回収し、50mlの破砕緩衝液(30mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、30mM NaCl、0.1mM EDTA)に懸濁後、ソニケーション処理により菌体を破砕し、細胞破砕液を得た。次に細胞破砕液を80℃にて15分間処理した後、遠心分離にて不溶性画分を除去した。更に、ポリエチレンイミンを用いた除核酸処理、硫安塩析、ヘパリンセファロースクロマトグラフィーを行い、最後に保存緩衝液(50mM Tris−HCl緩衝液(pH8.0)、50mM 塩化カリウム、1mM ジチオスレイトール、0.1% Tween20、0.1%ノニデットP40、50%グリセリン)に置換し、耐熱性DNAポリメラーゼを得た。
A液: 40mM Tris−HCl緩衝液(pH7.5)、16mM 塩化マグネシウム、15mM ジチオスレイトール、100μg/ml BSA
B液: 1.5μg/μl 活性化仔牛胸腺DNA
C液: 1.5mM dNTP(250cpm/pmol [3H]dTTP)
D液: 20% トリクロロ酢酸(2mM ピロリン酸ナトリウム)
E液: 1mg/ml 仔牛胸腺DNA
A液25μl、B液5μl、C液5μl及び滅菌水10μlを、マイクロチューブに加えて攪拌混合後、上記精製酵素希釈液5μlを加えて、75℃で10分間反応する。その後冷却し、E液50μl、D液100μlを加えて、攪拌後更に10分間氷冷する。この液をガラスフィルター(ワットマン製GF/Cフィルター)で濾過し、0.1N塩酸及びエタノールで十分洗浄し、フィルターの放射活性を液体シンチレーションカウンター(パッカード製Tri−Carb2810 TR)を用いて計測し、鋳型DNAへのヌクレオチドの取り込みを測定した。酵素活性の1単位はこの条件下で30分当り10nmolのヌクレオチドを酸不溶性画分に取り込む酵素量とした。
PCR
実施例2で作製したDNAポリメラーゼを用いて、ヒトβ−グロビン3.6kb、8.5kbを増幅するPCRを実施した。
PCRにはKOD Dash(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、およびを0.2mM dNTPs、ヒトβ−グロビン3.6kbを増幅する15pmolのプライマー(配列番号6及び7)、もしくは8.5kbを増幅する15pmolのプライマー(配列番号8及び9)、50ngのヒトゲノムDNA(Roche製)、1、2、5、10Uの酵素を含む50μlの反応液を94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、10秒→68℃、4分(3.6kbの増幅)または8分(8.5kbの増幅)を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem製)を用いてPCRを行った。反応終了後、5μlの反応液について1%アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
高速PCR
実施例2で作製したDNAポリメラーゼを用いて、伸長時間を短くした高速PCRを実施した。PCRにはKOD Dash(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、およびを0.2mM dNTPs、ヒトβ−グロビン3.6kbを増幅する15pmolのプライマー(配列番号6及び7)、50ngのヒトゲノムDNA(Roche製)、5Uの酵素を含む50μlの反応液を94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、10秒→68℃、15秒、1分、または2分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem)を用いてPCRを行った。反応終了後、5μlの反応液について1%アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下増幅DNA断片の増幅量を確認した。
血液からの直接増幅
実施例2で作成したDNAポリメラーゼを用いて、反応液中に血液を直接添加してPCRを実施した。PCRにはKOD Dash(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、およびを0.2mM dNTPs、ヒトβ−グロビン3.6kbを増幅する15pmolのプライマー(配列番号6及び7)、血液を1μl、3μl、または5μl、5Uの酵素を含む50μlの反応液を94℃、2分の前反応の後、98℃、10秒→60℃、10秒→68℃、4分を35サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem社)を用いてPCRを行った。反応終了後、5μlの反応液について1%アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅DNA断片の増幅量を確認した。
逆転写能を有するDNAポリメラーゼを用いたRT−PCR
実施例2で作製したDNAポリメラーゼを用いて、RNAから1ステップでのRT−PCRを実施した。RT−PCRにはTKOD −Plus− Ver.2(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、および2.5mM Mn(OAc)2、0.4mM dNTPs、ヒトβ−グロビンを増幅する0.4pmolのプライマー(配列番号10及び11)、1/30000倍希釈 SYBR(登録商標) GreenI、1Uの抗体混合酵素を含む20μlの反応液にHeLa total RNAを200ng、20ng、2ng、0.2ngになるよう添加し、90℃、30秒の前反応の後、61℃、20分の逆転写反応、95℃、60秒での再度、前反応後、95℃、15秒→60℃、15秒→74℃、45分を40サイクル繰り返すスケジュールでLC96(Roche製)を用いてリアルタイムPCRを行った。酵素にはTth DNAポリメラーゼ、改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509K、E744R)を使用した。
逆転写能をもつDNAポリメラーゼを用いたRT−PCR
実施例2で作製したDNAポリメラーゼを用いて、RNAからの1ステップでのRT−PCRを実施した。RT−PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer及び2.5mM Mn(OAc)2、0.4mM dNTPs、β-Actinを増幅する4pmolのプライマー(配列番号10及び11)、1/30000倍希釈 SYBR(登録商標) GreenI、1Uの抗体混合酵素を含む20μlの反応液にHeLa total RNAを10ng、1ng、0.1ng、0.01ngになるよう添加し、90℃、30秒の前反応の後、60℃、1、5または10分の逆転写反応、95℃、60秒での再度、前反応後、95℃、15秒→60℃、60秒を45サイクル繰り返すスケジュールで、LC96(Roche)を用いてリアルタイムPCRを行った。酵素にはTth DNAポリメラーゼ、改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509R、E774K)を使用した。
改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509K、Q509R)の保存安定性
実施例2で作製したTth DNAポリメラーゼ(Q509K、Q509R)を用いたMaster Mixの保存安定性について評価を実施した。Master MixにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo製)添付のBufferを用い、20μl系に0.4mM dNTPsおよび1Uの抗体混合酵素を含むように2×Master Mixを調製した。これを−20℃と37℃で4週間保存し、改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509K、Q509R)の安定性の違いについて評価した。評価系としては、RNAからの1ステップでのRT−PCRを実施した。調製したMaster Mixを用いて、1×Master Mix及び2.5mM Mn(OAc)2、10pmolのプライマー(配列番号12及び13)、4pmolのプローブ(配列番号14)、1Uの抗体混合酵素を含む20μlの反応液にエンテロウィルスRNAを625コピー分の量を添加し、90℃、30秒の前反応の後、60℃、5分の逆転写反応、95℃、60秒での再度、前反応後、95℃、5秒→60℃、5秒を45サイクル繰り返すスケジュールで、LC96(Roche製)を用いてリアルタイムPCRを行った。
FTAカードで保存した血液から直接増幅
実施例2で作成したDNAポリメラーゼを用いて、反応液中に血液を直接添加してPCRを実施した。PCRにはKOD FX(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer、およびを0.4mM dNTPs、ヒトβ−グロビン1.3kbを増幅する15pmolのプライマー(配列番号15及び16)、FTAカード(GEヘルスケア)に血液を貼付したものをφ1.2mmのパンチで抜出したもの1つ、2Uの酵素を含む50μlの反応液を94℃、2分の前反応の後、94℃、30秒→60℃、10秒→68℃、2分を30サイクル繰り返すスケジュールでPCR system GeneAmp9700(Applied Biosystem製)を用いてPCRを行った。酵素には抗体を混合したTth DNAポリメラーゼ、改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509K、Q509R)、Taq DNAポリメラーゼ、および改変型Taq DNAポリメラーゼ(E507K、E507R)使用した。反応終了後、5μlの反応液について1%アガロース電気泳動を行い、エチジウムブロマイド染色し、紫外線照射下、増幅DNA断片の増幅量を確認した。
改変型Tth DNAポリメラーゼの血漿由来成分に対する耐性
実施例2で作製したTth DNAポリメラーゼを用いて、反応液中40%の血漿を持ち込んだ際の影響を評価した。方法として大腸菌ゲノムDNAをスパイクし、リアルタイムPCRを実施した。PCRにはTHUNDERBIRD(登録商標)Probe One−step qRT−PCR Kit(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer及び4pmolの大腸菌特異的プライマー(配列番号17及び18)、4pmolのプローブ(配列番号19)、1Uの抗体混合酵素、血漿8μlを含む20μlの反応液に大腸菌ゲノムDNAを5ng、0.5ng、0.05ng、0.005ngになるよう添加し、95℃、1分の前反応の後、95℃、15秒→60℃、15秒を40サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムPCRを行った。酵素にはTth DNAポリメラーゼ、改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509R)を使用した。
高速RT−PCR検出
実施例2で作製したTth DNAポリメラーゼ(Q509R)を用いてエンテロウィルスRNAからの1ステップでのRT−PCRを実施した。RT−PCRにはKOD −Plus− Ver.2(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer及び2.5mM Mn(OAc)2、0.4mM dNTPs、10pmolのプライマー(配列番号12及び13)、4pmolのプローブ(配列番号14)、1Uの抗体混合酵素を含む20μlの反応液にエンテロウィルスRNAを2500、625、156、40、24.4コピー分の量をそれぞれ添加し、90℃、30秒の前反応の後、60℃、5分の逆転写反応、95℃、60秒での再度、前反応後、95℃、5秒→60℃、5秒を50サイクル繰り返すスケジュールで、LC96(Roche製)を用いてリアルタイムPCRを行った。酵素にはTth DNAポリメラーゼ、改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509R)を使用した。
改変型Tth DNAポリメラーゼの血液耐性
実施例2で作製したTth DNAポリメラーゼを用いて、リアルタイムPCRを実施した。PCRにはTHUNDERBIRD(登録商標)Probe One−step qRT−PCR Kit(Toyobo製)添付のBufferを用い、1×PCR Buffer及び4pmolのプライマー(配列番号20及び21)、4pmolのプローブ(配列番号22)、4Uの抗体混合酵素、血漿1μlを含む20μlの反応液を調製し、95℃、1分の前反応の後、95℃、15秒→60℃、60秒を40サイクル繰り返すスケジュールでリアルタイムPCRを行った。酵素にはTth DNAポリメラーゼ、改変型Tth DNAポリメラーゼ(Q509R、E744R)を使用した。
Claims (13)
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号1のアミノ酸配列を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号2のアミノ酸配列と90%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号2のアミノ酸配列と96%以上の同一性を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 逆転写活性を有し、かつ、配列番号2のアミノ酸配列を有するDNAポリメラーゼにおいて、509位および744位からなる群から選択される少なくとも1つの部位のアミノ酸を改変したことを特徴とするDNAポリメラーゼ。
- 配列番号1または配列番号2における509位または744位に相当するアミノ酸の改変が、ヒスチジン、リジンおよびアルギニンからなる群より選択されるいずれかのアミノ酸に置換されたものである請求項1から6のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 配列番号1または配列番号2における509位に相当するアミノ酸の改変が、アルギニンに置換されたものである請求項7に記載のDNAポリメラーゼ。
- 逆転写反応が5分以下で完了する請求項1から8のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 逆転写反応が1分以下で完了する請求項9に記載のDNAポリメラーゼ。
- 1kbあたりの伸長時間が30秒以下である請求項1から10のいずれかに記載のDNAポリメラーゼ。
- 請求項1〜11のいずれかに記載のDNAポリメラーゼを使用して、精製工程を経ていない生体試料を増幅することを特徴とする核酸増幅方法。
- 前記生体試料が、血液由来試料、唾液、髄液、尿および乳からなる群より選ばれた少なくとも1種の試料である請求項12に記載の核酸増幅方法。
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