CN103436601A

CN103436601A - 一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b及其使用方法和应用

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Publication number: CN103436601A
Application number: CN2013102387141A
Authority: CN
Inventors: 郭涛; 罗文龙; 陈志强; 王慧; 周丹华; 刘永柱; 张建国
Original assignee: South China Agricultural University
Current assignee: South China Agricultural University
Priority date: 2013-06-17
Filing date: 2013-06-17
Publication date: 2013-12-11
Anticipated expiration: 2033-06-17
Also published as: CN103436601B

Abstract

本发明涉及生物技术领域，具体公开了一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b及其使用方法和应用。所述的功能标记Wx-a/b由引物Wx-a/b-out、Wx-a/b-in构成。所述功能标记Wx-a/b可用来检测Wx基因型，可实现批量化、自动化、全封闭的基因型检测。所述检测方法成本低、简便实用、重复性好。

Description

一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b及其使用方法和应用

技术领域

本发明涉及生物技术领域，更具体地，涉及一种利用DNA熔解温度分析水

稻Wx基因的功能标记Wx-a/b及其使用方法和应用。

背景技术

水稻是我国重要的农作物，适中的直链淀粉含量是高品质稻米的一个重要特性。稻米的直链淀粉含量(Amylose Content, AC)，是稻米食用口感最重要的影响因素之一；中低AC的籼稻，因软而不过于黏，受到消费者喜爱。传统的直链淀粉含量选择方法，是通过化学法测定，这种方法存在破坏性、效率低的缺点；同时，化学法无法在育种低世代（如F2单株世代）进行测定。最有效的选择，应是直接对直链淀粉基因型进行选择。

研究表明，Wx基因对于稻米AC的高低具有决定性的作用。在非糯水稻品种中，Wx基因座位有Wx ^a和Wx ^b两种等位基因；Wx ^b的第1内含子+1位点由野生型Wx ^a的G突变为T，导致第1内含子剪接效率降低及剪接不正常，成熟Wx转录本含量降低从而引起直链淀粉含量下降。蔡秀玲等针对该位点开发功能标记了PCR-Acc I，通过Acc I酶酶切后电泳来区分Wx ^a和Wx ^b，其中基因型为Wx ^b的种质总体上属于中低AC型；利用PCR-Acc I进行MAS，可定向导入Wx ^b来改良高AC材料的稻米品质。但是，由于这一功能标记需酶切后再电泳分析，成本较高、操作较繁杂，使其难以得到普遍应用。

成本低、简便实用、重复性好的共显性标记，是有效开展分子辅助选择育种的重要基础。DNA序列的差异会导致DNA熔解温度的不同，如Wx ^a和Wx ^b两种等位基因在第1内含子+1位点的G/T变异，将导致该DNA区段Wx ^a比Wx ^b的熔解解温度高1℃。如果能利用DNA熔解温度检测基因型，将可避免凝胶电泳的缺陷，实现批量化、自动化、全封闭的基因型检测。利用DNA熔解温度判别基因型在人类疾病的研究中已有报道，但是，该技术涉及环节较多、需详尽的前期优化工作，目前在水稻上系统开展此技术研究的报道较少，这在一定程度上限制了其在水稻育种中的广泛应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是，为了克服现有技术中Wx基因型检测方法的上述不足，提供一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b。

本发明所要解决的另一技术问题是，一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因型的方法。

本发明所要解决的上述技术问题，通过以下技术方案予以实现：

一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b，其特征在于，

所述的功能标记Wx-a/b由引物Wx-a/b-out、Wx-a/b-in构成，引物Wx-a/b-out由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成；引物Wx-a/b-in由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成。

SEQ ID NO:1的核苷酸序列（5’-3’）为TACCAGGACTTGTTTGGAGCTT；SEQ ID NO:2的核苷酸序列（5’-3’）为AAACCTTAACCATAGGAGCAGC；

SEQ ID NO:3的核苷酸序列（5’-3’）为TGTTAGGTTGCATTTACTGGGAGT；SEQ ID NO:4的核苷酸序列（5’-3’）为CAAACCTTAACCATAGGAGCAGC。作为一种优选方案，所述的水稻是指品种为R173、日本晴的水稻。

一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因型的方法，包括如下步骤：利用上述功能标记Wx-a/b进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以水稻基因组DNA为模板，利用Wx-a/b-out引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用Wx-a/b-in引物扩增；然后检测第二轮PCR扩增产物DNA熔解温度，通过熔解温度高低区分Wx ^a与Wx ^b基因序列差异，从而判别待测水稻材料的基因型。

作为一种优选方案，所述的方法，具体包括如下步骤：

S1.第一轮PCR：反应体系依次加入2×Power Taq PCR MasterMix母液5 μL、10 μmol/L的SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2各0.3 μL以及0.5 μL水稻基因组DNA，最后以双蒸水补足10 μL，进行PCR扩增，扩增程序为95℃, 5min; 95℃, 20s; 57℃, 20s; 72℃, 10s , 25个循环; 72℃, 5min，反应完成后，向PCR管加入200 μL双蒸水稀释第一轮PCR产物；

S2.第二轮PCR：反应体系依次加入2×Power Taq PCR MasterMix母液4 μL、10 μmol/L的SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4各0.3 μL、0.5 μL 20×EvaGreen染料、以及0.5 μL稀释过的第一轮PCR产物，最后以双蒸水补足10 μL；PCR扩增程序为95℃, 2min; 95℃, 20s; 59℃, 20s; 72℃, 10s, 25个循环; 72℃, 5min; 95℃, 2min；25℃, 2min；

S3.第二轮扩增产物分别全部转移至96孔板，加入20 μL矿物油，离心消除气泡；将待测的96孔板放入LightScanner 96分析系统，读取60℃~95℃的熔解曲线；所采集的原始数据用LightScanner Call IT软件进行分析，选用Small Amplicon模式进行自动化分析。

根据含有Wx ^a基因型的DNA的熔解温度较含有Wx ^b基因型的DNA的熔解温度高1℃来判断Wx基因为Wx ^a型还是Wx ^b型。

Wx ^a基因型的DNA的熔解温度为74.3℃

Wx ^b基因型的DNA的熔解温度为73.3℃

Wx ^a和Wx ^b杂合型的DNA的熔解温度为73.8℃

所述的DNA的熔解温度即DNA双链的解链温度。

扩增产物中已加入荧光染料，荧光染料与扩增产物DNA双链特异结合，在外来光源激发下，荧光染料发出荧光，可以由仪器收集荧光值；而在温度升高的过程中，荧光染料从DNA双链解脱，仪器收集的荧光值随之降低。通过这种原理，可以探知不同DNA片段的溶解温度差别。Wx ^a型相比较Wx ^b型，其DNA双链解链所需温度较高；而杂合链具有两个解链温度，在荧光值上可以明显区分。

上述功能标记Wx-a/b在Wx基因的分子标记辅助选择中的应用。

上述功能标记Wx-a/b在水稻品种选育方面的应用。

所述的功能标记Wx-a/b可用于水稻直链淀粉含量的分子标记辅助选择。通过该方法，可以高效的将Wx ^b基因转移到Wx ^a基因水稻品种中，进而提高中低直链淀粉含量水稻品种选育效率。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：本发明利用DNA熔解温度检测基因型，避免了凝胶电泳的缺陷，可实现批量化、自动化、全封闭的基因型检测；所述检测方法成本低、简便实用、重复性好。

附图说明

图1为功能标记Wx-a/b引物所在基因组位置及扩增片段。Wx ^a与Wx ^b基因的功能变异位点分别以星号（*）标识。

图2为利用Wx-G/T鉴定Wx ^a、Wx ^b及其杂合型的DNA片段熔解温度。

图3为利用PCR ACC I法鉴定Wx ^a、Wx ^b及其杂合型的电泳结果。图3中： M为 DNA ladder; 1~2为Wx ^b(日本晴)酶切; 3~4为杂合型（日本晴+R173）酶切; 5~6为Wx ^a(R173)酶切; 7为Wx ^b(日本晴)未酶切; 8为Wx ^a(R173)未酶切。

具体实施方式

以下结合具体实施例来进一步解释本发明，但实施例对本发明不做任何形式的限定。

实施例1：一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记开发。

1.水稻品种R173、日本晴基因组DNA的提取。

具体方法：1）取少量水稻插秧后一月幼叶置于液氮冷冻的2.0 mL灭菌离心管中搅拌至粉末状，加1000μL2×CTAB-DNA提取液（质量分数W/V 2%的CTAB，pH8.0；质量分数W/V 1%的PVP；100 mmol/L Tris-HCl，pH8.0；1.4 mol/L NaCl；20 mmol/L EDTA，pH8.0；体积分数V/V 0.2% 的巯基乙醇）；2）置于65 ℃恒温水浴锅中每隔10 min摇动一次，30~45 min后取出；3）冷却2 min后加1000 μL氯仿-异戊醇（体积比24：1），上下剧烈充分摇动，使两者混合均匀；4）10000 rpm离心10 min，轻取上清至1.5 ml 灭菌新离心管中，加入600 μL预冷异丙醇上下轻摇均匀；5）-20℃放置30 min使DNA沉淀；6）10000 rpm离心6 min，立即倒掉上清倒立离心管于纸巾上；7）1 min后直立离心管，加入800 μL 70%乙醇和3 M NaAc(体积比9：1)，轻摇使DNA悬浮放置30 min；8）10000 rpm离心6 min，立即倒掉上清加入800 μL 70%乙醇将DNA再次漂洗30 min；9）10000 rpm离心3 min，通风橱内烘干；10）加入100-200 μL1×TB Buffer(10 mM Tris-HCl，pH8.0；1 mM EDTA，pH8.0)溶解，4 ℃保存备用。

2. 水稻品种R173、日本晴直链淀粉含量鉴定方法。

具体方法：1）用SDM-A型旋风式磨粉机将待测试样的整精米磨成粉，称取100±0.5mg米粉样品加入100mL容量瓶，加入1.0mLφ=95%酒精使其分散，9.0mL 1mol/L NaOH煮沸10min，冷却定容，吸取5.0mL样品溶液移入另一100mL容量瓶（同时吸取5.0mL 0.09mol/L NaOH作为对照），加入1.00 mL 1mol/L乙酸、1.50mL I₂-kI溶液，定容，20min后用分光光度计测定620nm下吸光值（OD₆₂₀）；2）称取与待测样品保存在同样的条件下三天以上的高、中、低已知直链淀粉含量的标准样品各100mg，用上述方法与待测样品同时进行测定。以标样的直链淀粉为纵坐标，以相应的吸光值为横坐标，绘制标准曲线和列出曲线的回归方程式；3）重复测定一次，两次结果的误差应在1.0%，取平均值即为直链淀粉含量。

3. 水稻品种R173、日本晴Wx基因标记Wx-a/b开发及扩增。

1）比较R173、日本晴Wx基因第1内含子+1位点序列差异，设计涵盖差异位点的功能标记Wx-a/b（图1）。相比日本晴该区段，R173在第1内含子+1位点为G，导致该区段DNA熔解温度比日本晴高1℃。所述的Wx-a/b由两对引物Wx-a/b-out、Wx-a/b-in构成，引物序列如下：

Wx-a/b-out：正向引物序列（5’-3’）TACCAGGACTTGTTTGGAGCTT（SEQ ID NO:1）；反向引物序列（5’-3’）AAACCTTAACCATAGGAGCAGC（SEQ ID NO:2）。

Wx-a/b-in：正向引物序列（5’-3’）TGTTAGGTTGCATTTACTGGGAGT（SEQ ID NO:3）；反向引物序列（5’-3’）CAAACCTTAACCATAGGAGCAGC（SEQ ID NO:4）。

2）利用功能标记Wx-a/b进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以基因组DNA为模板，利用Wx-a/b-out引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用Wx-a/b-in引物扩增。

第一轮PCR：反应体系依次加入2×Power Taq PCR MasterMix母液（百泰克，北京）5 μL、引物Wx-a/b-out的正向引物序列和反向引物序列（10 μmol/L）各0.3 μL以及0.5 μL基因组DNA，最后以双蒸水补足10 μL。在GeneAmp 9700型PCR仪(Applied Biosystems, USA)上进行PCR扩增，扩增程序为95℃, 5min; 25× (95℃, 20s; 57℃, 20s; 72℃, 10s); 72℃, 5min。反应完成后，向PCR管加入200 μL双蒸水，以稀释第一轮PCR产物（约20倍）。

第二轮PCR：反应体系依次加入2×Power Taq PCR MasterMix母液（百泰克，北京）4 μL、引物Wx-a/b-in的正向引物序列和反向引物序列（10 μmol/L）各0.3 μL、0.5 μL 20×EvaGreen染料(Biotium, USA)、以及0.5 μL稀释过的第一轮PCR产物，最后以双蒸水补足10 μL。PCR扩增程序为95℃, 2min; 25× (95℃, 20s; 59℃, 20s; 72℃, 10s); 72℃, 5min; 95℃, 2min；25℃, 2min。

4.功能标记Wx-a/b扩增产物DNA熔解温度检测方法。

第二轮扩增产物分别全部转移至带裙边、白底不透明的96孔板，加入20 μL矿物油(SIGMA，USA)，离心(1000 rpm，1 min)以消除气泡。将待测的检测板放入LightScanner 96 (Idaho Technology，USA)分析系统，读取60℃-95℃的熔解曲线。所采集的原始数据用LightScanner Call IT软件(Idaho Technology，USA)进行分析，选用Small Amplicon模式进行自动化分析。

5. 利用PCR ACC I法鉴定Wx ^a、Wx ^b及其杂合型。

具体方法：1）利用PCR-AccⅠ引物（上游引物5'-3'GCTTCACTTCTCTGCTTGTG，下游引物5'-3'ATGATTTAACGAGAGTTGAA）扩增R173、日本晴基因组DNA；2）扩增产物酶切，酶切体系：10μL PCR产物，2μL 10×L Buffer，1μL AccⅠ限制性内切酶，其余用ddH₂O补足至20μL,37℃酶切1h；3）制备1%的琼脂糖凝胶进行电泳检测，观察结果并照相保存。

实施例2：利用Wx-a/b检测水稻Wx基因型。

1.供试材料。

本实验所研究材料为籼稻品种R173、粳稻品种日本晴。

2. 2份供试材料直链淀粉含量鉴定。

直链淀粉含量鉴定方法同实施例1所述。

结果表明，R173为高直链淀粉含量品种（26.5%），日本晴为低直链淀粉含量品种（12.3%）。

3. 2份供试材料DNA提取，PCR扩增分析。

DNA提取和PCR扩增方法同实施例1所述。

4. 功能标记Wx-a/b扩增产物DNA熔解温度检测方法。

熔解温度检测方法同实施例1所述。

结果表明，R173扩增产物DNA熔解温度较日本晴高1℃（图2），说明R173含有Wx ^a，而日本晴为Wx ^b；表明所利用的功能标记可以区分高直链淀粉含量与低直链淀粉含量的水稻品种，准确率达100%。

5. 利用PCR ACC I法鉴定Wx ^a、Wx ^b及其杂合型。

鉴定方法同实施例1所述。

结果表明，基因型Wx ^a（R173）能够被ACC I酶切，其产物只剩下403 bp的片段能被检测到；基因型为Wx ^b（日本晴）的则无法被切开，只有460 bp的片段；杂合型则同时检测到460 bp和403 bp的条带（图3）。可见，功能标记Wx-a/b的分型结果与PCR ACC I标记的检测结果是完全一致的，两种标记都能够准确区分Wx ^a、Wx ^b及其杂合型。说明熔解温度检测与常规凝胶电泳结果一致，可代替凝胶电泳检测Wx基因型，提高检测效率。

SEQUENCE LISTING

<110> 华南农业大学

<120> 一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b及其使用方法和应

用

<130>

<160> 4

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 22

<212> DNA

<213> Wx-a/b-out-F

<400> 1

taccaggact tgtttggagc tt 22

<210> 2

<211> 22

<212> DNA

<213> Wx-a/b-out-R

<400> 2

aaaccttaac cataggagca gc 22

<210> 3

<211> 24

<212> DNA

<213> Wx-a/b-in-F

<400> 3

tgttaggttg catttactgg gagt 24

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> Wx-a/b-in-R

<400> 4

caaaccttaa ccataggagc agc 23

Claims

1.一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因的功能标记Wx-a/b，其特征在于，所述的功能标记Wx-a/b由引物Wx-a/b-out、Wx-a/b-in构成，引物Wx-a/b-out由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2组成；引物Wx-a/b-in由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4组成。

2.根据权利要求1所述的功能标记Wx-a/b，其特征在于，所述的水稻是指品种为R173、日本晴的水稻。

3.一种利用DNA熔解温度分析水稻Wx基因型的方法，其特征在于，包括如下步骤：利用权利要求1或2所述的功能标记Wx-a/b进行两轮PCR扩增，第一轮PCR以水稻基因组DNA为模板，利用Wx-a/b-out引物扩增；第二轮PCR以稀释的第一轮PCR扩增产物为模板，利用Wx-a/b-in引物扩增；然后检测第二轮PCR扩增产物DNA熔解温度，通过熔解温度高低区分Wx ^a与Wx ^b基因序列差异，从而判别待测水稻材料的基因型。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

5.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，含有Wx ^a基因型的DNA的熔解温度较含有Wx ^b基因型的DNA的熔解温度高0.8~1.2℃。

6.根据权利要求3或4所述的方法，其特征在于，Wx ^a基因型的DNA的熔解温度为74.2~74.4℃，Wx ^b基因型的DNA的熔解温度为73.2~73.4℃。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，Wx ^a基因型的DNA的熔解温度为74.3℃，Wx ^b基因型的DNA的熔解温度为73.3℃。

8.权利要求1或2所述的功能标记Wx-a/b在Wx基因的分子标记辅助选择中的应用。

9.权利要求1或2所述的功能标记Wx-a/b在水稻品种选育方面的应用。