CN104032027B - 转基因玉米mir604转化事件特异性定量pcr精准检测的引物和探针及方法 - Google Patents

转基因玉米mir604转化事件特异性定量pcr精准检测的引物和探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量分析方法，具体是指转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物序列MIR604eveF、下游引物序列MIR604eveR、荧光探针序列MIR604eveP、MIR604的DNA稀释液以及Taqman Master mix（2×）和水配制成PCR反应体系，进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含转基因MIR604品系生物成分检测。

Description

转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测的引物和探针及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量的分析方法。
背景技术
国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，同时弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系，更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，建立一种新型转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法已成为必要。
目前关于转基因玉米MIR604的检测技术，主要集中在普通定性PCR分析方法和标准，尚无关于扩增检测转基因玉米MIR604及产品的转化事件特异性某特定位点（基因序列）的定量PCR精准检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米MIR604及产品的转化事件特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。
本发明通过下述技术方案实现：
转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测的引物和探针，
其中，上游引物序列，MIR604eveF：5'-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3'；
下游引物序列，MIR604eveR：5'-CGACGCTTGCGCGAG-3'；
荧光探针序列，MIR604eveP：5'-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3'。
转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法，包括以下步骤：
（1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，MIR604eveF：5'-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3'
下游引物序列，MIR604eveR：5'-CGACGCTTGCGCGAG-3'
荧光探针序列，MIR604eveP：5'-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3'；
（2）制备MIR604的DNA稀释液；
（3）配制PCR反应体系；
（4）定量PCR检测。
进一步地，步骤（1）所述合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤（2）所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
再进一步地，步骤（3）所述的配制PCR反应体系，即将DNA稀释液加入到反应体系中配制成20μl的反应体系，所述20μl的反应体系包括以下组分：
TaqmanMastermix（2×）10μl
上游引物1μl
下游引物1μl
荧光探针0.5μl
DNA稀释液4.0μl
水3.5μl。
另外，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
本发明具有以下优点及有益效果：
（1）本发明打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；
（2）本发明弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系；
（3）本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权；
（4）本发明扩增效率高、准确度高。
附图说明
图1为本发明对非目标转化体的转基因作物和非转基因作物的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法，主要包括以下步骤：
（1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，MIR604eveF：5'-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3'
下游引物序列，MIR604eveR：5'-CGACGCTTGCGCGAG-3'
荧光探针序列，MIR604eveP：5'-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3'。
本实施例引物及荧光探针的合成浓度均为10μmol/l。
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米MIR604及产品的转化事件特异性某特定位点，即目的基因与受体玉米基因组旁侧位点设计；通过该设计就可以精准检测转基因玉米中MIR604的转化事件。
（2）制备MIR604的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米MIR604中提取出浓度为50ng/μl的DNA稀释液。
（3）配制PCR反应体系；即将DNA稀释液加入到反应体系中配制成20μl的反应体系，所述20μl的反应体系包括以下组分：
TaqmanMastermix（2×）10μl
上游引物1μl
下游引物1μl
荧光探针0.5μl
DNA稀释液4.0μl
水3.5μl。
（4）定量PCR检测。
根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。
采用本发明对非转基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15个玉米转化体，5个水稻转化体，5个大豆转化体，3个棉花转化体，3个油菜转化体和1个甜菜转化体进行了特异性检测，检测结果如图1所示，从图1可看出本发明设计的引物和探针对以上非转基因作物和转基因转化体均没有非特异扩增。另外图1中△Rn代表荧光原始信号减去背景信号的值。
同时，采用本发明对1%的转基因玉米MIR604转化事件特异性片段进行定量检测，连续重复做10个平行样品的检测数据见表1。
表1检测样品（1%，CRM）转基因玉米MIR604特异片段定量检测结果
实验次数 构建特异序列Ct值 构建特异序列绝对含量（ng） zSSⅡbCt值 zSSⅡb绝对含量（ng） 构建特异序列相对含量（%）
1 32.067 3.260 23.577 271.363 1.20
2 32.018 3.374 23.415 302.365 1.12
3 31.993 3.434 23.400 305.339 1.12
4 31.988 3.446 23.268 333.564 1.03
5 31.987 3.447 23.267 333.684 1.03
6 31.965 3.500 23.254 336.798 1.04
7 31.963 3.506 23.234 341.120 1.03
8 31.943 3.554 23.234 341.318 1.04
9 31.926 3.596 23.232 341.694 1.05
10 31.919 3.616 23.223 343.740 1.05
平均值 31.977 3.473 23.310 325.098 1.07
另外，采用不同核酸浓度的10%转基因玉米MIR604片段对本发明方法的灵敏度进行检测，检测结果见表2。
表2转基因玉米MIR604结构特异片段灵敏度检测结果
采用本方法能够精准检测转基因玉米中MIR604品系特异片段及其含量，获得标准曲线斜率，在-3.6～-3.1之间，相关系数大于0.99，扩增效率为100.6%，在90%～110%的范围内。待检样品的定量检测结果（1.07%）非常接近真实值（1%），检测结果的偏差率小于国际认可的25%，检测结果的不确定度小于10%。本发明灵敏度测定结果表面，本发明最低能检测到核酸浓度为0.012ng，约为5个拷贝。
由以上检测结果可得知，本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方法的范围，本发明的扩增效率高、准确度高。
SEQUENCELISTING
<110>四川省农业科学院分析测试中心
<120>转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测的引物和探针及方法
<130>
<160>3
<170>PatentInversion3.3
<210>1
<211>21
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>上游引物（MIR604eveF）
<400>1
gccgtatccgcaatgtgttat21
<210>2
<211>15
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>下游引物（MIR604eveR）
<400>2
cgacgcttgcgcgag15
<210>3
<211>19
<212>DNA
<213>Artificial
<220>
<223>荧光探针（MIR604eveP）
<400>3
agagttggtggtacgggta19

Claims (5)

1.转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测的引物和探针，其特征在于,
上游引物序列，MIR604eveF：5'-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3'；
下游引物序列，MIR604eveR：5'-CGACGCTTGCGCGAG-3'；
荧光探针序列，MIR604eveP：5'-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3'。
2.转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于,包括以下步骤：
（1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，MIR604eveF：5'-GCCGTATCCGCAATGTGTTAT-3'
下游引物序列，MIR604eveR：5'-CGACGCTTGCGCGAG-3'
荧光探针序列，MIR604eveP：5'-FAM-AGAGTTGGTGGTACGGGTA-TAMRA-3'；
（2）制备MIR604的DNA稀释液；
（3）配制PCR反应体系；
（4）定量PCR检测。
3.根据权利要求2所述的转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（1）所述合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/L，步骤（2）所述制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μL。
4.根据权利要求3所述的转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（3）所述的配制PCR反应体系，即将DNA稀释液加入到反应体系中配制成20μl的反应体系，所述20μl的反应体系是由以下组分组成：
2×TaqmanMastermix10μl
上游引物1μl
下游引物1μl
荧光探针0.5μl
DNA稀释液4.0μl
水3.5μl。
5.根据权利要求2或4所述的转基因玉米MIR604转化事件特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，60℃退火60s，45个循环。
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