CN101641443A - 玉米事件dp-098140-6，鉴定和/或检测其的组合物和方法 - Google Patents
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Abstract
提供了涉及转基因草甘膦/ALS抑制剂耐性玉米植物的组合物和方法。具体地，本发明提供了具有赋予针对草甘膦和至少一种ALS－抑制除草剂的DP－098140－6事件的玉米植物。在所述的染色体位置上拥有DP－098140－6事件的玉米植物包含具有至少SEQ ID NO：5和/或6的多核苷酸序列的基因组/转基因连接。DP－098140－6事件的基因组插入位点的表征提供了增强的育种效率并使得能够应用分子标记以在育种群体及其后代中追踪转基因插入片段。提供了用于鉴定、检测和应用玉米事件DP－098140－6的各种方法和组合物。
Description
发明领域
本发明属于分子生物学领域。更具体地，本发明涉及通过联合表达赋予针对草甘膦的耐性的序列和赋予针对一种或更多种ALS抑制剂化学物质耐性的序列而赋予的多重除草剂耐性。
发明背景
已知外源基因在植物中的表达受到它们在植物基因组中的位置的影响，可能是由于染色质结构(例如，异染色质)或转录调控元件(例如，增强子)接近整合位点的邻近性(Weising等(1988)Ann.Rev.Genet 22：421-477，1988)。同时，在基因组不同位置的转基因的存在以不同的方式影响植物的整个表型。由于这一原因，通常需要筛选大量的事件，以鉴定其特征在于最优化表达所导入的感兴趣基因的事件。例如，已在植物和其它生物中观察到在不同的事件之间可能存在所导入基因表达水平的很大不同。还可能存在表达空间或时间模式的差异，例如，在不同植物组织中转基因相对表达的不同，这可能与从存在于所导入的基因构建物中的转录调控元件所期望的模式不一致。还观察到转基因插入可能会影响内源基因的表达。由于这些原因，通常产生几百至几千个不同的事件，并且为具有对于商业目的而言期望的转基因表达水平和模式的单个事件对这些事件进行筛选。具有期望转基因表达水平或模式的事件可用于通过应用常规育种方法的有性异型杂交将该转基因渐渗入到其它遗传背景中。此类杂交的后代保持了最初转化体的转基因表达特征。这一策略可用于确保在适于本地生长条件的各种变体中的可靠的基因表达。
能够检测特定事件的存在以确定有性杂交后代是否保持了感兴趣的转基因将是有利的。此外，用于检测特定事件的方法可能有助于遵守需要售前许可的规章以及标记来源于重组农作物的食物，或用于环境监测、监测田地中作物的性状、或监测来源于作物收获的产品，以及用于保证受规章或合同条款约束的各方的遵守。
在作物的商业生产中，期望能够简单快速地从作物植物田地中消除不想要的植物(即，“杂草”)。理想的处理是可以是这样的处理：即能将其施用于整个田地，但其能够仅仅除去不想要的植物，同时使得作物植物不受到伤害。一种此类处理系统可能包括应用对除草剂具有耐性的作物植物，因此，当将除草剂喷雾于耐除草剂作物植物田地上时，作物植物将继续生长，而非耐除草剂的野草则被杀死或严重受损。理想地，此类处理可以利用各种除草剂特性，因此杂草控制可以提供灵活性或经济性的最佳可能组合。例如，单个的除草剂在田地中具有不同的寿命，有些除草剂在被施与至田野后能持续并在相对长的时间内有效，而其它除草剂被很快地降解为其它和/或非活性化合物。理想的处理系统将允许使用不同的除草剂，因此种植者能够根据特定的情况修改除草剂的选择。
由于主要杂草物种及优选的作物物种在位置和地域上的差异，存在对于作物保护和杂草管理的定制系统的持续需求，所述定制系统能够适应特定地域、地理和/或位置的需求。需要能够快速鉴定产生此类特性的植物事件的方法和组合物。例如，存在对于作物保护和杂草管理方法的持续需要，其能够降低：控制田地中杂草所需的施用除草剂的次数；控制田地中杂草所需的除草剂的量；生产作物所需耕作的量；和/或延缓或预防除草剂抗性杂草发展和/或出现的程序。存在对于允许靶向应用特定除草剂组合的作物保护和杂草管理的方法和组合物的以及有效检测此类事件的持续需要。
发明概述
提供了涉及转基因草甘膦/ALS抑制剂耐性玉米植物的组合物和方法。具体地，本发明提供了含有DP-098140-6事件的玉米植物，所述事件赋予针对草甘膦和至少一种ALS-抑制除草剂的抗性。在叙述的染色体位置上拥有DP-098140-6事件的玉米植物包含具有至少SEQID NO：5和/或6多核苷酸序列的基因组/转基因连接。还提供了以专利保藏号PTA-8296保藏的种子，以及来源于其的植物、植物细胞、植物部分、谷物、和植物产品。事件DP-098140-6的基因组插入位点的性质提供了增强的育种效率并使得能够应用分子标记以在育种群体及其后代中追踪转基因插入片段。提供了用于鉴定、检测和应用玉米事件DP-098140-6的各种方法和组合物。
附图简述
图1显示了PHP24279的质粒图谱。质粒PHP24279被用于产生DP-098140-6玉米系。
图2提供了来自质粒PHP24279的T-DNA的概要图谱，其显示了具有附加的侧翼边缘序列的各种遗传元件。RB表示右侧翼边缘序列以及LB表示左侧翼边缘序列。显示了引物100235、99878、99885和100240的位置。
图3显示了来自PHP24279的T-DNA的图谱，并且展示了引物0601738和0601734的位置。
图4提供了事件DP-098140-6的育种图解。
图5提供了DP-098140-6中DNA插入片段的概要图谱，标出了EcoR V和Spe I位点。虚线表示在所插入的PHP24279T-DNA侧翼的基因组区域。
图6提供了来自质粒PHP24279的T-DNA的概要图谱，标出了在glyat4621和zm-hra表达盒之内的遗传元件的位置，以及EcoR V和Spe I的限制性酶位点的碱基对位置。T-DNA的总大小为7386个碱基对。探针概略地标示为图谱下的编号的表格，并且在下面予以确认。表24中提供了对于这些探针的其它细节。
图7A-7C提供了对于事件DP-098140-6的全部侧翼及全部转基因插入片段的核苷酸序列(SEQ ID NO：48)。
发明详述
以下将参照附图更完整地描述本发明，其中显示了本发明一些但不是全部的实施方案。实际上，可以以许多不同的形式实施这些发明，并且不应当理解为限制至本文所列出的实施方案；而是，提供这些实施例以使得本发明将满足可实施的法律需要。全文中，相同的数字表示相同的元件。
本发明所属领域的技术人员能够想到具有前面的描述和相关附图中所存在的教导的益处的本文所提出的发明的许多修改和其它实施方案。因此，应当理解，本发明不限于所公开的特定实施方案，预期那些修改和其它实施方案也包括在所附权利要求的范围之内。尽管本文应用了特定的术语，但它们仅以一般的和描述性的意义使用，并且不用于限定的目的。
提供了涉及转基因草甘膦/ALS抑制剂耐性玉米植物的组合物和方法。具体地，本发明提供了具有事件DP-098140-6的玉米植物。DP-098140-6也称为事件E6631.98.40或事件98140。已通过插入来源于地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)的草甘膦乙酰转移酶(glyat4621)基因和玉米乙酰乳酸合酶基因的修饰形式(zm-hra)对具有“事件DP-098140-6”的玉米植物进行了修饰。通过基因改组方法功能性地改良了glyat4621基因，以优化草甘膦乙酰转移酶(GLYAT)乙酰化除草剂草甘膦的活性的动力学。在植物中插入glyat4621基因通过将草甘膦转化为非毒性乙酰化形式而赋予针对除草剂活性组分草甘膦的抗性。插入zm-hra基因产生了乙酰乳酸合酶(ALS)的修饰形式。ALS对于支链氨基酸的生物合成很重要，并且会被某些除草剂抑制。在zm-hra基因中的修饰克服了这一抑制，并且因此提供了针对大量ALS-抑制除草剂的耐性。因此，具有事件DP-098140-6的玉米植物具有对草甘膦和至少一种ALS-抑制除草剂的耐性。
将赋予草甘膦和ALS抑制剂耐性的多核苷酸连接在相同的DNA构建物上，并且插入到玉米基因组中描述的位置上，由此产生DP-098140-6玉米事件。在叙述的染色体位置上拥有DP-098140-6事件的玉米植物包含具有至少SEQ ID NO：5和/或6的多核苷酸序列的基因组/转基因连接。事件DP-098140-6的基因组插入位点的性质提供了增强的育种效率并使得能够应用分子标记以在育种群体及其后代中追踪转基因插入片段。提供了用于鉴定、检测和应用玉米事件DP-098140-6的各种方法和组合物。本文所使用的术语“事件DP-098140-6特异的”是指适于有辨别力地在植物、植物材料或在产品中鉴定事件DP-098140-6的多核苷酸序列，所述产品诸如但不限于包含或来源于植物材料的食物或饲料产品(新鲜的或加工的)。
组合物还包括以专利保藏号PTA-8296保藏的种子，以及来源于它们的植物、植物细胞和种子。申请人于2007年3月28日在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，Manassas，VA 20110-2209美国，保藏了至少2500粒玉米事件DP-098140-6的种子，且对保藏指定了ATCC保藏号PTA-8296。这些保藏将根据国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约而保持。这些保藏仅仅是方便本领域技术人员，并且不是承认保藏是根据35U.S.C.§112所需。在2007年3月28日以ATCC保藏的种子来自由Pioneer Hi-Bred International，Inc.，7250 NW62nd Avenue，Johnston，Iowa 50131-1000保持的保藏。在本申请未决期间，这一保藏对于专利和商标专员以及根据请求被专利商标专员确定的待授予其权利的人是可获得的。当允许本申请任一权利要求时，依据37C.F.R.§1.808，申请人将使得杂交玉米38N86在美国典型培养物保藏中心(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，VA20110-2209的至少2500粒种子的保藏样品对于公众是可获得的。玉米事件DP-098140-6种子的这一保藏将在ATCC保藏中心(其为公共保藏所)中维持30年的时间，或最近请求后5年，或维持专利的可实施期间，无论哪个较长，并且如果其在该期间变得不存活时，将进行替换。此外，申请人满足了37C.F.R.§§1.801-1.809的所有要求，包括提供保藏时样品存活的证明。申请人没有权力免除由法律限定的在生物材料转移或其在商业上运输上的限制。申请人没有免除对这一专利授予的他们的权利或在植物品种保护法(Plant Variety ProtectionAct)(7USC 2321以及下列等等)下可应用于事件DP-098140-6的权利的任何侵犯。未被授权的种子繁殖是被禁止的。该种子可能会受到控制。
本文所使用的术语“玉米”的意思是任何玉米植物并且包括能够用玉米繁殖的所有植物品种。本文所使用的术语植物包括植物细胞、植物器官、植物原生质体、从其中可以再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物丛、在植物或植物部分中完整无缺的植物细胞、所述植物部分诸如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、茎、根、根尖、花药等。谷粒是指商业种植者为非种植或再生该物种的目的生产的成熟种子。再生植物的后代、变种或突变种也包括在本发明的范围内，只要这些部分包含DP-098140-6事件。
转基因“事件”是通过如下产生的：用包括包含感兴趣的转基因的核酸表达盒的异源DNA构建物转化植物细胞，再生由将转基因插入到植物基因组而得到的植物群，以及选择特征在于插入到特定基因组位置的特定植物。事件通过转基因的表达具有表型上的特征。在遗传水平，事件是植物遗传组成的部分。术语“事件”还指通过转化体和包括异源DNA的另一品种之间有性异型杂交产生的后代。甚至在与回归亲本重复回交后，来自转化亲本的所插入的DNA和侧翼DNA在相同的染色体位置上存在于杂交后代中。术语“事件”还指来自最初转化体的DNA，其包含插入DNA和紧邻该插入DNA的侧翼序列，预期其能被转移至作为有性杂交的结果而接受了包括感兴趣的转基因的插入DNA的后代，其中所述有性杂交是包括该插入DNA的亲本系(例如，最初的转化体和从自交产生的后代)和不含有该插入DNA的亲本系的杂交。
本文所使用的“插入DNA”是指在用于转化植物材料的表达盒内的异源DNA，而“侧翼DNA”可以包含天然存在于生物诸如植物中的基因组DNA，或通过转化方法导入的外源(异源)DNA、其对于原始插入DNA分子来说是外来的，例如，与转化事件相关的片段。本文所使用的“侧翼区域”或“侧翼序列”是指至少20、50、100、200、300、400、1000、1500、2000、2500或5000个碱基对或更多碱基对的序列，其紧接位于原始外源插入DNA分子的上游且与其邻接，或紧接位于原始外源插入DNA分子的下游且与其邻接。DP-098140-6事件侧翼区域的非限制性实例包括SEQ ID NO：1、2和46所示多核苷酸序列及其变体和片段。
导致外源DNA随机整合的转化方法将产生含有不同的且对于每一转化体特有的侧翼区域特征的转化体。当通过传统杂交将重组DNA导入植物时，其侧翼区域通常将不会改变。转化子将还含有在一段异源插入DNA和基因组之间的、或两段基因组DNA、或两段异源DNA之间的独特的连接。“连接”是其中两个特定DNA片段连接的位点。例如，在插入DNA连接侧翼DNA的地方存在连接。当两个DNA片段以这样一种方式连接在一起，所述方式是从天然生物中发现的方式经修饰的时，在转化生物中也存在连接点。本文所使用的“连接DNA”是指包含连接点的DNA。来自DP-098140-6事件的连接DNA的非限制性实例如SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、48、49或50或其变体和片段所示。
可以通过首先有性杂交生长自转基因DP-098140-6玉米植物(或来源于具有赋予除草剂耐性的本发明实施方案的表达盒的转化体的其后代)的第一亲本玉米植物及缺乏除草剂耐性表型的第二亲本玉米植物而繁殖DP-098140-6植物，由此产生复数个第一后代植物；并且然后选择展示出所期望的除草剂耐性的第一后代植物；并且使该第一后代植物自交，由此产生复数个第二后代植物；并且然后从展示出所期望的除草剂耐性的第二后代植物中挑选。这些步骤还可以包括使第一除草剂耐性后代植物或第二除草剂耐性后代植物与第二亲本玉米植物或第三亲本玉米植物回交，由此产生展示出所期望的除草剂耐性的玉米植物。进一步认识到，针对表型分析后代不是必需的。可以应用在本文其它地方公开的各种方法与组合物检测和/或鉴定DP-098140-6事件。
还可以使两种不同的转基因植物有性杂交以产生含有两种独立隔离添加的外源基因的后代。合适后代的自交能够产生对于两种所添加的外源基因而言纯合的植物。如无性繁殖那样，也预期了与亲本植物的回交以及与非转基因植物的异型杂交。可以在若干参考之一中找到通常用于不同性状和作物的其它育种方法的描述，例如Fehr，在Breeding Methods for Cultivar Development中，Wilcos J.编辑，American Society of Agronomy，Madison Wis.(1987)。
术语“种质”是指代表基因型、品种、物种或培养物的个体、个体群或克隆，或其遗传材料。
“系”或“株”是通常近亲交配至某种程度且通常是等基因或接近等基因的同一家系的个体组。
一般培养近亲交配玉米系用于产生玉米杂种，以及在产生新的和不同的近亲交配玉米系的繁殖群体中用作种质。近亲交配玉米系通常被用作通过传统育种和/或分子渐渗技术渐渗入新性状的靶标。近亲交配玉米系需要是高度同质、纯合且可再生的，以用作商业杂种的亲本。可利用许多分析方法以确定近亲交配系的纯合性和表型稳定性。
短语“杂种植物”是指从遗传上不同的个体之间的杂交产生的植物。
本发明上下文中的术语“杂交的”或“杂交”的意思是配子的融合，例如，在植物的情况下通过授粉以产生后代(即，细胞、种子或植物)。该术语包含有性杂交(通过另一植物给一株植物授粉)，以及在植物的情况下，自交(自花传粉，即当花粉和胚珠来自于同一植物时)。
术语“渐渗”是指将来自一个遗传背景的基因座的期望的等位基因转移至另一背景。在一种方法中，可通过两个亲本之间的有性杂交渐渗入期望的等位基因，其中至少亲本之一在其基因组中具有期望的等位基因。
在一些实施方案中，将赋予本发明的玉米DP-098140-6事件的多核苷酸操作至分子堆积(molecular stack)中。在其它实施方案中，该分子堆积还包含至少一种赋予第三除草剂耐性的另外多核苷酸。在一个实施方案中，该序列赋予针对草铵膦的耐性；并且在特定的实施方案中，该序列包含pat基因。
在其它实施方案中，本发明的玉米DP-098140-6事件包含一个或更多个感兴趣的性状；以及在更特定的实施方案中，用感兴趣的多核苷酸序列的任意组合堆积(stack)植物，以产生具有所期望的性状组合的植物。本文所使用的性状是指来源于特定序列或序列组的表型。例如，可用任何其它编码具有杀虫和/或杀昆虫活性的多肽的多核苷酸堆积除草剂耐性多核苷酸，所述多肽诸如苏云金芽孢杆菌(Bacillusthuringiensis)毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892、5,747,450、5,737,514、5,723,756、5,593,881；Geiser等，(1986)Gene 48：109；Lee等(2003)Appl.Environ.Microbiol.69：4648-4657(Vip3A)；Galitzky等(2001)Acta Crystallogr.D.Biol.Crystallogr.57：1101-1109(Cry 3BbI)；以及Herman等(2004)J.Agric.Food Chem.52：2726-2734(Cry 1F))、凝集素(Van Damme等(1994)Plant MoI.Biol.24：825)、pentin(描述于美国专利号5,981,722)，等等。所产生的组合还可以包括多个拷贝的任一感兴趣的多核苷酸。
在一些实施方案中，可以用其它除草剂耐性性状堆积玉米DP-098140-6事件，以产生具有进一步改善的特性的本发明转基因植物。可用于此类实施方案的其它除草剂耐性多核苷酸包括通过其它作用模式赋予针对草甘膦或针对ALS抑制剂的耐性的那些，例如，诸如，编码草甘膦氧化还原酶的基因，如在美国专利号5,776,760和5,463,175中更完整地描述的那样。其它可与玉米DP-098140-6事件联合的性状包括来源于赋予植物产生较高水平的5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶(EPSPS)能力的多核苷酸的那些，例如，如在美国专利号6,248,876B1、5,627,061、5,804,425、5,633,435、5,145,783、4,971,908、5,312,910、5,188,642、4,940,835、5,866,775、6,225,114B1、6,130,366、5,310,667、4,535,060、4,769,061、5,633,448、5,510,471、Re.36,449、RE 37,287E和5,491,288；以及国际公开WO 97/04103、WO 00/66746、WO 01/66704和WO 00/66747中更完整地描述的那样。其它可与玉米DP-098140-6事件联合的性状包括赋予针对磺酰脲和/或咪唑啉酮的抗性的那些，例如，如在美国专利号5,605,011、5,013,659、5,141,870、5,767,361、5,731,180、5,304,732、4,761,373、5,331,107、5,928,937和5,378,824；以及国际公开WO 96/33270中更完整地描述的那样。
在一些实施方案中，可用例如羟苯丙酮酸二加氧酶(hydroxyphenylpyruvatedioxygenases)堆积玉米DP-098140-6事件，所述酶催化其中将对羟苯丙酮酸酯(HPP)转化为尿黑酸酯的反应。抑制该酶且结合至该酶以抑制HPP转化为尿黑酸酯的分子可用作杀虫剂。在植物中赋予针对此类杀虫剂耐性的性状描述于美国专利号6,245,968B1、6,268,549和6,069,115；以及国际公开WO 99/23886中。可与玉米DP-098140-6事件堆积的合适的除草剂耐性性状的其它实例包括芳氧基链烷酸酯二加氧酶多核苷酸(据报道其赋予针对2，4-D和其它苯氧基植物生长素除草剂以及针对芳氧基苯氧基丙酸酯除草剂的耐性，例如，如在WO2005/107437中描述的那样)，以及麦草畏耐性多核苷酸，例如，如在Herman等(2005)J.Biol.Chem.280：24759-24767中描述的那样。
可与玉米DP-098140-6事件联合的除草剂耐性性状的其它实例包括编码外源草丁膦(phosphinothricin)乙酰转移酶的多核苷酸赋予的那些，如在美国专利号5,969,213、5,489,520、5,550,318、5,874,265、5,919,675、5,561,236、5,648,477、5,646,024、6,177,616和5,879,903中描述的那样。含有外源草丁膦乙酰转移酶的植物能够展示出增强了的针对草铵膦除草剂的耐性，所述草铵膦抑制谷胺酰胺合酶。可与玉米DP-098140-6事件联合的除草剂耐性性状的其它实例包括赋予经改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的多核苷酸赋予的那些，如在美国专利号6,288,306B1、6,282,837B1和5,767,373；以及国际公开WO01/12825中描述的那样。含有此类多核苷酸的植物能够展示出增强了的针对靶向protox酶的任何除草剂(也称作“protox抑制剂”)的耐性。
可与玉米DP-098140-6事件联合的除草剂耐性性状的其它实例包括在植物，例如诸如玉米植物或小白酒草中赋予针对至少一种除草剂的耐性的那些。除草剂耐性杂草在本领域是已知的，正如针对特定除草剂的抗性不同的植物那样。例如，参见Green和Williams(2004)″Correlation of Corn(Zea mays)Inbred Response to Nicosulfuron and Mesotrione，″Kansas City，Missouri，2004年2月9-12日的WSSA年会上提交的墙报；Green(1998)Weed Technology 12：474-477；Green和Ulrich(1993)Weed Science 41：508-516。可以通过育种或通过其它方法将负责这些耐性的性状与玉米DP-098140-6事件联合，以提供本发明的植物以及其使用方法。
还可将玉米DP-098140-6事件与至少一种其它性状联合以产生还包含各种期望的性状组合的本发明植物，所述性状组合包括但不限于，动物饲养所期望的性状，诸如高油含量(例如，美国专利号6,232,529)；均衡的氨基酸含量(例如hordothionins(美国专利号5,990,389、5,885,801、5,885,802和5,703,409；美国专利号5,850,016))；大麦高赖氨酸(Williamson等(1987)Eur.J.Biochem.165：99-106和WO98/20122)及高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等(1986)J.Biol.Chem.261：6279；Kirihara等(1988)Gene 71：359；和Musumura等(1989)PlantMol.Biol.12：123))；增加的可消化性(例如，修饰的储存蛋白质(美国申请号10/053,410，2001年11月7日提交))；以及硫氧还蛋白(美国申请号10/005,429，2001年12月3日提交)；这些文献公开的内容都通过引用的方式引入本文。期望的性状组合还包括LLNC(低亚麻酸含量，例如参见Dyer等(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.59：224-230)和OLCH(高油酸含量，例如参见Fernandez-Moya等(2005)J.Agric.Food Chem.53：5326-5330)。
还可以使玉米DP-098140-6事件与其它期望的性状联合，所述性状例如，诸如串珠镰孢菌毒素解毒基因(美国专利号5,792,931)、无毒性和疾病抗性基因(Jones等(1994)Science 266：789；Martin等(1993)Science 262：1432；Mindrinos等(1994)Cell 78：1089)；以及诸如以下的加工的或过程产品所期望的性状：修饰的油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))、修饰的淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)、以及淀粉去分支酶(SDBE))；以及聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5,602,321；β-酮硫解酶，聚羟基丁酸酯合酶，以及促进聚羟基链烷酸酯(PHAs)表达的乙酰乙酰基-CoA还原酶(Schubert等(1988)J.Bacteriol.170：5837-5847))；这些文献公开的内容都通过引用的方式引入本文。还可以将除草剂耐性多核苷酸与提供农学性状的多核苷酸联合，所述农学性状诸如雄性不育(例如参见美国专利号5.583,210)、茎强度、开花时间；或转化技术性状，诸如细胞周期调控或基因靶向(例如，WO99/61619、WO 00/17364和WO 99/25821)；这些文献公开的内容都通过引用的方式引入本文。
在另一实施方案中，玉米DP-098140-6事件还可以与RcgI序列或其生物活性变体或片段联合。该RcgI序列是谷类中的炭疽病茎腐烂抗性基因。例如，参见美国专利申请号11/397,153、11/397,275和11/397,247，其每一个都通过引用的方式引入本文。
可通过任何方法产生这些堆积的组合，包括但不限于通过常规方法繁殖植物，或遗传转化。如果通过遗传转化植物堆积序列，可以在任何时间以任何顺序联合感兴趣的多核苷酸序列。可以用由转化盒的任意组合提供的感兴趣的多核苷酸以共转化方案同时导入这些性状。例如，如果将要导入两个序列，则该两个序列可以包含在分开的转化盒中(反式)或包含在同一转化盒中(顺式)。可以由相同的启动子或不同的启动子驱动序列的表达。在某些情况下，导入将抑制感兴趣的多核苷酸表达的转化盒可能是合意的。这可以与其它抑制盒或过表达盒的任意组合联合，以在植物中产生期望的性状组合。进一步认识到可以应用位点特异性重组系统在期望的基因组位置堆积多核苷酸序列。例如参见，WO99/25821、WO99/25854、WO99/25840、WO99/25855和WO99/25853，其所有均通过引用的方式引入本文。
如在本文所使用的那样，术语“多核苷酸”的使用不预期将本发明限制至包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到多核苷酸可以包含核糖核苷酸以及核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。此类脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸包括天然存在的分子和合成的类似物。本发明的多核苷酸还包括序列的所有形式，包括但不限于，单链形式、双链形式、发夹、茎-环结构等等。
DP-098140-6植物包含具有草甘膦乙酰转移酶多核苷酸和遗传修饰的乙酰乳酸合酶基因(zm-hra)的表达盒。该盒可包括可操作地连接至glyat和zm-hra多核苷酸的5’和3’调控序列。“可操作地连接”是指两个或更多个元件之间的功能连接。例如，感兴趣的多核苷酸和调控序列(即，启动子)之间的可操作连接是允许感兴趣的多核苷酸表达的功能连接。可操作地连接的元件可以是邻接的和非邻接的。当用于指两个蛋白编码区域之间的连接时，可操作地连接是指编码区域位于相同的阅读框中。该盒可附加地含有至少一种待共转化至该生物的附加基因。或者，可在多重表达盒上提供该附加的基因。此类表达盒提供复数个限制性位点和/或重组位点，用于插入将在调控区域的转录调控之下的多核苷酸。该表达盒可附加地含有可选择的标记基因。
该表达盒可以在转录的5’-3’方向包括：转录和翻译起始区域(即启动子)、编码区和在植物中有功能的转录及翻译终止区域。“启动子”是指能够控制编码序列或功能RNA表达的核苷酸序列。一般地，编码序列位于启动子序列的3’端。启动子序列可以包含近侧的和更远侧上游元件，后者元件通常称为增强子。相应地，“增强子”是能够刺激启动子活性的核苷酸序列，并且可以是启动子固有的元件或是插入以增强启动子水平或组织特异性的异源元件。启动子可以是完整地来源于天然基因，或由来源于在自然中发现的不同启动子的不同元件组成，或甚至包含合成的核苷酸片段。本领域技术人员应当理解，不同的启动子可以在不同的组织或细胞类型、或在发育的不同阶段、或响应不同的环境条件指导基因的表达。在多数细胞类型中在多数时间引起核酸片段表达的启动子通常被称为“组成型启动子”。在植物细胞中有用的各种类型的新启动子不断地被发现；可在Okamuro和Goldberg(1989)Biochemistry of Plants 15：1-82的汇编中找到许多实例。还认识到，由于多数情况下调控序列的确切边界还没有被完全地定义，因此不同长度的核酸片段可能具有相同启动子活性。
表达盒还可以含有5’前导序列。此类前导序列可增强翻译。调节区(即，启动子、转录调控区、RNA加工或稳定区、内含子、多腺苷酸化信号、转录终止区以及翻译终止区)和/或编码区对于宿主细胞或彼此可以是天然的/类似的或异源的。
“翻译前导序列”是指位于基因的启动子序列和编码序列之间的核苷酸序列。该翻译前导序列存在于完全加工的mRNA的翻译起始序列上游。该翻译前导序列可能影响许多参数，包括最初转录物至mRNA的加工、mRNA稳定性和/或翻译效率。已描述了翻译前导序列的实例(Turner和Foster(1995)MoL Biotechnol 3：225-236)。“3’非编码序列”是指位于编码序列下游且包括多腺苷酸化识别序列和其它编码能够影响mRNA加工或基因表达的调控信号的序列的核苷酸序列。通常多腺苷酸化信号的特征在于影响多腺苷酸序列添加到mRNA前体的3’末端。Ingelbrecht等(1989)Plant Cell 1：671-680例证了不同3’非编码序列的应用。
如本文所使用的那样，关于序列的“异源”是来自异质物种的序列，或者，如果是来自相同的物种的话，其通过有意的人类介入在组成和/或基因组座位上从其天然形式进行了实质上的修饰。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与该多核苷酸来源的物种不同的物种，或者，如果来自相同/相似物种的话，其中的一个或两者都从它们最初的形式和/或基因组座位得到实质性修饰，或者该启动子不是用于可操作连接的多核苷酸的天然启动子。
在制备表达盒中，可对各种DNA片段进行操作，从而以适当的方向以及视情况而定在合适的阅读框中提供DNA序列。为此，可以应用接合体或连接体以连接DNA片段或可包含其它操作以提供适当的限制性位点、多余DNA的移除、限制性位点的移除等。为这一目的，可以包括体外诱变、引物修复、限制、退火、再替换等，例如转换或颠换。表达盒还可以包含用于选择转化细胞的可选择标记基因。利用可选择标记基因选择转化细胞或组织。
提供了可用于各种检测和/或鉴定玉米DP-098140-6事件的方法中的分离的多核苷酸。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或其生物活性部分基本上或实质上没有天然存在的环境中发现的通常伴随或与所述多核苷酸相互作用的组分。因此，当通过重组技术产生时，分离的或纯化的多核苷酸基本上没有其它细胞材料或培养基，或当化学合成时，基本上没有化学前体或其它化学物质。理想地，“分离的”多核苷酸没有这样的序列，即在该多核苷酸来源的生物的基因组DNA中，所述序列(理想地为蛋白质编码序列)天然地在该多核苷酸的侧翼(即，位于该多核苷酸5’和3’末端的序列)。例如，在各种实施方案中，分离的多核苷酸可以含有少于约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的这种序列，在该多核苷酸来源的生物的基因组DNA中，所述序列天然地位于该多核苷酸侧翼。
在特定的实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO：5或6所示的连接DNA序列。在其它实施方案中，本发明的多核苷酸包含SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、48、49或50所示连接DNA序列或其变体或片段。在特定的实施方案中，本文描述的检测方法扩增包含DP-098140-6特定事件的连接的多核苷酸。连接DNA序列片段或变体适于有辨别力地鉴定事件DP-098140-6。如在本文其它地方所讨论的那样，此类序列可用作引物和/或探针。
在其它实施方案中，本发明的多核苷酸包含能够检测DP-098140-6事件或DP-098140-6特异区域的多核苷酸。此类序列包括SEQ ID NOS：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57所示的任意多核苷酸或其变体和片段。检测DP-098140-6事件或DP-098140-6特异区域的多核苷酸的片段和变体适于有辨别力地鉴定事件DP-098140-6。如在本文其它地方所讨论的那样，此类序列可用作引物和/或探针。还提供了包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、23、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56所示序列或其互补序列，或由上述序列组成的分离的DNA核苷酸引物序列。
“变体”的意思是基本上类似的序列。对于多核苷酸，变体包含具有在5’和/或3’末端的缺失(即，截短)；在天然多核苷酸的一个或更多个内部位置的一个或更多个核苷酸的缺失和/或添加；和/或在天然多核苷酸的一个或更多个位置的一个或更多个核苷酸替换的多核苷酸。
本文所使用的“探针”是分离的多核苷酸，其附着有常规的可检测标签或报告分子，例如放射性同位素、配体、化学发光剂、酶等等。此类探针与靶多核苷酸的链互补，在本发明的情况下，与从玉米事件DP-098140-6分离的DNA的链互补，不管是来自玉米植物还是来自包括来自该事件的DNA的样品。根据本发明的探针不仅包括脱氧核糖核酸或核糖核酸，还包括聚酰胺和其它能够特异性地检测靶DNA序列存在的探针材料。
本文所使用的“引物”是分离的多核苷酸，其通过核酸杂交退火至互补靶DNA链以形成引物和靶DNA链间的杂交，然后通过聚合酶，例如DNA聚合酶，沿着靶DNA链延伸。本发明的引物对是指它们用于例如通过聚合酶链式反应(PCR)或其它常规核酸扩增方法扩增靶多核苷酸的用途。“PCR”或“聚合物链式反应”是用于扩增特定DNA片段的技术(参见，美国专利号4,683,195和4,800,159；在此通过引用并入本文)。可以应用本文公开的引物(即，SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、30、31、32、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55或56)的任意组合，使得该引物对能够检测DP-098140-6事件或特异区域。引物对的非限制性实例包括SEQ ID NOS：13和14、SEQ ID NOS：15和16、SEQ ID NOS：17和18、SEQ ID NO：20和21、SEQ ID NO：51和52以及SEQ ID NO：54和55。
探针和引物有足够的核苷酸长度以结合靶DNA序列并特异性地检测和/或鉴定具有DP-098140-6事件的多核苷酸。应当认识到，可通过操作者确定杂交条件或反应条件，以达到这一结果。这一长度可以是足够用于所选择的检测方法的长度的任意长度。一般地，使用8、11、14、16、18、20、22、24、26、28、30、40、50、75、100、200、300、400、500、600、700个核苷酸或更多，或约11-20、20-30、30-40、40-50、50-100、100-200、200-300、300-400、400-500、500-600、600-700、700-800之间或更多个核苷酸长度。此类探针和引物能够在高严格杂交条件下与靶序列特异性杂交。根据本发明实施方案的探针和引物可以具有与靶序列连续核苷酸的完全DNA序列同一性，尽管通过常规方法可以设计与靶DNA序列不同且保持了特异性检测和/或鉴定靶DNA序列的能力的探针。因此，探针和引物可以与靶多核苷酸(即SEQID NO：1-57)共享约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更大的序列同一性或互补性，或可与靶序列(即SEQ ID NO：1-57)有1、2、3、4、5、6或更多个核苷酸不同。探针可用作引物，但通常经设计以结合靶DNA或RNA且不用于扩增程序。在一个非限制性实施方案中，探针可包含编码glyat4621或zm-hra序列或这些序列的任何变体或片段的多核苷酸。
特异引物可用于扩增整合片段以产生扩增子，所述扩增子能被用作“特异性探针”或对于在生物样品中鉴定事件DP-098140-6而言，其本身能被检测。或者，在PCR反应过程中可以使用本发明的探针，以允许检测扩增事件(即，TaqmanTM探针或MGB探针，所谓的实时PCR)。当在允许探针与样品结合的条件下使探针与生物样品的多核苷酸杂交时，能够检测到这一结合，并且因此允许表明生物样品中存在事件DP-098140-6。本领域已经描述了结合探针的此类鉴定。在本发明的实施方案中，特异性探针是这样的序列，即在最优化的条件下，其特异性地与位于该事件的5’或3’侧翼区域内的区域杂交且还包括部分与之邻接的外源DNA。该特异性探针可以包括与DP-098140-6事件的特异区域至少80％、80至85％之间、85至90％之间、90至95％之间、以及95至100％之间的同一(或互补)的序列。
本文所使用的“扩增的DNA”或“扩增子”是指作为核酸模板一部分的靶多核苷酸的多核苷酸扩增产物。例如，为确定由有性杂交产生的玉米植物是否含有DP-098140-6事件，可应用DNA引物对使从玉米植物组织样品提取的DNA进行多核苷酸扩增，以产生诊断DP-098140-6事件DNA存在的扩增子，其中所述DNA引物对包括来源于与所插入的异源DNA的插入位点相邻的侧翼序列的第一引物，以及来源于所插入的异源DNA的第二引物。在特定的实施方案中，该扩增子包含DP-098140-6连接多核苷酸(即，SEQ ID NO：4、5、6、7、8、9、10、11、12、48、49或50)。通过“诊断”DP-098140-6事件，意指利用在生物样品中鉴别DP-098140-6事件的存在或不存在的任何方法或测定。或者，第二引物可以来源于侧翼序列。在其它实施方案中，引物对可以来源于插入DNA两侧的侧翼序列，因此产生包括表达构建物的整个插入多核苷酸以及位于转基因插入片段侧翼的序列的扩增子。参见图2。扩增子具有一定的长度且具有也可诊断事件的序列(即，具有来自DP-098140-6事件的连接DNA)。复制子的长度可在引物对加上一个核苷酸碱基对的结合长度至能通过DNA扩增方案扩增的扩增子的任意长度之间变化。来源于侧翼序列的引物对成员可以与插入DNA序列有一定距离，这一距离可在一个核苷酸碱基对至扩增反应的极限(或约2万个核苷酸碱基对)之间变化。应用术语“扩增子”特异地排除了在DNA热扩增反应中可能形成的引物二聚体。
用于制备和应用探针和引物的方法描述于，例如，分子克隆：实验手册，第2版，卷1-3，Sambrook等编辑，Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，N.Y.1989(后文称为，“Sambrook等，1989”)；Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel等编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience，纽约，1992(周期性地更新)(后文称为，“Ausubel等，1992”)；以及Innis等，PCR Protocols：AGuide to Methods and Applications，Academic Press：San Diego，1990。可以例如通过应用用于此目的的计算机程序，诸如在Vector NTI版本6(Informax Inc.，Bethesda Md.)中的PCR引物分析工具、PrimerSelect(DNASTAR Inc.，Madison，Wis.)和Primer(版本0.5.COPYRGT.，1991，Whitehead Institute for Biomedical Research，Cambridge，Mass.)从已知序列中衍生PCR引物对。此外，可以肉眼扫描序列，并应用本领域技术人员公知的原则手工鉴定引物。
应当理解，本文使用的术语“转基因”包括任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，其基因型已通过异源核酸的存在而被改变，包括最初如此改变的那些转基因，以及通过从该最初的转基因有性杂交或无性繁殖产生的那些。本文使用的术语“转基因”不包括通过常规植物育种方法或通过天然发生的事件诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变的基因组(染色体或染色体外)的改变。
“转化”是指将核酸片段转移至宿主生物基因组中，产生遗传稳定的遗传。含有该转化的核酸片段的宿主生物被称为“转基因”生物。植物转化方法的实例包括农杆菌介导的转化(De Blaere等(1987)Meth.Enzymol.143：277)和微粒加速或“基因枪”转化技术(Klein等.(1987)Nature(伦敦)327：70-73；美国专利号4,945,050，通过引用引入本文)。其它转化方法在下面公开。
因此，可将本发明的分离多核苷酸整合进能够导入宿主细胞并在宿主细胞中复制的重组构建物，一般为DNA构建物中。此类构建物可以是载体，所述载体包括复制系统和能够在给定的宿主细胞中转录和翻译多肽编码序列的序列。许多适于稳定转染植物细胞或用于建立转基因植物的载体描述于，例如Pouwels等(1985；增刊1987)CloningVectors：A Laboratory Manual、Weissbach和Weissbach(1989)Methodsfor Plant Molecular Biology(Academic Press，纽约)；以及Flevin等(1990)Plant Molecular Biology Manual(Kluwer Academic出版)。一般地，植物表达载体包括，例如一个或更多个在5’或3’调控序列转录控制下的克隆的植物基因和显性可选择标记。此类植物表达载体还可以含有启动子调控区域(例如，控制可诱导的或组成型的、环境或发育调控的、或细胞或组织特异性表达的调控区域)、转录起始开始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点、和/或多腺苷酸化信号。
提供了用于鉴定事件DP-098140-6的不同方法和组合物。此类方法用于在任何生物材料中鉴定和/或检测DP-098140-6事件。此类方法包括，例如，证实种子纯度的方法和在种子批中为DP-098140-6事件筛选种子的方法。在一个实施方案中，提供了用于在生物样品中鉴定事件DP-098140-6的方法，并且其包括使样品与第一和第二引物接触，以及扩增包含DP-098140-6特异区域的多核苷酸。
生物样品可以包含人们期望确定其中是否存在具有事件DP-098140-6的DNA的任何样品。例如，生物样品可以包含任何植物材料，或包含或来源于植物材料的材料，诸如但不限于食物或饲料产品。本文所使用的“植物材料”是指获自或来源于植物或植物部分的材料。在特定的实施方案中，生物样品包含玉米组织。
本文公开的基于侧翼DNA和插入序列的引物和探针可用于通过常规方法确认(并且如果需要的话，校正)公开的序列，例如，通过再克隆和测序该序列。本发明的多核苷酸探针和引物特异性地检测靶DNA序列。可以应用任何常规的核酸杂交或扩增方法以在样品中鉴定来自转基因事件的DNA的存在。通过“特异性地检测”，意指该多核苷酸可以用作引物以扩增DP-098140-6特异区域，或该多核苷酸可用作在严格条件下与来自DP-098140-6事件的多核苷酸杂交的探针。允许特异性检测DP-098140-6事件或DP-098140-6事件特异区域的杂交的水平和程度足以区分具有DP-098140-6特异区域的多核苷酸和缺乏这一区域的多核苷酸，并且由此允许辨别地鉴定DP-098140-6事件。通过“共享足以允许扩增DP-098140-6特异事件的序列同一性或互补性”，意指该序列与来自DP-098140-6特异区域的多核苷酸的片段或全长共享至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的同一性或互补性。
就应用特定的扩增引物对扩增靶多核苷酸(例如，通过PCR)而言，“严格条件”是允许引物对与靶多核苷酸杂交并且优选地在DNA热扩增反应中产生可识别的具有DP-098140-6特异区域的扩增产物(扩增子)的条件，其中一条具有相应的野生型序列(或其互补)的引物和另一条具有相应的DP-098140-6插入DNA序列的引物与所述的靶多核苷酸结合。在PCR方法中，可以设计寡核苷酸引物用于PCR反应中以扩增DP-098140-6特异区域。用于设计PCR引物和PCR克隆的方法在本领域是公知的，并且公开于Sambrook等(1989)，分子克隆：实验手册(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，纽约)。也参见Innis等，编辑(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications(Academic Press，纽约)；Innis和Gelfand，编辑(1995)PCR Strategies(Academic Press，纽约)；以及Innis和Gelfand，编辑(1999)PCR Methods Manual(Academic Press，纽约)。扩增方法还描述于美国专利号4,683,195、4,683,202和Chen等(1994)PNAS91：5695-5699。这些方法以及其它DNA扩增领域公知的方法均可用于实践本发明的实施方案。应当理解，在特定PCR方案中需要调整许多参数以适应特定的实验室条件，且可能经微小的修改但仍然能得到类似的结果。这些调整对于本领域技术人员是显而易见的。
扩增的多核苷酸(扩增子)可以是允许检测DP-098140-6事件或DP-098140-6特异区域的任何长度。例如，该扩增子可以是约10、50、100、200、300、500、700、100、2000、3000、4000、5000个核苷酸长或更长。
在特定的实施方案中，检测DP-098140-6事件的特异区域。
在本发明的方法中可以应用任何允许扩增和/或检测DP-098140-6特异区域的任何引物。例如，在特定的实施方案中，第一引物包含SEQID NO：1、2或46的多核苷酸片段，其中该第一或第二引物与该多核苷酸共享足以扩增DP-098140-6特异区域的序列同一性或互补性。引物对可以包含SEQ ID NO：1的片段和SEQ ID NO：2、3、46或47的片段；或可选地，引物对可以包含SEQ ID NO：2或46的片段以及SEQ ID NO：3、47或1的片段。在其它实施方案中，第一和第二引物可以包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55或56所示序列的任一个或任意组合。引物可以是足以扩增DP-098140-6特异区域的任何长度，包括，例如，至少6、7、8、9、10、15、20、15或30或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。
如在本文其它地方所讨论的那样，可以应用任何PCR扩增DP-098140-6事件或特异区域的方法，包括例如实时PCR。参见，例如，Livak等(1995a)在相反末端具有荧光染料的寡核苷酸提供了用于检测PCR产物和核酸杂交的淬灭探针系统.PCR methods andApplications.4：357-362；美国专利5,538,848；美国专利5,723,591；Applied Biosystems User Bulletin 2号，“基因表达的相对定量”P/N4303859；以及Applied Biosystems User Bulletin第5号，“用TaqmanVIC探针的多重PCR”P/N4306236；其每一个都通过引用引入本文。
因此，在特定的实施方案中，提供了在生物样品中检测玉米事件DP-098140-6或其后代存在的方法。该方法包括(a)从生物样品中提取DNA样品；(b)提供DNA引物分子对，包括但不限于SEQ ID NO：13-21、25-30、34-45、51-56中的序列的任意组合，包括例如：i)SEQID NO：13和SEQ ID NO：14的序列；ii)SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的序列；iii)SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列；iv)SEQ ID NO：20和21的序列；v)SEQ ID NO：51和52的序列；vi)SEQ ID NO：54和55；(c)提供DNA扩增反应条件；(d)进行DNA扩增反应，由此产生DNA扩增子分子；以及(e)检测DNA扩增子分子，其中在DNA扩增反应中检测到所述DNA扩增子分子表明存在玉米事件DP-098140-6。对于用作引物或探针的核酸分子的目的，仅需要在序列中足够互补以能够在所应用的特定溶剂和盐浓度下形成稳定的双链结构。
在杂交技术中，应用了选择性地与具有DP-098140-6特定事件的靶多核苷酸杂交的多核苷酸的全部或一部分。当论及多核苷酸探针时，通过“严格条件”或“严格杂交条件”，意指在该条件下探针将与其靶序列杂交至比与其它序列可检测地更高的程度(例如，至少是背景的2倍)的条件。就应用特定扩增引物对扩增靶多核苷酸(例如，通过PCR)而言，“严格条件”是允许该引物对与靶多核苷酸杂交的条件，其中一个引物具有相应的野生型序列且另一个引物具有相应的DP-098140-6插入DNA序列。严格条件是序列依赖性的，且在不同环境中是可变的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格度，可以鉴定与探针100％互补的靶序列(同源探测)。或者，可以调整严格条件以允许序列中的一些错配，因此能检测较低的同一性程度(异源探测)。一般而言，探针少于约1000个核苷酸长，或少于500个核苷酸长。
本文所使用的基本上同一或互补的序列是将与核酸分子的互补链特异性杂交的多核苷酸，其与该核酸分子在高严格条件下比较。促进DNA杂交的合适的严格条件，例如约45℃的6X氯化钠/柠檬酸钠(SSC)，随后在50℃用2X SSC洗涤，是本领域技术人员公知的，或可以在Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，N.Y.(1989)，6.3.1-6.3.6中找到。一般地，对于杂交和检测严格条件是这样的条件：其中在pH7.0至8.3时盐浓度少于约1.5M Na离子、一般为约0.01至1.0M Na离子浓度(或其他盐)，且温度对于短探针(例如，约10-50个核苷酸)而言至少约30℃及对于长探针(例如，超过50个核苷酸)而言至少约60℃。也可以通过添加去稳定剂诸如甲酰胺达到严格条件。示例性的低严格条件包括在37℃在30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的溶液中杂交，并且在50至55℃在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中洗涤。示例性的中严格条件包括在37℃在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中杂交，并且在55至60℃在0.5X至1X SSC中洗涤。示例性的高严格条件包括在37℃在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中杂交，并且在60至65℃在0.1X SSC中洗涤。任选地，洗涤缓冲液可以包含约0.1％至约1％的SDS。杂交的持续时间一般少于约24小时，通常约4至约12小时。洗涤的持续时间将至少是足以达到平衡的时间长度。
在杂交反应中，特异性通常是杂交后洗涤的函数，关键因素是离子强度和最终洗涤溶液的温度。对于DNA-DNA杂交链，可从Meinkoth和Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式估计Tm：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中M是一价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟嘌呤核苷酸和胞嘧啶核苷酸的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，以及L是杂交链的碱基对长度。Tm是在其中50％的互补靶序列与完全匹配的探针杂交的温度(在规定的离子强度和pH下)。对于每1％的错配，Tm减少约1℃，因此可以调整Tm、杂交条件和/或洗涤条件以与具有期望同一性的序列杂交。例如，如果搜寻具有≥90％同一性的序列，Tm可以降低10℃。一般而言，将严格条件选择为比特定序列和其互补链在规定的离子强度和pH下的热解链点(Tm)低约5℃。然而，高度严格杂交条件可以利用在比该热解链点(Tm)低1、2、3或4℃下杂交和/或洗涤；中等严格条件可以利用在比该热解链点(Tm)低6、7、8、9或10℃下杂交和/或洗涤；低严格条件可以利用在比该热解链点(Tm)低11、12、13、14、15或20℃下杂交和/或洗涤。应用该等式、杂交和洗涤组合物以及期望的Tm，本领域普通技术人员能够理解内在地描述了杂交和/或洗涤溶液严格度的变化。如果期望的错配程度导致了低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)的Tm，最好增加SSC浓度，因此可使用较高的温度。关于核酸杂交的广泛指导可以在Tijssen(1993)LaboratoryTechniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization withNucleic Acid Probes，Part I，第2章(Elsevier，New York)；和Ausubel等编辑(1995)Current Protocols in Molecular Biology，第2章(GreenePublishing and Wiley-Interscience，纽约)找到。参见Sambrook等(1989)分子克隆：实验手册(第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，纽约)和Haymes等(1985)In：Nucleic Acid Hybridization，aPractical Approach，IRL Press，Washington，D.C。
如果它们展示出互补性的话，将多核苷酸称为另一多核苷酸的“互补链”。如在本文所使用的那样，当一个多核苷酸分子的每一个核苷酸与另一多核苷酸分子的核苷酸互补时，则称分子展示出“完全的互补性”。如果它们能够以足以允许它们在至少通常的“低严格”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交的话，则称这两个分子是“最低互补的”。类似地，如果它们能够以足以允许它们在通常的“高严格”条件下保持彼此退火的稳定性彼此杂交的话，则称这两个分子是“互补的”。
还提供了在样品中检测相应于DP-098140-6事件的DNA存在的方法。在一个实施方案中，该方法包括：(a)使生物样品与多核苷酸探针接触，其中所述探针在严格杂交条件下与来自玉米事件DP-098140-6的DNA杂交并特异性地检测DP-098140-6事件；(b)使该样品和探针经历严格杂交条件；以及(c)检测该探针与DNA的杂交，其中杂交的检出表明DP-098140-6事件的存在。
可以应用各种方法检测DP-098140-6特异区域或其扩增子，包括但不限于Genetic Bit分析(Nikiforov等(1994)Nucleic Acid Res.22：4167-4175)，其中设计覆盖相邻的侧翼DNA序列和插入DNA序列的DNA寡核苷酸。将该寡核苷酸固定在微孔板的孔中。在对感兴趣区域PCR后(应用在插入序列中的一条引物和在相邻侧翼序列的一条引物)，单链PCR产物可与固定的寡核苷酸退火并可作为用于单碱基延伸反应的模板，所述单碱基延伸反应应用了DNA聚合酶和对于预期的下一碱基特异的经标记的ddNTPs。读出可以是荧光或基于ELISA的。信号表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸的插入/侧翼序列的存在。
另一检测方法是如Winge((2000)Innov.Pharma.Tech.00：18-24)描述的Pyrosequencing技术。在这一方法中，设计覆盖相邻DNA和插入DNA连接的寡核苷酸。使该寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(一条引物在插入序列中，且一条在侧翼序列)退火，并且在DNA聚合酶、ATP、硫酸化酶、萤光素酶、腺苷三磷酸双磷酸酶、腺苷5’磷酸硫酸和萤光素的存在下孵育。dNTP被逐个地添加，并且该整合产生光信号，检测该光信号。光信号表明由于成功的扩增、杂交和单或多碱基延伸的转基因插入/侧翼序列的存在。
由Chen等((1999)Genome Res.9：492-498)描述的荧光偏振也是可用于检测本发明扩增子的方法。应用这一方法，设计覆盖侧翼和插入DNA连接的寡核苷酸。使该寡核苷酸与来自感兴趣区域的单链PCR产物(一条引物在插入DNA中，且一条在侧翼DNA序列中)杂交，并在DNA聚合酶和荧光标记的ddNTP的存在下孵育。单碱基延伸导致ddNTP的掺入。应用荧光计测量作为偏振的改变的掺入。偏振改变表明由于成功的扩增、杂交和单碱基延伸的转基因插入/侧翼序列的存在。
已描述了分子信标(Molecular Beacons)在序列检测中的应用，如Tyangi等((1996)Nature Biotech.14：303-308)描述的那样。简而言之，设计覆盖侧翼和插入DNA连接的FRET寡核苷酸探针。该FRET探针独特的结构导致其含有使荧光和淬灭部分非常接近的二级结构。在热稳定聚合酶和dNTPs的存在下循环FRET探针和PCR引物(一条引物在插入DNA序列中，且一条在侧翼序列中)。在成功的PCR扩增后，FRET探针和靶序列的杂交导致探针二级结构的移除以及荧光和淬灭部分的空间分离。产生了荧光信号。荧光信号表明由于成功扩增和杂交的侧翼/转基因插入序列的存在。
应用对扩增子内部发现的序列特异的探针的杂交反应是用于检测由PCR反应产生的扩增子的另一方法。
本文所使用的“试剂盒”是指一组试剂，其用于完成本发明方法实施例的目的，更具体的，用于在生物样品中鉴定和/或检测DP-098140-6事件。为了质量控制(例如，种子批的纯度)，在植物材料，或包含或来源于植物材料的材料，诸如但不限于食物和饲料产品中检测事件DP-098140-6的目的，本发明的试剂盒可被利用，且其成分可以具体调整。
在特定的实施方案中，提供了用于在生物样品中鉴定事件DP-098140-6的试剂盒。该试剂盒包含第一和第二引物，其中该第一和第二引物扩增包含DP-098140-6特异区域的多核苷酸。在其它的实施方案中，该试剂盒还包含用于检测DP-098140-6特异区域的多核苷酸。该试剂盒包含：例如，包含SEQ ID NO：1、2、3、46、47或48多核苷酸的片段的第一引物，其中该第一或第二引物与该多核苷酸共享足以扩增所述DP-098140-6特异区域的序列同源性或互补性。例如，在特定的实施方案中，第一引物包含SEQ ID NO：1、2、3、46、47或48的多核苷酸的片段，其中该第一或第二引物与该多核苷酸共享足以扩增所述DP-098140-6特异区域的序列同源性或互补性。引物对可以包含SEQ ID NO：1的片段以及SEQ ID NO：2、3、46或47的片段，或可选地，引物对可以包含SEQ ID NO：2或46的片段以及SEQID NO：3、47或1的片段。在其它实施方案中，第一和第二引物可包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、47、51、52、53、54、55或56所示序列的任一个或任意组合。引物可以是足以扩增DP-098140-6区域的任何长度，包括例如，至少6、7、8、9、10、15、20、15或30或约7-10、10-15、15-20、20-25、25-30、30-35、35-40、40-45个核苷酸或更长。在一个实施方案中，引物包含SEQ ID NO：24的片段。该片段可以包含SEQ ID NO：24的10、20、30、40、50、60、70或更多个连续核苷酸。在其它实施方案中，SEQ ID NO：24或其片段可用作探针。此类片段可用作具有SEQ ID NO：24的至少10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160或170或更多个连续核苷酸的探针。在其它实施方案中，应用了包含SEQ ID NO：24的探针。
还提供了包含至少一个能够特异性地检测DP-098140-6特异区域或插入DNA的多核苷酸的DNA检测试剂盒，其中所述多核苷酸包括至少一种足够长的与SEQ ID NO：1、2、3、24、47、31-33或57同源或互补的连续核苷酸的DNA分子。在特定的实施方案中，DNA检测试剂盒包含具有SEQ ID NO：5或6的多核苷酸，或包含与选自如下的序列杂交的序列：a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3或47的序列；和b)SEQ ID NO：2或46和SEQ ID NO：3或47的序列。
本发明的方法和组合物中应用的任意的多核苷酸及其片段和变体可以与DP-098140-6事件转基因插入片段的区域、DP-098140-6事件的连接序列或DP-098140-6事件的侧翼序列共享序列同一性。确定各种序列关系的方法是已知的。本文所使用的“参照序列”是用作序列比较的基准的明确的序列。参照序列可以是特定序列的亚组或全部；例如，全长cDNA或基因序列的部分，或完整的cDNA或基因序列。本文所使用的“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续且特定的部分，其中为了最优化两个多核苷酸的比对，在该比较窗口中的该多核苷酸序列可包含与参照序列(其不包含添加或缺失)相比较的添加或缺失(例如，缺口)。一般而言，该比较窗口的长度为至少20个连续核苷酸，以及任选地可以是30、40、50、100或更长。本领域技术人员能够理解，为避免由于在多核苷酸序列中包括缺口而导致的与参照序列的高相似性，通常引入缺口罚分并且从匹配数目上将其减去。
用于比较的序列比对方法是本领域公知的。因此，可以应用数学算法来完成任意两条序列间序列同一性百分比的确定。此类数学算法的非限制性实例是Myers和Miller(1988)CABIOS 4：11-17的算法、Smith等(1981)Adv.Appl.Math.2：482的局部比对算法、Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的全局比对算法、Pearson和Lipman(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448的局部检索(search-for-local)比对方法、Karlin和Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264的，如在Karlin和Altschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：5873-5877中改进的算法。
可以利用这些数学算法的计算机工具比较序列以确定序列同一性。此类工具包括但不限于：在PC/Gene程序中的CLUSTAL(可获自Intelligenetics，Mountain View，California)、ALIGN程序(版本2.0)和GCG Wisconsin Genetics软件包，版本10(可获自Accelrys Inc.，9685Scranton Road，San Diego，California，USA)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。可以应用缺省参数完成应用这些程序的比对。Higgins等(1988)Gene 73：237-244(1988)、Higgins等(1989)CABIOS 5：151-153、Corpet等(1988)Nucleic Acids Res.16：10881-90、Huang等(1992)CABIOS 8：155-65和Pearson等(1994)Meth.Mol.Biol.24：307-331很好地描述了CLUSTAL程序。ALIGN程序基于Myers和Miller(1988)(同上)的算法。当比较氨基酸序列时，用ALIGN程序可以应用PAM120权重残基表、12的缺口长度罚分以及4的缺口罚分。Altschul等(1990)J.Mol.Biol.215：403的BLAST程序基于Karlin和Altschul(1990)(同上)的算法。可以应用BLASTN程序，得分＝100，字长＝12完成BLAST核苷酸检索，以得到与编码本发明蛋白质的核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，得分＝50，字长＝3完成BLAST蛋白质检索，以得到与本发明的蛋白质或多肽同源的氨基酸序列。为得到对于比较目的的缺口比对，可以如Altschul等(1997)Nucleic Acids Res.25：3389描述的那样应用缺口BLAST(在BLAST2.0中)。或者，可以应用PSI-BLAST(在BLAST 2.0中)以完成检测分子间远关系的迭代检索。参见Altschul等(1997)，同上。当利用BLAST、缺口BLAST、PSI-BLAST时，可以应用各个程序(例如，对于核苷酸序列的BLASTN、对于蛋白质的BLASTX)的缺省参数。参见www.ncbi.nlm.nih.gov。也可以通过检查手工地完成比对。
除非另外说明，本发明提供的序列同一性/相似性值是指采用GAP版本10或其任意等价的程序应用如下参数得到的值：对于核苷酸序列的％同一性和％相似性，应用50的GAP权重和3的字长，以及nwsgapdna.cmp得分矩阵；对于氨基酸序列的％同一性和％相似性，应用8的GAP权重和2的字长，以及BLOSUM62得分矩阵。通过“等价程序”，意指任意的这样的序列比较程序，即对于任意两个所讨论的序列而言，当与由GAP版本10产生的相应的比对比较时，所述序列比较程序产生具有相同的核苷酸或氨基酸残基匹配的比对以及相同的序列同一性百分比。
GAP应用了Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48：443-453的算法，以寻找两个完整序列的最大化匹配数且最小化缺口数的比对。GAP考虑所有可能的匹配和缺口位置，并且产生具有最大的匹配碱基数以及最少缺口的比对。其允许以匹配碱基单位提供缺口产生罚分和缺口延伸罚分。对于每一个其插入的缺口，GAP必须利用匹配的缺口产生罚分数。如果选择了大于0的缺口延伸罚分，GAP还必须对于每一插入的缺口利用缺口长度乘以缺口延伸罚分。对于蛋白质序列，GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中的缺省缺口产生罚分值和缺口延伸罚分值分别是8和2。对于核苷酸序列，缺省缺口产生罚分是50，而缺省延伸罚分是3。缺口产生和缺口延伸罚分可以表达为选自0至200的整数。因此，例如，缺口产生和缺口延伸罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。
GAP是最佳比对家族的一个成员。这一家族可能有许多成员，但没有其它成员具有更佳的质量。GAP展示出对于比对的4个优值：质量、比率、同一性和相似性。质量是为了比对序列的最大化的度量。比率是质量除以较短片段的碱基数。同一性百分比是实际上匹配的符号的百分比。相似性百分比是相似符号的百分比。忽略在缺口对面的符号。当对于符号对的得分矩阵值大于或等于相似性阈值0.50时，对相似性进行记分。在GCG Wisconsin Genetics软件包版本10中使用的得分矩阵是BLOSUM62(参见Henikoff和Henikoff(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89：10915)。
如在本文所使用的那样，在两条多核苷酸或多肽序列上下文的“序列同一性”或“同一性”涉及当两条序列中在特定比较窗口上为最大一致性比对时相同的残基。当论及蛋白质而使用序列同一性百分比时，应当认识到，不相同的残基位置通常是通过保守氨基酸替换而不同，其中氨基酸残基被其它具有类似化学性质(例如，带电或疏水性)的氨基酸残基替换，并且因此没有改变该分子的功能性质。当序列在保守替换中不同时，可以向上调整序列同一性百分比以校正取代的保守性质。通过此类保守替换而不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。制造这一调整的方法是本领域技术人员公知的。一般地，这包括将保守替换记分为部分错配而不是完全错配，由此增加序列同一性百分比。因此，例如，当给相同的氨基酸1的得分且给非保守的取代0的得分时，则给保守取代0至1的得分。例如，可以应用程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California)计算保守取代的得分。
本文所使用的“序列同一性百分比”的意思是通过比较在比较窗口上的两条最优化比对的序列而确定的值，其中为了最优化比对两条序列，比较窗口中多核苷酸序列的部分可以包含与参照序列(其不包括添加或缺失)相比较的添加或缺失(即，缺口)。如下计算百分比：确定存在于两条序列中的相同的核酸碱基或氨基酸残基位置的数目以得出匹配位置数，将该匹配位置数除以该比较窗口中的总位置数，将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
本发明提供了用于在栽培区域中控制杂草、在栽培区域中预防除草剂抗性杂草的发展或出现、生产作物以及增加作物安全性的方法。术语“控制”及其衍化，例如在“控制杂草”中那样，是指抑制杂草的生长、发芽、再生和/或增殖；和/或杀死、移除、毁坏或以其它方式减少杂草的出现和/或活性中的一种或更多种。
本文所使用的术语“栽培区域”包括人们期望在其上种植植物的任何地区。此类栽培区域包括但不限于：在其中栽培植物的田地(诸如，作物田地、草地、林地、管理的森林、用于栽培水果和蔬菜的田地等)、温室、生长室等等。
本发明的方法包括在栽培区域中种植玉米DP-098140-6种子或植物，并且在特定的实施方案中，对该作物、种子、杂草或其栽培区域施用有效量的感兴趣的除草剂。应当认识到，可以在作物栽培在该栽培区域之前或之后使用除草剂。此类除草剂施用可以包括施用草甘膦、ALS抑制剂化学物质或其任意组合。在特定的实施方案中，将ALS抑制剂化学物质与草甘膦联合的混合物施用于玉米DP-098140-6，其中至少ALS抑制剂化学物质的有效浓度将显著的损害适当的对照植物。在一个非限制性实施方案中，除草剂包括磺酰基氨基羰基三唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧(硫)苯甲酸酯类、咪唑啉酮、三嗪和/或次膦酸中至少之一。
在另一个非限制性实施方案中，除草剂的组合包括草甘膦、灭草烟(imazapyr)、氯嘧黄隆(chlorimuron-ethyl)、喹禾灵(quizalofop)和氟磺胺草醚(fomesafen)，其中有效量能被作物和对照杂草耐受。如在本文其它地方公开的那样，可以应用任意有效量的这些除草剂。在特定的实施方案中，除草剂的组合包括包含约1110至约1130g ai/公顷的有效量的草甘膦；包含约7.5至约27.5g ai/公顷的有效量的灭草烟；包含约7.5至约27.5g ai/公顷的有效量的氯嘧黄隆；包含约50至约70g ai/公顷的有效量的喹禾灵；以及包含约240至约260g ai/公顷的有效量的氟磺胺草醚。
在其它实施方案中，应用了至少两种除草剂的组合物，其中该组合不包括草甘膦。在其它实施方案中，将至少一种ALS抑制剂和草甘膦施用于植物。有关可以在本发明方法中应用的各种除草剂组合的更详细的描述在本文的其它地方进行了讨论。
在一个实施方案中，控制杂草的方法包括在区域中种植DP-098140-6玉米种子或植物，并给该作物、作物部分、所述作物的种子或栽培的区域施用有效量的除草剂，其中所述有效量包括：
i)当施用于第一对照作物、作物部分、种子或栽培区域时，不能被第一对照作物耐受的量，其中所述的第一对照作物表达赋予针对草甘膦耐性的第一GLYAT多核苷酸，并且不表达编码zm-hra多肽的第二多核苷酸；
ii)当施用于第二作物、作物部分、种子或栽培区域时，不能被第二对照作物耐受的量，其中所述的第二对照作物表达zm-hra多核苷酸并且不表达GLYAT多核苷酸；以及
iii)当施用于DP-098140-6玉米作物、作物部分、种子或其栽培区域时能被耐受的量。除草剂可以包含包括或不包括草甘膦在内的除草剂的组合。在特定的实施方案中，除草剂的组合包含如下更详细讨论的ALS抑制剂化学物质。
在另一个实施方案中，控制杂草的方法包括在区域中种植DP-098140-6玉米作物种子或植物，并给该作物、作物部分、所述作物的种子或栽培的区域施用有效量的除草剂，其中所述的有效量包含在建议标签使用率以上的水平，其中当施用于DP-098140-6玉米作物、作物部分、种子或其栽培区域时，所述有效量能被耐受。施用的除草剂可以包含包括或不包括草甘膦在内的除草剂的组合。在特定的实施方案中，除草剂的组合包含如下更详细讨论的ALS抑制剂化学物质。可以在本发明的各种方法中应用的其它除草剂及其组合将在下文更详细的讨论。
“对照”或“对照植物”或“对照植物细胞”提供了对于测量受试植物或植物细胞表型改变的参照点，并且可以是任何合适的植物或植物细胞。对照植物或植物细胞可包括，例如：(a)野生型植物或细胞，即，与用于遗传改变的产生该受试植物或细胞的起始材料具有相同基因型的植物或细胞；(b)这样的植物或植物细胞：其与起始材料的基因型相同，但转化有空构建物(即，用对感兴趣的性状不具有已知影响的构建物，诸如包含标记基因的构建物)；(c)这样的植物或植物细胞：其为受试植物或植物细胞后代中的非转化分离子；(d)与受试植物或植物细胞遗传上相同，但不暴露于与受试植物或植物细胞相同的处理(例如，除草剂处理)下的植物或植物细胞；(e)在这样的条件下的受试植物或植物细胞本身，其中在该条件下感兴趣的基因不表达；或(f)在这样的条件下的受试植物或植物细胞本身，其中在该条件下其已暴露于特定处理，例如，诸如，除草剂或除草剂和/或其它化学物质的组合。在一些实例中，合适的对照植物或对照植物细胞可以具有与受试植物或植物细胞不同的基因型，但可以共有用于遗传改变的产生受试植物或细胞的起始材料的除草剂敏感特性(参见例如，Green(1998)WeedTechnology 12：474-477；Green和Ulrich(1993)Weed Science 41：508-516)。在一些实例中，合适的对照玉米植物是“Jack”玉米植物(Illinois Foundation Seed，Champaign，Illinois)。在其它实施方案中，空分离子(null segregant)可以用作对照，因为除了转基因插入DNA之外，它们与DP-098140-6遗传上相同。
可将任何除草剂施用于DP-098140-6玉米作物、作物部分或含有该作物植物的栽培区域。除草剂的分类(即，将除草剂分组为类或亚类)是本领域公知的，并且包括通过HRAC(除草剂抗性作用委员会)和WSSA(美国杂草科学协会)的分类(也参见，Retzinger和Mallory-Smith(1997)Weed Technology 11：384-393)。HRAC分类(具有关于相应的WSSA组的注释)的简化版本如表1所示。
可以通过它们的作用模式和/或作用位置对除草剂进行分类，并且还可以通过它们施用的时间(例如，萌发前或萌发后)、施用的方法(例如，叶施用或土壤施用)、或通过它们怎么被植物吸收或影响植物进行分类。例如，噻黄隆和苯黄隆施用于作物叶子并且通常在此代谢，而玉嘧黄隆和氯嘧黄隆通常通过植物的根和叶两者吸收。“作用模式”通常是指除草剂抑制或以其它方式损害的植物内代谢或生理过程；而“作用部位”通常是指除草剂作用或直接相互作用的植物内物理位置或生物化学部位。可以以各种方式对除草剂分类，包括通过作用模式和/或作用部位(例如，参见表1)。
通常，在表达其的植物中赋予针对特定除草剂或其它化学物质的耐性的除草剂耐性基因也会赋予针对相同类或亚类中的其它除草剂或化学物质的耐性，例如，表1所示的类或亚类。因此，在本发明的一些实施方案中，本发明的转基因植物对相同类或亚类中的一种以上的除草剂或化学物质具有耐性，例如，诸如，PPO、磺酰脲或合成植物生长素的抑制剂。
一般地，本发明的植物可以耐受用不同类型的除草剂(即，具有不同的作用模式和/或作用部位的除草剂)以及比之前已知植物更高量的除草剂的处理，由此允许改进的杂草管理策略，其被推荐以减少除草剂耐性杂草的发生和流行。可以应用特定的除草剂组合以有效地控制杂草。
由此，本发明提供了转基因玉米植物，可以在该转基因作物待种植的区域中流行的除草剂耐性杂草种类的基础上选择其用于作物生产。用于评估各种杂草种类的除草剂耐性的方法是本领域公知的。杂草管理技术也是本领域公知的，例如诸如，应用对除草剂(本地杂草种类对其不具耐性)具耐性的作物的轮作。许多机构检测并公开地报道了除草剂耐性杂草的发生和性质，包括除草剂抗性作用委员会(HRAC)、美国杂草科学协会以及各种国家机关(参见例如，来自2004 IllinoisAgricultural Pest Management Handbook的对于各种阔叶杂草的除草剂抗性得分)，并且本领域技术人员将能够应用这些信息以确定在特定区域中应当使用哪些作物和除草剂组合。
这些机构还出版了用于预防除草剂耐性杂草的发展和/或出现，以及控制其蔓延的建议和指引(例如，参见Owen和Hartzler(2004)，2005Herbicide Manual for Agricultural Professionals，Pub.WC 92 Revised(Iowa State University Extension，Iowa State University of Science andTechnology，Ames，Iowa)；Weed Control for Corn，Maizes，and Sorghum，“2004 Illinois Agricultural Pest Management Handbook”第2章(University of Illinois Extension，University of Illinois atUrbana-Champaign，Illinois)；Weed Control Guide for Field Crops，MSUExtension Bulletin E434(Michigan State University，East Lansing，Michigan))。
表1：HRAC除草剂分类的简化版本
I.ALS抑制剂(WSSA组2)
A.磺酰脲
1.四唑黄隆
2.氯嘧黄隆(Chlorimuron-ethyl)
3.甲黄隆(Metsulfuron-methyl)
4.烟嘧黄隆
5.玉嘧黄隆
6.嘧黄隆(Sulfometuron-methyl)
7.噻黄隆(Thifensulfuron-methyl)
8.苯黄隆(Tribenuron-methyl)
9.磺氨黄隆
10.苄嘧黄隆(Bensulfuron-methyl)
11.绿黄隆
12.醚黄隆
13.环丙黄隆
14.胺苯黄隆(Ethametsulfuron-methyl)
15.乙氧嘧黄隆
16.啶嘧黄隆
17.氟啶黄隆(Flupyrsulfuron-methyl)
18.甲酰胺黄隆(Foramsulfuron)
19.啶咪黄隆
20.碘甲黄隆(Iodosulfuron-methyl)
21.甲磺胺黄隆(Mesosulfuron-methyl)
22.环丙氧黄隆
23.氟嘧黄隆(Primisulfuron-methyl)
24.氟丙黄隆
25.吡嘧黄隆(Pyrazosulfuron-ethyl)
26.乙黄黄隆
27.醚苯黄隆(Triasulfuron)
28.三氟啶黄隆(Trifloxysulfuron)
29.氟胺黄隆(Triflusulfuron-methyl)
30.三氟甲黄隆(Tritosulfuron)
31.吡氯黄隆(Halosulfuron-methyl)
32.氟吡黄隆(Flucetosulfuron)
B.磺酰基氨基羰基三唑啉酮
1.氟酮黄隆(Flucarbazone)
2.丙苯黄隆(Procarbazone)
C.三唑并嘧啶
1.唑嘧磺胺盐(Cloransulam-methyl)
2.氟唑啶草
3.唑嘧磺胺
4.双氟磺草胺(Florasulam)
5.唑草磺胺
6.五氟磺草胺(Penoxsulam)
7.Pyroxsulam
D.嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯类
1.双嘧苯甲酸
2.环酯草醚(Pyriftalid)
3.嘧苯草肟
4.嘧硫苯甲酸
5.肟啶草
E.咪唑啉酮类
1.灭草烟
2.咪草烟
3.灭草喹
4.甲基咪草烟(Imazapic)
5.咪甲酯(Imazamethabenz-methyl)
6.咪草啶酸
II.其它除草剂活性成分/额外的作用方式
A.乙酰辅酶A羧化酶(ACCase)抑制剂(WSSA组1)
1.芳氧基苯氧基丙酸酯类(‘FOPs’)
a.精喹禾灵(Quizalofop-P-ethyl)
b.氯甲草(Diclofop-methyl)
c.炔草酯(Clodinafop-propargyl)
d.高噁唑禾草灵(Fenoxaprop-P-ethyl)
e.精吡氟禾草灵(Fluazifop-P-butyl)
f.喔草酯
g.Haloxyfop-P-methyl
h.氰氟草酯(cyhalofop-butyl)
i.精喹禾灵(Quizalofop-P-ethyl)
2.环己烷二酮类(‘DIMs’)
a.枯杀达
b.丁氧环酮
c.烯草酮
d.噻草酮
e.稀禾啶
f.吡喃草酮(Tepraloxydim)
g.肟草酮
B.光系统II抑制剂一HRAC组C1/WSSA组5
1.三嗪类
a.莠灭净(Ametryne)
b.阿特拉津
c.草净津
d.敌草净(Desmetryne)
e.二甲丙乙净(Dimethametryne)
f.扑灭通
g.扑草净
h.扑灭津
i.西马津
j.西草净(Simetryne)
k.甲氧去草净
l.特丁津
m.去草净
n.草达津
2.三嗪酮类
a.六嗪酮
b.赛克津
c.苯嗪草
3.三唑啉酮类
a.氨唑草酮(Amicarbazone)
4.尿嘧啶类
a.除草定
b.环草定
c.特草定
5.哒嗪酮类
a.杀草敏
6.氨基甲酸苯酯类
a.异苯敌草
b.甜菜宁
C.光系统II的抑制剂-HRAC组C2/WSSA组7
1.脲
a.氟草隆
b.利谷隆
c.氯溴隆
d.绿麦隆
e.枯草隆
f.丁噁隆
g.敌草隆
h.噻二唑隆
i.非草隆
j.异丙隆
k.异恶隆
l.噻唑隆
m.秀谷隆
n.甲氧隆
o.绿谷隆
p.草不隆
q.环草隆
r.丁唑隆
2.酰胺类
a.敌稗
b.蔬草灭
D.光系统II的抑制剂-HRAC组C3/WSSA组6
1.腈类
a.杀草全
b.溴苯腈
c.碘苯腈
2.苯并噻二嗪酮(苯达松)
a.苯达松
3.苯基哒嗪
a.达草止
b.Pyridafol
E.光系统-I-电子转移(联吡啶鎓)(WSSA组22)
1.敌草快
2.对草快
F.PPO(原卟啉原氧化酶)抑制剂(WSSA组4)
1.二苯醚
a.氟锁草醚
b.治草醚
c.氯硝醚
d.乙羧氟草醚
e.氟黄胺草醚
f.氟硝磺酰胺
g.乳氟禾草灵
h.乙氧氟草醚
2.苯基吡唑类
a.异丙吡草酯(Fluazolate)
b.吡草醚(Pyraflufen-ethyl)
3.N-苯基酞亚胺(N-phenylphthalimides)
a.吲哚酮草酯(Cinidon-ethyl)
b.氟噁嗪酮
c.酰亚胺苯氧乙酸戊酯(Flumiclorac-pentyl)
4.噻二唑类
a.达草氟(Fluthiacet-methyl)
b.噻二唑胺
5.噁二唑类
a.恶草灵
b.炔丙噁唑草
6.三唑啉酮类
a.氟酮唑草(Carfentrazone-ethyl)
b.磺胺草唑
7.噁唑烷二酮类
a.戊噁唑草
8.嘧啶二酮类
a.双苯嘧草酮(Benzfendizone)
b.Butafenicil
9.其它
a.Pyrazogyl
b.氟唑草胺(Profluazol)
G.漂白：抑制八氢番茄红素去饱和酶步骤(PDS)的类胡萝卜素生物合成(WSSA组12)
1.哒嗪酮
a.达草灭
2.吡啶羧酰胺类
a.吡氟草胺
b.氟吡酰草胺(Picolinafen)
3.其它
a.氟丁酰草胺(Beflubutamid)
b.氟草同
c.氟咯草酮(Flurochloridone)
d.呋草酮
H.漂白：抑制4-羟基苯基-丙酮酸-二加氧酶(4-HPPD)(WSSA组28)
1.三酮
a.硝草酮(Mesotrione)
b.磺草酮(Sulcotrione)
c.topremezone
d.temtorione
2.异噁唑类
a.异噁氯草酮(Isoxachlortole)
b.异噁氟草
3.吡唑类
a.吡草酮
b.苄草唑
c.吡唑特
4.其它
a.苯并双环酮(Benzobicyclon)
I.漂白：抑制类胡萝卜素生物合成(未知的靶标)(WSSA组11和13)
1.三唑类(WSSA组11)
a.杀草强
2.异噁唑二酮类(WSSA组13)
a.异恶草酮
3.脲类
a.氟草隆(fluometuron)
3.二苯醚
a.苯草醚
J.抑制EPSP合酶
1.甘氨酸类(WSSA组9)
a.草甘膦
b.草硫膦
K.抑制谷氨酰胺合成酶
1.次膦酸类
a.草铵膦(Glufosinate-ammonium)
b.双丙氨酰膦
L.抑制DHP(二氢蝶酸)合成(WSSA组18)
1氨甲酸酯类
a.黄草灵
M.微管组装抑制(WSSA组3)
1.二硝基苯胺
a.氟草胺
b.地乐胺
c.敌乐胺
d.丁氟消草
e.黄草消
f.胺硝草
g.氟乐灵
2.磷酸酰胺类
a.甲基胺草磷(Amiprophos-methyl)
b.抑草磷(Butamiphos)
3.吡啶类
a.氟硫草定
b.噻氟啶草(Thiazopyr)
4.苯甲酰胺类
a.拿草特
b.丙戊草胺
5.苯二羧酸类
a.敌草索(Chlorthal-dimethyl)
N.抑制有丝分裂/微管组织WSSA组23)
1.氨甲酸酯类
a.氯苯胺灵
b.苯胺灵
c.长杀草
O.抑制细胞分裂(如提出的机理那样抑制极长链脂肪酸；WSSA组15)
1.氯乙酰胺类
a.乙草胺
b.甲草胺
c.丁草胺
d.克草胺
e.Dimethanamid
f.吡草胺
g.异丙甲草胺
h.烯草胺(Pethoxamid)
i.丙草胺
j.扑草胺
k.异丙草胺
l.噻醚草胺
2.乙酰胺类
a.草乃敌
b.草萘胺
c.萘丙胺
3.氧代乙酰胺
a.氟噻草胺(Flufenacet)
b.苯噻草胺
4.四唑啉酮
a.四唑草胺(Fentrazamide)
5.其它
a.莎稗磷
b.唑草胺(Cafenstrole)
c.茚草酮(Indanofan)
d.哌草磷
P.抑制细胞壁(纤维素)合成
1.腈类(WSSA组20)
a.敌草腈
b.草克乐
2.苯甲酰胺类(异恶草胺(WSSA组21))
a.异恶草胺
3.三唑并羧酰胺类(胺草唑)
a.胺草唑
Q.解偶联(膜破坏)：(WSSA组24)
1.二硝基酚类
a.DNOC
b.地乐酚
c.地乐消酚
R.通过AAC抑制之外的对脂类合成的抑制
1.硫代氨基甲酸酯类(WSSA组8)
a.苏达灭
b.草灭特
c.哌草丹
d.EPTC
e.禾草畏
f.草达灭
g.坪草丹
h.克草猛
i.苄草丹
j.杀草丹
k.丁草威
l.野麦畏
m.灭草猛
2.二硫代磷酸酯
a.地散磷
3.苯并呋喃类
a.呋草黄
b.乙呋草黄
4.卤代链烷酸(WSSA组26)
a.TCA
b.茅草枯
c.四氟丙酸
S.合成植物生长素(IAA-样)(WSSA组4)
1.苯氧基羧酸
a.稗草胺
b.2，4-D
c.2甲4氯丙酸
2.苯甲酸类
a.麦草畏
b.草灭平
c.TBA
3.吡啶羧酸
a.二氯皮考啉酸
b.氟草烟
c.毒莠定
d.Tricyclopyr
4.喹啉羧酸
a.二氯喹啉酸
b.喹草酸
5.其它(草除灵)
a.草除灵(Benazolin-ethyl)
T.抑制植物生长素转运
1.酞氨酯(Phthalamates)；缩氨基脲类(WSSA组19)
a.西力特
b.二氟吡隆-Na(Diflufenzopyr-Na)
U.其它作用机理
1.芳基氨基丙酸
a.麦草伏M/强氟燕灵(Flamprop-M-methyl/-isopropyl)
2.吡唑鎓(Pyrazolium)
a.野燕枯
3.有机砷剂
a.DSMA
b.MSMA
4.其它
a.溴丁酰草胺
b.环庚草醚
c.苄草隆(Cumyluron)
d.棉隆
e.甲基香草隆(Daimuron-methyl)
f.香草隆
g.乙苯酰草
h.膦铵素
i.威百亩
j.氯噁嗪草
k.油酸
l.壬酸
m.稗草畏
在一个实施方案中，将一种ALS抑制剂或至少两种ALS抑制剂应用于DP-098140-6玉米作物或者栽培区。在非限制性实施方案中，ALS抑制剂除草剂的组合可包括或不包括草甘膦。可以以能选择性控制杂草并且不显著伤害作物的任何有效比率应用ALS抑制剂。在特定实施方案中，以将显著伤害合适的对照植物的水平应用至少一种ALS抑制剂。在其它实施方案中，以高于作物的推荐标签使用率来应用至少一种ALS抑制剂。在其它实施方案中，以低于推荐的使用率应用ALS抑制剂的混合物，并且杂草仍然被选择性控制。抑制乙酰乳酸合酶(也称作乙酰羟基酸合酶)并且因此可以用于本发明方法的除草剂包括如表1中列出的磺酰脲，包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)；如表1中列出的磺酰基氨基羰基三唑啉酮，包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)；如表1中列出的三唑并嘧啶，包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)；如表1中列出的嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯，包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)；和如表1中列出的咪唑啉酮，包括其农业上合适的盐(例如，钠盐)。在一些实施方案中，本发明的方法包括使用磺酰脲，其不是氯嘧黄隆、绿黄隆、玉嘧黄隆、噻黄隆或苯黄隆。
在其它还有一些方法中，单独或与其它感兴趣的除草剂组合的草甘膦可以应用于DP-098140-6玉米植物或它们的栽培区。草甘膦制剂的非限制性实例在表2中给出。在特定实施方案中，草甘膦为盐的形式，如铵盐、异丙基铵盐、钾盐、钠盐(包括倍半钠盐)或者trimesium(或者称作草硫膦)。在其它还有一些实施方案中，将协同有效量的草甘膦和ALS抑制剂(如磺酰脲)组合的混合物应用于DP-098140-6玉米植物或它们的栽培区。
表2.草甘膦制剂比较
从而，在一些实施方案中，通过应用植物耐受的除草剂，在生长DP-098140-6玉米作物的方法中使用本发明的转基因植物。公开了以这种方式用一种或更多种除草剂的组合处理，所述除草剂包括但不限于：乙草胺、三氟羧草醚和其钠盐、苯草醚、丙烯醛(2-丙烯醛)、甲草胺、枯杀达、莠灭净、氨唑草酮、磺氨黄隆、氯氨吡啶酸(aminopyralid)、杀草强、氨基磺酸铵、莎稗磷、黄草灵、阿特拉津、四唑黄隆、氟丁酰草胺、草除灵、草除灵、bencarbazone、氟草胺、呋草黄、苄嘧黄隆、地散磷、苯达松、苯并双环酮、吡草酮、治草醚、双丙氨酰膦(bilanafos)、双嘧苯甲酸和其钠盐、除草定、溴丁酰草胺、杀草全、溴苯腈、溴苯腈辛酸盐、丁草胺、氟丙嘧草酯(butafenacil)、丁胺磷、地乐胺、丁氧环酮、苏达灭、唑草胺、长杀草、氟酮唑草、儿茶酚、氯硝醚、草灭平、氯溴隆、甲基-整形醇、氯草敏、氯嘧黄隆、绿麦隆、氯苯胺灵、绿黄隆、敌草索、草克乐、吲哚酮草酯、环庚草醚、醚黄隆、烯草酮、炔草酯、异恶草酮、稗草胺、二氯皮考啉酸、二氯吡啶酸盐、唑嘧磺胺盐、CUH-35(2-甲氧基乙基2-[[[4-氯-2-氟-5-[(1-甲基-2-丙炔基)氧基]苯基](3-氟代苯甲酰基)氨基]羰基]-1-环己烯-1-甲酸)、苄草隆、草净津、草灭特、环丙黄隆、噻草酮、氰氟草酯、2，4-D和其butotyl、丁基、异辛基和异丙基酯和其二甲基铵盐，二乙醇胺和三乙醇胺盐，香草隆、茅草枯(dalapon)、茅草枯(dalapon-sodium)、棉隆、2，4-DB和其二甲基铵盐、钾和钠盐、异苯敌草、敌草净、麦草畏和它的二甘醇铵、二甲基铵、钾和钠盐、敌草腈、2，4-滴丙酸、氯甲草、唑嘧磺胺、野燕枯甲硫酸盐、吡氟草胺、二氟吡隆、丁噁隆、哌草丹、克草胺、异戊乙净、二甲吩草胺、二甲吩草胺-P、噻节因，二甲基次胂酸和其钠盐、敌乐胺、地乐消酚、草乃敌、敌草快二溴化物、氟硫草定、敌草隆、DNOC、桥氧酞钠、EPTC、禾草畏、丁氟消草、胺苯黄隆、乙呋草黄、氯氟草醚(ethoxyfen)、乙氧嘧黄隆、乙苯酰草、高噁唑禾草灵、高噁唑禾草灵、四唑草胺、非草隆、非草隆-TCA、甲氟燕灵、强氟燕灵、麦草伏M、啶嘧黄隆、双氟磺草胺、吡氟禾草灵(fluazifop-butyl)、精吡氟禾草灵、氟酮黄隆、氟吡黄隆、氟消草、氟噻草胺、氟哒嗪草酯(flufenpyr)、氟哒嗪草酯-乙基、氟唑啶草、酰亚胺苯氧乙酸戊酯、氟噁嗪酮、氟草隆、乙羧氟草醚、氟啶黄隆和其钠盐、抑草丁(flurenol)、抑草丁(flurenol-butyl)、氟草同、氟咯草酮、氟草烟、呋草酮、达草氟、氟黄胺草醚、甲酰胺黄隆、膦铵素-铵、草铵膦(glufosinate)、草铵膦(glufosinate-ammonium)、草甘膦和其盐，如铵盐、异丙基铵、钾盐、钠盐(包括倍半钠)和trimesium(或称作草硫膦)、吡氯黄隆、氟吡禾灵(haloxyfop-etotyl)、Haloxyfop-P-methyl、六嗪酮、HOK-201(N-(2，4-二氟苯基)-1，5-二氢-N-(1-甲基乙基)-5-氧-1-[(四氢-2H-吡喃-2-基)甲基]-4H-1，2，4-三唑-4-甲酰胺)、咪甲酯、咪草啶酸、甲咪唑烟酸(imazapic)、灭草烟、灭草喹(imazaquin)、灭草喹(imazaquin-ammonium)、咪草烟、咪草烟-铵、啶咪黄隆、茚草酮、碘甲黄隆、碘苯腈、碘苯腈辛酸盐、碘苯腈-钠、异丙隆、异恶隆、异恶草胺、异噁氟草、异恶氯草酮、乳氟禾草灵、环草定、利谷隆、马来酸酰肼、MCPA和其盐(例如，MCPA-二甲基铵、MCPA-钾和MCPA-钠、酯(例如、MCPA-2-乙基己基、MCPA-butotyl)和硫酯(例如、MCPA-乙硫酯)、MCPB和其盐(例如、MCPB-钠)和酯(例如、MCPB-乙基)、2甲4氯丙酸、高2甲4氯丙酸盐、苯噻草胺、氟草磺、甲磺胺黄隆、硝草酮、成百亩-钠、噁唑酰草胺(metamifop)、苯嗪草、吡草胺、氟草磺、甲基胂酸和其钙、单铵、单钠和二钠盐、甲基香草隆、吡喃隆、秀谷隆、异丙甲草胺、S-metholachlor、唑草磺胺、甲氧隆、赛克津、甲黄隆、草达灭、绿谷隆、萘丙胺、草萘胺、抑草生、草不隆、烟嘧黄隆、达草灭、坪草丹、黄草消、炔丙噁唑草、恶草灵、环丙氧黄隆、氯噁嗪草、乙氧氟草醚、对草快二氯化物、克草猛、壬酸、胺硝草、五氟磺草胺、蔬草灭、戊噁唑草、黄草伏(perfluidone)、pethoxyamid、甜菜宁、毒莠定、毒莠定-钾、氟吡酰草胺、pinoxaden、piperofos、丙草胺、氟嘧黄隆、氨氟乐灵、环苯草酮(profoxydim)、扑灭通、扑草净、扑草胺、敌稗、喔草酯、扑灭津、苯胺灵、异丙草胺、丙苯黄隆(propoxycarbazone)、炔苯酰草胺、苄草丹、氟丙黄隆、双唑草腈(pyraclonil)、吡草醚、pyrasulfotole、pyrazogyl、吡唑特(pyrazolynate)、苄草唑、吡嘧黄隆、嘧苯草肟、稗草畏、达草止、环酯草醚、肟啶草、pyrimisulfan、嘧硫苯甲酸、嘧硫苯甲酸钠、pyroxsulam、二氯喹啉酸、喹草酸、灭藻醌、喹禾灵(quizalofop-ethyl)、精喹禾灵(quizalofop-P-ethyl)、精喹禾灵(quizalofop-P-tefuryl)、玉嘧黄隆、稀禾啶、环草隆、西马津、西草净、磺草酮、磺胺草唑、嘧黄隆、乙黄黄隆、2，3，6-TBA、TCA、TCA-钠、丙戊草胺、丁唑隆、tefuryltrione、tembotrione、吡喃草酮、特草定、甲氧去草净、特丁津、去草净、噻醚草胺、噻氟啶草、thiencarbazone、噻黄隆、杀草丹、丁草成、topramezone、肟草酮、野麦畏、醚苯黄隆、吡嘧黄隆(triaziflam)、苯黄隆、定草酯、定草酯-butotyl、定草酯-三乙铵、灭草环、草达津、三氟啶黄隆、氟乐灵、氟胺黄隆、三氟甲黄隆和灭草猛。
其它合适的除草剂和农用化学品是本领域已知的，如WO2005/041654中描述的那些。其它除草剂还包括生物除草剂，如Alternaria destruens Simmons，胶胞炭疽菌(Colletotrichumgloeosporiodes)(Penz.)Penz.& Sacc.，Drechsiera monoceras(MTB-951)、疣孢漆斑菌(Myrothecium verrucaria)(Albertini &Schweinitz)Ditmar：Fries，棕榈疫霉(Phytophthora palmivora)(Butl.)Butl.和Puccinia thlaspeos Schub。多种除草剂的组合可以导致针对杂草的大于累加(即，协同)的效果和/或对作物或针对作物或其它希望的植物的小于累加的效果(即，安全化)。在一些情况下，草甘膦与具有相似控制谱但是不同作用方式的其它除草剂的组合对于防止抗性杂草的生长将是尤其有利的。本领域技术人员通过简单的实验方法可以容易地确定任一种具体除草剂的除草剂有效量。
可以如上述将除草剂关于它们的作用方式分成组和/或亚组，或者可以根据它们的化学结构将它们分成组和/或亚组。
氨磺胺除草剂具有作为基本分子结构特征的氨磺酰部分(-S(O)2NH-)。如本文指出地，氨磺酰除草剂尤其包含磺酰脲除草剂、磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂和三唑并嘧啶除草剂。在磺酰脲除草剂中，氨磺酰部分是磺酰脲桥(-S(O)2NHC(O)NH(R)-)中的组分。在磺酰脲除草剂中，磺酰脲桥的磺酰基末端直接或者通过氧原子或者通过任选取代的氨基或亚甲基连接到被典型取代的环状或非环状基团上。在磺酰脲桥的相反末端，氨基(其可以具有取代基如甲基(R为CH3)代替卤素)连接到杂环基团上，典型地，所述基团是对称的嘧啶或三嗪环，具有一个或两个取代基，如甲基、乙基、三氟甲基、甲氧基、乙氧基、甲基氨基、二甲基氨基、乙基氨基和卤素。在磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂中，磺酰胺部分是磺酰基氨基羰基桥(-S(O)2NHC(O)-)的组分，在磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂中，磺酰基氨基羰基桥的磺酰基末端通常连接被取代的苯基环。在磺酰基氨基羰基桥的相反末端，羰基连接到三唑啉酮环的1位，典型地，其被诸如烷基和烷氧基的基团取代。在三唑并嘧啶除草剂中，磺酰胺部分的磺酰基部分连接到被取代的[1，2，4]三唑并嘧啶环体系的2-位并且磺酰胺部分的氨基末端连接到被取代的芳基，典型地，苯基，或者可选地，磺酰胺部分的氨基末端连接到被取代的[1，2，4]三唑并嘧啶环体系的2-位并且磺酰胺部分的磺酰基末端连接到被取代的芳基，典型地，吡啶基。
用于本发明的磺酰脲除草剂的代表是下式的那些：
其中：
J选自
J是R13SO2N(CH3)-；
R是H或CH3；
R1是F、Cl、Br、NO2、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C3-C4环烷基、C2-C4卤代链烯基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C2-C4烷氧基烷氧基、CO2R14、C(O)NR15R16、SO2NR17R18、S(O)nR19、C(O)R20、CH2CN或L；
R2是H、F、Cl、Br、I、CN、CH3、OCH3、SCH3、CF3或OCF2H；
R3是Cl、NO2、CO2CH3、CO2CH2CH3、C(O)CH3、C(O)CH2CH3、C(O)-环丙基、SO2N(CH3)2、SO2CH3、SO2CH2CH3、OCH3或OCH2CH3；
R4是C1-C3烷基、C1-C2卤代烷基、C1-C2烷氧基、C2-C4卤代链烯基、F、Cl、Br、NO2、CO2R14、C(O)NR15R16、SO2NR17R18、S(O)nR19、C(O)R20或L；
R5是H、F、Cl、Br或CH3；
R6是C1-C3烷基，任选用0-3个F、0-1个Cl和0-1个C3-C4烷氧基乙酰氧基取代，或R6是C1-C2烷氧基、C2-C4卤代链烯基、F、Cl、Br、CO2R14、C(O)NR15R16、SO2NR17R18、S(O)nR19、C(O)R20或L；
R7是H、F、Cl、CH3或CF3；
R8是H、C1-C3烷基或吡啶基；
R9是C1-C3烷基、C1-C2烷氧基、F、Cl、Br、NO2、CO2R14、SO2NR17R18、S(O)nR19、OCF2H、C(O)R20、C2-C4卤代链烯基或L；
R10是H、Cl、F、Br、C1-C3烷基或C1-C2烷氧基；
R11是H、C1-C3烷基、C1-C2烷氧基、C2-C4卤代链烯基、F、Cl、Br、CO2R14、C(O)NR15R16、SO2NR17R18、S(O)nR19、C(O)R20或L；
R12是卤素、C1-C4烷基或C1-C3烷基磺酰基；
R13是C1-C4烷基
R14是烯丙基、炔丙基或氧杂环丁烷-3-基；或R14是C1-C3烷基，任选被独立地选自卤素、C1-C2烷氧基和CN的至少一个成员取代；
R15是H、C1-C3烷基或C1-C2烷氧基；
R16是C1-C2烷基；
R17是H、C1-C3烷基、C1-C2烷氧基、烯丙基或环丙基；
R18是H或C1-C3烷基；
R19是C1-C3烷基、C1-C3卤代烷基、烯丙基或炔丙基；
R20是任选被卤素取代的C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基或C3-C5环烷基；
n是0、1或2；
L是
L1是CH2、NH或O；
R21是H或C1-C3烷基；
X是H、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4卤代烷基、C1-C4卤代烷硫基、C1-C4烷硫基、卤素、C2-C5烷氧基烷基、C2-C5烷氧基烷氧基、氨基、C1-C3烷基氨基或二(C1-C3烷基)氨基；
Y是H、C1-C4烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基、C1-C4烷硫基、C1-C4卤代烷硫基、C2-C5烷氧基烷基、C2-C5烷氧基烷氧基、氨基、C1-C3烷基氨基、二(C1-C3烷基)氨基、C3-C4链烯氧基、C3-C4炔氧基、C2-C5烷硫基烷基、C2-C5烷基亚硫酰基烷基、C2-C5烷基磺酰基烷基、C1-C4卤代烷基、C2-C4炔基、C3-C5环烷基、叠氮基或氰基；和
Z是CH或N；
并且满足下述条件：(i)当X和Y的一个或两个是C1卤代烷氧基时，Z是CH；和(ii)当X是卤素时，Z是CH，并且Y是OCH3、OCH2CH3、N(OCH3)CH3、NHCH3、N(CH3)2或OCF2H。应当注意到本发明的单种液体除草剂组合物，其包含一种或更多种式I的磺酰脲，其中当R6是烷基时，所述烷基不被取代。
预期用于本发明的代表性三唑并嘧啶除草剂是下式的那些：
其中：
R22和R23各自独立地选自卤素、硝基、C1-C4烷基、C1-C4卤代烷基、C1-C4烷氧基、C1-C4卤代烷氧基或C2-C3烷氧基羰基；
R24是H、卤素、C1-C2烷基或C1-C2烷氧基；
W是-NHS(O)2-或-S(O)2NH-；
Y1是H、C1-C2烷基或C1-C2烷氧基；
Y2是H、F、Cl、Br、C1-C2烷基或C1-C2烷氧基；
Y3是H、F或甲氧基；
Z1是CH或N；和
Z2是CH或N；
并且满足下述条件：Y1和Y2中至少一个不是H。
在上文对代表性的三唑并嘧啶除草剂的马库什描述中，当W是-NHS(O)2-时，磺酰胺部分的磺酰基末端连接到[1，2，4]三唑并嘧啶环系统，并且当W是-S(O)2NH-时，磺酰胺部分的氨基末端连接到[1，2，4]三唑并嘧啶环系统。
在上文提到的内容中，单独使用或者用于化合物单词如“烷硫基”或者“卤代烷基”时，术语“烷基”包括直链或支链烷基，如甲基、乙基、正丙基、异丙基或者不同的丁基异构体。“环烷基”包括例如，环丙基、环丁基和环戊基。“链烯基”包括直链或支链烯，如乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基和不同的烯基异构体。“链烯基”还包括多烯，如1，2-丙二烯基和2，4-丁二烯基、“炔基”包括直链或支链炔，如乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基和不同的丁炔基异构体。炔基还可以包括包含多个三键的部分，如2，5-己二炔基。“烷氧基”包括例如，甲氧基、乙氧基、正丙氧基、异丙氧基和不同的丁氧基异构体。“烷氧基烷基”指烷基上的烷氧基取代。“烷氧基烷基”的实例包括CH3OCH2、CH3OCH2CH2、CH3CH2OCH2、CH3CH2CH2CH2OCH2和CH3CH2OCH2CH2。“烷氧基烷氧基”指烷氧基上的烷氧基取代。“链烯氧基”包括直链或支链链烯氧基部分。“链烯氧基”的实例包括H2C＝CHCH2O、(CH3)CH＝CHCH2O和CH2＝CHCH2CH2O。“炔氧基”包括直链或支链的炔氧基部分。“炔氧基”的实例包括HC≡CCH2O和CH3C≡CCH2O。“烷硫基”包括支链或直链烷硫基部分，如甲硫基、乙硫基和不同的丙硫基异构体。“烷硫基烷基”指烷基上的烷硫基取代。“烷硫基烷基”的实例包括CH3SCH2、CH3SCH2CH2、CH3CH2SCH2、CH3CH2CH2CH2SCH2和CH3CH2SCH2CH2；“烷基亚硫酰基烷基”和“烷基磺酰基烷基”分别包括对应的亚砜和砜。类似地定义其它取代基，例如“烷基氨基”、“二烷基氨基”。
取代基中碳原子总数通过“Ci-Cj”前缀表示，其中i和j为1到5的数。例如，C1-C4烷基表示甲基到丁基，包括各种异构体。作为进一步的实例，C2烷氧基烷基表示CH3OCH2；C3烷氧基烷基表示例如CH3CH(OCH3)、CH3OCH2CH2或CH3CH2OCH2；C4烷氧基烷基表示用含有总共4个碳原子的烷氧基取代的烷基的多种异构体，实例包括CH3CH2CH2OCH2和CH3CH2OCH2CH2。
单独或者在化合物单词如“卤代烷基”中的术语“卤素”包括氟、氯、溴或碘。此外，当用于化合物单词如“卤代烷基”时，所述烷基可以部分或完全被卤素原子取代，所述卤素原子可以是相同或不同的。“卤代烷基”的实例包括F3C、ClCH2、CF3CH2和CF3CCl2。术语“卤代烷氧基”、“卤代烷硫基”等等类似于术语“卤代烷基”定义。“卤代烷氧基”的实例包括CF3O、CCl3CH2O、HCF2CH2CH2O和CF3CH2O。“卤代烷硫基”的实例包括CCl3S、CF3S、CCl3CH2S和ClCH2CH2CH2S。
下面的磺酰脲除草剂阐明了可用于本发明的磺酰脲：磺氨黄隆(N-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-N-甲基甲磺酰胺)、四唑黄隆(N-[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]-1-甲基-4-(2-甲基-2H-四唑-5-基)-1H-吡唑-5-磺酰胺)、苄嘧黄隆(2-[[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]甲基]苯甲酸甲酯)、氯嘧黄隆(2-[[[[(4-氯-6-甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸乙酯)、绿黄隆(2-氯-N-[[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]羰基]苯磺酰胺)、醚黄隆(N-[[(4，6-二甲氧基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]羰基]-2-(2-甲氧基乙氧基)苯磺酰胺)、环丙黄隆(N-[[[2-(环丙基羰基)苯基]氨基]磺酰基]-N1-(4，6-二甲氧基嘧啶-2-基)脲)、胺苯黄隆(2-[[[[[4-乙氧基-6-(甲基氨基)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸甲酯)、乙氧嘧磺隆([[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基磺酸2-乙氧基苯酯)、啶嘧黄隆(N-[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]-3-(三氟甲基)-2-吡啶磺酰胺)、氟吡黄隆(1-[3-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-2-吡啶基]-2-氟代丙基甲氧基乙酸酯)、氟啶黄隆(2-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-6-(三氟甲基)-3-吡啶羧酸甲酯)、甲酰胺黄隆(2-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-4-(甲酰基氨基)-N，N-二甲基苯甲酰胺)、吡氯黄隆(3-氯-5-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酸甲酯)、啶咪黄隆(2-氯-N-[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)-氨基]羰基]咪唑并[1，2-a]吡啶-3-磺酰胺)、碘甲黄隆(4-碘代-2-[[[[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸甲酯)、甲磺胺黄隆(2-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-4-[[(甲基磺酰基)氨基]甲基]苯甲酸甲酯)、甲黄隆(2-[[[[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸甲酯)、烟嘧黄隆(2-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-N，N-二甲基-3-吡啶甲酰胺)、环丙氧黄隆(2-[[[[(4，6-二甲基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸3-氧杂环丁烷酯)、氟嘧黄隆(2-[[[[[4，6-二(三氟甲氧基)-2-嘧啶基]氨基]羰基]氨基]磺酰基]-苯甲酸甲酯)、氟丙黄隆(N-[[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]羰基]-2-(3，3，3-三氟丙基)苯磺酰胺)、吡嘧黄隆(5-[[[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-1-甲基-1H-吡唑-4-羧酸乙酯)、玉嘧黄隆(N-[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]-3-(乙基磺酰基)-2-吡啶磺酰胺)、嘧黄隆(2-[[[[(4，6-二甲基-2-嘧啶基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸甲酯)、乙黄黄隆(N-[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]-2-(乙基磺酰基)咪唑并[1，2-a]吡啶-3-磺酰胺)、噻黄隆(3-[[[[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]羰基]氨基]磺酰基]-2-噻吩羧酸甲酯)、醚苯黄隆(2-(2-氯代乙氧基)-N-[[(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)氨基]羰基]苯磺酰胺)、苯黄隆(2-[[[[N-(4-甲氧基-6-甲基-1，3，5-三嗪-2-基)-N-甲基氨基]羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸甲酯)、三氟啶黄隆(N-[[(4，6-二甲氧基-2-嘧啶基)氨基]羰基]-3-(2，2，2-三氟乙氧基)-2-吡啶磺酰胺)、氟胺黄隆(2-[[[[[4-二甲基氨基)-6-(2，2，2-三氟乙氧基)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]羰基]氨基]磺酰基]-3-甲基苯甲酸甲酯)和三氟甲黄隆(N-[[[4-甲氧基-6-(三氟甲基)-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]羰基]-2-(三氟甲基)苯磺酰胺)。
下面的三唑并嘧啶除草剂举例说明可用于本发明的三唑并嘧啶：唑嘧磺胺盐(3-氯-2-[[(5-乙氧基-7-氟[1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2-基)磺酰基]氨基]苯甲酸甲酯、唑嘧磺胺(N-(2，6-二氯苯基)-5-乙氧基-7-氟[1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2-磺酰胺、双氟磺草胺(N-(2，6-二氟苯基)-8-氟-5-甲氧基[1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2-磺酰胺)、氟唑啶草(N-(2，6-二氟苯基)-5-甲基[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶-2-磺酰胺)、唑草磺胺(N-(2，6-二氯-3-甲基苯基)-5，7-二甲氧基[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶-2-磺酰胺)、五氟磺草胺(2-(2，2-二氟乙氧基)-N-(5，8-二甲氧基[1，2，4]三唑并[1，5-c]嘧啶-2-基)-6-(三氟甲基)苯磺酰胺)和pyroxsulam(N-(5，7-二甲氧基[1，2，4]三唑并[1，5-a]嘧啶-2-基)-2-甲氧基-4-(三氟甲基)-3-吡啶磺酰胺)。
下面的磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂举例说明了可用于本发明的磺酰基氨基羰基三唑啉酮：氟酮黄隆(4，5-二氢-3-甲氧基-4-甲基-5-氧代-N-[[2-(三氟甲氧基)苯基]磺酰基]-1H-1，2，4-三唑-1-羧酰胺)和丙苯黄隆(2-[[[(4，5-二氢-4-甲基-5-氧代-3-丙氧基-1H-1，2，4-三唑-1-基)-羰基]氨基]磺酰基]苯甲酸甲酯)。
另外的除草剂包括甜菜宁、三唑啉酮和WO2006/012981中公开的除草剂，通过引用将其完整并入本文。
本发明的方法还包括对田间的作物和杂草应用足量的所述作物种子或植物耐受的至少一种除草剂，如草甘膦、羟基苯基丙酮酸二加氧酶抑制剂(例如，硝草酮或磺草酮)、八氢番茄红素去饱和酶抑制剂(例如，吡氟草胺)、色素合成抑制剂、磺酰胺、咪唑啉酮、双丙氨酰膦、膦丝菌素、双丙氨酰膦、草胺膦、唑啶草酮(azafenidin)、氟丙嘧草酯(butafenacil)、草硫膦、草铵膦、三唑并嘧啶、嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯、或磺酰基氨基羰基三唑啉酮、和乙酰辅酶A羧化酶抑制剂，如精喹禾灵、合成的植物生长素，如二氯喹啉酸、KIH-485，或protox抑制剂以控制杂草而不显著伤害作物植物。
通常，应用于田间的除草剂的有效量是足够选择性控制杂草而不显著影响作物的量。本文使用的“杂草”指在具体区域不想要的植物。相反地，本文中使用的“作物植物”指在具体区域需要的植物，如玉米植物。从而，在一些实施方案中，杂草是非作物植物或非作物物种，而在一些实施方案中，杂草是将从具体区域被消除的作物物种，例如，种植玉米事件DP-098140-6的田间中次等的和/或非转基因玉米植物，或者种植DP-098140-6的田间中的玉米植物。可以将杂草分类成两大组：单子叶植物和双子叶植物。
可以通过本文描述的除草剂来控制(即，杀死或伤害)许多植物物种。因此，本发明的方法可以用于控制这些植物物种(当不需要它们时(即，它们是杂草时))。这些植物物种包括作物植物，以及通常被认为是杂草的物种，包括但不限于物种如：blackgrass(Alopecurusmyosuroides)、谷莠子(giant foxtail)(Setaria faberi)、马唐(largecrabgrass)(Digitaria sanguinalis)、苏里南草(Surinam grass)(Brachiariadecumbens)、野生燕麦(wild oat)(Avena fatua)、苍耳(common cocklebur)(Xanthium pensylvanicum)、普通藜(commonlambsquarters)(Chenopodium album)、番薯属(morning glory)(Ipomoeacoccinea)、灰菜(pigweed)(Amaranthus spp.)、天鹅绒叶属(Abutiliontheophrasti)、稗草(common barnyardgrass)(Echinochloa crus-galli)、百慕大草(bermudagrass)(Cynodon dactylon)、早雀麦(downy brome)(Bromus tectorum)、牛筋草(goosegrass)(Eleusine indica)、狗尾草(greenfoxtail)(Setaria viridis)、多花黑麦草(Italian ryegrass)(Loliummultiflorum)、约翰逊草(Johnsongrass)(Sorghum halepense)、lessercanarygrass(Phalaris minor)、windgrass(Apera spica-venti)、乌利千草(wooly cupgrass)(Erichloa villosa)、莎草(yellow nutsedge)(Cyperusesculentus)、蘩缕(common chickweed)(Stellaria media)、豚草(commonragweed)(Ambrosia artemisiifolia)、地肤(Kochia scoparia)、小白酒草(horseweed)(Conyza canadensis)、rigid黑麦草(Lolium rigidum)、牛筋草(Eleucine indica)、hairy飞蓬(Conyza bonariensis)、长叶车前(buckhorn plantain)(Plantago lanceolata)、热带紫鸭拓草(Commelinabenghalensis)、田旋花(field bindweed)(Convolvulus arvensis)、香附子(purple nutsedge)(Cyperus rotundus)、redvine(Brunnichia ovata)、大果田菁(hemp sesbania)(Sesbania exaltata)、镰刀豆(sicklepod)(Sennaobtusifolia)、蓝茎向日葵(Texas blueweed)(Helianthus ciliaris)和角胡麻(Devil’s claws)(Proboscidea louisianica)。在其它实施方案中，杂草包含除草剂抗性黑麦草，例如，草甘膦抗性黑麦草、对草快抗性黑麦草、ACC酶抑制剂抗性黑麦草，和非选择性除草剂抗性黑麦草。在一些实施方案中，不想要的植物位置邻近作物植物。
如本文所用地，“选择性控制”意指栽培区中多数杂草被显著伤害或杀死，而如果作物植物也存在于田间，那么多数作物植物不被显著伤害。从而，当至少55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多的杂草被显著伤害或杀死，而如果作物植物也存在于田间，小于45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％的作物植物被显著伤害或杀死时，认为该方法选择性控制杂草。
在一些实施方案中，本发明的玉米DP-098140-6植物不被以下述剂量应用于植物的特定除草剂处理造成显著损伤，所述剂量等同于每英亩或每公顷至少0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、110、120、150、170、200、300、400、500、600、700、800、800、1000、2000、3000、4000、5000或更多克或盎司(1盎司＝29.57ml)的活性成分或商业产品或除草剂制剂的比率，而通过相同的处理显著损伤合适的对照植物。
在一些特定实施方案中，ALS抑制剂除草剂的有效量包含每公顷至少约0.1、1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、750、800、850、900、950、1000、2000、3000、4000、5000或更多克或盎司(1盎司＝29.57ml)活性成分。在其它实施方案中，ALS抑制剂的有效量包含每公顷至少约0.1-50、约25-75、约50-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-200、约200-500、约500-600、约600-800、约800-1000或更多克或盎司(1盎司29.57ml)的活性成分。任何ALS抑制剂，例如表1中所列的那些都可以以这些水平应用。
在其它一些实施方案中，磺酰基脲的有效量包含每公顷至少0.1、1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、800、900、1000、5000或更多克或盎司(1盎司＝29.57ml)的活性成分。在其它实施方案中，磺酰基脲的有效量包含每公顷至少约0.1-50、约25-75、约50-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160、约160-170、约170-180、约190-200、约200-250、约250-300、约300-350、约350-400、约400-450、约450-500、约500-550、约550-600、约600-650、约650-700、约700-800、约800-900、约900-1000、约1000-2000或更多克或盎司(1盎司＝29.57ml)的活性成分。可以以该水平应用的代表性磺酰脲在表1中给出。
在其它一些实施方案中，磺酰基氨基羰基三唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯和咪唑啉酮的有效量可以包含每公顷至少约0.1、1、5、10、25、50、75、100、150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1500、1550、1600、1650、1700、1800、1850、1900、1950、2000、2500、3500、4000、4500、5000或更多克或盎司(1盎司29.57ml)的活性成分。在其它实施方案中，磺酰基氨基羰基三唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯或咪唑啉酮的有效量包含每公顷至少约0.1-50、约25-75、约50-100、约100-110、约110-120、约120-130、约130-140、约140-150、约150-160、约160-170、约170-180、约190-200、约200-250、约250-300、约300-350、约350-400、约400-450、约450-500、约500-550、约550-600、约600-650、约650-700、约700-800、约800-900、约900-1000、约1000-2000或更多克或盎司(1盎司29.57ml)的活性成分。
除草剂的有效量的另外范围可以见例如，University Extensionservices的多种出版物中。见，例如，Bernards等(2006)Guide forWeed Management in Nebraska(www.ianrpubs.url.edu/sendlt/ec130)；Regher等(2005)Chemical Weed Control for Fields Crops，Pastures，Rangeland，and Noncropland，Kansas State University AgriculturalExtension Station and Corporate Extension Service；Zollinger等(2006)North Dakota Weed Control Guide，North Dakota Extension Service和www.weeds.iastate.edu的Iowa State University Extension，通过引用将它们都并入本文。
在本发明的一些实施方案中，将草甘膦应用于栽培区和/或栽培区的至少一株植物，应用的比率为每英亩8到32盎司酸当量，或者应用范围的下限为每英亩10、12、14、16、18、20、22、24、26、28和30盎司之间的酸当量，应用范围的上限为每英亩12、14、16、18、20、22、24、26、28、30和32盎司(1盎司＝29.57ml)之间的酸当量。在其它实施方案中，以每公顷至少1、5、10、20、30、40、50、60、70、80、90或更高盎司活性成分应用草甘膦(1盎司＝29.57ml)。在本发明的一些实施方案中，将磺酰基脲除草剂应用于田间和/或田间的至少一株植物，应用的比率为每英亩0.04到1.0盎司活性成分，或应用范围的下限为每英亩0.1、0.2、0.4、0.6到0.8盎司之间活性成分，应用范围的上限为每英亩0.2、0.4、0.6、0.8到1.0盎司之间活性成分(1盎司＝29.57ml)。
如本领域已知地，作为一类的草甘膦除草剂含有相同的活性成分，但是活性成分作为多种不同盐和/或制剂中的一种存在。然而，已知抑制ALS的除草剂在其活性成分以及其化学配方的方面有所不同。本领域技术人员熟悉对于特定体积和/或重量的除草剂制剂中存在的活性成分和/或酸当量的量的确定。
在一些实施方案中，使用ALS抑制剂除草剂。ALS抑制剂除草剂被应用于作物、作物部分、种子或者栽培区的比率可以是本文公开的任何比率。在特定实施方案中，ALS抑制剂除草剂的比率为约0.1到约5000g ai/公顷，约0.5到约300g ai/公顷或约1到约150g ai/公顷。
通常，将特定除草剂以每年不超过1、2、3、4、5、6、7或8次，或每个生长期不超过1、2、3、4或5次应用于特定田间(和其中生长的任何植物)。
“用除草剂的组合处理”或“将除草剂的组合应用于”作物、栽培区或田间意指：用指明是所述组合的一部分的每种除草剂和/或化学品对特定的田间，作物或杂草进行处理，使得实现所需的效果，即，使得选择性控制杂草而作物不受到显著损害。在一些实施方案中，对每种除草剂敏感的杂草显示出每种除草剂处理引起的损害，所述损害是累加的或协同的。每种除草剂和/或化学品的应用可以是同时的或者可以在不同时间应用，只要实现所需的效果即可。此外，可以在种植作物之前进行应用。
用于本发明方法中的除草剂与除草剂组合物中其它除草剂活性成分的比例通常为按重量计5000∶1到1∶5000、1000∶1到1∶1000、100∶1到1∶100、10∶1到1∶10或5∶1到1∶5的比例。本领域技术人员可以基于所希望的杂草控制谱容易地确定最佳比例。此外，在本发明的方法中也可以应用表1中公开的多种除草剂的范围的任何组合。
从而，在一些实施方案中，本发明提供了用于选择性控制田间杂草的改进方法，其中总的除草剂应用可以为其它方法中使用的量的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％以下。类似地，在一些实施方案中，用于选择性控制田间杂草的特定除草剂的量可以为将用于其它方法，即不利用本发明植物的方法中该特定除草剂的量的90％、85％、80％、75％、70％、65％、60％、55％、50％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％或1％以下。
在一些实施方案中，本发明的DP-098140-6玉米植物从协同效应受益，其中GLYAT多肽和zm-hra多肽赋予的除草剂耐受性大于将每种基因单独赋予各自含有它们的转基因植物的除草剂耐受性简单组合所预期的除草剂耐受性。见，例如，McCutchen等(1997)J.Econ.Entomol.90：1170-1180；Priesler et al.(1999)J. Econ.Entomol.92：598-603。如本文所用的，如在“协同效应”或“协同除草剂组合”或“协同除草剂组合物”中的术语“协同性”、“协同的”、“协同地”或其衍生术语指这样的情况，在所述情况下，除草剂组合，如至少第一种除草剂和第二种除草剂的组合，的生物活性大于各自除草剂生物活性之和。通常通过Kull，等，Applied Microbiology 9，538(1961)所述的方法，来确定采用“协同指数(SI)”表示的协同性。也见Colby，“Calculating Synergistic and Antagonistic Responses of HerbicideCombinations，”Weeds 15，20-22(1967)。
在其它一些情况下，赋予本发明的DP-098140-6植物的除草剂耐受性是累加的；即，除草剂耐受性基因赋予的除草剂耐受概况是可从简单组合每种基因分别赋予各自含有它们的转基因植物的除草剂耐受性来预期的。两种或更多种除草剂针对关键杂草物种的累加和/或协同活性将增加总体有效性和/或减小控制所述杂草所需的活性成分的实际量。当观察到协同性时，本发明的植物可以显示出对除草剂的更高剂量或比率的耐受性和/或该植物可以显示出对在将预期显示出对其耐受的那些之外的另外的除草剂或其它化学品的耐受性。例如，DP-098140-6玉米植物可以显示出对有机磷酸酯化合物如杀虫剂和/或4-羟基苯基丙酮酸二加氧酶抑制剂的耐受性。
从而，例如，本发明的DP-098140-6玉米植物可以显示出大于预期的、对多种除草剂的耐受性，所述除草剂包括但不限于草甘膦、ALS抑制剂化学物质和磺酰基脲除草剂。本发明的DP-098140-6玉米植物可以显示出对特定除草剂或除草剂组合的耐受性，其为含有仅仅单个除草剂耐受性基因(其赋予对相同除草剂或除草剂组合的耐受性)的合适的对照植物的耐受性的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、300％、400％、500％或更高。从而，本发明的DP-098140-6玉米植物与合适的对照植物相比可以显示出对于相同剂量除草剂的减小的损伤，或者它们可以比对照植物应答更高剂量的除草剂而显示出相同程度的损伤。因此，在特定实施方案中，用于田间选择性含有杂草的特定除草剂比将用于其它方法(即不利用本发明植物的方法)中的该特定除草剂的量大1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大。
以相同的方式，在一些实施方案中，本发明的DP-098140-6玉米植物与合适的对照植物相比显示出对除草剂活性成分的特定制剂的提高的耐受性。除草剂在商业上作为制剂出售，其除了所述除草剂活性成分外通常还包括其它成分；这些成分通常意在增强所述活性成分的功效。此类其它成分可以包括例如，安全剂(safener)和佐剂(见，例如，Green和Foy(2003)“Adjuvants：Tools for Enhancing HerbicidePerformance，”，Weed Biology and Management，ed.Inderjit(KluwerAcademic Publishers，荷兰))。从而，本发明的DP-098140-6玉米植物可以显示出对特定除草剂制剂(例如，特定通过商业途径可获得的除草剂产品)的耐受性，其为仅仅含有赋予对相同除草剂制剂的耐受性的单种除草剂耐受性基因的合适的对照植物的耐受性的至少1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、12％、15％、17％、20％、22％、25％、27％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、80％、90％、100％、125％、150％、175％、200％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、1100％、1200％、1300％、1400％、1500％、1600％、1700％、1800％、1900％或2000％或更高。
在一些实施方案中，本发明的DP-091804-6玉米植物显示出对除草剂或除草剂的类的提高的耐受性(至少一种其它除草剂耐受性赋予对所述除草剂或除草剂的类的耐受性)，以及显示出对至少一种其它除草剂或化学品的提高的耐受性(所述至少一种其它除草剂或化学品具有与草甘膦或对应于所述至少一种其它除草剂耐受性基因的除草剂不同的作用机理或基础)。本发明的该令人惊奇的益处可以用于生长作物的方法中，所述方法包括：用化学品的多种组合进行处理，所述化学品包括例如，用于生长作物的其它化学品。从而，例如，DP-098140-6玉米植物也可以显示出毒死蜱耐受性，毒死蜱是一种全身性的有机磷酸酯杀虫剂。从而，本发明还提供了赋予对草甘膦的耐受性(即GLYAT基因)的DP-098140-6玉米植物和其显示出对影响细胞色素P450基因的化学品的提高的耐受性的磺酰基脲除草剂耐受性基因，和其利用方法。在一些实施方案中，DP-098140-6玉米植物也显示出对麦草畏的提高的耐受性。在这些实施方案中，在草甘膦和磺酰基脲除草剂存在时，对麦草畏的提高的耐受性可能是明显的。
在其它一些方法中，将除草剂组合应用于DP-098140-6玉米植物，其中所述除草剂组合在控制杂草方面产生累加的或协同效应。此类除草剂组合可以使得应用比率得以减小，更宽范围的不想要的植物得以被控制，以更少的应用提高对不想要的植物的控制，除草剂活性更快发作，或者除草活性得以延长。
“累加的除草剂组合物”具有约等于各自组分所观察到的活性的除草活性。“协同的除草剂组合”具有除草活性，其高于根据各自组分单独使用时观察到的活性所预期的活性。因此，本发明公开的主题提供了协同除草剂组合，其中该混合物的杂草控制程度超过各自除草剂控制的总和。在一些实施方案中，混合物的杂草控制程度以任何统计学显著量超过各自除草剂控制总和，包括例如，约1％到5％、约5％到约10％、约10％到约20％、约20％到约30％、约30％到40％、约40％到约50％、约50％到约60％、约60％到约70％、约70％到约80％、约80％到约90％、约90％到约100％、约100％到120％或更大。此外，除草剂的“协同有效量”指一种除草剂引起除草剂组合物中存在的另一种除草剂中的协同效应必需的量。从而，术语“增效剂”和其衍生术语指增强活性成分的活性的物质，活性成分即制剂中存在的用于从其得到生物效应的物质，例如，除草剂。
因此，在一些实施方案中，本发明公开的主题提供了控制栽培区中杂草的方法。在一些实施方案中，该方法包括：(a)在该区域种植DP-098140-6作物种子或作物植物；和(b)对杂草、作物植物、作物部分、栽培区或者其组合应用有效量的除草剂组合物，该组合物包含至少一种协同有效量的草甘膦和协同有效量的ALS抑制剂(例如，但不限于磺酰基脲除草剂)或者其农学上合适的盐，其中至少一种：(i)草甘膦的协同有效量低于不存在磺酰基脲除草剂时控制杂草所需的草甘膦的量；(ii)ALS抑制剂除草剂的协同有效量低于不存在草甘膦时控制杂草所需的ALS抑制剂的量；和(iii)其组合；并且其中该除草剂组合物的有效量被作物种子或作物植物耐受并且控制栽培区中的所述杂草。
在一些实施方案中，用于本发明公开的控制杂草的方法中的除草剂组合物包含协同有效量的草甘膦和磺酰基脲除草剂。在进一步的实施方案中，本发明公开的协同除草剂组合物包含草甘膦和选自甲黄隆、绿黄隆和醚苯黄隆的磺酰基脲除草剂。
在具体实施方案中，协同除草剂组合还包含佐剂，如基于硫酸铵的佐剂，如ADD-(Wenkem S.A.，Halfway House，Midrand，南非)。在另外实施方案中，本发明公开的协同除草剂组合物包含另外的除草剂，例如，有效量的嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯除草剂。在一些实施方案中，嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯除草剂包含双嘧苯甲酸，例如(
Valent U.S.A.Corp.，Walnut Creek，California，美国)或者其农学上合适的盐。
在本发明公开的控制不想要的植物的方法的一些实施方案中，将草甘膦在出现(emergence)前、出现后或出现前和出现后应用于不需要的植物或植物作物；和/或将ALS抑制剂除草剂(即，磺酰基脲除草剂)在出现前、出现后或出现前和出现后应用于不需要的植物或植物作物。在其它实施方案中，草甘膦和/或ALS抑制剂除草剂(即，磺酰基脲除草剂)一起应用或单独应用。在其它实施方案中，在种植感兴趣的植物，例如上面的步骤(a)之前至少应用一次协同除草剂组合物，例如，上面的步骤(b)。
在使作物(例如，玉米作物)生长的田间仅用草甘膦难以控制的杂草包括但不限于下面的：小白酒草(例如，Conyza canadensis)、rigid黑麦草(例如，Lolium rigidum)、牛筋草(例如，Eleusine indica)、多花黑麦草(例如，Lolium multiflorum)、hairy飞蓬(例如，香丝草(Conyzabonariensis))、长叶车前(例如，Plantago lanceolata)、豚草(例如，Ambrosia artemisifolia)、番薯属(例如，Ipomoea spp.)、waterhemp(例如，苋属(Amaranthus spp.))、田旋花(例如，Convolvulus arvensis)、yellownutsedge(例如，油莎豆(Cyperus esculentus))、普通藜(例如，藜(Chenopodium album))、野生荞麦(例如，Polygonium convolvulus)、天鹅绒叶属(例如，Abutilon theophrasti)、地肤(kochia)(例如，Kochiascoparia)和亚洲鸭跖草(例如，鸭跖草属(Commelina spp.))。在发现此类杂草的区域，DP-098140-6玉米可尤其用于用将对不含有这两种多核苷酸的作物植物引起不可接受的损害的除草剂组合来处理田间(和因此在田中生长的任何作物)。耐受草甘膦和其它除草剂，如磺酰基脲，咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂以及耐受具有不同作用模式或作用位点的至少一种其它除草剂的本发明植物可尤其用于这样的情况，其中杂草耐受与植物耐受的除草剂中的至少两种相同的除草剂。以这种方式，可能使得本发明的植物改进对耐受一种以上除草剂的杂草的控制。
例如，用于使当前的商业作物(包括例如，玉米)生长的田间杂草控制的一些常用的处理包括草甘膦和任选地，2，4-D；然而，该组合具有一些缺点。具体地，一些杂草种类不能被该组合良好的控制并且该组合对于寒冷天气中的杂草控制不能很好地发挥作用。玉米田中杂草控制的另一常用的处理是磺酰基脲除草剂氯嘧黄隆，其在土壤中具有显著残留活性，从而对所有以后出现的杂草物种保持选择压力，对于磺酰基脲抗性杂草的生长和扩散产生有利的环境。然而，可以用将引起标准植物品种不可接受的损害的除草剂(例如，氯嘧黄隆)和除草剂组合来处理DP-098140-6玉米。从而，例如，可以用磺酰基脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮如磺酰基脲氯嘧黄隆单独或者与其它除草剂组合来处理含有DP-098140-6玉米的田间。例如，可以用草甘膦和苯黄隆的组合(通过商业途径以
得到)来处理含有本发明的玉米植物的田间。该组合对于一些情况下的杂草控制具有几个优点，包括：使用具有不同作用方式的除草剂和使用在土壤中具有相对短的残留活性期的除草剂。具有相对短的残留活性期除草剂在例如这样的情况下是所希望的：减小将有利于除草剂耐受性杂草的生长的选择压力是重要的。当然，在需要杂草控制的任何具体情况下，其它考虑可能是更重要的，如在种植作物之前，通过具有相对长的残留活性期的除草剂防止田间发生和/或出现杂草。还可以用除草剂组合来处理DP-098140-6玉米植物，所述组合包括烟嘧黄隆、甲黄隆、苯黄隆、噻黄隆和/或玉嘧黄隆的至少一种。包括苯黄隆和噻黄隆的处理可以是尤其有用的。
在使本发明的商业品种作物(包括例如，玉米)生长的田中杂草控制的其它常用的处理包括磺酰基脲除草剂噻黄隆(可通过商业途径以Harmony
得到)。然而，噻黄隆的一个缺点是连续的杂草控制所需的较高应用率通常导致对相同田中生长的作物的伤害。可以用草甘膦和噻黄隆的组合处理DP-098140-6玉米植物，其具有使用具有不同作用方式的除草剂的优点。从而，抗仅仅任一种除草剂的杂草可被两种除草剂的组合控制，并且该处理不显著伤害DP-091840-6玉米植物。
在使本发明的商业品种作物(包括例如，玉米)生长的田中杂草控制的其它除草剂是三唑并嘧啶除草剂唑嘧磺胺盐(可通过商业途径以
得到)和咪唑啉酮除草剂灭草喹(可通过商业途径以
得到)。当单独使用这些除草剂时，它们可以提供杂草的仅仅边缘控制。然而，可以例如用草甘膦(例如，
(草甘膦异丙胺盐))、灭草烟(当前可通过商业途径以
得到)、氯嘧黄隆(当前可通过商业途径以
得到)、精喹禾灵(当前可通过商业途径以Assure
得到)和氟黄胺草醚(当前可通过商业途径以
得到)的组合，来处理含有DP-098140-6玉米的田间。该组合具有使用不同作用方式的除草剂处理的优点。从而，通过这五种除草剂的组合控制仅仅耐受这些除草剂的一种或几种的杂草，并且DP-098140-6玉米不被所述除草剂组合处理所显著伤害。所述组合提供了对预期在当前杂草控制实践中出现和扩散的除草剂耐受性杂草的非常宽的保护范围。
也可以用例如包括草甘膦、玉嘧黄隆和麦草畏或硝草酮的除草剂组合来处理含有DP-098140-6玉米植物的田间。该组合物尤其可用于控制已经发展了对抑制ALS的除草剂的一定的耐受性的杂草。尤其可用于杂草控制的除草剂的另一组合包括草甘膦和至少一种下面的：甲黄隆(可通过商业途径以
的)、灭草烟(可通过商业途径以
得到)、咪草烟、灭草喹和磺胺草唑。应当理解，上文和本文别处讨论的任合组合也可以与任合其它除草剂或农业化学品组合用于处理区域。
使当前的商业作物(包括例如，玉米)生长的田间中杂草控制的一些常用处理包括草甘膦(当前可通过商业途径以
得到)、玉嘧黄隆(当前可通过商业途径以
或
得到)、麦草畏(通过商业途径以
得到)、阿特拉津和硝草酮(通过商业途径以
得到)。由于对多种除草剂的弱耐受性，这些除草剂有时被单独使用。不幸的是，当单独使用时，这些除草剂每种都具有显著的缺点。具体地，耐受各自除草剂的杂草发生率不断增加，使得在一些情况下草甘膦的有效量比预期的要低。玉嘧黄隆在导致作物损伤的高剂量下提供了较好的杂草控制，例如麦草畏的替代物通常比其它常用的除草剂更昂贵。然而，可以用将对标准植物品种引起不可接受的伤害的除草剂或除草剂组合来处理DP-098140-6玉米，所述组合包括包含玉嘧黄隆和/或麦草畏的除草剂组合。用于本发明的DP-098140-6玉米植物的其它合适的除草剂组合包括草甘膦、磺酰基脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶氧基(硫代)苯甲酸酯，和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂，包括例如，下面的至少一种：甲黄隆、苯黄隆、氯嘧黄隆、咪草烟、灭草烟和灭草喹。
例如，可以用草甘膦和玉嘧黄隆，或者玉嘧黄隆和至少一种其它除草剂的组合来处理DP-098140-6玉米植物。还可以用草甘膦、玉嘧黄隆和麦草畏的组合，或者草甘膦、玉嘧黄隆和至少一种其它除草剂的组合处理DP-098140-6玉米植物。在一些实施方案中，至少一种其它除草剂具有与草甘膦和玉嘧黄隆不同的作用方式。草甘膦、玉嘧黄隆和麦草畏的组合具有如下优点：这些除草剂具有不同的作用方式和短的残留活性，这降低了除草剂耐受性杂草的发生和扩散的风险。
使当前的商业作物生长的田间中杂草控制的一些常用处理包括草甘膦(当前可通过商业途径以得到)、氯嘧黄隆、苯黄隆、玉嘧黄隆(当前可通过商业途径以
或
得到)、咪草烟、灭草烟和灭草喹。不幸的是，当单独使用时，这些除草剂的每种具有显著缺点。具体地，耐受各自除草剂的杂草发生率不断增加，使得在一些情况下每种各自除草剂的有效性比期望的要低。然而，DP-098140-6玉米可以用将对标准植物品种引起不可接受的伤害的除草剂组合来处理，包括包含上述这些除草剂的至少一种的除草剂的组合。
在本发明的方法中，可以以任何方式配制除草剂并将其应用于感兴趣的区域，如栽培大田或区域。可以以任何形式，如以液体喷雾剂或作为固体粉剂或粒剂向田间应用除草剂。在一些特定实施方案中，用于方法中的除草剂或除草剂组合包括罐混合物或预混合物。也可以将除草剂配制为例如使用掺和技术产生的“均匀颗粒掺合物”(见，例如，美国专利号6,022,552，标题“Uniform Mixtures of PesticideGranules”)。美国专利号6,022,552的掺和技术以干燥粒剂形式产生了经配制的作物保护化学品的非分离掺合物(即，“均匀颗粒掺合物”)，其使得可以递送被设计用于解决特定问题的定制混合物。可以以与常规预混合产品相同的方式运输、处理、二次采样和应用均匀颗粒掺合物，在常规预混合产品中将活性成分配制到相同的颗粒中。
简言之，通过将至少两种挤出的经配制的颗粒产品混合在一起，来制备“均匀颗粒掺合物”。在一些实施方案中，每种颗粒产品都包含经注册的制剂，其含有单种活性成分，该活性成分可以是例如除草剂、杀真菌剂和/或杀昆虫剂。可以通过控制用于掺合物中颗粒的相对大小和大小分布，来优化“均匀颗粒掺合物”的均一性(均匀性)。可以通过挤压机模子中的孔的大小控制挤出的颗粒的直径，用离心筛分方法，得到具有所希望的长度分布的、挤出颗粒的群体(见，例如，美国专利号6,270,025)。
当均匀的颗粒掺合物可以被二次采样成合适的大小等分试样并且每个等分试样的组成将满足所需的测定法规范时，所述均匀的颗粒掺合物被认为是“均匀的”。为了证实均匀性，制备均匀颗粒的大样品，然后将其二次采样成大于最小的统计样品大小的等分试样。
在一些非限制性实施方案中，，可以用除草剂(例如，氯嘧黄隆和其它除草剂的组合，没有DP-098140-6事件的情况下，所述除草剂将引起对没有草甘膦/ALS抑制剂遗传学的植物品种的不可接受的作物应答)来处理3560.4.5.3玉米植物。从而，可以用磺酰基脲、咪唑啉酮、三唑并嘧啶、嘧啶基(硫代)苯甲酸酯，和/或磺酰基氨基羰基三唑啉酮除草剂单独或者与其它除草剂组合，来处理例如，种植并且含有DP-098140-6玉米的田间。因为ALS抑制剂化学品具有不同的除草剂属性，所有ALS与其它化学品的掺和物将提供优良的杂草管理策略，包括改变和增加的杂草范围，能够提供特定残留活性(具有残留活性的SU/ALS抑制剂化学导致提高的叶活性，其导致草甘膦应用之间更宽的窗口，以及如果天气条件阻止及时应用时，其使得控制期增加)。
掺合物还提供了以正常的、标记的使用率加入其它农业化学品的能力，如另外的除草剂(第三/第四种作用机理)、杀真菌剂、杀昆虫剂、植物生长调节剂等等，从而节省与另外应用相关的成本。
可以将对DP-098140-6玉米植物应用的任何除草剂制剂制备为“罐混合”组合物。在此类实施方案中，每种成分或成分的组合可以相互单独保存。然后可以在应用前将成分相互混合。通常，此类混合在应用前不久混合。在罐混合方法中，每种成分在混合前通常存在于水或者合适的有机溶剂中，对于配制技术的另外教导，见，T.S.Woods，“The Formulator′s Toolbox--Product Forms for Modern Agriculture”Pesticide Chemistry and Bioscience，The Food-Environment Challenge，T.Brooks和T.R.Roberts编著，Proceedings of the 9th InternationalCongress on Pesticide Chemistry，The Royal Society of Chemistry，Cambridge，1999，pp.120-133。也见美国专利号3,235,361第6栏16行到第7栏第19行和实施例10-41、美国专利号3,309,192第5栏第43行到第7栏第62行，和实施例8、12、15、39、41、52、53、58、132、138-140、162-164、166、167和169-182、美国专利号2,891,855第3栏第66行到第5栏第17行和实施例1-4、Klingman，Weed Controlas a Science，John Wiley and Sons，Inc.，New York，1961，pp 81-96和Hance et al.，Weed Control Handbook，第8版，Blackwell ScientificPublications，Oxford，1989，通过引用将它们都完整并入本文。
本发明的方法还允许开发用于DP-098140-6玉米植物的除草剂组合。在此类方法中，对栽培区中的环境条件加以评估。可以评估的环境条件包括，但不限于，地下和地表水污染问题、作物的预期用途、作物耐受性、土壤残留、栽培区中存在的杂草，土壤质地、土壤pH、土壤中有机物质的量、应用设备，和耕地实践。当评估环境条件时，可以将有效量的除草剂组合应用于作物、作物部分、作物种子或栽培区。
在一些实施方案中，应用于本发明的DP-098140-6玉米植物的除草剂用于防止敏感杂草开始生长和/或用于引起感兴趣区域生长的杂草的伤害。在一些实施方案中，除草剂或除草剂混合物对会影响到随后种植于感兴趣区域(即，栽培田或区域)中的作物的杂草发挥这些作用。在本发明的方法中，除草剂组合的应用不需要同时进行。只要种植作物的田间含有可检测量的第一种除草剂并且在作物在栽培区期间的某个时间应用第二种除草剂，就认为已经用根据本发明的除草剂混合物处理了所述作物。从而，本发明的方法包括应用除草剂，所述应用是“出现前”、“出现后”“种植前掺入”和/或涉及种植前的种子处理。
在一个实施方案中，针对涂布种子提供了方法。所述方法包括用有效量的除草剂或除草剂的组合(如本文别处公开)涂布种子。然后可以将种子种植在栽培区。还提供了具有涂层的种子，所述涂层包含有效量的除草剂或除草剂的组合(如本文别处公开)。
“出现前”指在植物从土壤可见地出现前应用于感兴趣区域(例如，栽培田或区域)的除草剂。“出现后”指在植物从土壤可见地出现后应用于感兴趣区域的除草剂。在一些情况下，术语“出现前”和“出现后”用于感兴趣区域中的杂草，在一些情况下，这些术语用于感兴趣区域中的作物植物。当用于杂草时，这些术语可以仅用于存在或者认为存在于感兴趣区域中的仅仅一种具体类型的杂草或者复数种的杂草种类。尽管可以在出现前和/或出现后处理中应用任何除草剂，但是已知一些除草剂当在出现前或出现后应用时在控制一种或复数种杂草中更有效。例如，玉嘧黄隆具有出现前和出现后活性，而其它除草剂主要具有出现前(异丙甲草胺)或出现后(草甘膦)活性。具体除草剂的这些性质是本领域已知的，并且容易由本领域技术人员确定。此外，本领域技术人员将能容易地选择用于本发明的转基因植物和/或将种植本发明的转基因植物的区域的合适的除草剂和应用时间。“种植前掺入”涉及在种植前向土壤中掺入化合物。
从而，本发明提供了使作物生长和/或控制杂草，如“种植前减弱”的改进方法，其中在种植感兴趣作物前用除草剂处理区域以便更好地控制杂草。本发明还提供了使作物生长和/或控制杂草的方法，所述杂草是“无-耕种”或“低-耕种”的(也称作“减少的耕种”)。在此类方法中，与常规方法相比，土壤不被栽培或者在生长周期期间被栽培的频率较低；这些方法可以节约由于另外的栽培引起的成本，如劳力和燃料成本。
本发明的方法包括使用同时和/或序贯应用多个类别的除草剂。在一些实施方案中，本发明的方法涉及用仅仅一种除草剂或其它化学品，如磺酰基脲除草剂处理本发明的植物和/或感兴趣区域(例如，栽培田或区域)和/或杂草。
除草剂应用于感兴趣区域(和其中的任何植物)的时间在对杂草控制的优化中可能是重要的。可以针对植物大小和/或生长阶段和/或感兴趣区域中植物的发育，如区域中生长的作物植物或杂草，来确定应用除草剂的时间。植物生长和/或发育的阶段是本领域已知的。例如，玉米植物通常经过下面的营养阶段VE(突出体)、V1(第一叶)、V2(第二叶)、V3(第三叶)、V(n)(Nth/叶)和VT(雄花穗)。玉米通过生殖期的进展如下：R1(抽丝)、R2(发疱)、R3(产乳)、R4(蜡熟)、R5(dent)；和R6(生理成熟)。棉花植物通常经过VE(突出体)、VC(子叶)、V1(第一真叶)和V2到VN。然后，在约V14开始的生殖阶段包括R1(开始开花)、R2(完全花)、R3(开始棉桃)、R4(cutout，棉桃发育)、R5(开始成熟，第一个打开的棉桃)、R6(成熟，50％打开的棉桃)和R7(完全成熟，80-90％打开的棉桃)。从而，例如，除草剂或其它化学品应用于生长植物的感兴趣区域的时间可以是特定区域中一些或者所有植物已经达到至少特定大小和/或生长和/或发育阶段的时间，或者特定区域中一些或全部植物还没有达到特定大小和/或生长和/或发育阶段的时间。
在一些实施方案中，本发明的DP-098140-6玉米植物显示出对出现后除草剂处理的提高的耐受性。例如，本发明的植物与合适的对照植物相比，可以耐受更高剂量的除草剂，耐受更宽范围的除草剂(即，耐受更多的ALS抑制剂化学品)，和/或可以耐受在更早或更晚发育时间应用的除草剂剂量。例如，在一些实施方案中，本发明的DP-098140-6玉米植物显示出增加的、对下述形态缺陷的抗性，已知所述形态缺陷是由特定发育阶段的处理引起的。从而，例如，当在晚于V5、V6、V7、V8、V9、V10、V11、V12、V13或更晚阶段用除草剂处理玉米植物时，通常引起称作“耳穗萎缩(ear pinch)”的现象，而本发明的草甘膦/ALS抑制剂耐受性植物在相同阶段被处理时显示出“耳穗萎缩”的降低的发生率。从而，本发明的草甘膦/ALS抑制剂耐受性植物可用于涉及在比以前可行的发育阶段更晚的阶段进行除草剂处理的方法中。从而，可以用特定除草剂来处理本发明的植物，所述除草剂在相同发育阶段的对照植物中引起形态缺陷，但是本发明的草甘膦/ALS抑制剂耐受性植物将不受到该相同处理的显著伤害。
不同的化学品如除草剂具有不同的“残留”作用，即用所述化学品或除草剂处理对被处理的区域中生长的植物持续具有影响的不同时间量。此类影响可以是希望的或不希望的，这取决于被处理的区域(例如，栽培田或区域)的需要的将来目的。从而，可以基于将用于每种植物的处理的残留效果和它们对将随后在相同区域中生长的作物的影响，来选择作物轮作方案。本领域技术人员熟悉可以用于评估除草剂的残留作用的技术；例如，通常，草甘膦具有很小的或没有土壤残留活性，而抑制ALS的除草剂的残留活性水平则有所不同。多种除草剂的残留活性是本领域已知的，并且也已知随着多种环境因素而变，所述因素包括例如，土壤湿度水平、温度、pH和土壤组成(质地和有机物质)。DP-098140-6玉米植物可以特别用于使作物生长的方法中，其中提高的对除草剂的残留活性的耐受性是有益的。
例如，在一个实施方案中，DP-098140-6玉米植物对草甘膦以及对ALS抑制剂化学品(如磺酰基脲除草剂)有提高的耐受性(当单独应用时)，并且进一步提供了对除草剂如草甘膦和/或ALS抑制剂化学品的组合的提高的耐受性。此外，本发明的转基因植物提供了对与除草剂处理联用的常用于作物的其他化学品的提高的耐受性，所述其他化学品为诸如安全剂、佐剂，如磺酸铵和作物土壤浓缩物，等等。
术语“安全剂”指当加入除草剂制剂时消除或减小除草剂对某些作物的植物毒性作用的物质。本领域普通技术人员将明白，对安全剂的选择部分依赖于感兴趣作物植物和特定除草剂或协同除草剂组合物中包括的除草剂组合。适用于本发明公开的除草剂组合物的示例性安全剂包括，但不限于，美国专利号4,808,208、5,502,025、6,124,240和美国专利申请公布号2006/0148647、2006/0030485、2005/0233904、2005/0049145、2004/0224849、2004/0224848、2004/0224844、2004/0157737、2004/0018940、2003/0171220、2003/0130120、2003/0078167中公开的那些，通过引用将它们的公开内容完整并入本文。本发明的方法可以涉及使用除草剂与除草剂安全剂的组合以增加作物安全性，所述安全剂为诸如解草酮、BCS(1-溴-4-[(氯代甲基)磺酰基]苯)、喹氧乙酸、抑害腈、抑害胺、2-(二氯甲基)-2-甲基-1，3-二氧戊环(MG 191)、解草唑-乙基、解草啶、解草安、肟草安，解草呋、isoxadifen-乙基、吡咯二酸二乙酯、去草酮((4-甲氧基-3-甲基苯基)(3-甲基苯基)-甲酮)、萘酸酐(1，8-萘酸酐)和解草腈。除草剂安全剂的解毒有效量可以与本发明的化合物同时应用，或者作为种子处理应用。因此，本发明的一方面涉及包含草甘膦、至少一种其它除草剂和解毒有效量的除草剂安全剂的混合物的用途。
种子处理尤其可用于选择性的杂草控制，因为它在生理上限制针对作物植物的解毒。因此，本发明的尤其有用的实施方案是选择性控制田中杂草生长的方法，其包括：用解毒有效量的安全剂来处理用于生长作物的种子，并用能有效控制杂草的量的除草剂来处理大田。本领域技术人员可以通过简单实验容易地确定安全剂的解毒有效量。当用安全剂处理希望的植物使得除草剂对植物的效应与所述除草剂对没有该安全剂处理的植物的效应相比减低时，存在解毒有效量的安全剂；通常，解毒有效量的安全剂防止对用该安全剂处理的植物的损害或严重损害。本领域技术人员能够确定安全剂的使用是否合适和确定应该施用于作物的安全剂剂量。
在一些特定实施方案中，应用于本发明的植物的除草剂或除草剂组合作为安全剂。在该实施方案中，对植物以解毒有效量应用第一种除草剂或除草剂混合物。因此，提供了用于控制培养区中杂草的方法。该方法包括在该区域种植作物种子或植物，所述作物种子或植物包含可操作地连接到植物中有活性的启动子上的、编码可以赋予草甘膦耐受性的多肽的第一种多核苷酸；和可操作地连接到植物中有活性的启动子上的、编码ALS抑制剂耐受性多肽的第二种多核苷酸。将包含至少一种有效量的第一种和第二种除草剂的除草剂组合应用于作物、作物部分、杂草或者其栽培区。有效量的除草剂组合能控制杂草；并且，当单独应用有效量的第一种除草剂时，与没有暴露于第一种除草剂的对照作物相比，所述作物不耐受所述有效量的第一种除草剂；并且有效量的第二种除草剂足以产生安全效果，其中与仅仅应用第一种除草剂时的作物耐受性相比，当应用第一种和第二种除草剂时，该安全效果提供了作物耐受性的增加。
在一些特定实施方案中，使除草剂安全的组合包含第一种ALS抑制剂和第二种ALS抑制剂。在其它实施方案中，通过应用有效量的草甘膦和至少一种ALS抑制剂化学品的组合来实现安全效果。在其它一些实施方案中，当用来自磺酰基脲家族化学品的至少一种除草剂与来自ALS家族化学品的至少一种除草剂(如咪唑啉酮)组合来处理DP-098140-6玉米作物、作物部分、作物种子、杂草或者栽培区时，实现安全效果。
此类混合物提供了增加的作物耐受性(即，除草损伤的减轻)。该方法允许在处理后或处理前增加化学品的应用率。此类方法可用于增加控制不想要的或不需要的植物。在其它实施方案中，当用来自磺酰基脲家族化学品的至少一种除草剂与来自咪唑啉酮家族的至少一种除草剂相组合处理DP-098140-6玉米作物、作物部分、作物种子、杂草或者栽培区时，实现安全效果。该方法提供了增加的作物耐受性(即，除草损伤的减轻)。在特定实施方案中，磺酰基脲包含玉嘧黄隆并且咪唑啉酮包含咪草烟。在其它实施方案中，将草甘膦应用于作物、作物部分或栽培区。
如本文所用地，“佐剂”是加入喷雾溶液或制剂以修饰喷雾溶液的农业化学或物理性质的任何物质。见例如，Green和Foy(2003)“Adjuvants：Tools for Enhancing Herbicide Performance，”，WeedBiology and Management，ed.Inderjit(Kluwer Academic Publishers，荷兰)。可以将佐剂分类或再分类为活化剂、酸化剂、缓冲剂、添加剂、粘着剂、抗絮凝剂、抗泡剂、去泡剂、抗冻剂、吸引剂、基本掺合物、螯合剂、清洁剂、色素或染料、相容剂、共溶剂、偶合剂、作物油浓缩物、沉积剂、去污剂、分散剂、漂浮控制剂、乳化剂、蒸发减速剂、扩充剂、肥料、泡沫标记、配制剂(formulant)、惰性物质、湿润剂(humectants)、甲基化种子油、高负荷COCs、聚合物、改良的植物油、渗透剂、排斥剂、石油浓缩剂、防腐剂、耐雨水冲刷剂、保留助剂、增溶剂、表面活性剂、散布剂、粘着剂、散布粘着剂、增效剂、增稠剂、迁移助剂、紫外线保护剂、植物油、水调节剂、和润湿剂(wetting agents)。
此外，本发明的方法可以包括使用除草剂和除草剂混合物，以及一种或更多种其它杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学不育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、进食兴奋剂或者其它生物活性化合物或昆虫致病性细菌、病毒或真菌以形成多组分混合物，其给予更宽范围的农业保护。可以用于本发明方法中的此类农业保护剂的实例包括：杀昆虫剂，如阿巴克丁、高灭磷、啶虫脒、amidoflumet(S-1955)、除虫菌素、印楝素、谷硫磷(azinphos)-甲基、联苯菊酯、联苯肼酯(bifenazate)、噻嗪酮、虫螨成、巴丹、虫螨腈、定虫隆、毒死蜱、毒死蜱-甲基、环虫酰肼(chromafenozide)、噻虫胺(clothianidin)、丁氟螨酯(cyflumetofen)、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、功夫菊酯、λ-功夫菊酯、氯氰菊酯、环丙马秦、溴氰菊酯、丁醚脲、敌匹硫磷、狄氏剂、二氟苯隆、四氟醚菊酯(dimefluthrin)、乐果、呋虫胺(dinotefuran)、二苯丙醚(diofenolan)、依马菌素、硫丹、杀灭阿菊酯、ethiprole、苯硫威、苯醚威、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺(flonicamid)、氟虫酰胺(flubendiamide)、氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯、flufenerim(UR-50701)、氟虫脲、fonophos、氯虫酰肼(halofenozide)、氟铃脲、氟蚁腙、盖达落立、吡虫啉、异柳磷、氯芬奴隆、马拉硫磷、氰氟虫腙(metaflumizone)、灭蜗灵、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、烯虫酯、甲氧氯、甲氧苄氟菊酯(metofluthrin)、久效磷、甲氧虫酰肼(methoxyfenozide)、尼藤吡蓝、nithiazine、双苯氟脲(novaluron)、多氟脲(noviflumuron)(XDE-007)、氨基乙二酰、对硫磷、对硫磷-甲基、扑灭司林、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜成、丙溴磷、profluthrin、拒嗪酮、pyrafluprole、除虫菊精、啶虫丙醚(pyridalyl)、pyriprole、蚊蝇醚、鱼藤酮、兰尼碱、多杀菌(spinosad)、季酮螨酯(spirodiclofen)、甲螨酯(spiromesifen)(BSN 2060)、螺虫乙酯(spirotetramat)、硫丙磷、虫酰肼、氟苯脲、七氟菊酯、特丁磷、司替罗磷、噻虫啉(thiacloprid)、快胜、硫双威、thiosultap-钠、四溴菊酯、唑蚜成、三氯磷酸酯和杀铃脲；杀真菌剂，如苯并噻二唑(acibenzolar)、aldimorph、吲唑磺菌胺(amisulbrom)、阿扎康唑、腈嘧菌酯、苯霜灵、苯菌灵、苯噻菌胺(benthiavalicarb)、苯噻菌胺-异丙基、binomial、联苯、联苯三唑醇、杀稻瘟菌素-S、波尔多液(三碱基硫酸铜)、啶酰菌胺(boscalid)/nicobifen、糠菌唑、磺嘧菌灵、丁硫丹、萎锈灵、环丙酰亚胺(carpropamid)、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、氯苯甲醚、百菌清、乙菌利、克霉唑、氧氯化铜、铜盐，如硫酸铜和氢氧化铜、氰唑磺菌胺(cyazofamid)、cyflunamid、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺(cyprodinil)、苯氟磺胺、双氯氰菌胺(diclocymet)、哒菌清、氯硝胺、乙霉威、苯醚甲环唑、烯酰吗啉、醚菌胺(dimoxystrobin)、烯唑醇、烯唑醇-M、消螨普、discostrobin、二氰蒽醌、十二环吗啉、多果定、益康唑、乙环唑、稻瘟光、氟环唑(epoxiconazole)、噻唑菌胺(ethaboxam)、乙菌定、ethridiazole、恶唑酮菌(famoxadone)、咪唑菌酮(fenamidone)、乐必耕、分菌氰唑、fencaramid、甲呋酰胺、fenhexamide、稻瘟酰胺(fenoxanil)、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、醋酸三苯锡、氢氧三苯锡、福美铁、ferfurazoate、嘧菌腙、氟啶胺、咯菌腈、flumetover、氟吡菌胺(fluopicolide)、氟嘧菌酯(fluoxastrobin)、氟喹唑、氟喹唑、氟硅唑、磺菌胺、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、三乙膦酸铝(fosetyl-aluminum)、麦穗宁、呋霜灵、furametapyr、己唑醇、恶霉灵(hymexazole)、双胍辛胺、烯菌灵、亚胺唑、培福朗、iodicarb、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、异丙菌胺(iprovalicarb)、异康唑、稻瘟灵、春雷霉素、醚菌酯(kresoxim)-甲基、代森锰锌、双炔酰菌胺(mandipropamid)、代森锰、mapanipyrin、精甲霜灵(mefenoxam)、灭锈胺、甲霜灵、叶菌唑、磺菌威、代森联、苯氧菌胺(metominostrobin)/fenominostrobin、嘧菌胺、苯菌酮(metrafenone)、咪康唑、灭克落、甲胂铁铵(neo-asozin)(甲基胂酸铁)、氟苯嘧啶醇、辛噻酮、甲呋酰胺、醚菌胺(orysastrobin)、恶霜灵，奥索利酸、恶咪唑(oxpoconazole)、氧化萎锈灵、多效唑、配那唑、纹枯脲、吡噻菌胺(penthiopyrad)、perfurazoate、膦酸、2-苯并〔c〕呋喃酮、picobenzamid、啶氧菌酯(picoxystrobin)、多氧菌素、烯丙苯噻唑、丙氯灵、腐霉利、霜霉威、霜霉威-盐酸盐、丙环唑、丙森锌、丙氧喹啉(proquinazid)、丙硫菌唑(prothioconazole)、唑菌胺酯(pyraclostrobin)、pryazophos、消斑肟、二甲嘧菌胺、消斑肟、pyrolnitrine、咯喹酮、quinconazole、喹氧灵(quinoxyfen)、五氯硝苯、硅噻菌胺(silthiofam)、硅氟唑(simeconazole)、螺环菌胺(spiroxamine)、链霉素、硫、戊唑醇、techrazene、酞枯酸、四氯硝基苯、氟醚唑、噻苯哒唑、噻氟菌胺、硫芬酯、硫芬酯-甲基、塞兰姆、噻酰菌胺(tiadinil)、甲基立枯磷(tolclofos-methyl)、甲苯氟磺胺、三唑酮、三唑醇、嘧菌醇、咪唑嗪、十三吗啉、trimoprhamide三环唑、布洛芬、嗪氨灵、灭菌唑、烯效唑、有效霉素、伐菌唑灵、乙硫锌、福美锌和草酰胺(zoxamide)；杀线虫剂，如涕灭威、氨基乙二酰和苯线磷；杀细菌剂，如链霉素；杀螨剂，如阿米曲士、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、开乐散、除螨灵(dienochlor)、环氧乙烷(etoxazole)、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、霸螨灵、噻螨酮、快螨特、哒螨灵和吡螨胺；和生物剂，包括昆虫致病性细菌，如苏云金芽孢杆菌Aizawai亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Aizawai)、和苏云金芽孢杆菌的包囊的δ内毒素(例如，Cellcap，MPV，MPVII)；昆虫致病性真菌，如青蕈真菌；和昆虫致病性病毒，包括杆状病毒、核多角体病病毒(NPV)，如HzNPV、AfNPV；和颗粒性病毒(GV)，如CpGV。用于本发明的这些多种混合物配偶体与其它组分(如除草剂)的重量比例通常为100∶1到1∶100，或30∶1到1∶30，10∶1到1∶10或4∶1到1∶4。
本发明还涉及下述组合物，其包含生物学有效量的感兴趣的除草剂或除草剂混合物和有效量的至少一种另外的生物活性化合物或试剂，并且可以还包含至少一种表面活性剂、固体稀释剂或液体稀释剂。此类生物活性化合物或试剂的实例是：杀昆虫剂，如阿巴克丁、高灭磷、啶虫脒、amidoflumet(S-1955)、阿佛菌素、印楝素、谷硫磷甲基、联苯菊酯、联苯肼酯、噻嗪酮、虫螨威、虫螨腈、定虫隆、毒死蜱、毒死蜱-甲基、环虫酰肼、噻虫胺、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、功夫菊酯、λ-功夫菊酯、氯氰菊酯、环丙马秦、溴氰菊酯、丁醚脲、敌匹硫磷、二氟苯隆、乐果、二苯丙醚、依马菌素、硫丹、杀灭阿菊酯、ethiprole、苯硫威、苯醚威、甲氰菊酯、氰戊菊酯、氟虫腈、氟啶虫酰胺、氟氰菊酯、τ-氟胺氰菊酯、flufenerim(UR-50701)、氟虫脲、fonophos、氯虫酰肼、氟铃脲、盖达落立、吡虫啉、异柳磷、氯芬奴隆、马拉硫磷、灭蜗灵、甲胺磷、杀扑磷、灭多虫、烯虫酯、甲氧氯、久效磷、甲氧虫酰肼、nithiazin、双苯氟脲、多氟脲(XDE-007)、氨基乙二酰、对硫磷、对硫磷-甲基、扑灭司林、甲拌磷、伏杀磷、亚胺硫磷、磷胺、抗蚜成、丙溴磷、拒嗪酮、pyridalyl、蚊蝇醚、鱼藤酮、多杀菌、甲螨酯(BSN 2060)、硫丙磷、虫酰肼、氟苯脲、七氟菊酯、特丁磷、司替罗磷、噻虫啉、快胜、硫双威、thiosultap-钠、四溴菊酯、三氯磷酸酯和杀铃脲；杀真菌剂，如苯并噻二唑、腈嘧菌酯、苯菌灵、杀稻瘟菌素-S、波尔多液(三碱基硫酸铜)、糠菌唑、环丙酰亚胺、敌菌丹、克菌丹、多菌灵、氯苯甲醚、百菌清、氧氯化铜、铜盐、cyflufenamid、霜脲氰、环丙唑醇、嘧菌环胺、(S)-3，5-二氯-N-(3-氯-1-乙基-1-甲基-2-氧代丙基)-4-甲基苯甲酰胺(RH 7281)、双氯氰菌胺(S-2900)、哒菌清、氯硝胺、苯醚甲环唑、(S)-3，5-二氢-5-甲基-2-(甲基thio)-5-苯基-3-(苯基-氨基)-4H-咪唑并1-4-酮(RP 407213)、烯酰吗啉、醚菌胺、烯唑醇、烯唑醇-M、多果定、稻瘟光、氟环唑、恶唑酮菌、咪唑菌酮、乐必耕、分菌氰唑、fencaramid(SZX0722)、拌种咯、苯锈啶、丁苯吗啉、醋酸三苯锡、氢氧三苯锡、氟啶胺、fludioxynil、flumetover(RPA 403397)、flumorf/flumorlin(SYP-L 190)、fluoxastrobin(HEC 5725)、氟喹唑、氟硅唑、氟酰胺、粉唑醇、灭菌丹、fosetyl-铝、呋霜灵、furametapyr(S-82658)、己唑醇、种菌唑、异稻瘟净、异菌脲、稻瘟灵、春雷霉素、kresoxim-甲基、代森锰锌、代森锰、精甲霜灵、灭锈胺、甲霜灵、叶菌唑、苯氧菌胺/fenominostrobin(SSF-126)、苯菌酮(AC375839)、灭克落、甲胂铁铵(甲基胂酸铁)、nicobifen(BAS510)、醚菌胺、恶霜灵、配那唑、纹枯脲、烯丙苯噻唑、丙氯灵、霜霉威、丙环唑、丙氧喹啉(DPX-KQ926)、丙硫菌唑(JAU 6476)、消斑肟、唑菌胺酯、二甲嘧菌胺、咯喹酮、喹氧灵、螺环菌胺、硫磺、戊唑醇、氟醚唑、噻苯哒唑、噻氟菌胺、硫芬酯-甲基、塞兰姆、噻酰菌胺、三唑酮、三唑醇、三环唑、布洛芬、灭菌唑、有效霉素和伐菌唑灵；杀线虫剂，如涕灭威、氨基乙二酰和苯线磷；杀细菌剂，如链霉素；杀螨剂，如如阿米曲士、灭螨猛、乙酯杀螨醇、三环锡、开乐散、除螨灵、环氧乙烷、喹螨醚、苯丁锡、甲氰菊酯、霸螨灵、噻螨酮、快螨特、哒螨灵和吡螨胺；和生物剂，包括昆虫致病性细菌，如苏云金芽孢杆菌Aizawai亚种(Bacillus thuringiensis subsp.Aizawai)和苏云金芽孢杆菌的包囊的δ内毒素(例如，Cellcap、MPV、MPVII)；昆虫致病性真菌，如青蕈真菌；和昆虫致病性病毒，包括杆状病毒、核多角体病病毒(NPV)，如HzNPV、AfNPV；和颗粒性病毒(GV)，如CpGV。本发明的方法还可以包括使用经遗传转化的植物来表达对无脊椎动物害虫有毒的蛋白质(如苏云金芽孢杆菌δ内毒素)。在此类实施方案中，外源应用的无脊椎动物害虫控制化合物的作用可以与所表达的毒素蛋白质是协同的。
关于这些农业保护剂的一般性参考文献包括The Pesticide Manual，第13版，C.D.S.Tomlin，Ed.，British Crop Protection Council，Farnham，Surrey，U.K.，2003和The BioPesticide Manual，第二版，L.G.Copping，Ed.，British Crop Protection Council，Farnham，Surrey，U.K.，2001。
在一些情况中，与具有相似的控制范围但是不同作用方式的其它无脊椎动物害虫控制化合物或试剂的组合对于抗性管理来说将是尤其有利的。从而，本发明的组合物可以还包含生物学有效量的至少一种另外的具有相似的控制范围但是不同作用方式的无脊椎动物害虫控制化合物或试剂。经遗传修饰以表达植物保护化合物(如蛋白质)的植物或者植物的所在地与生物学有效量的本发明化合物的接触，也提供了更宽范围的植物保护，其对于抗性管理来说是有利的。
从而，本发明的方法使用除草剂或除草剂组合并且还可以进一步包括使用杀昆虫剂和/或杀真菌剂和/或其它农业化学品(例如肥料)。本发明的此类组合治疗的用途可以扩展针对另外的杂草种类的活性谱，并且抑制任何抗性生物型的增殖。
本发明的方法可以还包含使用植物生长调节剂，如aviglycine、N-(苯基甲基)-1H-嘌呤-6-胺、乙烯利、epocholeone、赤霉酸、赤霉素A4和A7、harpin蛋白、缩节胺、调环酸钙盐、保民丰(prohydrojasmon)、硝基酚酸钠和抗倒酯-甲基和植物生长修饰生物，如蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)菌株BP01。
在以下实施例中进一步定义了本发明的实施方案。应该理解，仅仅是以示范的方式给出这些实施例。从上面的讨论和这些实施例，本领域技术人员可以明了本发明的实质特征，并且在不背离其主旨和范围的情况下，可以作出对本发明实施方案的各种改变和修改，以使其适应各种应用和条件。因此，除了本文所显示和描述的那些之外，从上文的描述，本发明实施方案的各种修改对于本领域技术人员根据之前的描述是显而易见的。此类修改也意图包括在所附权利要求的范围之内。
实施例
在对本发明的描述中用到了以下缩写：
| ALS | 乙酰乳酸合酶蛋白 |
| bp | 碱基对 |
| glyat4621 | 草甘膦乙酰转移酶基因 |
| GLYAT4621 | 草甘膦乙酰转移酶蛋白 |
| zm-als | 来自玉米的野生型乙酰乳酸合酶基因 |
| zm-hra | 来自玉米的乙酰乳酸合酶基因的修饰形式 |
| kb | 千碱基 |
| PCR | 聚合酶链式反应 |
| UTR | 非翻译区 |
实施例1：玉米事件DP-098140-6的插入片段和侧翼边缘序列表
征
通过将来源于地衣型芽胞杆菌(Bacillus licheniformis)的草甘膦乙酰转移酶基因(glyat4621)和玉米乙酰乳酸合酶基因(zm-hra)经修饰形式插入玉米(Zea mays)进行修饰。用于遗传修饰的载体是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株LBA4404的质粒，通过移除其天然T-DNA消除了病原性。通过用质粒PHP24279(图1)的农杆菌介导的转化获得了玉米事件DP-098140-6。质粒PHP24279的T-DNA含有将在下文进一步描述的2个表达盒。
将玉米的未成熟胚芽无菌地从正在发育的颖果中移出，并用含有GLYAT4621和ZM-HRA表达盒的根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)菌株LBA4404处理。在胚芽和农杆菌在不含草甘膦的固体培养基中共培养一段时间之后，将该胚芽转移至含有抗生素和草甘膦的新鲜选择培养基中。该抗生素杀死任何残余的农杆菌。该选择培养基刺激玉米的体胚胎形成并且选择含有整合的glyat4621基因盒的那些细胞。因此，在草甘膦中存活的愈伤组织增殖并产生胚发生组织，其应该是经遗传转化的。获得愈伤组织样品用于分子分析以通过PCR证实转基因的存在。然后在草甘膦的存在下，操作该胚发生组织以再生完整的转基因植物，将其转移至温室。然后使T0植物经受不同浓度的草甘膦和磺酰脲喷雾。将存活的植物与近交系杂交以获得用于进一步评估的种子。
glyat4621基因来源于土壤细菌地衣芽胞杆菌并且通过基因改组方法合成以最优化GLYAT4621酶的乙酰转移酶活性(Castle等(2004)Science 304：1151-1154)。ZM-HRA表达盒含有经修饰的玉米乙酰乳酸合酶基因，即zm-hra(玉米高抗性等位基因)，其编码赋予针对ALS抑制性除草剂(诸如磺酰脲)范围内的抗性的ZM-HRA蛋白。
来自这一质粒的插入T-DNA(图2和3)含有方向相反的glyat4621基因盒以及zm-hra基因盒。glyat4621基因的表达由来自玉米的泛素调控区(ubiZM1启动子5’UTR，以及内含子(Christensen等(1992))和pinII终止子(An等(1989)Plant Cell 1：115-122)控制。zm-hra基因的表达受到天然玉米乙酰乳酸合酶启动子(zm-als启动子)(Fang等(2000))控制。zm-hra基因的终止子是来自马铃薯(Solanum tuberosum)蛋白酶抑制剂II基因的3’终止子序列(pinII终止子)。两个盒的上游都是3个拷贝的来自花椰菜花叶病毒的增强子区域(CaMV 35S增强子，美国专利申请号11/508,045，在此通过引用并入本文)，其使得T-DNA上的两个盒的表达增强。表3显示了质粒PHP24279的T-DNA区的概要。表4显示了在DP-098140-6的产生中所使用的质粒PHP24279的遗传元件。
表3：PHP24279的T-DNA中遗传元件的描述
| 在T-DNA上的位置(碱基对位置) | 遗传元件 | 大小(碱基对) | 描述 |
| 1至25 | 右边缘 | 25 | T-DNA右边缘区，来自根癌农杆菌的Ti质粒 |
| 26至177 | Ti质粒区 | 152 | 来自根癌农杆菌Ti质粒的非功能序列 |
| 178至210 | 聚合接头区 | 33 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 211至521 | pinII终止子 | 311 | 来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的终止子区(Keil等，1986；An等，1989).(反方向) |
| 522至537 | 聚合接头区 | 33 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 538至2454 | zm-hra基因 | 1917 | 经修饰的内源玉米乙酰乳酸合酶基因(Fang等，1992).(反方向) |
| 2455至3115 | zm-als启动子 | 661 | 来自玉米乙酰乳酸合酶基因的启动子区(Fang等，1992).(反方向) |
| 3116至3189 | 聚合接头区 | 74 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 3190至3625 | CaMV 35S增强子 | 436 | 来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck等，1980；Odell等.，1985). |
| 3626至3648 | 聚合接头区 | 23 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 3649至4086 | CaMV 35S增强子 | 438 | 来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck等，1980；Odell等.，1985). |
| 4087至4093 | 聚合接头区 | 7 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 4094至4531 | CaMV 35S增强子 | 438 | 来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck等，1980；Odell等.，1985). |
| 4532至4566 | 聚合接头区 | 35 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 4567至 | ubiZM1启 | 900 | 来自玉米泛素基因的启动子区(Christensen等， |
| 5466 | 动子 | 1992). | |
| 5467至5549 | ubiZM15’UTR | 83 | 来自玉米泛素基因的5’非翻译区(Christensen等，1992). |
| 5550至6558 | ubiZM1I内含子 | 1009 | 来自玉米泛素基因的内含子区(Christensen等，1992). |
| 6559至6586 | 聚合接头区 | 28 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 6587至7030 | glyat4621基因 | 444 | 合成的草甘膦N-乙酰转移酶基因(Castle等，2004.Siehl等，2007). |
| 7031至7046 | 聚合接头区 | 16 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 7047至7362 | pinII终止子 | 316 | 来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的终止子区(Keil等.，1986；An等，1989). |
| 7363至7415 | Ti质粒区 | 53 | 来自根癌农杆菌Ti质粒的非功能序列 |
| 7416至7440 | 左边缘 | 25 | T-DNA左边缘区，来自根癌农杆菌的Ti质粒 |
表4：用于产生DP-098140-6玉米的质粒PHP24279的遗传元件的描述
确定了DP-098140-6事件中插入的T-DNA的核苷酸序列。跨越了所导入遗传元件的独特连接的PCR扩增可以区分DP-098140-6植物和它们非遗传修饰的副本植物，并且可以用于筛选插入的T-DNA的存在，甚至在很低浓度的情况下。以下提供了对来自DP-098140-6玉米叶子和成熟种子的基因组DNA的构建物特异性聚合酶链式反应(PCR)分析。
具体地，分离来自测试物质(来自事件DP-098140-6的种子)和代表事件背景的对照物质(来自具有遗传背景的非遗传修饰玉米的种子)叶组织和成熟种子的基因组DNA，并使其经历应用构建物特异性引物对的定性PCR扩增。在1.5％或2％琼脂糖凝胶上分离该PCR产物，以确认从测试物质产生的基因组DNA中存在插入的构建物，以及从对照物质产生的基因组DNA中不存在插入的构建物。应用参照标准品(100碱基对DNA梯，Invitrogen Corporation目录号#10380-012)以确定PCR产物大小。
从植物收获测试及对照叶子样品(V5-V7叶阶段)。应用标准尿素提取方案从测试和对照叶组织中提取基因组DNA。应用
Magnetic 96 DNA Plant System(Promega Corporation目录号#FF3760)分离来自测试和对照种子样品的基因组DNA。应用
试剂(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)在荧光分光光度计上定量基因组DNA，和/或在琼脂糖凝胶上显现以确认定量值以及确定DNA质量。
应用构建物特异性引物对(06-O-1734/06-O-1738)，对从事件DP-098140-6和对照样品叶子和成熟种子中分离的基因组DNA进行PCR扩增(来自Promega Corporation的PCR Master Mix目录号#7505)，所述引物跨越了玉米泛素内含子和glyat4621编码区，并允许唯一地鉴定玉米事件DP-098140-6。应用第二引物组(02-O-197/02-O-198)以扩增内源玉米转化酶基因(Genbank登录号 AF171874)，作为PCR扩增阳性对照。表5显示了每一引物组的PCR靶位置和预期的PCR产物的大小。表6A和6B显示了PCR试剂和反应条件。表7列出了在这一研究中使用的引物序列。
表5：PCR基因组DNA靶位置和PCR产物的期望大小
| 引物组 | 构建物DNA靶位置 | PCR产物的预期大小(bp) |
| 06-O-1734/06-O-1738 | 泛素内含子/PHP24279的glyat4621编码区 | 203 |
| 02-O-197/02-O-198 | 玉米转化酶基因 | 225 |
PCR：聚合酶链式反应
BP：碱基对
表6A：用于叶子和种子的PCR试剂和反应条件
PCR：聚合酶链式反应
ddH2O：双蒸水
*Promega#M7505
表6B
PCR：聚合酶链式反应
ddH2O：双蒸水
*Promega#M7505
表7：用于PCR反应的引物序列列表
| 引物名称 | 序列5’-3’ | 靶序列 | SEQIDNO |
| 06-O-1734 | TATGCCTAAGGTCATAGGTATCCTCTGCGTTG | DP-098140-6特异性 | 20 |
| 06-O-1738 | TGATGGCATATGCAGCAGCTATATGTGGAT | DP-098140-6特异性 | 21 |
| 02-O-197 | CCGCTGTATCACAAGGGCTGGTACC | 玉米转化酶基因 | 22 |
| 02-O-198 | GGAGCCCGTGTAGAGCATGACGATC | 玉米转化酶基因 | 23 |
在所有来自叶子和成熟种子的DP-098140-6DNA样品中观察到了通过构建物特异性引物组06-O-1734/06-O-1738扩增的约200bp大小的构建物特异性PCR产物，但是在所有对照样品和无模板对照中其均不存在。这一实验重复了若干次，并且获得了类似的结果(数据未显示)。这些结果与含有事件DP-098140-6的基因组DNA样品的预期PCR产物大小(203bp)接近一致。在用检测叶子和种子样品中内源性玉米转化酶基因的引物组02-O-197/02-O-198进行PCR反应后，在事件DP-098140-6和对照样品中均观察到了约220bp大小的PCR产物(数据未显示)。在所有样品中，这一结果与含有玉米内源性转化酶基因的基因组DNA样品的预期PCR产物大小(225bp)接近一致。在无样品对照中没有观察到该内源性靶带。
由于叶子基因组DNA和成熟种子基因组DNA是用不同的方案分离的，因此测试了用于PCR反应的模板量。在这一研究中，对于所有的分析，在PCR反应中应用了40ng叶子基因组DNA和12ng种子基因组DNA。
为评估PCR扩增的敏感性，在非遗传修饰的对照DNA中制备DP-098140-6单DNA样品的不同稀释物，导致叶子中的DP-098140-6DNA量为40ng至800fg(在所有样品中的总DNA是40ng)、以及成熟种子中的DP-098140-6DNA量为12ng至240fg范围(在所有样品中的总DNA是12ng)。如之前描述的那样，对每一稀释物进行PCR扩增。基于这一分析，确定检测限(LOD)如下：叶子中约为40ng总DNA中含40pg DP-098140-6DNA，或0.1％事件DP-098140-6DNA(数据未显示)；种子中约为12ng总DNA中含120pg事件DP-098140-6DNA，或1％(数据未给出)。这对于许多筛选应用提供了足够的敏感性。
应用针对事件DP-098140-6的构建物特异性引物组的定性PCR分析确认了该测试植物含有事件DP-098140-6，如通过在所有分析的测试植物样品(包括叶子和成熟种子)中存在构建物特异性靶标带，并且在非遗传修饰的对照植物中不存在所证实的那样。这一结果是可重复的。测试植物和对照植物均含有内源性玉米转化酶基因。在规定的条件下预测的分析敏感性对于叶子是0.1％事件DP-098140-6DNA，以及对于成熟种子是1％。
实施例2.通过Southern印迹的玉米事件DP-098140-6的表征
通过Southern印迹分析表征了插入到DP-098140-6(此后称为“98140”)玉米的DNA。表8概述了来自各个Southern印迹分析的结果。所使用的方法描述如下。从对98140玉米和非遗传修饰的对照植物取样的冻干叶子组织中提取基因组DNA。用限制性内切酶消化基因组DNA，并在琼脂糖凝胶上按大小分离。在样品的旁边跑上分子量标记，用于估测大小。对在琼脂糖凝胶上分开的DNA片段在原位进行脱嘌呤(depurinated)、变性和中和；然后转移至尼龙膜。在转移至膜后，通过UV交联使DNA与膜结合。通过PCR从质粒PHP24279中产生与glyat4621和zm-hra基因同源的片段，通过大小在琼脂糖凝胶上分开、切割、并应用凝胶提取试剂盒纯化。所有的DNA探针均通过应用[32P]dCTP的随机主标记从该片段产生。将经标记的探针与尼龙膜上的靶DNA杂交，用于检测特异性片段。在高严格条件下进行杂交后洗涤。将印迹暴露于X光胶片一个或更多个时间点，以检测杂交片段并且显现分子量标记。以下详细地描述了DP-098140-6玉米中插入片段的分子分析。DP-098140-6玉米Southern分析结果表明存在插入到DP-098140-6玉米中的单个、完整拷贝的T-DNA。此外，由于已经通过农杆菌介导的转化方法获得了这一遗传修饰的玉米，还通过实时定性PCR确定了不存在来自T-DNA边缘外侧的骨架DNA的并入。所使用的方法的细节将在下面提供。这些结果表明只有包含在质粒PHP24279的T-DNA边缘之内的DNA才能被整合到DP-098140-6玉米中。
选择限制性酶Spe I以评估插入的T-DNA的完整性，因为这些位点位于释放出6775bp的片段的两个基因盒侧面(图6)。如zm-hra探针一样(表8)，glyat4621探针与Spe I消化的DNA中所预期的6775bp片段杂交(表8)，表明完整的T-DNA插入到了基因组中。zm-hra探针还与98140玉米中的两条其它带杂交，所述带是内源性基础的，因为它们存在于未修饰的玉米中。这一结果是所预期的，因为这一构建物中的zm-hra基因是从内源性玉米基因修饰得到的。基于这些结果，在98140玉米中的插入片段含有PHP24279的T-DNA的完整拷贝。
为评估插入的glyat4621和zm-hra基因的数量，选择了限制性酶EcoR V。在PHP24279T-DNA中glyat4621和zm-hra盒之间存在单个的EcoR V位点(图6)。与glyat4621和zm-hra探针杂交的条带数量将表明每一基因插入的拷贝数。在98140玉米中用glyat4621探针观察到约6000bp的单个条带，表明在98140玉米中有单拷贝的glyat4621基因(表8)。此外，zm-hra探针与DP-098140-6玉米中超过10kb的单个片段杂交，表明单个拷贝的zm-hra基因(表8)。在这一印迹上，zm-hra探针与存在于未修饰的玉米样品中的另外条带杂交，并且是由于内源性玉米基因。总之，这些结果表明存在插入到DP-098140-6玉米中的单个、完整的T-DNA拷贝。
对从原代转化子(T0)的叶组织穿孔物(leaf punches)中分离的基因组DNA进行实时定性PCR，以筛选骨架DNA的存在。用Extract-N-AmpTM试剂盒(Sigma Aldrich)从玉米叶穿孔物中分离基因组DNA。设计
探针和引物对以检测以下骨架靶标：四环素抗性(tetA)基因(51bp扩增子)、大观霉素抗性(spc)基因(57bp扩增子)、virG基因(66bp扩增子)、以及两个刚好位于T-DNA左边缘(LB，58bp扩增子)和右边缘(RB，62bp扩增子)外侧的区域。此外，为确认在每一反应中可扩增的DNA的存在，应用了针对玉米内源性基因的
探针和引物对(62bp扩增子)。将有被动参照染料以标准化荧光波动的Extract-N-AmpTM PCR反应混合物(Sigma Aldrich)用于分析。在50℃持续2分钟并随后在95℃持续3分钟的最初孵育后，如下进行40个循环：95℃15秒、60℃1分钟。阳性或阴性确定都是在比较骨架靶标和内源性靶标Ct(阈循环)的基础上进行的。
在应用不同的检测四环素抗性(tet)、大观霉素抗性(spc)和virG基因和两个正好在左(LB)和右(RB)边缘外侧的区域(在农杆菌介导的转化过程中一般不会并入的区域)的探针的这一筛选的基础上，对于骨架DNA的存在，DP-098140-6玉米是阴性的(表9)。基于内源基因对照，每一反应均含有可扩增的DNA。该结果表明仅包含在质粒PHP24279T-DNA边缘里面的DNA插入到了DP-098140-6玉米中。
表8：在DP-098140-6玉米的Southern印迹中预期的和观察的杂交片段概述
脚注：标有星号(*)的片段是因为探针与内源性玉米序列的杂交并且在它们存在于未修饰的玉米中的基础上鉴定。
1：与质粒阳性对照等价迁移。与预期相同的大小。
表9：在DP-098140-6玉米中检测骨架DNA的实时定性PCR分析结果
| 检测的骨架DNA | 分析结果 |
| tet | 阴性 |
| spc | 阴性 |
| virG | 阴性 |
| LB | 阴性 |
| RB | 阴性 |
实施例3：插入片段的表达
在温室中栽培植物生长的V5阶段收集的叶组织中评估了GLYAT4621和Zm-HRA蛋白的表达。对于每一样品，收集了四个新鲜的叶穿孔物并且应用GenoGrinder(Spex Certiprep)在提取缓冲液中研磨。应用Bio-Rad蛋白质分析确定总的可提取的蛋白质(TEP)，其基于Bradford染料结合方法。将样品提取物稀释于样品提取缓冲液中用于ELISA分析。
GLYAT4621和ZM-HRA ELISA利用了“三明治”模式，以量化植物组织提取物中的特异性靶蛋白。在这些分析中，将标准物(一式三份孔)和样品(一式两份孔)在固定的板中孵育，所述板已预包被有对感兴趣的蛋白特异的抗体。在孵育一小时后，从板中洗去未结合的物质，并且使结合的蛋白质与不同的蛋白特异性抗体孵育，所述抗体已与酶辣根过氧物酶(HRP)缀合。通过添加HRP底物溶液检测结合的复合物。用硫酸终止反应并且应用450nm-650nm波长设定的分子装置板读数器检测每一孔的光密度。应用
Pro软件进行计算，所述计算产生针对标准曲线的二次拟合并将样品OD值转化为靶蛋白的浓度值。将来自一式两份孔中的平均浓度表达为pg靶蛋白/μg总可提取蛋白(TEP)。样品定量的下限(LLOQ)是10pg GLYAT4621蛋白/μgTEP，以及检测上限是2000pg GLYAT4621蛋白/μg TEP。样品定量的下限是20pg ZM-HRA蛋白/μgTEP，以及检测上限是5000pgZM-HRA蛋白/μg TEP。
结果显示于表10中，并且显示出在DP-098140-6玉米的叶组织中表达了GLYAT4621和ZM-HRA蛋白。如预期的那样，在任何来自未遗传修饰的对照植物的样品中没有检测到GLYAT4621和ZM-HRA蛋白。
表10：在植物V5发育生长阶段收集的DP-098140-6玉米植物叶组织中测量的GLYAT4621和ZM-HRA蛋白表达水平概述。
aTEP：总可提取蛋白
w范围：最低的观察的个体结果-最高的观察个体结果
证实DP-098140-6玉米植物中插入片段表达的另一方法是评估它们对草甘膦和磺酰脲的耐性。在10个场所进行了除草剂耐性实验。该实验的目的是确定DP-098140-6玉米对草甘膦和磺酰脲的耐性。如下对DP-098140-6玉米进行喷雾：草甘膦1.26kg ae/haw、氯嘧黄隆(chlorimuron)5.8g ai/ha2、苯黄隆(tribenuron)17.3g ai/ha以及玉嘧黄隆17.5g ai/ha。在V4发育生长阶段进行所有的除草剂施用。在V4除草剂施用后10天对该十个位置中每一个的三株植物进行除草剂损伤打分。以0-100刻度收集除草剂损伤得分，0显示没有损伤症状(等级5是良好耐受-植物上仅有很小的叶片烧化)以及100显示植
1每公顷kg酸当量
w每公顷g活性组分
物的完全死亡(表12)。
在10个位置和3株植物上计算结果的平均值，并且在表11中显示了标准差。结果显示DP-098140-6玉米对草甘膦和磺酰脲很好的耐受。在一些实例中，因为附属作物反应等级系统的性质，标准差大于平均损伤得分。尽管如早先提到且如表12所显示的那样，5的得分是对除草剂良好耐受的，几乎没有或没有损伤存在，由于在0至100损伤等级测量植物，一株植物的5的得分使得标准差升高至超过平均值。
表11：喷洒有草甘膦和磺酰脲(氯嘧黄隆(chlorimuron)、苯黄隆(tribenuron)和玉嘧黄隆)的DP-098140-6玉米的除草剂损伤得分结果
| 玉米 | 平均草甘膦/磺酰脲损伤(V4阶段施用后10天分级) | 草甘膦/磺酰脲损伤的标准差 |
| 98140 | 0.17 | 0.91 |
表12：对于除草剂损伤的0至100作物反应等级系统
实施例4：DP-098140-6性状的孟德尔分离
通过喷洒草甘膦在植物育种过程中分析glyat4621基因的孟德尔分离。使最初转化的98140玉米与原种近交系杂交以得到单杂交杂种。将该单杂交杂种与该原种近交系再次回交以得到BC1种子。将该BC1代与原种系再次杂交得到BC2。
在每一代喷雾消除草甘膦敏感植物且得到半合子种子。种植来自回交代繁殖系的种子并且用草甘膦喷洒该植物。对于这些代的每一代，耐受植物对敏感植物的预期比值是1∶1。观察到的比值如表13所示。该结果显示，对于DP-098140-6玉米的所分析的不同的代，在5％的显著水平上，观察分离比和预期分离比之间没有显著的差异。GLYAT4621和ZM-HRA表达盒包含在相同的插入片段中，并且因此草甘膦分离数据代表了草甘膦和ALS-抑制除草剂诸如磺酰脲的分离样式。因此，转基因的孟德尔分离数据提供了新近导入的遗传材料稳定遗传的证据。
表13：基于草甘膦耐性的DP-098140-6玉米的孟德尔分离
| 代 | 观察比a | 预期比b | x2 | 显著差异？ |
| BC1 | 82∶80 | 81∶81 | 0.88 | 无 |
| BC2 | 59∶56 | 57.5∶57.5 | 0.78 | 无 |
a：以观察的对草甘膦耐受的数目：观察的对草甘膦敏感的数目表示的数据。
b：以预期的对草甘膦耐受的数目：预期的对草甘膦敏感的数目表示的数据。
实施例5：玉米事件DP-098140-6的其它插入片段和侧翼边缘序
列的表征
为表征插入DNA的完整性和基因组插入位置，确定了DP-098140-6玉米的侧翼基因组DNA边缘区。玉米DP-098140-6的侧翼基因组序列如SEQ ID NO：1和46所示。对DP-098140-6玉米插入片段和边缘区序列的PCR扩增确定了该边缘区是玉米起源的且该连接区域可用于鉴定DP-098140-6玉米。总之，DP-098140-6玉米插入片段和基因组边缘序列的表征和Southern印迹数据一起表明在玉米基因组中存在DNA片段的单个插入。然后应用各种分子技术特异地表征DP-098140-6玉米系中的整合位点。
在DP-098140-6玉米系的最初表征中，应用GenomeWalker和反向PCR方法对侧翼基因组边缘区进行克隆和测序。应用来自侧翼边缘序列的信息，在DP-098140-6玉米基因组DNA和未修饰的对照基因组DNA上进行PCR。
对于左边缘序列，用在左基因组边缘的引物(引物99885；SEQ IDNO：15)和转基因插入片段中的引物(引物100240；SEQ ID NO：16)进行PCR，得到DP-098140-6玉米植物中的预期产物(1.2kb)。
对于右基因组边缘序列，用在右基因组边缘的引物(引物100235；SEQ ID NO：13)和转基因插入片段中的引物(引物99878；SEQ ID NO：14)进行PCR，得到DP-098140-6玉米植物中的预期产物(750bp)。
开发了其它引物序列并且应用了以下方案：
寡核苷酸PCR试剂：
正向引物：5’GTCCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCT 3’
(SEQ ID NO：17)
反向引物：5’TTTTTTCTAGGAAAGCTGGTTACATG 3’
(SEQ ID NO：18)
Taqman MGB探针：5’Fam-AGCGTCAATTTGC-MGB 3’
(SEQ ID NO：19)
在PCR中以600nM的浓度应用每一引物。在PCR中以80nM的浓度应用MGB探针。应用的PCR混合物是来自Sigma-Aldrich的“Extract-N-Amp PCR Ready Mix”(目录号E3004)。通过添加0.01体积的Sigma-Aldrich“用于定量PCR的参照染料”(目录号R4526)，Rox参照染料也包括在PCR混合物中。PCR进行40个循环，每一循环由以下两个步骤组成：步骤1：95℃15秒；步骤2：60℃60秒。该扩增子产物具有85bp的大小。
本领域技术人员还可以包括应用内源基因的对照PCR，以证实分离的基因组DNA适于PCR扩增。已成功地用于玉米样品的玉米内源基因是以下基因：转化酶基因(Hernandez等(2004)J.Agric Food Chem.52：4632-4637；Hernandez等(2004)J Cereal Science 39：99-107；乙醇脱氢酶基因(Hernandez等(2004)J.Agric Food Chem.52：4632-4637；Ingham等(2001)BioTechniques 31：132-140；玉米醇溶蛋白基因(Hernandez等(2004)J.Agric Food Chem.52：4632-4637；Vaitilingom等(1999)J Agric.Food Chem.47：5261-5266和高迁移率组基因(Hernandez等(2004)J.Agric Food Chem.52：4632-4637；Pardigol等(2003)Eur Food Res Technol 216：412-420。
表14：PCR产物描述和大小
| 引物 | 引物 | 扩增区域描述 | PCR产物大小(bp) |
| 100235 | 99878 | 右侧翼基因组序列/转基因边缘 | 751bp |
| 99885 | 100240 | 左侧翼基因组序列/转基因边缘 | 1257bp |
| 102588 | 102589 | 左侧翼基因组序列/转基因边缘 | 85bp |
表25：另外的寡核苷酸和扩增区域的描述
| 名称 | 描述 | 序列 | SEQIDNO |
| 06-O-1536 | ZM-HRA寡核苷酸F | AAGGGTGCTGACATCCTCGTCGAGT | 25 |
| 06-O-1537 | ZM-HRA中间寡核苷酸R | GTCCCATGCATACCTAGCATGCGCA | 26 |
| 06-O-1538 | ZM-HRA中间寡核苷 | GGATAAGGCCGATCTGTTGCTTGCA | 27 |
| 酸F | |||
| 06-O-1539 | ZM-HRA寡核苷酸R | TCAGTACACAGTCCTGCCATCACCAT | 27 |
| 06-O-1541 | GLYAT(4621)F | ATGGCTATTGAGGTTAAGCC | 29 |
| 06-O-1542 | GLYAT(4621)R | CCTCTTATACATCAGGATGTGAGG | 30 |
| 06-O-1779 | 正向；5′边缘 | ATGAAAAAGTCCAAGTCGAGCAAGGGTACGTAC | 34 |
| 06-O-1782 | 反向；3′边缘 | GCTAGCCCTAACTGGCACCATATATCATTTTG | 35 |
| 06-O-1783 | 反向；3′边缘 | AACTGCACCAGTCACTTGGCAAACGAC | 36 |
| 07-O-1877 | 正向；5′边缘 | CGTTTTTTTGTGTGTGTATGTCTCTTTGCTTGGTC | 37 |
| 07-O-1878 | 正向；5′边缘 | TGTATGTCTCTTTGCTTGGTCTTTCTCTATCGATC | 38 |
| 07-O-1879 | 反向；3′边缘 | ATGACGTGATACAACTTTACTTCAGTATAAGACTG | 39 |
| 07-O-1880 | 反向；3′边缘 | CAACTATCTCAGTCTTATTCTATGTTCATGACGTG | 40 |
| 07-O-1946 | 插入片段 | TCGGAGTACAGACGGTACTGACACAAG | 41 |
| 07-O-1947 | 正向，插入片段 | CCTCTCTAGAGATAATGAGCATTGCATGTC | 42 |
| 07-O-1948 | 反向，插入片段 | GCGACCCGTTTGGATTCCCTTGTCTG | 43 |
| 07-O-1949 | 反向，插入片段 | TGCAAGCTCCTAATCCCGGGCTGCAG | 44 |
| 07-O-1950 | 反向，插入片段 | CTGGTTCGCTGGTTGGTGTCCGTTAG | 45 |
| DP098-3’-f12 | 正向 | TGCGAATTCAGTACATTAAAAACGT | 51 |
| DP098-3’-r12 | 反向 | TGTTTTTTTTCTAGGAAAGCTGGTT | 52 |
| DP098-3’-p6 | FAM-CCGCAATGTGTTATTAAGTTGTCTAAGCGTCA-TAMRA | 53 | |
| DP098-f6 | 正向 | GTGTGTATGTCTCTTTGCTTGGTCTT | 54 |
| DP098-r2 | 反向 | GATTGTCGTTTCCCGCCTTC | 55 |
| DP098-65 | 探针 | FAM-CTCTATCGATCCCCCTCTTTGATAGTTTAAACT-TAMR | 56 |
| A |
实施例6：玉米事件DP-098140-6的两代的除草剂耐性和ELISA
分析
通过插入glyat4621和zm-hra基因修饰了DP-098140-6玉米(Zeamays)。通过基因改组方法功能上改善了从地衣芽胞杆菌(Bacilluslicheniformis)分离的glyat4621基因，以优化草甘膦乙酰转移酶(GLYAT)活性的动力学。由glyat4621基因编码的GLYAT4621蛋白赋予针对除草剂活性组分草甘膦的耐性。zm-hra基因的插入产生了乙酰乳酸合酶(ALS)的修饰形式。ALS对于支链氨基酸生物合成很重要并且被某些除草剂抑制。在zm-hra基因上的该修饰克服了这一抑制并且因此提供了对大范围ALS-抑制除草剂的耐性。
这一研究的目的是在含有事件DP-098140-6的玉米中评估除草剂耐性和蛋白质表达。评估了两代DP-098140-6玉米和两代近等系对照玉米以确定DP-098140-6玉米在传代当中是否显示出始终如一的蛋白质表达以及对草甘膦和ALS-抑制除草剂的耐性
应用含有四个块的随机完整块设计将植物种植于温室中。每一块由24块平地组成。代表项目1-12(分离1∶1)的平地含有约每项目15株植物；而代表项目13-24(非分离)的平地含有约每项目10株植物。应用对GLYAT蛋白特异的侧流试纸测试(lateral flow strip test)在V2生长阶段对测试和对照项目进行GLYAT4621的性状确认。将具有阳性性状确认结果(表达GLYAT4621)的植物用于测试项目且将具有阴性性状确认结果(不表达GLYAT4621)的植物用作对照项目。然后移除没有用于对照的任何剩余的阴性分离子，并且在每一块内(处理)将剩余的阳性植物缩减为每项目5株植物。在V4生长阶段，将含有草甘膦(1.46L/ha或20oz/英亩)+非离子型表面活性剂(0.25％体积/体积)+硫酸铵(3.4kg/ha)的除草剂处理施用于项目1、9、13和21；将含有噻黄隆(thiefensulfuron)(3.5g/ha或0.5oz/英亩)和苯黄隆(tribenuron)(3.5g/ha或0.5oz/英亩)(每一个均含有非离子型表面活性剂(0.25％体积/体积))+硫酸铵(3.4kg/ha))的除草剂施用于项目2、10、14、22；以及将含有草甘膦，噻黄隆和苯黄隆的罐式混合物施用于项目3、11、15和23(表15)。
通过估计除草剂损伤百分比在除草剂施用14和21天后肉眼评估除草剂损伤，其中“0”代表没有可见的损伤以及“100”代表完全的植物死亡。该损伤等级考虑到与相同玉米系未处理项目相比较时所有的除草剂损伤症状。损伤症状包括变色、叶片斑点和枯萎。将每一玉米系未处理的项目定级为0％损伤并且通过与这一未处理的项目比较定级相同玉米系除草剂处理的项目。在施用除草剂21天后拍摄照片，以记录除草剂损伤。为进一步表征对ALS-抑制除草剂的耐性(DP-098140-6玉米中zm-hra基因的特性)，在除草剂处理后14和21天测量了所有项目的植物高度。当通过手臂延伸时，以从土壤表面至最高叶子尖端的cm数测量植物高度。
进行定量酶联免疫吸附测定(ELISA)分析以表征DP-098140-6玉米种子中GLYAT4621和ZM-HRA蛋白的表达。进行定量ELISA的方法如下：
冻干所有叶子和种子样品并应用SPEX Certiprep GenoGrinder仔细地研磨约60秒。在冻干和研磨之间，将样品在＜-10℃下冷冻储存在监测温度的冷冻室中。
以以下靶重量将匀质的组织称重至1.2ml管：10mg叶片和20mg种子。用0.6ml测试缓冲液和两个5/32”钢球，应用具有每分钟1500冲击的单个30秒循环提取每一样品。通过离心(4,000rpm 10分钟)分离不溶解的材料。应用特异的GLYAT4621和ZM-HRA ELISA方法分析稀释的提取物。
GLYAT4621ELISA方法利用了用于确定玉米植物组织提取物中GLYAT4621存在的序贯“三明治”ELISA。将标准物(在一式三份孔中分析)和稀释的样品提取物(在一式两份孔中分析)在固定的96孔板中孵育一小时，所述板已预包被有GLYAT4621特异性抗体。从板中洗去未结合的物质，并且将已与酶辣根过氧物酶(HRP)缀合的不同GLYAT4621特异性抗体加入到孔中。结合的GLYAT4621蛋白包夹在包被在板上的抗体和抗体-HRP缀合物之间。在1小时孵育的终点，从板上洗去未结合的物质。通过添加底物检测结合的GLYAT4621蛋白-抗体复合物，所述底物在HRP的存在下产生有色产物。在30分钟后用终止溶液(1N盐酸)终止反应，并且应用Molecular Devices板读数器(Molecular Devices Corporation，1311 Orleans Drive，Sunnyvale，CA 94089-1136，USA)用450nm至(minus)650nm的波长设定确定每一孔的光密度。应用SoftMax Pro软件(Molecular DevicesCorporation，1311 Orleans Drive，Sunnyvale，CA 94089-1136，USA)进行计算，所述计算产生标准曲线的二次拟合并将样品光密度(OD)值转化为GLYAT4621蛋白浓度。将作为ng/ml的一式两份孔数值的平均值用于计算每一样品的报道GLYAT4621浓度(ng/mg干重)。
用于GLYAT4621分析的量化范围是0.36至8.8ng/ml。对于每一组织的以ng/mg干重的量化下限(LLOQ)基于提取体积(μl)对重量比值，以ng/ml的ELISA的量化极限以及用于分析的稀释。对于GLYAT4621的在ng/ml干重基准上的样品LLOQ对于叶子是0.22ng/mg干重以及对于种子是0.22ng/mg干重。
ZM-HRA ELISA方法利用了用于确定玉米植物组织提取物中ZM-HRA蛋白存在的序贯“三明治”模式。将标准物(在一式三份孔中分析)和稀释的样品提取物(在一式两份孔中分析)在固定的96孔板中孵育一小时，所述板已预包被有ZM-HRA特异性抗体。从板中洗涤未结合的物质，并且将已与酶辣根过氧物酶(HRP)缀合的不同的ZM-HRA抗体加入到孔中。结合的ZM-HRA蛋白包夹在包被在板上的抗体和抗体-HRP缀合物之间。在1小时孵育的终点，从板上洗脱未结合的物质。通过添加底物检测结合的ZM-HRA蛋白-抗体复合物，所述底物在HRP的存在下产生有色产物。用终止溶液(盐酸)终止反应，并且应用Molecular Devices板读数器(Molecular Devices Corporation，1311Orleans Drive，Sunnyvale，CA 94089-1136，USA)用450nm至650nm的波长设定确定每一孔的光密度。应用SoftMax Pro软件(MolecularDevices Corporation，1311 Orleans Drive，Sunnyvale，CA 94089-1136，USA)进行计算，所述计算产生标准曲线的二次拟合并将样品OD值转化为ZM-HRA蛋白浓度。将以ng/ml的来自一式两份孔的平均浓度用于计算每一样品的报道ZM-HRA浓度(ng/mg干重)。
用于ZM-HRA分析的量化范围是0.9至22ng/ml。对于每一组织的以ng/mg干重的量化下限(LLOQ)基于提取体积(μl)对重量比值、以ng/ml的ELISA的量化极限以及用于分析的稀释。对于ZM-HRA的在ng/ml干重基准上的样品LLOQ对于叶子是0.54ng/mg干重以及对于种子是0.14ng/mg干重。
对植物高度数据计算了平均值、标准误差和P值。对于除草剂损伤计算了平均值。对于在叶子和种子组织上表达的每一种蛋白，计算了蛋白表达数据的平均值、范围和标准偏差。
经喷雾的来自世代1和世代2的DP-098140-6玉米植物显示出没有除草剂损伤并且与未喷雾对照和未喷雾的DP-098140-6玉米植物的两代是可比较的(数据未给出)。草甘膦和草甘膦/噻黄隆/苯黄隆罐式混合物喷雾的对照玉米的两代均导致100％损伤(表16)。在处理评估21天后，噻黄隆/苯黄隆处理导致对对照的10至50％损伤。如预期的那样，DP-098140-6玉米中的zm-hra基因允许改善针对ALS-抑制除草剂的耐性，如由植物高度测量和照片证实的那样(表17-18并且数据未给出)。
ELISA分析表明GLYAT4621蛋白在所有的DP-098140-6玉米叶子样品中表达(除了一株之外)，并且不在对照叶子样品中表达(低于LLOQ)(除一株之外)。这些例外是由于温室侧流试纸测试分析期间的误称所致。由于分离，GLYAT4621蛋白在25个种子样品中的10个中表达(表19)。ELISA分析表明ZM-HRA蛋白在所有的98140玉米叶子样品中表达(除了一株之外)，并且不在对照叶子样品中表达(低于LLOQ)(除一株之外)。这些例外是由于温室侧流试纸测试分析期间的误称所致。ZM-HRA蛋白仅在一个分离世代1的种子样品中表达(由于侧流试纸测试分析期间的误称所致)并且不在世代2种子样品中表达。ZM-HRA蛋白不在任何对照种子样品中表达(低于LLOQ)(表20)。
表15：实验设计
| 项目1 | 事件 | 世代 | 植物数目 | 除草剂处理 |
| 1 | 98140 | 1 | 5 | 草甘膦 |
| 2 | 98140 | 1 | 5 | 噻黄隆/苯黄隆 |
| 3 | 98140 | 1 | 5 | 草甘膦+噻黄隆/苯黄隆 |
| 4 | 9814 | 1 | 5 | 未喷洒 |
| 0 | ||||
| 9 | 对照 | 1 | 5 | 草甘膦 |
| 10 | 对照 | 1 | 5 | 噻黄隆/苯黄隆 |
| 11 | 对照 | 1 | 5 | 草甘膦+噻黄隆/苯黄隆 |
| 12 | 对照 | 1 | 5 | 未喷洒 |
| 13 | 98140 | 2 | 5 | 草甘膦 |
| 14 | 98140 | 2 | 5 | 噻黄隆/苯黄隆 |
| 15 | 98140 | 2 | 5 | 草甘膦+噻黄隆/苯黄隆 |
| 16 | 98140 | 2 | 5 | 未喷洒 |
| 21 | 对照 | 2 | 5 | 草甘膦 |
| 22 | 对照 | 2 | 5 | 噻黄隆/苯黄隆 |
| 23 | 对照 | 2 | 5 | 草甘膦+噻黄隆/苯黄隆 |
| 24 | 对照 | 2 | 5 | 未喷洒 |
1项目5-8和17-20含有对这一概要报告不特定的事件。
表16：除草剂处理后DP-098140-6和对照玉米的平均除草剂损害等级
表17：对于DP-098140-6和对照玉米植物高度的统计学比较——世代1
1p-值＜0.05表明统计学显著差异。
20cm的值表明可见的由于除草剂处理而死亡的植物。
表18：对于DP-098140-6和对照玉米植物高度的统计学比较——世代2
1p-值＜0.05表明统计学显著差异。
20cm的值表明可见的由于除草剂处理而死亡的植物。
表19：98140和对照玉米样品中GLYAT4621蛋白质浓度结果概述
1范围表示在所有样品中最低和最高的个体值。
2由于在温室中明显误称的植物鉴定号从概述统计中排除一个叶子标本。
3在概述统计中仅应用了未分离种子样品。
4对照种子样品取自这一事件的空分离的群体。
5对于在样品LLOQ以下的结果，指定0的值用于计算目的。
表20：DP-098140-6和对照玉米样品中ZM-HRA蛋白质浓度结果概述
1范围表示在所有样品中最低和最高的个体值。
2由于在温室中明显误称的植物鉴定从概述统计中排除一个叶子标本。
3对于在样品LLOQ以下的结果，指定0的值用于计算目的。
4所有样品均在LLOQ以下。
表26：在PHP24279T-DNA中遗传元件的描述
| 在T-DNA上的位置(碱基对位置) | 遗传元件 | 大小(碱基对) | 描述 |
| 1至25 | 右边缘 | 25 | T-DNA右边缘区，来自根癌农杆菌的Ti质粒 |
| 26至177 | Ti质粒区 | 152 | 来自根癌农杆菌Ti质粒的非功能序列 |
| 178至210 | 聚合接头区 | 33 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 211至521 | pinII终止子 | 311 | 来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的终止子区(Keil等，1986；An等，1989).(反方向) |
| 522至537 | 聚合接头区 | 33 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 538至2454 | zm-hra基因 | 1917 | 经修饰的内源性玉米乙酰乳酸合酶基因(Fang等，1992).(反方向) |
| 2455至3115 | zm-als启动子 | 661 | 来自玉米乙酰乳酸合酶基因的启动子区(Fang等，1992).(反方向) |
| 3116至3189 | 聚合接头区 | 74 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 3190至3625 | CaMV 35S增强子 | 436 | 来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck等，1980；Odell等.，1985). |
| 3626至3648 | 聚合接头区 | 23 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 3649至4086 | CaMV 35S增强子 | 438 | 来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck等，1980；Odell等.，1985). |
| 4087至4093 | 聚合接头区 | 7 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 4094至4531 | CaMV 35S增强子 | 438 | 来自花椰菜花叶病毒基因组的增强子区(Franck等，1980；Odell等.，1985). |
| 4532至4566 | 聚合接头区 | 35 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 4567至5466 | ubiZM1启动子 | 900 | 来自玉米泛素基因的启动子区(Christensen等，1992). |
| 5467至5549 | ubiZM15’UTR | 83 | 来自玉米泛素基因的5’非翻译区(Christensen等，1992). |
| 5550至6558 | ubiZM1I内含子 | 1009 | 来自玉米泛素基因的内含子区(Christensen等，1992). |
| 6559至6586 | 聚合接头区 | 28 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 6587至7030 | glyat4621基因 | 444 | 合成的草甘膦N-乙酰转移酶基因(Castle等，2004.Siehl等，2007). |
| 7031至7046 | 聚合接头区 | 16 | 克隆遗传元件所需区域 |
| 7047至7362 | pinII终止子 | 316 | 来自马铃薯蛋白酶抑制剂II基因的终止子区(Keil等，1986；An等，1989). |
| 7363至7415 | Ti质粒区 | 53 | 来自根癌农杆菌Ti质粒的非功能序列 |
| 7416至7440 | 左边缘 | 25 | T-DNA左边缘区，来自根癌农杆菌的Ti质粒 |
实施例7：DP-098140-6玉米的分子和遗传特征
为表征插入到DP-098140-6玉米中的DNA，进行了Southern印迹分析。通过Southern印迹分析T0S3世代的单个植物以确定插入的表达盒的每一个遗传元件的数目并且以证实在整合中保持了PHP24279T-DNA的完整性。用EcoR V和Spe I限制性酶研究了DP-098140-6玉米中插入的整合模式。在BC0S2和BC1和两代的个体植物上进行Southern印迹分析，以确认代间插入片段的稳定性，以及证实不存在来自质粒PHP24279的骨架序列。还通过Southern印迹分析了BC1S1世代以确认在第四代内插入片段的稳定性。
种植了来自T0S3、BC0S2、BC1和BC1S1世代的DP-098140-6玉米的种子并且将从个体植物中收获的叶组织用于基因组DNA提取。
种植来自未修饰的玉米品种PHWVZ和PH09B的种子，并且将从个体植物中收获的叶组织用于基因组DNA提取。将PHWVZ和PH09B的对照DNA用作阴性对照以帮助说明杂交结果，因为若干个探针(zm-hra、als启动子、ubiZM1启动子和ubiZM1内含子)与内源性玉米序列交叉杂交。
从大肠杆菌(E.coli)(Invitrogen，Carlsbad，CA)制备来自PHP24279的质粒DNA并且用作Southern印迹分析的阳性对照，以证实探针杂交并且证实内部片段的大小。该质粒储存是用于农杆菌介导的转化实验以产生DP-098140-6玉米的质粒的拷贝，并且用限制性酶将其消化以确定质粒图谱。在这一研究中使用的探针来源于质粒PHP24279或来源于含有等价遗传元件的质粒。
将凝胶电泳和Southern印迹分析的DNA分子量标记物用于确定近似的分子量。对于Southern分析，将用地高辛配基(DIG)标记(Roche，Indianapolis，IN)的DNA分子量标记物VII用作杂交片段的大小标准物。将ΦX174RF DNA/Hae III片段(Invitrogen，Carlsbad，CA)用作分子量标准品以确定片段在凝胶上的充分迁移和分离。
如上面所描述的那样从个体植物收获的叶组织中提取基因组DNA。应用Geno/GrinderTM(SPEX CertiPrep，Inc.，Metuchen，NJ)仪器在含有研磨珠的管中研磨组织，并且应用基于尿素的方法(从Chen和Dellaporta，1994改良)分离基因组DNA。在37℃用5ml尿素提取缓冲液(7M尿素、0.34M NaCl、0.05M Tris-HCl、pH 8.0、0.02MEDTA、1％N-月硅酰基肌氨酸)提取约1克研磨的组织12-30分钟，随后用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取两次，以及用水饱和氯仿提取一次。通过添加1/10体积的3M NaOAc(pH 5.2)和1体积的异丙醇使DNA从水相沉淀，随后离心以沉淀DNA。在用70％乙醇洗涤沉淀两次后，将该DNA溶解于0.5ml TE缓冲液(10mM Tris、1mM EDTA，pH 7.5)中，并在37℃用10μg核糖核酸酶A处理15分钟。用酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)提取该样品一次，并用水饱和氯仿提取一次，随后用异丙醇沉淀并用70％乙醇洗涤。干燥后，用0.5ml TE缓冲液重新溶解DNA并在4℃储存。
提取后，按照标准方法应用
试剂(Molecular Probes，Inc.，Eugene，OR)在荧光分光光度计上定量DNA。还在琼脂糖凝胶上显现DNA以从
分析确认定量值并且以确定DNA质量。
通过应用能够检测GLYAT4621蛋白的侧流装置进行DP-098140-6玉米植物和对照植物的表型分析，以确定用于Southern印迹分析的材料中GLYAT4621蛋白的不存在或存在。
通过在500μl提取缓冲液(20mM Tris(pH 7.5)、67mM NaCl、0.5％Tween 20)中将叶穿孔物(leaf punches)研磨至均匀制备叶提取物。将侧流装置(EnviroLogix，Inc.，Portland，ME)置于匀浆中，并允许其显影。在孵育后，从侧流装置读出结果。单个条纹表明阴性结果并且双条纹表明样品对于GLYAT4621蛋白是阳性的。
将从来自世代T0S3、BC0S2和BC1的所有DP-098140-6玉米植物中提取的DNA的初步DNA Southern印迹分析用于证实glyat4621和zm-hra基因两者的存在。用于这一初步表征的方法描述如下。在来自这三个世代和BC1S1世代的DP-098140-6玉米植物亚组上进行最终的Southern印迹分析。
按照标准方法用限制性酶消化从所选择的DP-098140-6玉米和对照玉米植物提取的基因组DNA样品。根据生产商的推荐，在100μl体积中应用50单位的酶消化约4μg基因组DNA。在37℃使消化进行3小时，随后用1/10体积的3M NaOAc(pH 5.2)和2体积的100％乙醇进行乙醇沉淀。在4℃孵育和离心后，使DNA干燥并重新溶解于TE缓冲液中。以等价于每玉米基因组约1或3基因拷贝的量将参照质粒PHP24279掺入对照植物DNA样品中，并且用相同的酶消化以作为探针杂交的阳性对照，并且以证实Southern印迹中内部片段的大小。
在限制性酶消化后，通过大小在琼脂糖凝胶上电泳分离产生的DNA片段，并且将分子量标准品[ΦX174 RF DNA/Hae III片段(Invitrogen)]用于确定片段在凝胶上的充分迁移和分离。将在如下描述那样的DIG检测后可看见的DIG标记的DNA分子量标记物VII(Roche)用于确定Southern印迹上的杂交片段大小。
使含有分离的DNA片段的琼脂糖凝胶原位脱嘌呤、变性以及中和，并应用如为TURBOBLOTTERTM Rapid Downward转移系统(Schleicher & Schuell，Keene，NH)所描述的那样的方法将其转移至在20x SSC缓冲液(3M NaCl、0.3M柠檬酸钠)中的尼龙膜上。在转移至膜上后，通过UV交联(Stratalinker，Stratagene，La Jolla，CA)将DNA结合在膜上。
将针对ubiZM1启动子、ubiZM1内含子、glyat4621(SEQ ID NO：33)、pinII终止子、als启动子、zm-hra(SEQ ID NO：31和32)以及35S增强子的探针用于检测该插入片段内的基因和元件。应用PHP24279质粒的骨架区域(virG、tet、spc、LB和RB探针)证实在DP-098140-6玉米中不存在质粒骨架DNA。应用特异引物从质粒PHP24279或具有等价元件的质粒中通过PCR产生该探针元件的DNA片段。在琼脂糖凝胶上电泳分离PCR片段，切除，并应用凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Valencia，CA)纯化。通过将DIG标记的核苷酸[DIG-11]-dUTP掺入该片段的PCR从这些片段产生DNA探针。根据在PCR DIG探针合成试剂盒(Roche)中提供的方法进行分离片段PCR标记。
当与标记的探针杂交时，作为离散带检测结合至尼龙膜的DNA片段。应用基本上如为DIG Easy Hyb溶液(Roche)所描述的那样的方法，使标记的探针与尼龙膜上靶DNA杂交，以检测特定片段。在严格洗涤后，应用具有DIG洗涤和封闭缓冲液设置(Roche)的CDP-Star化学发光核酸检测系统显现杂交的DIG标记的探针和DIG标记的DNA标准品。将印迹暴露于X光胶片一个或更多个时间点以检测杂交片段并且以显现分子量标准品。通过用Luminescent Image AnalyzerLAS-3000(Fujifilm Medical Systems，Stamford，CT)检测获得数码图像。将数码图像与作为用于这一报告的确认而曝光的最初X光胶片比较。为每一消化和每一探针存档所检测条带的大小。
在杂交和检测后，剥离膜上的DIG标记的探针以制备用于随后与另外探针再杂交的印迹。在蒸馏的、去离子水中简单的冲洗膜，并且然后在37-40℃在恒定震动下在0.2M NaOH和0.1％SDS的溶液中进行剥离。然后将膜在2x SSC中冲洗，并且直接用于随后的杂交，或在4℃或-20℃储存用于之后的使用。该基于碱的剥离方法有效的移除用碱不稳定的DIG标记的探针。
转基因拷贝数和插入完整性
用EcoR V消化研究在DP-098140-6玉米中插入的整合模式以确定拷贝数，并且用Spe I消化以确定插入的完整性。使Southern印迹与若干种探针杂交以确定拷贝数和每一遗传元件的完整性。应用ubiZM1启动子、ubiZM1内含子、和glyat4621探针以表征glyat4621盒(表21并且数据未给出)。应用als启动子和zm-hra探针以表征zm-hra盒(表21并且数据未给出)。应用35S增强子探针和pinII终止子探针以表征与两个盒相关的遗传元件(表21并且数据未给出)。
表21：用于Southern印迹杂交的DNA探针的描述
| 探针名称 | 遗传元件 | 在PHP24279T-DNA上的位置(bp至bp) | 在PHP24279质粒上的位置(bp至bp) | 探针长度(bp) |
| ubiZM1启动子 | ubiZM1启动子 | 4602至5460 | 22689至23457 | 859 |
| ubiZM1内含子 | ubiZM15’UTR和内含子 | 5472至6551 | 23559至24638 | 1080 |
| glyat4621 | glyat4621基因 | 6587至7021 | 24674至25108 | 435 |
| als启动子 | als启动子 | 2503至3101 | 20590至21188 | 599 |
| zm-hra1 | zm-hra基因 | 538至14681490至2259 | 18625至1955519577至20346 | 931770 |
| pinII终止子 | pinII终止子 | 235至46827100至73332 | 18322至18555225187至254202 | 234 |
| 35S增强子 | CaMV 35S增强子 | 3192至361133653至407234097至45133 | 21279至21698321740至22159322184至226033 | 420 |
| virG | virG基因 | N/A | 2512至3255 | 744 |
| tet1 | 四环素抗性基因 | N/A | 32556至3309433200至33657 | 539458 |
| spc | 大观霉素抗性基因 | N/A | 26707至27481 | 775 |
| LB | 与左T-DNA边缘邻接的质粒骨架上的区域 | N/A | 25552至25897 | 346 |
| RB | 与右T-DNA边缘邻接的质粒骨架上的区域 | N/A | 17654至18043 | 390 |
*缩写：N/A-不适用的，它们不存在于PHP24279T-DNA上。
1.为这一探针设计了两条不重叠的片段，且联合用于杂交。所提供的bp是每一个不同的片段的位置。
2.在PHP24279和PHP24279T-DNA上有两个拷贝的pinII终止子。所提供的bp是每一个独立拷贝的位置。
3.在PHP24279和PHP24279T-DNA上有3个拷贝的35S增强子。所提供的bp是每一个独立拷贝的位置。
对于对glyat4621盒特异的探针、对zm-hra盒特异的探针、以及与两个盒相关的探针的预测的和观察的杂交条带分别描述于表22、24和27。ubiZM1启动子、ubiZM1内含子、als启动子和zm-hra探针均与对照和DP-098140-6玉米两者的基因组DNA中的序列杂交。确定在对照玉米DNA中存在的杂交条带来自内源玉米基因组并且因此不是T-DNA插入片段的一部分。在表22和24中通过星号(*)和灰色阴影标出了这些条带。在样品上样、凝胶电泳和转移、以及杂交强度上的一些差异影响了不同代和世代内样品之间微弱的内源条带的可视性。
表22：在用对glyat4621盒特异的探针的Southern印迹上预测和观察的杂交条带
星号(*)和灰色阴影表明标出的条带是由于探针与内源玉米基因组序列杂交所致，如通过在所有泳道、DP-098140-6玉米和对照中存在相同的条带所确定的那样。某些内源条带可能难以在打印拷贝中看到，但可在原始胶片中看出。
1.对于与含有质粒阳性对照的样品杂交的预测片段大小基于PHP24279质粒图谱。
2.对于DP-098140-6玉米的预测的片段大小基于PHP24279T-DNA图谱。
3.观察的片段大小被认为与这些分析接近，并且基于在Southern印迹上DIG标记的DNA分子量标记物VII片段所指出的大小。由于为了显影而掺入了DIG分子，该标记物片段通常比它们实际所标出的分子量要跑得大大约5-10％。将不直接与质粒片段一致的片段大小四舍五入为最近的100bp。
4.基于来自PHP24279的T-DNA完整插入所预测的最小片段大小。片段大小四舍五入为最近的100bp。
5.所观察到的片段大小与基于Southern印迹上等价迁移所预测的片段大小相同。
表24：在用对zm-hra盒特异的探针的Southern印迹上预测和观察的杂交条带
星号(*)和灰色阴影表明标出的条带是由于探针与内源玉米基因组序列杂交所致，如通过在所有泳道、DP-098140-6玉米和对照中存在相同的条带所确定的那样。某些内源条带可能难以在打印拷贝中看到，但可在原始胶片中看出。并不是所有的内源条带在所有样品中都是相同的，因为在产生所分析的不同世代的育种过程中使用的品种的基因组不同。
1.对于与含有质粒阳性对照的样品杂交的预测片段大小基于PHP24279质粒图谱。
2.对于DP-098140-6玉米的预测的片段大小基于PHP24279T-DNA图谱。
3.观察的片段大小被认为与这些分析接近，并且基于在Southern印迹上DIG标记的DNA分子量标记物VII片段所指出的大小。由于为了显影而掺入了DIG分子，该标记物片段通常比它们实际所标出的分子量要跑得大大约5-10％。将不直接与质粒片段一致的片段大小四舍五入为最近的100bp。
4.基于来自PHP24279的T-DNA完整插入所预测的最小片段大小。片段大小四舍五入为最近的100bp。
5.由于背景中的等位基因不同，并不是在所有世代中都可以观察到所有内源条带。此外，在样品上样、凝胶电泳和转移、以及杂交强度上的差异影响了不同代和世代内样品之间微弱的内源条带的可视性。
6.所观察到的片段大小与基于Southern印迹上等价迁移所预测的片段大小相同。
基于如以下所讨论的Southern印迹分析，确定以将单个、完整的PHP24279T-DNA插入到了DP-098140-6玉米基因组中，如在插入图谱中所图解的那样(图5)。
拷贝数
EcoR V消化提供了关于整合到DP-098140-6玉米基因组中遗传元件的拷贝数信息，因为在PHP24279T-DNA中在碱基对(bp)位置3651上存在单个的限制性酶位点，并且任何另外的位点将落在玉米基因组中T-DNA序列之外。除了35S增强子探针外，与来自每一个盒的探针的杂交将在杂交条带数目的基础上表明在DP-098140-6玉米中找到的每一元件的拷贝数(例如，一个杂交条带表明元件的一个拷贝)。存在两拷贝的pinII终止子，一个位于每一基因盒中EcoR V位点任一侧，因此，对于单T-DNA插入，用这一探针将预计两条杂交条带。在T-DNA中存在三拷贝的35S增强子元件；然而，由于EcoR V位点位于两拷贝之间，因此仅能预计两条杂交条带。对于DP-098140-6玉米的用EcoR V所预测和观察的片段大小如下给出：glyat4621盒：表22；zm-hra盒：表24；与两个盒相关的元件：表27。
表27：在用对glyat4621盒及zm-hra盒通用的探针的Southern印迹上预测和观察的杂交条带
| 探针 | 限制性酶 | 从PHP242791预测的片段大小(bp) | 从PHP24279T-DNA2预测的片段大小(bp) | 在DP-098140-6玉米3中观察到的片段大小(bp) |
| pinII终止子 | EcoRV | 111789691 | ＞38004＞37004 | ＞8600～6100 |
| 35S增强子 | EcoRV | 111789691 | ＞38004＞37004 | ＞8600～6100 |
| pinII终止子 | Spe I | 427856773813 | 6773＞4004＞3004 | 67735～4900～450 |
| 35S增强子 | Spe I | 6773 | 6773 | 67735 |
1.对于与含有质粒阳性对照的样品杂交的预测片段大小基于PHP24279质粒图谱。
2.对于DP-098140-6玉米的预测的片段大小基于PHP24279T-DNA图谱。
3.观察的片段大小被认为与这些分析接近，并且基于在Southern印迹上DIG标记的DNA分子量标记物VII片段所指出的大小。由于为了显影而掺入了DIG分子，该标记物片段通常比它们实际所标出的分子量要跑得大大约5-10％。将不直接与质粒片段一致的片段大小四舍五入为最近的100bp(如果＞500bp)，或四舍五入为最近的50bp(如果＜500bp)。
4.基于来自PHP24279的T-DNA完整插入所预测的最小片段大小。片段大小四舍五入为最近的100bp。
5.所观察到的片段大小与基于Southern印迹上等价迁移所预测的片段大小相同。
将单个拷贝的glyat4621盒的独特元件插入到DP-098140-6玉米中。使ubiZM1启动子、ubiZM1内含子及glyat4621探针与来自T0S3代个体DP-098140-6玉米植物的用EcoR V消化的基因组DNA杂交(表22)。每一个探针与约6100bp的相同的单个片段杂交(表22)，表明在DP-098140-6玉米中在插入片段上按预期排列遗传元件的单拷贝插入。ubiZM1启动子和ubiZM1内含子探针与玉米基因组的内源元件是同源的，并且因此每一探针还与对照玉米样品中的条带杂交(表22)。
同样地，将单拷贝的zm-hra盒专有的每一个元件插入到了DP-098140-6玉米中。将两个包含这一盒的独特的元件：als启动子和zm-hra基因用作探针以确定所插入的拷贝数。该两个探针的每一个与大于8600碱基对(bp)的相同的单个片段杂交(表24)，表明在DP-098140-6玉米中在插入片段上按预期排列遗传元件的单拷贝插入。这一盒的探针也与玉米基因组的内源元件同源，并且因此每一探针还与对照玉米样品中的条带杂交。
PinII终止子存在于glyat4621和zm-hra盒两者之中。三拷贝的35S增强子元件位于两个表达盒之间。由于EcoR V限制性酶位点位于bp位置3651上的该三个拷贝的35S增强子的两个之间(图6)，可以预期PinII终止子及35S增强子探针将与含有glyat4621或zm-hra基因盒的相同片段杂交。在两种情况下，利用这些探针的EcoR VSouthern印迹杂交导致与glyat4621盒相关的6100bp条带及与zm-hra盒相关的超过8600bp条带两者的检测(表27并且数据未给出)。在35S增强子探针的情况下，超过8600bp的条带基本上比约6100bp的条带更弱，因为其为含有单拷贝增强子元件的条带，而该6100bp的条带含有两个拷贝的35S增强子(数据未给出)。对于pinII终止子和35S增强子探针，仅存在两条杂交条带，与上面对于该两个基因盒的其它组分标注的杂交条带相一致，其进一步表明存在以其期望排列的单拷贝的PHP24279T-DNA插入到DP-098140-6玉米基因组中。
插入完整性
应用Spe I消化证实含有glyat4621和zm-hra盒两者的插入T-DNA在DP-098140-6玉米中是完全且完整的。在PHP24279T-DNA中存在两个Spe I位点(碱基位置396和7169)，其位于在每一基因表达盒末端发现的pinII终止子元件内部(图6)。与glyat4621和zm-hra盒的探针的杂交确认在预期的内部6773bp片段上发现了所有了元件。此外，由于Spe I位点位于终止子内部，pinII终止子探针与两个其它的预期边缘片段杂交。用Spe I的预期和观察的片段大小如下给出：glyat4621盒：表22；zm-hra盒：表24；与两个盒相关的元件：表27。
针对glyat4621盒的ubiZM1启动子、ubiZM1内含子和glyat4621探针与和质粒对照条带匹配的源于单插入的6773bp条带杂交(表22，数据未给出)。类似地，针对zm-hra盒(als启动子和zm-hra)的探针与相同的内部6773bp条带杂交(表24，数据未给出)。35S增强子和pinII终止子探针也与预期的内部6773bp条带杂交(表27，数据未给出)。通过与相应于T-DNA的PHP24279质粒片段杂交确认了对于每一探针的条带大小(数据未给出)。由于这些探针与相同的预期大小的内部片段杂交，确定DP-098140-6玉米中的PHP24279T-DNA是完整的，并且确认该盒的所有元件均在这一片段上。
除了内部6773bp条带之外，pinII终止子探针还与两条另外的条带杂交，一条约4900bp，另一条为约450bp(表27，数据未给出)。这些另外的条带是由于Spe I限制性位点位于pinII终止子探针区域内部，导致该探针与PHP24279T-DNA完整插入的两个边缘片段杂交。该两个另外杂交条带的存在表明在该T-DNA中的pinII终止子是完整的，并且另外地确认已将完整的PHP24279T-DNA插入到DP-098140-6玉米中。
如之前所描述的那样，ubiZM1启动子、ubiZM1内含子、als启动子和zm-hra探针与玉米基因组的内源元件同源，并且因此每一个探针均与对照玉米样品中的条带杂交(表22和24，数据未给出)。
各代间插入的稳定性
应用EcoR V对三个世代的98140玉米：BC0S2、BC1和BC1S1进行了Southern印迹分析，以证实在98140玉米中插入的稳定性，如通过在所有世代中相同的杂交模式证实的那样。如早前讨论过的那样，EcoR V限制性酶具有位于PHP24279T-DNA之内的单位点(bp位置3651)，并且当与glyat4621和zm-hra探针杂交时，将产生对于98140玉米独特的事件特异的杂交模式。这一分析能够确认各代间的事件稳定性，因为对98140玉米中插入结构的改变将能被检测出来。应用glyat4621探针将预期约6100bp的条带能确认各代间的稳定性(表22)。同样地，对于zm-hra探针，预期超过8600bp的带能确认各代间的稳定性(表24)。如在下面详细讨论的那样，所有分析的三个世代BC0S2、BC1和BC1S1均显示出与T0S3分析相一致的相同杂交模式，确定了在98140玉米中该插入的稳定性。
用EcoR V消化来自98140玉米BC0S2和BC1代的基因组DNA，并且与glyat4621和zm-hra探针杂交，以确认各代间的稳定性(数据未给出)。在两代中，对98140玉米特异的约6100bp条带均与glyat4621探针杂交(表22)。应用zm-hra探针，对98140玉米特异的超过8600bp的单个条带存在于两代中(表24)。除了该超过8600bp的条带外，zm-hra探针还与另外的条带杂交，其被确定为是玉米基因组内源的，因为这些条带存在于98140玉米和对照玉米植物中(数据未给出)。来自glyat4621和zm-hra探针两者的杂交结果的一致性确认了98140玉米中PHP24279T-DNA的插入在BC0S2和BC1中保持稳定。此外，在这两代中从98140插入得到的观察条带与在上述T0S3代的EcoR VSouthern印迹上用相同的探针看到的条带大小相同(数据未给出)，表明98140插入在所有三代中是稳定的。由于在最初转化的玉米系和与98140插入不相关的回交亲本系之间等位基因不同，预期在来自不同世代的98140玉米植物之间用zm-hra探针看到的内源条带存在差异。
还通过Southern印迹分析了来自98140玉米分离BC1S1代的植物。用EcoR V消化来自BC1S1代的基因组DNA，并与glyat4621和zm-hra探针杂交。在含有98140玉米插入的植物中，用glyat4621探针观察到了约6100bp的条带(表22并且数据未给出)，以及用zm-hra探针观察到了对98140玉米特异的超过8600bp的条带(表24并且数据未给出)。如在之前分析的那样，zm-hra探针与98140玉米和对照样品中另外的条带杂交，其是由于玉米基因组内的内源序列(数据未给出)。BC1S1代中内源条带的差异是由于来自亲本系的等位基因的分离所致，而不是由于98140插入的改变。空分离(null segregant)植物不与glyat4621探针杂交，并且仅显示出用zm-hra探针在对照植物中观察到的内源杂交(数据未给出)。来自glyat4621和zm-hra探针两者杂交结果与上述来自T0S3、BC0S2和BC1世代结果一致，并且确认了在传统玉米育种期间该插入的遗传稳定性。
因此，应用glyat4621和zm-hra探针对98140玉米T0S3、BC0S2、BC1和BC1S1世代的Southern印迹分析得到了所有四个世代的EcoRV消化相同的杂交模式。该一致的杂交模式表明该T-DNA插入在各代间稳定遗传。
DP-098140-6中性状的遗传
进行了来自四个不同世代(BC0S1、BC1S1、BC2和BC3)的性状遗传数据的x2分析，以确定DP-098140-6玉米中glyat4621和zm-hra基因的遗传性和稳定性。对于glyat4621和zm-hra基因的存在，预期来自BC0S1和BC1S1世代的植物以3∶1分离，并且预期来自BC2和BC3世代的植物以1∶1分离。
为确认预期的分离比，对来自幼苗的叶穿孔物进行聚合酶链式反应(PCR)分析。对所有植物进行针对glyat4621和zm-hra基因的定性PCR分析。
来自该分离分析的结果总结于表23中。在每种情况下，glyat4621阳性的植物对于zm-hra基因也是阳性的，并且反之亦然，确定了这两个基因如预期的那样共分离。为确认glyat4621和zm-hra基因按照孟德尔遗传定律分离，进行了x2分析。多有的P值均大于0.05，表明在DP-098140-6玉米的四个世代中，glyat4621和/或zm-hra基因的观察和预期频率之间没有统计学显著差异。这一分析结果与在DP-098140-6植物后代中根据孟德尔遗传定律分离的glyat4621和zm-hra基因的单座位插入的发现一致。在自花传粉或异花传粉的四个世代中已证实了插入片段的稳定性。参见表23。
表23：98140玉米的观察和预期分离比比较
概述和结论
进行了Southern印迹分析以表征DP-098140-6玉米中的DNA插入。该分析确定了已将单个、完整的PHP24279T-DNA插入到了玉米基因组中，以产生DP-098140-6玉米。存在glyat4621和zm-hra表达盒每一个元件的单个拷贝，在该两个盒之间存在三个35S增强子元件，并且保持了PHP24279T-DNA的稳定性。该分析确认了在T0S3、BC1S1、BC0S2和BC1世代间DP-098140-6玉米中插入的稳定性，由此确认了在传统育种过程中遗传的稳定性。
遗传分析确认该插入片段以标准孟德尔方式分离。在这一研究中得到的P值没有一个表明在四个不同的植物世代中，对于glyat4621和zm-hra基因的观察和预期分离比具有统计学上的显著差异。该结果与分子表征数据一致，其表明glyat4621和zm-hra转基因在玉米基因组的单个位点上稳定整合。
通过种植该种子并对得到的植物喷洒草甘膦，能很容易的得到足够数量的固定植物。用MAXIM XL杀真菌剂处理该玉米种子。当触摸该种子时，应当带上安全眼镜和化学抗性手套。不要咽下种子。
表28：SEQ ID NOS的概述表
| SEQ ID NO | 描述 |
| 1 | 右边缘基因组序列 |
| 2 | 左边缘基因组序列 |
| 3 | 全部内部转基因 |
| 4 | 全部侧翼和全部转基因插入片段 |
| 5 | 右侧翼基因组/右边缘转基因(10nt/10nt) |
| 6 | 左侧翼基因组/左边缘转基因(10nt/10nt) |
| 7 | 右侧翼基因组/右边缘转基因(20nt/20nt) |
| 8 | 左侧翼基因组/左边缘转基因(20nt/20nt) |
| 9 | 右侧翼基因组/右边缘转基因(30nt/30nt) |
| 10 | 左侧翼基因组/左边缘转基因(30nt/30nt) |
| 11 | 左侧翼基因组/全部转基因 |
| SEQ ID NO | 描述 |
| 12 | 右侧翼基因组/全部转基因 |
| 13 | 引物100235 |
| 14 | 引物99878 |
| 15 | 引物99885 |
| 16 | 引物100240 |
| 17 | 引物102588(18的引物对) |
| 18 | 引物102589 |
| 19 | Taqman MOB探针102590 |
| 20 | 引物06-O-1734 |
| 21 | 引物06-O-1738 |
| 22 | 引物02-O-197(转化酶) |
| 23 | 引物02-O-198(转化酶) |
| 24 | SEQ ID NO：3的最后185个核苷酸 |
| 25 | 寡核苷酸06-O-1536 |
| 26 | 寡核苷酸06-O-1537 |
| 27 | 寡核苷酸06-O-1538 |
| 28 | 寡核苷酸06-O-1539 |
| 29 | 寡核苷酸06-O-1541 |
| 30 | 寡核苷酸06-O-1542 |
| 31 | Zm-HRA 3’探针 |
| 32 | Zm-HRA 5’探针 |
| 33 | GLYAT4621探针 |
| 34 | 寡核苷酸06-O-1779 |
| 35 | 寡核苷酸06-O-1782 |
| 36 | 寡核苷酸06-O-1783 |
| 37 | 寡核苷酸07-O-1877 |
| 38 | 寡核苷酸07-O-1878 |
| 39 | 寡核苷酸07-O-1879 |
| 40 | 寡核苷酸07-O-1880 |
| 41 | 寡核苷酸07-O-1946 |
| SEQ ID NO | 描述 |
| 42 | 寡核苷酸07-O-1947 |
| 43 | 寡核苷酸07-O-1948 |
| 44 | 寡核苷酸07-O-1949 |
| 45 | 寡核苷酸07-O-1950 |
| 46 | 左边缘基因组序列(ud) |
| 47 | 全部内部转基因(ud) |
| 48 | 全部侧翼和全部转基因插入片段(ud) |
| 49 | 左侧翼基因组/全部转基因(ud) |
| 50 | 右侧翼基因组/全部转基因(ud) |
| 51 | 寡核苷酸DP098-3′-f12 |
| 52 | 寡核苷酸DP098-3′-r12 |
| 53 | 寡核苷酸DP098-3′-p6 |
| 54 | 寡核苷酸DP098-f6(正向) |
| 55 | 寡核苷酸DP098-r2(正向) |
| 56 | 寡核苷酸DP098-p5(探针) |
| 57 | Zm-HRA 3’探针(up#2) |
本文所使用的冠词“一”是指一个或一个以上(即，至少一个)该冠词的语法对象。通过实例的方式，“一个元件”意思是一个或更多个元件。
在本说明书中提到的所有出版物和专利申请均表示本发明所述领域技术人员的水平。所有的出版物和专利申请均在此通过引用的方式并入本文，如同特别地并单个地指出通过引用并入每一单个出版物或专利申请那样同样的程度。
尽管为了理解清楚的目的，已经通过说明和实施例的方式比较详细地描述了前述发明，但显而易见的是，在所附权利要求的范围内可以实施某些改变和修饰。
| 申请人或代理人档案号35718/332392 | 国际申请号PCT/US2007/ |
关于微生物保藏的说明
(细则13之二)
PCT/RO/134表(1998年7月)
序列表
<110>Chicoine，Timothy K.
Derry，Jeffery W.
Hazel，Christine B.
Henderson，Nancy L.
Hondred，David
Khazi，Deepa
Leysens，Nancy J.
Liu，Donglong
McCutchen，Billy Fred
Mehre，Wayne J.
Peeples，Kenneth A.
Saunders，David W.
Weber，Natalie N.
Young，Joshua K.
Zhong，Cathy Xiaoyan
<120>玉米事件DP-098140-6，鉴定和/或检测其的组合物和方法
<130>035718/332392
<160>57
<170>FastSEQ for Windows Version 4.0
<210>1
<211>726
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6的右边缘连接
<400>1
atgaaaaagt ccaagtcgag caagggtacg taccgcggcc ggcggctaat tacggaggac 60
atgtcgtagt agctggtagt aaattaacac acgcgtacga gtagcggagt taaatggggg 120
catgcatgca gcaggacgtg gtattagtaa gcttactact ctagctttat ccatccatcc 180
atcgcgctag ctggctgcag gcacgggtta tcttatcttg tcgtccagag gacgacacac 240
ggccggccgg tgaagtaaaa gggagtaatc ttattttgcc aggacgaggg gcggtacatg 300
atattacaca cgtaccatgc atgcatatat gcatggacaa ggtacgtcgt cgtcgatcga 360
cgtcgatgca tatgtgtgta tgtatgtacg tgcataatgc atggtaccag ctgctggctt 420
atatatattt gtcaccgatc gatgcatgct gctgctctac acggtttgac actttaattt 480
gactcatcga tgaccttgct agatagtagc ggctcgtcaa ttaatgagcc atcaagttaa 540
caagagggca cgggcttgcg cgactgattc caccttatta acatacgccc tgcgcccgcg 600
cgtgctgtac gtacgagaat ttcgaattac attaattcaa agctgtgtat gtatgtatat 660
atatatgtgc gtttttttgt gtgtgtatgt ctctttgctt ggtctttctc tatcgatccc 720
cctctt 726
<210>2
<211>1311
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6的左边缘连接
<221>misc_feature
<222>1263，1264，1265，1266，1267，1268
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>1263，1264，1265，1266，1267，1268
<223>n＝A，T，C或G
<400>2
ctgtacatgt aaccagcttt cctagaaaaa aaacacagta atatttacag tatacaataa 60
tgctcattga ttagatccaa aattatgaaa tgtatatatt ttttgccata acttttatta 120
cagtcttata ctgaagtaaa gttgtatcac gtcatgaaca tagaataaga ctgagatagt 180
tgactaatcc agtcatatcc tatagtacac tagtaaggtg catgtgctaa caatatgaca 240
aatctagtat ttctttatag tttatcatcc ataaatcgca aaatacctaa gcataatttt 300
atttgaatag agagagtact gcccgttatt gtatgaggta atgacttcca tatatacaac 360
atagtcataa gaacacaatt atgaaaaaaa tctatttaaa attgaaatgc gttgagatct 420
tgtcttgcat actaaacata gtaaatataa attaatgcat aaatgactgt tataacagac 480
aatgctggtg acaatagaca atgtactgaa tctaactgga tacgtaggat gctgctatct 540
tattcactca tagttattca gatagtggtc attctttttg acccatagaa aactgtgtgc 600
tataatacac caaaaggaaa gcaaagtgaa aaggaaactt tgaatagcca agaagactcg 660
gagtgcttca cgccttcacc tatcccacat aggtgatgag ctaagagtaa aatgtagatt 720
ctctcgagta ctgaatattg cctgcacttt tccttgcagt aaatacacct ttaatccatg 780
acgagagtcc actctttgag tccgtcttga gattcttcca ttgatcatac aacatgacct 840
cgaagtcctg atggagaaca acttatataa ttaaaactac aatacagaaa gttcctgaca 900
attaaaacct ttggtggtgg catgccgtag gttaaaaaaa atagataatg acaacacaac 960
tggagacacg ctctttgccg agtgctcaca cgtttgctga gagcgagcac tcggcaaata 1020
tatgatttgc cgaataccac cctcctcggc aaaacaatac actaggcaaa aaggtagttt 1080
cccatcacca tgatgcccgc cgttaatgta ccttctatgc cgagtatgtt ggcgctcagc 1140
aaagagatcg ttaccggcgt ttgtttcacc aagagctctt tgacgagtgt ggcacacgac 1200
aaaacctttt gccgagtgta attagtcgtt tgccaagtga ctggtgcagt tggcaaagga 1260
gtnnnnnntt atgtgtgggc aaaatgatat atggtgccag ttagggctag c 1311
<210>3
<211>7388
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的全部转基因
<400>3
tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag 60
tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga 120
accgcaacgt tgaaggagcc actcagcaag ctgggccccc cctcgaggtc ggccgcattc 180
gcaaaacaca cctagactag atttgttttg ctaacccaat tgatattaat tatatatgat 240
taatatttat atgtatatgg atttggttaa tgaaatgcat ctggttcatc aaagaattat 300
aaagacacgt gacattcatt taggataaga aatatggatg atctctttct cttttattca 360
gataactagt aattacacat aacacacaac tttgatgccc acattatagt gattagcatg 420
tcactatgtg tgcatccttt tatttcatac attaattaag ttggccaatc cagaagatgg 480
acaagtctag gttaactgac tagctagtca gtacacagtc ctgccatcac catccaggat 540
catatccttg aaagccccac cactagggat cataggcaac acatgctcct ggtgtgggac 600
gattatatcc aagaggtacg gccctggagt ctcgagcatc ttctttatcg ctgcgcggac 660
ttcgttcttc tttgtcacac ggaccgctgg aatgttgaac cctttggcga tcgtcacgaa 720
atctggatat atctcacttt cattctctgg gtttcccaag tatgtgtgcg ctctgttggc 780
cttatagaac ctgtcctcca actgcaccac catccccagg tgctggttgt ttagcacaaa 840
gaccttcacc gggaggttct caattcggat catagctagc tcctgaacgt tcatgagaaa 900
gctaccatct ccatcgatgt caacaacagt gacacctggg ttggccacag aagcaccagc 960
agcagccggc aaaccaaatc ccatagcccc aagaccagct gaagacaacc actgccttgg 1020
ccgcttgtaa gtgtagtact gtgccgccca catctggtgc tgcccaacac ctgtgccgat 1080
gatggcctcg cctttcgtca gctcatcaag aacctgaata gcatattgtg gctggatctc 1140
ctcattagat gttttatacc caagggggaa ttccctcttc tgctgatcca actcatcgtt 1200
ccatgagcca aagtcaaagc tcttctttga tgtgcttcct tcaagaagag cattcatgcc 1260
ctgcaaagca agcttaacat ctgcacagat ggacacatgt ggctgcttgt tcttgccaat 1320
ctcagccgga tcaatatcaa cgtgcacaat cttagccctg cttgcaaaag cctcaatctt 1380
ccctgtcacg cgatcatcaa accgcacacc aagtgcaagc aacagatcgg ccttatccac 1440
tgcataattt gcatacaccg tcccatgcat acctagcatg cgcagagaca gtgggtcgtc 1500
gctggggaag ttgccgaggc ccataagagt agttgtgacc gggattccag tcagctccac 1560
aaagcgtcgc aactcctcac cagatgctgc gcagccaccg cccacataaa gaacagggcg 1620
ccgcgattca ccaacaagac gcagcacctg ctcaagcaac tcagtcgcag ggggcttggg 1680
aaggcgcgca atgtacccag gcagactcat gggcttgtcc cagacaggca ccgccatctg 1740
ctgctggatg tccttgggga tgtcgacaag caccggccct ggtcgaccag aggaggcgag 1800
gaagaaagcc tcctgcacga cgcgggggat gtcgtcgacg tcgaggacca ggtagttgtg 1860
cttggtgatg gagcgggtga cctcgacgat gggcgtctcc tggaaggcgt cggtgccaat 1920
catgcgtcgc gccacctgtc ccgtgatggc gaccatgggg acggaatcga gcagcgcgtc 1980
ggcgagcgcg gagactaggt tggtggcgcc ggggccggag gtggcgatgc agacgccgac 2040
gcggcccgag gagcgcgcgt agccggaggc ggcaaaggcc tccccttgct cgtggcggaa 2100
gaggtggttg gcgatgacgg gggagcgggt gagtgcctgg tggatctcca tggacgcgcc 2160
gccggggtag gcgaagacgt cgcggacgcc gcagcgctcg agggactcga cgaggatgtc 2220
agcacccttg cggggctcgg tggggcccca cggccggagc ggggtggccg ggggagccat 2280
cggcatggcg ggtgacgccg ctgagcacct gatgggcgcg gcgagggcgc ggcgggtggc 2340
caggaggtgc gcccggcgcc tcgccttggg cgcagcggta gtggcgccag tgagcgcggt 2400
agacgcggcg gcggcggtgg ccatggttgc ggcggctgtc tcggaggcgg cgcgagggtt 2460
tggggtgggt gccacggaca cggagtggga gaaaggggga tgtgcgtgga ggcctccctg 2520
cttttgttca gaggatgtgt ggctcagatg gtgatgggaa tgggactcgc aagacgacga 2580
cgacacgtcc gtcgcccgaa tacgtacacg ctacagaccg gacggtgggg cctgtcgacg 2640
tgggaccacg tgtcggcctg gattacaaac agtggtgtcc accgagtgct ggtacacgac 2700
agcgtgcgtc aaggaaggtt ttgaactgtt ccgttaaaaa aagaggggag attttggact 2760
tgactgtgga cgacggtgca tgtcatcgga gtacagacgg tactgacaca aggggcccag 2820
acaagggaat ccaaacgggt cgcacccacc tgccaggctg ccacccgcaa tccgcaacag 2880
ggaaaccggg cacagcccac aaccacaaga tgagcagctg cggcgacagc gtcaggcccg 2940
gtgtcggtgt tagggatggc accctttggc tccccgtatc cgtccccgcg acaaaaaaat 3000
ttcccgcggg gattcccacg aactcttgcg agagacattt cttccccatc cccgttcccc 3060
acggggataa atccccatcg gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagcttcgg 3120
tccgcggcca gcttgctaac ccgggccccc cctcgaggtc atcacatcaa tccacttgct 3180
ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat 3240
ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat 3300
ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg 3360
ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaattgccc 3420
tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta gacaagcgtg tcgtgctcca 3480
ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa gagactctgt atgaactgtt 3540
cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg aatctttgac tccatggacg 3600
gtatcgataa gctagcttga tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac 3660
gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc 3720
agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc 3780
ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag 3840
gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc ctttggtctt ctgagactgt 3900
atctttgata tttttggagt agacaagcgt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt 3960
cttcttgtca ttgagtcgta agagactctg tatgaactgt tcgccagtct ttacggcgag 4020
ttctgttagg tcctctattt gaatctttga ctccatgatc gaattatcac atcaatccac 4080
ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg 4140
tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg atggcctttc ctttatcgca 4200
atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc ttcacaataa agtgacagat 4260
agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc ctttgttgaa aagtctcaat 4320
tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg gagtagacaa gcgtgtcgtg 4380
ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt cgtaagagac tctgtatgaa 4440
ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct atttgaatct ttgactccat 4500
gggaattcct gcagcccggg atctaggagc ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt 4560
cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata 4620
ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata tatttaaact 4680
ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt agagaatcat 4740
ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa caggactcta 4800
cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat 4860
ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa tggtttttat 4920
agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt aagaaaacta 4980
aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata aaataaagtg 5040
actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg 5100
tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca 5160
gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg 5220
cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc 5280
agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc 5340
tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc 5400
gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg 5460
gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa 5520
ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc 5580
catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt 5640
tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat 5700
tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga 5760
cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct 5820
ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc 5880
ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt 5940
caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata 6000
gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 6060
gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg 6120
tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg 6180
tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta 6240
agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc 6300
atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat 6360
tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga tgatggcata 6420
tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt 6480
actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag gtcgaccgcc 6540
ggggatccac acgacaccat ggctattgag gttaagccta tcaacgcaga ggatacctat 6600
gaccttaggc atagagtgct cagaccaaac cagcctatcg aagcctgcat gtttgagtct 6660
gaccttacta ggagtgcatt tcaccttggt ggattctacg gaggtaaact gatttccgtg 6720
gcttcattcc accaagctga gcactctgaa cttcaaggta agaagcagta ccagcttaga 6780
ggtgtggcta ccttggaagg ttatagagag cagaaggctg gttccagtct cgtgaaacac 6840
gctgaagaga ttctcagaaa gagaggtgct gacatgatct ggtgtaatgc caggacatct 6900
gcttcaggat actacaggaa gttgggattc agtgagcaag gagaggtgtt cgatactcct 6960
ccagttggac ctcacatcct gatgtataag aggatcacat aactagctag tcagttaacc 7020
tagacttgtc catcttctgg attggccaac ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac 7080
acatagtgac atgctaatca ctataatgtg ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta 7140
ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc atccatattt cttatcctaa atgaatgtca 7200
cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga tgcatttcat taaccaaatc catatacata 7260
taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt 7320
gtgttttgcg aattcagtac attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg 7380
tcaatttg 7388
<210>4
<211>9425
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的右和左连接边缘和内部转基因
<221>misc_feature
<222>9377，9378，9379，9380，9381，9382
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>9377，9378，9379，9380，9381，9382
<223>n＝A，T，C或G
<400>4
atgaaaaagt ccaagtcgag caagggtacg taccgcggcc ggcggctaat tacggaggac 60
atgtcgtagt agctggtagt aaattaacac acgcgtacga gtagcggagt taaatggggg 120
catgcatgca gcaggacgtg gtattagtaa gcttactact ctagctttat ccatccatcc 180
atcgcgctag ctggctgcag gcacgggtta tcttatcttg tcgtccagag gacgacacac 240
ggccggccgg tgaagtaaaa gggagtaatc ttattttgcc aggacgaggg gcggtacatg 300
atattacaca cgtaccatgc atgcatatat gcatggacaa ggtacgtcgt cgtcgatcga 360
cgtcgatgca tatgtgtgta tgtatgtacg tgcataatgc atggtaccag ctgctggctt 420
atatatattt gtcaccgatc gatgcatgct gctgctctac acggtttgac actttaattt 480
gactcatcga tgaccttgct agatagtagc ggctcgtcaa ttaatgagcc atcaagttaa 540
caagagggca cgggcttgcg cgactgattc caccttatta acatacgccc tgcgcccgcg 600
cgtgctgtac gtacgagaat ttcgaattac attaattcaa agctgtgtat gtatgtatat 660
atatatgtgc gtttttttgt gtgtgtatgt ctctttgctt ggtctttctc tatcgatccc 720
cctctttgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta 780
agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac gtttggaact 840
gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agcaagctgg gccccccctc gaggtcggcc 900
gcattcgcaa aacacaccta gactagattt gttttgctaa cccaattgat attaattata 960
tatgattaat atttatatgt atatggattt ggttaatgaa atgcatctgg ttcatcaaag 1020
aattataaag acacgtgaca ttcatttagg ataagaaata tggatgatct ctttctcttt 1080
tattcagata actagtaatt acacataaca cacaactttg atgcccacat tatagtgatt 1140
agcatgtcac tatgtgtgca tccttttatt tcatacatta attaagttgg ccaatccaga 1200
agatggacaa gtctaggtta actgactagc tagtcagtac acagtcctgc catcaccatc 1260
caggatcata tccttgaaag ccccaccact agggatcata ggcaacacat gctcctggtg 1320
tgggacgatt atatccaaga ggtacggccc tggagtctcg agcatcttct ttatcgctgc 1380
gcggacttcg ttcttctttg tcacacggac cgctggaatg ttgaaccctt tggcgatcgt 1440
cacgaaatct ggatatatct cactttcatt ctctgggttt cccaagtatg tgtgcgctct 1500
gttggcctta tagaacctgt cctccaactg caccaccatc cccaggtgct ggttgtttag 1560
cacaaagacc ttcaccggga ggttctcaat tcggatcata gctagctcct gaacgttcat 1620
gagaaagcta ccatctccat cgatgtcaac aacagtgaca cctgggttgg ccacagaagc 1680
accagcagca gccggcaaac caaatcccat agccccaaga ccagctgaag acaaccactg 1740
ccttggccgc ttgtaagtgt agtactgtgc cgcccacatc tggtgctgcc caacacctgt 1800
gccgatgatg gcctcgcctt tcgtcagctc atcaagaacc tgaatagcat attgtggctg 1860
gatctcctca ttagatgttt tatacccaag ggggaattcc ctcttctgct gatccaactc 1920
atcgttccat gagccaaagt caaagctctt ctttgatgtg cttccttcaa gaagagcatt 1980
catgccctgc aaagcaagct taacatctgc acagatggac acatgtggct gcttgttctt 2040
gccaatctca gccggatcaa tatcaacgtg cacaatctta gccctgcttg caaaagcctc 2100
aatcttccct gtcacgcgat catcaaaccg cacaccaagt gcaagcaaca gatcggcctt 2160
atccactgca taatttgcat acaccgtccc atgcatacct agcatgcgca gagacagtgg 2220
gtcgtcgctg gggaagttgc cgaggcccat aagagtagtt gtgaccggga ttccagtcag 2280
ctccacaaag cgtcgcaact cctcaccaga tgctgcgcag ccaccgccca cataaagaac 2340
agggcgccgc gattcaccaa caagacgcag cacctgctca agcaactcag tcgcaggggg 2400
cttgggaagg cgcgcaatgt acccaggcag actcatgggc ttgtcccaga caggcaccgc 2460
catctgctgc tggatgtcct tggggatgtc gacaagcacc ggccctggtc gaccagagga 2520
ggcgaggaag aaagcctcct gcacgacgcg ggggatgtcg tcgacgtcga ggaccaggta 2580
gttgtgcttg gtgatggagc gggtgacctc gacgatgggc gtctcctgga aggcgtcggt 2640
gccaatcatg cgtcgcgcca cctgtcccgt gatggcgacc atggggacgg aatcgagcag 2700
cgcgtcggcg agcgcggaga ctaggttggt ggcgccgggg ccggaggtgg cgatgcagac 2760
gccgacgcgg cccgaggagc gcgcgtagcc ggaggcggca aaggcctccc cttgctcgtg 2820
gcggaagagg tggttggcga tgacggggga gcgggtgagt gcctggtgga tctccatgga 2880
cgcgccgccg gggtaggcga agacgtcgcg gacgccgcag cgctcgaggg actcgacgag 2940
gatgtcagca cccttgcggg gctcggtggg gccccacggc cggagcgggg tggccggggg 3000
agccatcggc atggcgggtg acgccgctga gcacctgatg ggcgcggcga gggcgcggcg 3060
ggtggccagg aggtgcgccc ggcgcctcgc cttgggcgca gcggtagtgg cgccagtgag 3120
cgcggtagac gcggcggcgg cggtggccat ggttgcggcg gctgtctcgg aggcggcgcg 3180
agggtttggg gtgggtgcca cggacacgga gtgggagaaa gggggatgtg cgtggaggcc 3240
tccctgcttt tgttcagagg atgtgtggct cagatggtga tgggaatggg actcgcaaga 3300
cgacgacgac acgtccgtcg cccgaatacg tacacgctac agaccggacg gtggggcctg 3360
tcgacgtggg accacgtgtc ggcctggatt acaaacagtg gtgtccaccg agtgctggta 3420
cacgacagcg tgcgtcaagg aaggttttga actgttccgt taaaaaaaga ggggagattt 3480
tggacttgac tgtggacgac ggtgcatgtc atcggagtac agacggtact gacacaaggg 3540
gcccagacaa gggaatccaa acgggtcgca cccacctgcc aggctgccac ccgcaatccg 3600
caacagggaa accgggcaca gcccacaacc acaagatgag cagctgcggc gacagcgtca 3660
ggcccggtgt cggtgttagg gatggcaccc tttggctccc cgtatccgtc cccgcgacaa 3720
aaaaatttcc cgcggggatt cccacgaact cttgcgagag acatttcttc cccatccccg 3780
ttccccacgg ggataaatcc ccatcgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 3840
cttcggtccg cggccagctt gctaacccgg gccccccctc gaggtcatca catcaatcca 3900
cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg 3960
gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttcaac gatggccttt cctttatcgc 4020
aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct tttccactat cttcacaata aagtgacaga 4080
tagctgggca atggaatccg aggaggtttc cggatattac cctttgttga aaagtctcaa 4140
ttgccctttg gtcttctgag actgtatctt tgatattttt ggagtagaca agcgtgtcgt 4200
gctccaccat gttgacgaag attttcttct tgtcattgag tcgtaagaga ctctgtatga 4260
actgttcgcc agtctttacg gcgagttctg ttaggtcctc tatttgaatc tttgactcca 4320
tggacggtat cgataagcta gcttgatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt 4380
tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact 4440
gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtagga 4500
gccaccttcc ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc 4560
gaggaggttt ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca attgcccttt ggtcttctga 4620
gactgtatct ttgatatttt tggagtagac aagcgtgtcg tgctccacca tgttgacgaa 4680
gattttcttc ttgtcattga gtcgtaagag actctgtatg aactgttcgc cagtctttac 4740
ggcgagttct gttaggtcct ctatttgaat ctttgactcc atgatcgaat tatcacatca 4800
atccacttgc tttgaagacg tggttggaac gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg 4860
tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt 4920
atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc ttccttttcc actatcttca caataaagtg 4980
acagatagct gggcaatgga atccgaggag gtttccggat attacccttt gttgaaaagt 5040
ctcaattgcc ctttggtctt ctgagactgt atctttgata tttttggagt agacaagcgt 5100
gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt cttcttgtca ttgagtcgta agagactctg 5160
tatgaactgt tcgccagtct ttacggcgag ttctgttagg tcctctattt gaatctttga 5220
ctccatggga attcctgcag cccgggatct aggagcttgc atgcctgcag tgcagcgtga 5280
cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac 5340
cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt 5400
taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag 5460
aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg 5520
actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc 5580
acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt 5640
ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga 5700
aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat 5760
aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt 5820
ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac 5880
caaccagcga accagcagcg tcgcgtcggg ccaagcgaag cagacggcac ggcatctctg 5940
tcgctgcctc tggacccctc tcgagagttc cgctccaccg ttggacttgc tccgctgtcg 6000
gcatccagaa attgcgtggc ggagcggcag acgtgagccg gcacggcagg cggcctcctc 6060
ctcctctcac ggcaccggca gctacggggg attcctttcc caccgctcct tcgctttccc 6120
ttcctcgccc gccgtaataa atagacaccc cctccacacc ctctttcccc aacctcgtgt 6180
tgttcggagc gcacacacac acaaccagat ctcccccaaa tccacccgtc ggcacctccg 6240
cttcaaggta cgccgctcgt cctccccccc ccccctctct accttctcta gatcggcgtt 6300
ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt 6360
ttgtgttaga tccgtgctgc tagcgttcgt acacggatgc gacctgtacg tcagacacgt 6420
tctgattgct aacttgccag tgtttctctt tggggaatcc tgggatggct ctagccgttc 6480
cgcagacggg atcgatttca tgattttttt tgtttcgttg catagggttt ggtttgccct 6540
tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt 6600
tttgtcttgg ttgtgatgat gtggtctggt tgggcggtcg ttctagatcg gagtagaatt 6660
ctgtttcaaa ctacctggtg gatttattaa ttttggatct gtatgtgtgt gccatacata 6720
ttcatagtta cgaattgaag atgatggatg gaaatatcga tctaggatag gtatacatgt 6780
tgatgcgggt tttactgatg catatacaga gatgcttttt gttcgcttgg ttgtgatgat 6840
gtggtgtggt tgggcggtcg ttcattcgtt ctagatcgga gtagaatact gtttcaaact 6900
acctggtgta tttattaatt ttggaactgt atgtgtgtgt catacatctt catagttacg 6960
agtttaagat ggatggaaat atcgatctag gataggtata catgttgatg tgggttttac 7020
tgatgcatat acatgatggc atatgcagca tctattcata tgctctaacc ttgagtacct 7080
atctattata ataaacaagt atgttttata attattttga tcttgatata cttggatgat 7140
ggcatatgca gcagctatat gtggattttt ttagccctgc cttcatacgc tatttatttg 7200
cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg 7260
accgccgggg atccacacga caccatggct attgaggtta agcctatcaa cgcagaggat 7320
acctatgacc ttaggcatag agtgctcaga ccaaaccagc ctatcgaagc ctgcatgttt 7380
gagtctgacc ttactaggag tgcatttcac cttggtggat tctacggagg taaactgatt 7440
tccgtggctt cattccacca agctgagcac tctgaacttc aaggtaagaa gcagtaccag 7500
cttagaggtg tggctacctt ggaaggttat agagagcaga aggctggttc cagtctcgtg 7560
aaacacgctg aagagattct cagaaagaga ggtgctgaca tgatctggtg taatgccagg 7620
acatctgctt caggatacta caggaagttg ggattcagtg agcaaggaga ggtgttcgat 7680
actcctccag ttggacctca catcctgatg tataagagga tcacataact agctagtcag 7740
ttaacctaga cttgtccatc ttctggattg gccaacttaa ttaatgtatg aaataaaagg 7800
atgcacacat agtgacatgc taatcactat aatgtgggca tcaaagttgt gtgttatgtg 7860
taattactag ttatctgaat aaaagagaaa gagatcatcc atatttctta tcctaaatga 7920
atgtcacgtg tctttataat tctttgatga accagatgca tttcattaac caaatccata 7980
tacatataaa tattaatcat atataattaa tatcaattgg gttagcaaaa caaatctagt 8040
ctaggtgtgt tttgcgaatt cagtacatta aaaacgtccg caatgtgtta ttaagttgtc 8100
taagcgtcaa tttgctgtac atgtaaccag ctttcctaga aaaaaaacac agtaatattt 8160
acagtataca ataatgctca ttgattagat ccaaaattat gaaatgtata tattttttgc 8220
cataactttt attacagtct tatactgaag taaagttgta tcacgtcatg aacatagaat 8280
aagactgaga tagttgacta atccagtcat atcctatagt acactagtaa ggtgcatgtg 8340
ctaacaatat gacaaatcta gtatttcttt atagtttatc atccataaat cgcaaaatac 8400
ctaagcataa ttttatttga atagagagag tactgcccgt tattgtatga ggtaatgact 8460
tccatatata caacatagtc ataagaacac aattatgaaa aaaatctatt taaaattgaa 8520
atgcgttgag atcttgtctt gcatactaaa catagtaaat ataaattaat gcataaatga 8580
ctgttataac agacaatgct ggtgacaata gacaatgtac tgaatctaac tggatacgta 8640
ggatgctgct atcttattca ctcatagtta ttcagatagt ggtcattctt tttgacccat 8700
agaaaactgt gtgctataat acaccaaaag gaaagcaaag tgaaaaggaa actttgaata 8760
gccaagaaga ctcggagtgc ttcacgcctt cacctatccc acataggtga tgagctaaga 8820
gtaaaatgta gattctctcg agtactgaat attgcctgca cttttccttg cagtaaatac 8880
acctttaatc catgacgaga gtccactctt tgagtccgtc ttgagattct tccattgatc 8940
atacaacatg acctcgaagt cctgatggag aacaacttat ataattaaaa ctacaataca 9000
gaaagttcct gacaattaaa acctttggtg gtggcatgcc gtaggttaaa aaaaatagat 9060
aatgacaaca caactggaga cacgctcttt gccgagtgct cacacgtttg ctgagagcga 9120
gcactcggca aatatatgat ttgccgaata ccaccctcct cggcaaaaca atacactagg 9180
caaaaaggta gtttcccatc accatgatgc ccgccgttaa tgtaccttct atgccgagta 9240
tgttggcgct cagcaaagag atcgttaccg gcgtttgttt caccaagagc tctttgacga 9300
gtgtggcaca cgacaaaacc ttttgccgag tgtaattagt cgtttgccaa gtgactggtg 9360
cagttggcaa aggagtnnnn nnttatgtgt gggcaaaatg atatatggtg ccagttaggg 9420
ctagc 9425
<210>5
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的右基因组边缘(10nt)/内部转基因(10nt)
<400>5
tccccctctt tgatagttta 20
<210>6
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的左基因组边缘(10nt)/内部转基因(10nt)
<400>6
cgtcaatttg ctgtacatgt 20
<210>7
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的右基因组边缘(20nt)/内部转基因(20nt)
<400>7
tctctatcga tccccctctt tgatagttta aactgaaggc 40
<210>8
<211>40
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的左基因组边缘(20nt)/内部转基因(20nt)
<400>8
gttgtctaag cgtcaatttg ctgtacatgt aaccagcttt 40
<210>9
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的右基因组边缘(30nt)/内部转基因(30nt)
<400>9
gcttggtctt tctctatcga tccccctctt tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac 60
<210>10
<211>60
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的左基因组边缘(30nt)/内部转基因(30nt)
<400>10
gtgttattaa gttgtctaag cgtcaatttg ctgtacatgt aaccagcttt cctagaaaaa 60
<210>11
<211>8699
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的左基因组边缘和全部内部转基因
<221>misc_feature
<222>8651，8652，8653，8654，8655，8656
<223>n＝A，T，C或G
<221>misc_feature
<222>8651，8652，8653，8654，8655，8656
<223>n＝A，T，C或G
<400>11
tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag 60
tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga 120
accgcaacgt tgaaggagcc actcagcaag ctgggccccc cctcgaggtc ggccgcattc 180
gcaaaacaca cctagactag atttgttttg ctaacccaat tgatattaat tatatatgat 240
taatatttat atgtatatgg atttggttaa tgaaatgcat ctggttcatc aaagaattat 300
aaagacacgt gacattcatt taggataaga aatatggatg atctctttct cttttattca 360
gataactagt aattacacat aacacacaac tttgatgccc acattatagt gattagcatg 420
tcactatgtg tgcatccttt tatttcatac attaattaag ttggccaatc cagaagatgg 480
acaagtctag gttaactgac tagctagtca gtacacagtc ctgccatcac catccaggat 540
catatccttg aaagccccac cactagggat cataggcaac acatgctcct ggtgtgggac 600
gattatatcc aagaggtacg gccctggagt ctcgagcatc ttctttatcg ctgcgcggac 660
ttcgttcttc tttgtcacac ggaccgctgg aatgttgaac cctttggcga tcgtcacgaa 720
atctggatat atctcacttt cattctctgg gtttcccaag tatgtgtgcg ctctgttggc 780
cttatagaac ctgtcctcca actgcaccac catccccagg tgctggttgt ttagcacaaa 840
gaccttcacc gggaggttct caattcggat catagctagc tcctgaacgt tcatgagaaa 900
gctaccatct ccatcgatgt caacaacagt gacacctggg ttggccacag aagcaccagc 960
agcagccggc aaaccaaatc ccatagcccc aagaccagct gaagacaacc actgccttgg 1020
ccgcttgtaa gtgtagtact gtgccgccca catctggtgc tgcccaacac ctgtgccgat 1080
gatggcctcg cctttcgtca gctcatcaag aacctgaata gcatattgtg gctggatctc 1140
ctcattagat gttttatacc caagggggan ttccctcttc tgctgatcca actcatcgtt 1200
ccatgagcca aagtcaaagc tcttctttga tgtgcttcct tcaagaagag cattcatgcc 1260
ctgcaaagca agcttaacat ctgcacagat ggacacatgt ggctgcttgt tcttgccaat 1320
ctcagccgga tcaatatcaa cgtgcacaat cttagccctg cttgcaaaag cctcaatctt 1380
ccctgtcacg cgatcatcaa accgcacacc aagtgcaagc aacagatcgg ccttatccac 1440
tgcataattt gcatacaccg tcccatgcat acctagcatg cgcagagaca gtgggtcgtc 1500
gctggggaag ttgccgaggc ccataagagt agttgtgacc gggattccag tcagctccac 1560
aaagcgtcgc aactcctcac cagatgctgc gcagccaccg cccacataaa gaacagggcg 1620
ccgcgattca ccaacaagac gcagcacctg ctcaagcaac tcagtcgcag ggggcttggg 1680
aaggcgcgca atgtacccag gcagactcat gggcttgtcc cagacaggca ccgccatctg 1740
ctgctggatg tccttgggga tgtcgacaag caccggccct ggtcgaccag aggaggcgag 1800
gaagaaagcc tcctgcacga cgcgggggat gtcgtcgacg tcgaggacca ggtagttgtg 1860
cttggtgatg gagcgggtga cctcgacgat gggcgtctcc tggaaggcgt cggtgccaat 1920
catgcgtcgc gccacctgtc ccgtgatggc gaccatgggg acggaatcga gcagcgcgtc 1980
ggcgagcgcg gagactaggt tggtggcgcc ggggccggag gtggcgatgc agacgccgac 2040
gcggcccgag gagcgcgcgt agccggaggc ggcaaaggcc tccccttgct cgtggcggaa 2100
gaggtggttg gcgatgacgg gggagcgggt gagtgcctgg tggatctcca tggacgcgcc 2160
gccggggtag gcgaagacgt cgcggacgcc gcagcgctcg agggactcga cgaggatgtc 2220
agcacccttg cggggctcgg tggggcccca cggccggagc ggggtggccg ggggagccat 2280
cggcatggcg ggtgacgccg ctgagcacct gatgggcgcg gcgagggcgc ggcgggtggc 2340
caggaggtgc gcccggcgcc tcgccttggg cgcagcggta gtggcgccag tgagcgcggt 2400
agacgcggcg gcggcggtgg ccatggttgc ggcggctgtc tcggaggcgg cgcgagggtt 2460
tggggtgggt gccacggaca cggagtggga gaaaggggga tgtgcgtgga ggcctccctg 2520
cttttgttca gaggatgtgt ggctcagatg gtgatgggaa tgggactcgc aagacgacga 2580
cgacacgtcc gtcgcccgaa tacgtacacg ctacagaccg gacggtgggg cctgtcgacg 2640
tgggaccacg tgtcggcctg gattacaaac agtggtgtcc accgagtgct ggtacacgac 2700
agcgtgcgtc aaggaaggtt ttgaactgtt ccgttaaaaa aagaggggag attttggact 2760
tgactgtgga cgacggtgca tgtcatcgga gtacagacgg tactgacaca aggggcccag 2820
acaagggaat ccaaacgggt cgcacccacc tgccaggctg ccacccgcaa tccgcaacag 2880
ggaaaccggg cacagcccac aaccacaaga tgagcagctg cggcgacagc gtcaggcccg 2940
gtgtcggtgt tagggatggc accctttggc tccccgtatc cgtccccgcg acaaaaaaat 3000
ttcccgcggg gattcccacg aactcttgcg agagacattt cttccccatc cccgttcccc 3060
acggggataa atccccatcg gggatcctct agagtcgacc tgcaggcatg caagcttcgg 3120
tccgcggcca gcttgctaac ccgggccccc cctcgaggtc atcacatcaa tccacttgct 3180
ttgaagacgt ggttggaacg tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat 3240
ctttgggacc actgtcggca gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat 3300
ggcatttgta ggagccacct tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg 3360
ggcaatggaa tccgaggagg tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaattgccc 3420
tttggtcttc tgagactgta tctttgatat ttttggagta gacaagcgtg tcgtgctcca 3480
ccatgttgac gaagattttc ttcttgtcat tgagtcgtaa gagactctgt atgaactgtt 3540
cgccagtctt tacggcgagt tctgttaggt cctctatttg aatctttgac tccatggacg 3600
gtatcgataa gctagcttga tatcacatca atccacttgc tttgaagacg tggttggaac 3660
gtcttctttt tccacgatgc tcctcgtggg tgggggtcca tctttgggac cactgtcggc 3720
agaggcatct tcaacgatgg cctttccttt atcgcaatga tggcatttgt aggagccacc 3780
ttccttttcc actatcttca caataaagtg acagatagct gggcaatgga atccgaggag 3840
gtttccggat attacccttt gttgaaaagt ctcaattgcc ctttggtctt ctgagactgt 3900
atctttgata tttttggagt agacaagcgt gtcgtgctcc accatgttga cgaagatttt 3960
cttcttgtca ttgagtcgta agagactctg tatgaactgt tcgccagtct ttacggcgag 4020
ttctgttagg tcctctattt gaatctttga ctccatgatc gaattatcac atcaatccac 4080
ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg 4140
tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg atggcctttc ctttatcgca 4200
atgatggcat ttgtaggagc caccttcctt ttccactatc ttcacaataa agtgacagat 4260
agctgggcaa tggaatccga ggaggtttcc ggatattacc ctttgttgaa aagtctcaat 4320
tgccctttgg tcttctgaga ctgtatcttt gatatttttg gagtagacaa gcgtgtcgtg 4380
ctccaccatg ttgacgaaga ttttcttctt gtcattgagt cgtaagagac tctgtatgaa 4440
ctgttcgcca gtctttacgg cgagttctgt taggtcctct atttgaatct ttgactccat 4500
gggaattcct gcagcccggg atctaggagc ttgcatgcct gcagtgcagc gtgacccggt 4560
cgtgcccctc tctagagata atgagcattg catgtctaag ttataaaaaa ttaccacata 4620
ttttttttgt cacacttgtt tgaagtgcag tttatctatc tttatacata tatttaaact 4680
ttactctacg aataatataa tctatagtac tacaataata tcagtgtttt agagaatcat 4740
ataaatgaac agttagacat ggtctaaagg acaattgagt attttgacaa caggactcta 4800
cagttttatc tttttagtgt gcatgtgttc tccttttttt ttgcaaatag cttcacctat 4860
ataatacttc atccatttta ttagtacatc catttagggt ttagggttaa tggtttttat 4920
agactaattt ttttagtaca tctattttat tctattttag cctctaaatt aagaaaacta 4980
aaactctatt ttagtttttt tatttaataa tttagatata aaatagaata aaataaagtg 5040
actaaaaatt aaacaaatac cctttaagaa attaaaaaaa ctaaggaaac atttttcttg 5100
tttcgagtag ataatgccag cctgttaaac gccgtcgacg agtctaacgg acaccaacca 5160
gcgaaccagc agcgtcgcgt cgggccaagc gaagcagacg gcacggcatc tctgtcgctg 5220
cctctggacc cctctcgaga gttccgctcc accgttggac ttgctccgct gtcggcatcc 5280
agaaattgcg tggcggagcg gcagacgtga gccggcacgg caggcggcct cctcctcctc 5340
tcacggcacc ggcagctacg ggggattcct ttcccaccgc tccttcgctt tcccttcctc 5400
gcccgccgta ataaatagac accccctcca caccctcttt ccccaacctc gtgttgttcg 5460
gagcgcacac acacacaacc agatctcccc caaatccacc cgtcggcacc tccgcttcaa 5520
ggtacgccgc tcgtcctccc ccccccccct ctctaccttc tctagatcgg cgttccggtc 5580
catggttagg gcccggtagt tctacttctg ttcatgtttg tgttagatcc gtgtttgtgt 5640
tagatccgtg ctgctagcgt tcgtacacgg atgcgacctg tacgtcagac acgttctgat 5700
tgctaacttg ccagtgtttc tctttgggga atcctgggat ggctctagcc gttccgcaga 5760
cgggatcgat ttcatgattt tttttgtttc gttgcatagg gtttggtttg cccttttcct 5820
ttatttcaat atatgccgtg cacttgtttg tcgggtcatc ttttcatgct tttttttgtc 5880
ttggttgtga tgatgtggtc tggttgggcg gtcgttctag atcggagtag aattctgttt 5940
caaactacct ggtggattta ttaattttgg atctgtatgt gtgtgccata catattcata 6000
gttacgaatt gaagatgatg gatggaaata tcgatctagg ataggtatac atgttgatgc 6060
gggttttact gatgcatata cagagatgct ttttgttcgc ttggttgtga tgatgtggtg 6120
tggttgggcg gtcgttcatt cgttctagat cggagtagaa tactgtttca aactacctgg 6180
tgtatttatt aattttggaa ctgtatgtgt gtgtcataca tcttcatagt tacgagttta 6240
agatggatgg aaatatcgat ctaggatagg tatacatgtt gatgtgggtt ttactgatgc 6300
atatacatga tggcatatgc agcatctatt catatgctct aaccttgagt acctatctat 6360
tataataaac aagtatgttt tataattatt ttgatcttga tatacttgga tgatggcata 6420
tgcagcagct atatgtggat ttttttagcc ctgccttcat acgctattta tttgcttggt 6480
actgtttctt ttgtcgatgc tcaccctgtt gtttggtgtt acttctgcag gtcgaccgcc 6540
ggggatccac acgacaccat ggctattgag gttaagccta tcaacgcaga ggatacctat 6600
gaccttaggc atagagtgct cagaccaaac cagcctatcg aagcctgcat gtttgagtct 6660
gaccttacta ggagtgcatt tcaccttggt ggattctacg gaggtaaact gatttccgtg 6720
gcttcattcc accaagctga gcactctgaa cttcaaggta agaagcagta ccagcttaga 6780
ggtgtggcta ccttggaagg ttatagagag cagaaggctg gttccagtct cgtgaaacac 6840
gctgaagaga ttctcagaaa gagaggtgct gacatgatct ggtgtaatgc caggacatct 6900
gcttcaggat actacaggaa gttgggattc agtgagcaag gagaggtgtt cgatactcct 6960
ccagttggac ctcacatcct gatgtataag aggatcacat aactagctag tcagttaacc 7020
tagacttgtc catcttctgg attggccaac ttaattaatg tatgaaataa aaggatgcac 7080
acatagtgac atgctaatca ctataatgtg ggcatcaaag ttgtgtgtta tgtgtaatta 7140
ctagttatct gaataaaaga gaaagagatc atccatattt cttatcctaa atgaatgtca 7200
cgtgtcttta taattctttg atgaaccaga tgcatttcat taaccaaatc catatacata 7260
taaatattaa tcatatataa ttaatatcaa ttgggttagc aaaacaaatc tagtctaggt 7320
gtgttttgcg aattcagtac attaaaaacg tccgcaatgt gttattaagt tgtctaagcg 7380
tcaatttgct gtacatgtaa ccagctttcc tagaaaaaaa acacagtaat atttacagta 7440
tacaataatg ctcattgatt agatccaaaa ttatgaaatg tatatatttt ttgccataac 7500
ttttattaca gtcttatact gaagtaaagt tgtatcacgt catgaacata gaataagact 7560
gagatagttg actaatccag tcatatccta tagtacacta gtaaggtgca tgtgctaaca 7620
atatgacaaa tctagtattt ctttatagtt tatcatccat aaatcgcaaa atacctaagc 7680
ataattttat ttgaatagag agagtactgc ccgttattgt atgaggtaat gacttccata 7740
tatacaacat agtcataaga acacaattat gaaaaaaatc tatttaaaat tgaaatgcgt 7800
tgagatcttg tcttgcatac taaacatagt aaatataaat taatgcataa atgactgtta 7860
taacagacaa tgctggtgac aatagacaat gtactgaatc taactggata cgtaggatgc 7920
tgctatctta ttcactcata gttattcaga tagtggtcat tctttttgac ccatagaaaa 7980
ctgtgtgcta taatacacca aaaggaaagc aaagtgaaaa ggaaactttg aatagccaag 8040
aagactcgga gtgcttcacg ccttcaccta tcccacatag gtgatgagct aagagtaaaa 8100
tgtagattct ctcgagtact gaatattgcc tgcacttttc cttgcagtaa atacaccttt 8160
aatccatgac gagagtccac tctttgagtc cgtcttgaga ttcttccatt gatcatacaa 8220
catgacctcg aagtcctgat ggagaacaac ttatataatt aaaactacaa tacagaaagt 8280
tcctgacaat taaaaccttt ggtggtggca tgccgtaggt taaaaaaaat agataatgac 8340
aacacaactg gagacacgct ctttgccgag tgctcacacg tttgctgaga gcgagcactc 8400
ggcaaatata tgatttgccg aataccaccc tcctcggcaa aacaatacac taggcaaaaa 8460
ggtagtttcc catcaccatg atgcccgccg ttaatgtacc ttctatgccg agtatgttgg 8520
cgctcagcaa agagatcgtt accggcgttt gtttcaccaa gagctctttg acgagtgtgg 8580
cacacgacaa aaccttttgc cgagtgtaat tagtcgtttg ccaagtgact ggtgcagttg 8640
gcaaaggagt nnnnnnttat gtgtgggcaa aatgatatat ggtgccagtt agggctagc 8699
<210>12
<211>8114
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中的右基因组边缘和全部内部转基因
<400>12
atgaaaaagt ccaagtcgag caagggtacg taccgcggcc ggcggctaat tacggaggac 60
atgtcgtagt agctggtagt aaattaacac acgcgtacga gtagcggagt taaatggggg 120
catgcatgca gcaggacgtg gtattagtaa gcttactact ctagctttat ccatccatcc 180
atcgcgctag ctggctgcag gcacgggtta tcttatcttg tcgtccagag gacgacacac 240
ggccggccgg tgaagtaaaa gggagtaatc ttattttgcc aggacgaggg gcggtacatg 300
atattacaca cgtaccatgc atgcatatat gcatggacaa ggtacgtcgt cgtcgatcga 360
cgtcgatgca tatgtgtgta tgtatgtacg tgcataatgc atggtaccag ctgctggctt 420
atatatattt gtcaccgatc gatgcatgct gctgctctac acggtttgac actttaattt 480
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caagagggca cgggcttgcg cgactgattc caccttatta acatacgccc tgcgcccgcg 600
cgtgctgtac gtacgagaat ttcgaattac attaattcaa agctgtgtat gtatgtatat 660
atatatgtgc gtttttttgt gtgtgtatgt ctctttgctt ggtctttctc tatcgatccc 720
cctctttgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta 780
agggagtcac gttatgaccc ccgccgatga cgcgggacaa gccgttttac gtttggaact 840
gacagaaccg caacgttgaa ggagccactc agcaagctgg gccccccctc gaggtcggcc 900
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tatgattaat atttatatgt atatggattt ggttaatgaa atgcatctgg ttcatcaaag 1020
aattataaag acacgtgaca ttcatttagg ataagaaata tggatgatct ctttctcttt 1080
tattcagata actagtaatt acacataaca cacaactttg atgcccacat tatagtgatt 1140
agcatgtcac tatgtgtgca tccttttatt tcatacatta attaagttgg ccaatccaga 1200
agatggacaa gtctaggtta actgactagc tagtcagtac acagtcctgc catcaccatc 1260
caggatcata tccttgaaag ccccaccact agggatcata ggcaacacat gctcctggtg 1320
tgggacgatt atatccaaga ggtacggccc tggagtctcg agcatcttct ttatcgctgc 1380
gcggacttcg ttcttctttg tcacacggac cgctggaatg ttgaaccctt tggcgatcgt 1440
cacgaaatct ggatatatct cactttcatt ctctgggttt cccaagtatg tgtgcgctct 1500
gttggcctta tagaacctgt cctccaactg caccaccatc cccaggtgct ggttgtttag 1560
cacaaagacc ttcaccggga ggttctcaat tcggatcata gctagctcct gaacgttcat 1620
gagaaagcta ccatctccat cgatgtcaac aacagtgaca cctgggttgg ccacagaagc 1680
accagcagca gccggcaaac caaatcccat agccccaaga ccagctgaag acaaccactg 1740
ccttggccgc ttgtaagtgt agtactgtgc cgcccacatc tggtgctgcc caacacctgt 1800
gccgatgatg gcctcgcctt tcgtcagctc atcaagaacc tgaatagcat attgtggctg 1860
gatctcctca ttagatgttt tatacccaag ggggaattcc ctcttctgct gatccaactc 1920
atcgttccat gagccaaagt caaagctctt ctttgatgtg cttccttcaa gaagagcatt 1980
catgccctgc aaagcaagct taacatctgc acagatggac acatgtggct gcttgttctt 2040
gccaatctca gccggatcaa tatcaacgtg cacaatctta gccctgcttg caaaagcctc 2100
aatcttccct gtcacgcgat catcaaaccg cacaccaagt gcaagcaaca gatcggcctt 2160
atccactgca taatttgcat acaccgtccc atgcatacct agcatgcgca gagacagtgg 2220
gtcgtcgctg gggaagttgc cgaggcccat aagagtagtt gtgaccggga ttccagtcag 2280
ctccacaaag cgtcgcaact cctcaccaga tgctgcgcag ccaccgccca cataaagaac 2340
agggcgccgc gattcaccaa caagacgcag cacctgctca agcaactcag tcgcaggggg 2400
cttgggaagg cgcgcaatgt acccaggcag actcatgggc ttgtcccaga caggcaccgc 2460
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gttgtgcttg gtgatggagc gggtgacctc gacgatgggc gtctcctgga aggcgtcggt 2640
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gatgtcagca cccttgcggg gctcggtggg gccccacggc cggagcgggg tggccggggg 3000
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cacgacagcg tgcgtcaagg aaggttttga actgttccgt taaaaaaaga ggggagattt 3480
tggacttgac tgtggacgac ggtgcatgtc atcggagtac agacggtact gacacaaggg 3540
gcccagacaa gggaatccaa acgggtcgca cccacctgcc aggctgccac ccgcaatccg 3600
caacagggaa accgggcaca gcccacaacc acaagatgag cagctgcggc gacagcgtca 3660
ggcccggtgt cggtgttagg gatggcaccc tttggctccc cgtatccgtc cccgcgacaa 3720
aaaaatttcc cgcggggatt cccacgaact cttgcgagag acatttcttc cccatccccg 3780
ttccccacgg ggataaatcc ccatcgggga tcctctagag tcgacctgca ggcatgcaag 3840
cttcggtccg cggccagctt gctaacccgg gccccccctc gaggtcatca catcaatcca 3900
cttgctttga agacgtggtt ggaacgtctt ctttttccac gatgctcctc gtgggtgggg 3960
gtccatcttt gggaccactg tcggcagagg catcttcaac gatggccttt cctttatcgc 4020
aatgatggca tttgtaggag ccaccttcct tttccactat cttcacaata aagtgacaga 4080
tagctgggca atggaatccg aggaggtttc cggatattac cctttgttga aaagtctcaa 4140
ttgccctttg gtcttctgag actgtatctt tgatattttt ggagtagaca agcgtgtcgt 4200
gctccaccat gttgacgaag attttcttct tgtcattgag tcgtaagaga ctctgtatga 4260
actgttcgcc agtctttacg gcgagttctg ttaggtcctc tatttgaatc tttgactcca 4320
tggacggtat cgataagcta gcttgatatc acatcaatcc acttgctttg aagacgtggt 4380
tggaacgtct tctttttcca cgatgctcct cgtgggtggg ggtccatctt tgggaccact 4440
gtcggcagag gcatcttcaa cgatggcctt tcctttatcg caatgatggc atttgtagga 4500
gccaccttcc ttttccacta tcttcacaat aaagtgacag atagctgggc aatggaatcc 4560
gaggaggttt ccggatatta ccctttgttg aaaagtctca attgcccttt ggtcttctga 4620
gactgtatct ttgatatttt tggagtagac aagcgtgtcg tgctccacca tgttgacgaa 4680
gattttcttc ttgtcattga gtcgtaagag actctgtatg aactgttcgc cagtctttac 4740
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ctccatggga attcctgcag cccgggatct aggagcttgc atgcctgcag tgcagcgtga 5280
cccggtcgtg cccctctcta gagataatga gcattgcatg tctaagttat aaaaaattac 5340
cacatatttt ttttgtcaca cttgtttgaa gtgcagttta tctatcttta tacatatatt 5400
taaactttac tctacgaata atataatcta tagtactaca ataatatcag tgttttagag 5460
aatcatataa atgaacagtt agacatggtc taaaggacaa ttgagtattt tgacaacagg 5520
actctacagt tttatctttt tagtgtgcat gtgttctcct ttttttttgc aaatagcttc 5580
acctatataa tacttcatcc attttattag tacatccatt tagggtttag ggttaatggt 5640
ttttatagac taattttttt agtacatcta ttttattcta ttttagcctc taaattaaga 5700
aaactaaaac tctattttag tttttttatt taataattta gatataaaat agaataaaat 5760
aaagtgacta aaaattaaac aaataccctt taagaaatta aaaaaactaa ggaaacattt 5820
ttcttgtttc gagtagataa tgccagcctg ttaaacgccg tcgacgagtc taacggacac 5880
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ccggtccatg gttagggccc ggtagttcta cttctgttca tgtttgtgtt agatccgtgt 6360
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tttcctttat ttcaatatat gccgtgcact tgtttgtcgg gtcatctttt catgcttttt 6600
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cttggtactg tttcttttgt cgatgctcac cctgttgttt ggtgttactt ctgcaggtcg 7260
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actcctccag ttggacctca catcctgatg tataagagga tcacataact agctagtcag 7740
ttaacctaga cttgtccatc ttctggattg gccaacttaa ttaatgtatg aaataaaagg 7800
atgcacacat agtgacatgc taatcactat aatgtgggca tcaaagttgt gtgttatgtg 7860
taattactag ttatctgaat aaaagagaaa gagatcatcc atatttctta tcctaaatga 7920
atgtcacgtg tctttataat tctttgatga accagatgca tttcattaac caaatccata 7980
tacatataaa tattaatcat atataattaa tatcaattgg gttagcaaaa caaatctagt 8040
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
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gtccgcaatg tgttattaag ttgtct 26
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<210>24
<211>185
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>包含事件DP-098140-6的内部转基因的3’末端的探针
<400>24
gtctttataa ttctttgatg aaccagatgc atttcattaa ccaaatccat atacatataa 60
atattaatca tatataatta atatcaattg ggttagcaaa acaaatctag tctaggtgtg 120
ttttgcgaat tcagtacatt aaaaacgtcc gcaatgtgtt attaagttgt ctaagcgtca 180
atttg 185
<210>25
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-0-1536
<400>25
aagggtgctg acatcctcgt cgagt 25
<210>26
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-0-1537
<400>26
gtcccatgca tacctagcat gcgca 25
<210>27
<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-0-1538
<400>27
ggataaggcc gatctgttgc ttgca 25
<210>28
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-0-1539
<400>28
tcagtacaca gtcctgccat caccat 26
<210>29
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-0-1541
<400>29
atggctattg aggttaagcc 20
<210>30
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-0-1542
<400>30
cctcttatac atcaggatgt gagg 24
<210>31
<211>931
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Zm-HRA 3’探针
<400>31
tcagtacaca gtcctgccat caccatccag gatcatatcc ttgaaagccc caccactagg 60
gatcataggc aacacatgct cctggtgtgg gacgattata tccaagaggt acggccctgg 120
agtctcgagc atcttcttta tcgctgcgcg gacttcgttc ttctttgtca cacggaccgc 180
tggaatgttg aaccctttgg cgatcgtcac gaaatctgga tatatctcac tttcattctc 240
tgggtttccc aagtatgtgt gcgctctgtt ggccttatag aacctgtcct ccaactgcac 300
caccatcccc aggtgctggt tgtttagcac aaagaccttc accgggaggt tctcaattcg 360
gatcatagct agctcctgaa cgttcatgag aaagctacca tctccatcga tgtcaacaac 420
agtgacacct gggttggcca cagaagcacc agcagcagcc ggcaaaccaa atcccatagc 480
cccaagacca gctgaagaca accactgcct tggccgcttg taagtgtagt actgtgccgc 540
ccacatctgg tgctgcccaa cacctgtgcc gatgatggcc tcgcctttcg tcagctcatc 600
aagaacctga atagcatatt gtggctggat ctcctcatta gatgttttat acccaagggg 660
gaattccctc ttctgctgat ccaactcatc gttccatgag ccaaagtcaa agctcttctt 720
tgatgtgctt ccttcaagaa gagcattcat gccctgcaaa gcaagcttaa catctgcaca 780
gatggacaca tgtggctgct tgttcttgcc aatctcagcc ggatcaatat caacgtgcac 840
aatcttagcc ctgcttgcaa aagcctcaat cttccctgtc acgcgatcat caaaccgcac 900
accaagtgca agcaacagat cggccttatc c 931
<210>32
<211>770
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>Zm-HRA 5’探针
<400>32
gtcccatgca tacctagcat gcgcagagac agtgggtcgt cgctggggaa gttgccgagg 60
cccataagag tagttgtgac cgggattcca gtcagctcca caaagcgtcg caactcctca 120
ccagatgctg cgcagccacc gcccacataa agaacagggc gccgcgattc accaacaaga 180
cgcagcacct gctcaagcaa ctcagtcgca gggggcttgg gaaggcgcgc aatgtaccca 240
ggcagactca tgggcttgtc ccagacaggc accgccatct gctgctggat gtccttgggg 300
atgtcgacaa gcaccggccc tggtcgacca gaggaggcga ggaagaaagc ctcctgcacg 360
acgcggggga tgtcgtcgac gtcgaggacc aggtagttgt gcttggtgat ggagcgggtg 420
acctcgacga tgggcgtctc ctggaaggcg tcggtgccaa tcatgcgtcg cgccacctgt 480
cccgtgatgg cgaccatggg gacggaatcg agcagcgcgt cggcgagcgc ggagactagg 540
ttggtggcgc cggggccgga ggtggcgatg cagacgccga cgcggcccga ggagcgcgcg 600
tagccggagg cggcaaaggc ctccccttgc tcgtggcgga agaggtggtt ggcgatgacg 660
ggggagcggg tgagtgcctg gtggatctcc atggacgcgc cgccggggta ggcgaagacg 720
tcgcggacgc cgcagcgctc gagggactcg acgaggatgt cagcaccctt 770
<210>33
<211>435
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>GAT4621探针
<400>33
atggctattg aggttaagcc tatcaacgca gaggatacct atgaccttag gcatagagtg 60
ctcagaccaa accagcctat cgaagcctgc atgtttgagt ctgaccttac taggagtgca 120
tttcaccttg gtggattcta cggaggtaaa ctgatttccg tggcttcatt ccaccaagct 180
gagcactctg aacttcaagg taagaagcag taccagctta gaggtgtggc taccttggaa 240
ggttatagag agcagaaggc tggttccagt ctcgtgaaac acgctgaaga gattctcaga 300
aagagaggtg ctgacatgat ctggtgtaat gccaggacat ctgcttcagg atactacagg 360
aagttgggat tcagtgagca aggagaggtg ttcgatactc ctccagttgg acctcacatc 420
ctgatgtata agagg 435
<210>34
<211>33
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1779
<400>34
atgaaaaagt ccaagtcgag caagggtacg tac 33
<210>35
<211>32
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1782
<400>35
gctagcccta actggcacca tatatcattt tg 32
<210>36
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1783
<400>36
aactgcacca gtcacttggc aaacgac 27
<210>37
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1877
<400>37
cgtttttttg tgtgtgtatg tctctttgct tggtc 35
<210>38
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1878
<400>38
tgtatgtctc tttgcttggt ctttctctat cgatc 35
<210>39
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1879
<400>39
atgacgtgat acaactttac ttcagtataa gactg 35
<210>40
<211>35
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1880
<400>40
caactatctc agtcttattc tatgttcatg acgtg 35
<210>41
<211>27
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1946
<400>41
tcggagtaca gacggtactg acacaag 27
<210>42
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1947
<400>42
cctctctaga gataatgagc attgcatgtc 30
<210>43
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1948
<400>43
gcgacccgtt tggattccct tgtctg 26
<210>44
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1949
<400>44
tgcaagctcc taatcccggg ctgcag 26
<210>45
<211>26
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸06-o-1950
<400>45
ctggttcgct ggttggtgtc cgttag 26
<210>46
<211>1311
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6的左边缘连接(UD)
<400>46
ctgtacatgt aaccagcttt cctagaaaaa aaacacagta atatttacag tatacaataa 60
tgctcattga ttagatccaa aattatgaaa tgtatatatt ttttgccata acttttatta 120
cagtcttata ctgaagtaaa gttgtatcac gtcatgaaca tagaataaga ctgagatagt 180
tgactaatcc agtcatatcc tatagtacac tagtaaggtg catgtgctaa caatatgaca 240
aatctagtat ttctttatag tttatcatcc ataaatcgca aaatacctaa gcataatttt 300
atttgaatag agagagtact gcccgttatt gtatgaggta atgacttcca tatatacaac 360
atagtcataa gaacacaatt atgaaaaaaa tctatttaaa attgaaatgc gttgagatct 420
tgtcttgcat actaaacata gtaaatataa attaatgcat aaatgactgt tataacagac 480
aatgctggtg acaatagaca atgtactgaa tctaactgga tacgtaggat gctgctatct 540
tattcactca tagttattca gatagtggtc attctttttg acccatagaa aactgtgtgc 600
tataatacac caaaaggaaa gcaaagtgaa aaggaaactt tgaatagcca agaagactcg 660
gagtgcttca cgccttcacc tatcccacat aggtgatgag ctaagagtaa aatgtagatt 720
ctctcgagta ctgaatattg cctgcacttt tccttgcagt aaatacacct ttaatccatg 780
acgagagtcc actctttgag tccgtcttga gattcttcca ttgatcatac aacatgacct 840
cgaagtcctg atggagaaca acttatataa ttaaaactac aatacagaaa gttcctgaca 900
attaaaacct ttggtggtgg catgccgtag gttaaaaaaa atagataatg acaacacaac 960
tggagacacg ctctttgccg agtgctcaca cgtttgctga gagcgagcac tcggcaaata 1020
tatgatttgc cgaataccac cctcctcggc aaaacaatac actaggcaaa aaggtagttt 1080
cccatcacca tgatgcccgc cgttaatgta ccttctatgc cgagtatgtt ggcgctcagc 1140
aaagagatcg ttaccggcgt ttgtttcacc aagagctctt tgacgagtgt ggcacacgac 1200
aaaacctttt gccgagtgta attagtcgtt tgccaagtga ctggtgcagt tggcaaagga 1260
gtcgtttatt atgtgtgggc aaaatgatat atggtgccag ttagggctag c 1311
<210>47
<211>7386
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6的全部转基因(UD)
<400>47
tgatagttta aactgaaggc gggaaacgac aatctgatca tgagcggaga attaagggag 60
tcacgttatg acccccgccg atgacgcggg acaagccgtt ttacgtttgg aactgacaga 120
accgcaacgt tgaaggagcc actcagcaag ctgggccccc cctcgaggtc ggccgcattc 180
gcaaaacaca cctagactag atttgttttg ctaacccaat tgatattaat tatatatgat 240
taatatttat atgtatatgg atttggttaa tgaaatgcat ctggttcatc aaagaattat 300
aaagacacgt gacattcatt taggataaga aatatggatg atctctttct cttttattca 360
gataactagt aattacacat aacacacaac tttgatgccc acattatagt gattagcatg 420
tcactatgtg tgcatccttt tatttcatac attaattaag ttggccaatc cagaagatgg 480
acaagtctag gttaactgac tagctagtca gtacacagtc ctgccatcac catccaggat 540
catatccttg aaagccccac cactagggat cataggcaac acatgctcct ggtgtgggac 600
gattatatcc aagaggtacg gccctggagt ctcgagcatc ttctttatcg ctgcgcggac 660
ttcgttcttc tttgtcacac ggaccgctgg aatgttgaac cctttggcga tcgtcacgaa 720
atctggatat atctcacttt cattctctgg gtttcccaag tatgtgtgcg ctctgttggc 780
cttatagaac ctgtcctcca actgcaccac catccccagg tgctggttgt ttagcacaaa 840
gaccttcact gggaggttct caattcggat catagctagc tcctgaacgt tcatgagaaa 900
gctaccatct ccatcgatgt caacaacagt gacacctggg tttgccacag aagcaccagc 960
agcagccggc aaaccaaatc ccatagcccc aagaccagct gaagacaacc actgccttgg 1020
ccgcttgtaa gtgtagtact gtgccgccca catctggtgc tgcccaacac ctgtgccgat 1080
gatggcctcg cctttcgtca gctcatcaag aacctgaata gcatattgtg gctggatctc 1140
ctcattagat gttttatacc caagggggaa ttccctcttc tgctgatcca actcatcgtt 1200
ccatgagcca aagtcaaagc tcttctttga tgtgcttcct tcaagaagag cattcatgcc 1260
ctgcaaagca agcttaacat ctgcacagat ggacacatgt ggctgcttgt tcttgccaat 1320
ctcagccgga tcaatatcaa cgtgcacaat cttagccctg cttgcaaaag cctcaatctt 1380
ccctgtcacg cgatcatcaa accgcacacc aagtgcaagc aacagatcgg ccttatccac 1440
tgcataattt gcatacaccg tcccatgcat acctagcatg cgcagagaca gtgggtcgtc 1500
gctggggaag ttgccgaggc ccataagagt agttgtgacc gggattccag tcagctccac 1560
aaagcgtcgc aactcctcac cagatgctgc gcagccaccg cccacataaa gaacagggcg 1620
ccgcgattca ccaacaagac gcagcacctg ctcaagcaac tcagtcgcag ggggcttggg 1680
aaggcgcgca atgtacccag gcagactcat gggcttgtcc cagacaggca ccgccatctg 1740
ctgctggatg tccttgggga tgtcgacaag caccggccct ggtcgaccag aggaggcgag 1800
gaagaaagcc tcctgcacga cgcgggggat gtcgtcgacg tcgaggacca ggtagttgtg 1860
cttggtgatg gagcgggtga cctcgacgat gggcgtctcc tggaaggcgt cggtgccaat 1920
catgcgtcgc gccacctgtc ccgtgatggc gaccatgggg acggaatcga gcagcgcgtc 1980
ggcgagcgcg gagactaggt tggtggcgcc ggggccggag gtggcgatgc agacgccgac 2040
gcggcccgag gagcgcgcgt agccggaggc ggcaaaggcc tccccttgct cgtggcggaa 2100
gaggtggttg gcgatgacgg gggagcgggt gagtgcctgg tggatctcca tggacgcgcc 2160
gccggggtag gcgaagacgt cgcggacgcc gcagcgctcg agggactcga cgaggatgtc 2220
agcacccttg cggggctcgg tggggcccca cggccggagc ggggtggccg ggggagccat 2280
cggcatggcg ggtgacgccg ctgagcacct gatgggcgcg gcgagggcgc ggcgggtggc 2340
caggaggtgc gcccggcgcc tcgccttggg cgcagcggta gtggcgccag tgagcgcggt 2400
agacgcggcg gcggcggtgg ccatggttgc ggcggctgtc tcggaggcgg cgcgagggtt 2460
tggggtgggt gccacggaca cggagtggga gaaaggggga tgtgcgtgga ggcctccctg 2520
cttttgttca gaggatgtgt ggctcagatg gtgatgggaa tgggactcgc aagacgacga 2580
cgacacgtcc gtcgcccgaa tacgtacacg ctacagaccg gacggtgggg cctgtcgacg 2640
tgggaccgac gtgtcggcct ggattacaaa cgtggtgtcc accgagtgct ggtacacgac 2700
agcgtgcgtc aaggaggttt tgaactgttc cgttaaaaaa agaggggaga ttttggactt 2760
gactgtggac gacggtgcat gtcatcggag tacagacggt actgacacaa ggggcccaga 2820
caagggaatc caaacgggtc gcacccacct gccaggctgc cacccgcaat ccgcaacagg 2880
gaaaccgggc acagcccaca accacaagat gagcagctgc ggcgacagcg tcaggcccgg 2940
tgtcggtgtt agggatggca ccctttggct ccccgtatcc gtccccgcga caaaaaaatt 3000
tcccgcgggg attcccacga actcttgcga gagacatttc ttccccatcc ccgttcccca 3060
cggggataaa tccccatcgg ggatcctcta gagtcgacct gcaggcatgc aagcttcggt 3120
ccgcggccag cttgctaacc cgggcccccc ctcgaggtca tcacatcaat ccacttgctt 3180
tgaagacgtg gttggaacgt cttctttttc cacgatgctc ctcgtgggtg ggggtccatc 3240
tttgggacca ctgtcggcag aggcatcttc aacgatggcc tttcctttat cgcaatgatg 3300
gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac agatagctgg 3360
gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt tgaaaagtct caattgccct 3420
ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt tttggagtag acaagcgtgt cgtgctccac 3480
catgttgacg aagattttct tcttgtcatt gagtcgtaag agactctgta tgaactgttc 3540
gccagtcttt acggcgagtt ctgttaggtc ctctatttga atctttgact ccatggacgg 3600
tatcgataag ctagcttgat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg 3660
tcttcttttt ccacgatgct cctcgtgggt gggggtccat ctttgggacc actgtcggca 3720
gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct 3780
tccttttcca ctatcttcac aataaagtga cagatagctg ggcaatggaa tccgaggagg 3840
tttccggata ttaccctttg ttgaaaagtc tcaattgccc tttggtcttc tgagactgta 3900
tctttgatat ttttggagta gacaagcgtg tcgtgctcca ccatgttgac gaagattttc 3960
ttcttgtcat tgagtcgtaa gagactctgt atgaactgtt cgccagtctt tacggcgagt 4020
tctgttaggt cctctatttg aatctttgac tccatgatcg aattatcaca tcaatccact 4080
tgctttgaag acgtggttgg aacgtcttct ttttccacga tgctcctcgt gggtgggggt 4140
ccatctttgg gaccactgtc ggcagaggca tcttcaacga tggcctttcc tttatcgcaa 4200
tgatggcatt tgtaggagcc accttccttt tccactatct tcacaataaa gtgacagata 4260
gctgggcaat ggaatccgag gaggtttccg gatattaccc tttgttgaaa agtctcaatt 4320
gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atatttttgg agtagacaag cgtgtcgtgc 4380
tccaccatgt tgacgaagat tttcttcttg tcattgagtc gtaagagact ctgtatgaac 4440
tgttcgccag tctttacggc gagttctgtt aggtcctcta tttgaatctt tgactccatg 4500
ggaattcctg cagcccggga ttaggagctt gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg 4560
tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt 4620
ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt 4680
actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat 4740
aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca 4800
gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat 4860
aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag 4920
actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa 4980
actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac 5040
taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt 5100
tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc 5160
gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc 5220
tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag 5280
aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc 5340
acggcaccgg cagctacggg ggattccttt cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc 5400
ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga 5460
gcgcacacac acacaaccag atctccccca aatccacccg tcggcacctc cgcttcaagg 5520
tacgccgctc gtcctccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca 5580
tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta 5640
gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg 5700
ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg 5760
ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt 5820
atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt 5880
ggttgtgatg atgtggtctg gttgggcggt cgttctagat cggagtagaa ttctgtttca 5940
aactacctgg tggatttatt aattttggat ctgtatgtgt gtgccataca tattcatagt 6000
tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg 6060
gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg 6120
gttgggcggt cgttcattcg ttctagatcg gagtagaata ctgtttcaaa ctacctggtg 6180
tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag 6240
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat 6300
atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta 6360
taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg 6420
cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac 6480
tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt cgaccgccgg 6540
ggatccacac gacaccatgg ctattgaggt taagcctatc aacgcagagg atacctatga 6600
ccttaggcat agagtgctca gaccaaacca gcctatcgaa gcctgcatgt ttgagtctga 6660
ccttactagg agtgcatttc accttggtgg attctacgga ggtaaactga tttccgtggc 6720
ttcattccac caagctgagc actctgaact tcaaggtaag aagcagtacc agcttagagg 6780
tgtggctacc ttggaaggtt atagagagca gaaggctggt tccagtctcg tgaaacacgc 6840
tgaagagatt ctcagaaaga gaggtgctga catgatctgg tgtaatgcca ggacatctgc 6900
ttcaggatac tacaggaagt tgggattcag tgagcaagga gaggtgttcg atactcctcc 6960
agttggacct cacatcctga tgtataagag gatcacataa ctagctagtc agttaaccta 7020
gacttgtcca tcttctggat tggccaactt aattaatgta tgaaataaaa ggatgcacac 7080
atagtgacat gctaatcact ataatgtggg catcaaagtt gtgtgttatg tgtaattact 7140
agttatctga ataaaagaga aagagatcat ccatatttct tatcctaaat gaatgtcacg 7200
tgtctttata attctttgat gaaccagatg catttcatta accaaatcca tatacatata 7260
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<210>49
<211>8697
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中左基因组边缘和全部内部转基因(UD)
<400>49
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tcactatgtg tgcatccttt tatttcatac attaattaag ttggccaatc cagaagatgg 480
acaagtctag gttaactgac tagctagtca gtacacagtc ctgccatcac catccaggat 540
catatccttg aaagccccac cactagggat cataggcaac acatgctcct ggtgtgggac 600
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gatggcctcg cctttcgtca gctcatcaag aacctgaata gcatattgtg gctggatctc 1140
ctcattagat gttttatacc caagggggaa ttccctcttc tgctgatcca actcatcgtt 1200
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aaggcgcgca atgtacccag gcagactcat gggcttgtcc cagacaggca ccgccatctg 1740
ctgctggatg tccttgggga tgtcgacaag caccggccct ggtcgaccag aggaggcgag 1800
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cttggtgatg gagcgggtga cctcgacgat gggcgtctcc tggaaggcgt cggtgccaat 1920
catgcgtcgc gccacctgtc ccgtgatggc gaccatgggg acggaatcga gcagcgcgtc 1980
ggcgagcgcg gagactaggt tggtggcgcc ggggccggag gtggcgatgc agacgccgac 2040
gcggcccgag gagcgcgcgt agccggaggc ggcaaaggcc tccccttgct cgtggcggaa 2100
gaggtggttg gcgatgacgg gggagcgggt gagtgcctgg tggatctcca tggacgcgcc 2160
gccggggtag gcgaagacgt cgcggacgcc gcagcgctcg agggactcga cgaggatgtc 2220
agcacccttg cggggctcgg tggggcccca cggccggagc ggggtggccg ggggagccat 2280
cggcatggcg ggtgacgccg ctgagcacct gatgggcgcg gcgagggcgc ggcgggtggc 2340
caggaggtgc gcccggcgcc tcgccttggg cgcagcggta gtggcgccag tgagcgcggt 2400
agacgcggcg gcggcggtgg ccatggttgc ggcggctgtc tcggaggcgg cgcgagggtt 2460
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cttttgttca gaggatgtgt ggctcagatg gtgatgggaa tgggactcgc aagacgacga 2580
cgacacgtcc gtcgcccgaa tacgtacacg ctacagaccg gacggtgggg cctgtcgacg 2640
tgggaccgac gtgtcggcct ggattacaaa cgtggtgtcc accgagtgct ggtacacgac 2700
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tgtcggtgtt agggatggca ccctttggct ccccgtatcc gtccccgcga caaaaaaatt 3000
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gcatttgtag gagccacctt ccttttccac tatcttcaca ataaagtgac agatagctgg 3360
gcaatggaat ccgaggaggt ttccggatat taccctttgt tgaaaagtct caattgccct 3420
ttggtcttct gagactgtat ctttgatatt tttggagtag acaagcgtgt cgtgctccac 3480
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tatcgataag ctagcttgat atcacatcaa tccacttgct ttgaagacgt ggttggaacg 3660
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gaggcatctt caacgatggc ctttccttta tcgcaatgat ggcatttgta ggagccacct 3780
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gccctttggt cttctgagac tgtatctttg atatttttgg agtagacaag cgtgtcgtgc 4380
tccaccatgt tgacgaagat tttcttcttg tcattgagtc gtaagagact ctgtatgaac 4440
tgttcgccag tctttacggc gagttctgtt aggtcctcta tttgaatctt tgactccatg 4500
ggaattcctg cagcccggga ttaggagctt gcatgcctgc agtgcagcgt gacccggtcg 4560
tgcccctctc tagagataat gagcattgca tgtctaagtt ataaaaaatt accacatatt 4620
ttttttgtca cacttgtttg aagtgcagtt tatctatctt tatacatata tttaaacttt 4680
actctacgaa taatataatc tatagtacta caataatatc agtgttttag agaatcatat 4740
aaatgaacag ttagacatgg tctaaaggac aattgagtat tttgacaaca ggactctaca 4800
gttttatctt tttagtgtgc atgtgttctc cttttttttt gcaaatagct tcacctatat 4860
aatacttcat ccattttatt agtacatcca tttagggttt agggttaatg gtttttatag 4920
actaattttt ttagtacatc tattttattc tattttagcc tctaaattaa gaaaactaaa 4980
actctatttt agttttttta tttaataatt tagatataaa atagaataaa ataaagtgac 5040
taaaaattaa acaaataccc tttaagaaat taaaaaaact aaggaaacat ttttcttgtt 5100
tcgagtagat aatgccagcc tgttaaacgc cgtcgacgag tctaacggac accaaccagc 5160
gaaccagcag cgtcgcgtcg ggccaagcga agcagacggc acggcatctc tgtcgctgcc 5220
tctggacccc tctcgagagt tccgctccac cgttggactt gctccgctgt cggcatccag 5280
aaattgcgtg gcggagcggc agacgtgagc cggcacggca ggcggcctcc tcctcctctc 5340
acggcaccgg cagctacggg ggattccttt cccaccgctc cttcgctttc ccttcctcgc 5400
ccgccgtaat aaatagacac cccctccaca ccctctttcc ccaacctcgt gttgttcgga 5460
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tacgccgctc gtcctccccc ccccccctct ctaccttctc tagatcggcg ttccggtcca 5580
tggttagggc ccggtagttc tacttctgtt catgtttgtg ttagatccgt gtttgtgtta 5640
gatccgtgct gctagcgttc gtacacggat gcgacctgta cgtcagacac gttctgattg 5700
ctaacttgcc agtgtttctc tttggggaat cctgggatgg ctctagccgt tccgcagacg 5760
ggatcgattt catgattttt tttgtttcgt tgcatagggt ttggtttgcc cttttccttt 5820
atttcaatat atgccgtgca cttgtttgtc gggtcatctt ttcatgcttt tttttgtctt 5880
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tacgaattga agatgatgga tggaaatatc gatctaggat aggtatacat gttgatgcgg 6060
gttttactga tgcatataca gagatgcttt ttgttcgctt ggttgtgatg atgtggtgtg 6120
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tatttattaa ttttggaact gtatgtgtgt gtcatacatc ttcatagtta cgagtttaag 6240
atggatggaa atatcgatct aggataggta tacatgttga tgtgggtttt actgatgcat 6300
atacatgatg gcatatgcag catctattca tatgctctaa ccttgagtac ctatctatta 6360
taataaacaa gtatgtttta taattatttt gatcttgata tacttggatg atggcatatg 6420
cagcagctat atgtggattt ttttagccct gccttcatac gctatttatt tgcttggtac 6480
tgtttctttt gtcgatgctc accctgttgt ttggtgttac ttctgcaggt cgaccgccgg 6540
ggatccacac gacaccatgg ctattgaggt taagcctatc aacgcagagg atacctatga 6600
ccttaggcat agagtgctca gaccaaacca gcctatcgaa gcctgcatgt ttgagtctga 6660
ccttactagg agtgcatttc accttggtgg attctacgga ggtaaactga tttccgtggc 6720
ttcattccac caagctgagc actctgaact tcaaggtaag aagcagtacc agcttagagg 6780
tgtggctacc ttggaaggtt atagagagca gaaggctggt tccagtctcg tgaaacacgc 6840
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ttcaggatac tacaggaagt tgggattcag tgagcaagga gaggtgttcg atactcctcc 6960
agttggacct cacatcctga tgtataagag gatcacataa ctagctagtc agttaaccta 7020
gacttgtcca tcttctggat tggccaactt aattaatgta tgaaataaaa ggatgcacac 7080
atagtgacat gctaatcact ataatgtggg catcaaagtt gtgtgttatg tgtaattact 7140
agttatctga ataaaagaga aagagatcat ccatatttct tatcctaaat gaatgtcacg 7200
tgtctttata attctttgat gaaccagatg catttcatta accaaatcca tatacatata 7260
aatattaatc atatataatt aatatcaatt gggttagcaa aacaaatcta gtctaggtgt 7320
gttttgcgaa ttcagtacat taaaaacgtc cgcaatgtgt tattaagttg tctaagcgtc 7380
aatttgctgt acatgtaacc agctttccta gaaaaaaaac acagtaatat ttacagtata 7440
caataatgct cattgattag atccaaaatt atgaaatgta tatatttttt gccataactt 7500
ttattacagt cttatactga agtaaagttg tatcacgtca tgaacataga ataagactga 7560
gatagttgac taatccagtc atatcctata gtacactagt aaggtgcatg tgctaacaat 7620
atgacaaatc tagtatttct ttatagttta tcatccataa atcgcaaaat acctaagcat 7680
aattttattt gaatagagag agtactgccc gttattgtat gaggtaatga cttccatata 7740
tacaacatag tcataagaac acaattatga aaaaaatcta tttaaaattg aaatgcgttg 7800
agatcttgtc ttgcatacta aacatagtaa atataaatta atgcataaat gactgttata 7860
acagacaatg ctggtgacaa tagacaatgt actgaatcta actggatacg taggatgctg 7920
ctatcttatt cactcatagt tattcagata gtggtcattc tttttgaccc atagaaaact 7980
gtgtgctata atacaccaaa aggaaagcaa agtgaaaagg aaactttgaa tagccaagaa 8040
gactcggagt gcttcacgcc ttcacctatc ccacataggt gatgagctaa gagtaaaatg 8100
tagattctct cgagtactga atattgcctg cacttttcct tgcagtaaat acacctttaa 8160
tccatgacga gagtccactc tttgagtccg tcttgagatt cttccattga tcatacaaca 8220
tgacctcgaa gtcctgatgg agaacaactt atataattaa aactacaata cagaaagttc 8280
ctgacaatta aaacctttgg tggtggcatg ccgtaggtta aaaaaaatag ataatgacaa 8340
cacaactgga gacacgctct ttgccgagtg ctcacacgtt tgctgagagc gagcactcgg 8400
caaatatatg atttgccgaa taccaccctc ctcggcaaaa caatacacta ggcaaaaagg 8460
tagtttccca tcaccatgat gcccgccgtt aatgtacctt ctatgccgag tatgttggcg 8520
ctcagcaaag agatcgttac cggcgtttgt ttcaccaaga gctctttgac gagtgtggca 8580
cacgacaaaa ccttttgccg agtgtaatta gtcgtttgcc aagtgactgg tgcagttggc 8640
aaaggagtcg tttattatgt gtgggcaaaa tgatatatgg tgccagttag ggctagc 8697
<210>50
<211>8112
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>玉米事件DP-098140-6中右基因组边缘和全部内部转基因(UD)
<400>50
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atgtcgtagt agctggtagt aaattaacac acgcgtacga gtagcggagt taaatggggg 120
catgcatgca gcaggacgtg gtattagtaa gcttactact ctagctttat ccatccatcc 180
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cgtcgatgca tatgtgtgta tgtatgtacg tgcataatgc atggtaccag ctgctggctt 420
atatatattt gtcaccgatc gatgcatgct gctgctctac acggtttgac actttaattt 480
gactcatcga tgaccttgct agatagtagc ggctcgtcaa ttaatgagcc atcaagttaa 540
caagagggca cgggcttgcg cgactgattc caccttatta acatacgccc tgcgcccgcg 600
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cctctttgat agtttaaact gaaggcggga aacgacaatc tgatcatgag cggagaatta 780
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aattataaag acacgtgaca ttcatttagg ataagaaata tggatgatct ctttctcttt 1080
tattcagata actagtaatt acacataaca cacaactttg atgcccacat tatagtgatt 1140
agcatgtcac tatgtgtgca tccttttatt tcatacatta attaagttgg ccaatccaga 1200
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cacaaagacc ttcactggga ggttctcaat tcggatcata gctagctcct gaacgttcat 1620
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catgccctgc aaagcaagct taacatctgc acagatggac acatgtggct gcttgttctt 2040
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aatcttccct gtcacgcgat catcaaaccg cacaccaagt gcaagcaaca gatcggcctt 2160
atccactgca taatttgcat acaccgtccc atgcatacct agcatgcgca gagacagtgg 2220
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cacgacagcg tgcgtcaagg aggttttgaa ctgttccgtt aaaaaaagag gggagatttt 3480
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aacagggaaa ccgggcacag cccacaacca caagatgagc agctgcggcg acagcgtcag 3660
gcccggtgtc ggtgttaggg atggcaccct ttggctcccc gtatccgtcc ccgcgacaaa 3720
aaaatttccc gcggggattc ccacgaactc ttgcgagaga catttcttcc ccatccccgt 3780
tccccacggg gataaatccc catcggggat cctctagagt cgacctgcag gcatgcaagc 3840
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ttgctttgaa gacgtggttg gaacgtcttc tttttccacg atgctcctcg tgggtggggg 3960
tccatctttg ggaccactgt cggcagaggc atcttcaacg atggcctttc ctttatcgca 4020
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ggacggtatc gataagctag cttgatatca catcaatcca cttgctttga agacgtggtt 4380
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gcgagttctg ttaggtcctc tatttgaatc tttgactcca tgatcgaatt atcacatcaa 4800
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cggtcgtgcc cctctctaga gataatgagc attgcatgtc taagttataa aaaattacca 5340
catatttttt ttgtcacact tgtttgaagt gcagtttatc tatctttata catatattta 5400
aactttactc tacgaataat ataatctata gtactacaat aatatcagtg ttttagagaa 5460
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ctatataata cttcatccat tttattagta catccattta gggtttaggg ttaatggttt 5640
ttatagacta atttttttag tacatctatt ttattctatt ttagcctcta aattaagaaa 5700
actaaaactc tattttagtt tttttattta ataatttaga tataaaatag aataaaataa 5760
agtgactaaa aattaaacaa atacccttta agaaattaaa aaaactaagg aaacattttt 5820
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tcctttattt caatatatgc cgtgcacttg tttgtcgggt catcttttca tgcttttttt 6600
tgtcttggtt gtgatgatgt ggtctggttg ggcggtcgtt ctagatcgga gtagaattct 6660
gtttcaaact acctggtgga tttattaatt ttggatctgt atgtgtgtgc catacatatt 6720
catagttacg aattgaagat gatggatgga aatatcgatc taggataggt atacatgttg 6780
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ctggtgtatt tattaatttt ggaactgtat gtgtgtgtca tacatcttca tagttacgag 6960
tttaagatgg atggaaatat cgatctagga taggtataca tgttgatgtg ggttttactg 7020
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ctattataat aaacaagtat gttttataat tattttgatc ttgatatact tggatgatgg 7140
catatgcagc agctatatgt ggattttttt agccctgcct tcatacgcta tttatttgct 7200
tggtactgtt tcttttgtcg atgctcaccc tgttgtttgg tgttacttct gcaggtcgac 7260
cgccggggat ccacacgaca ccatggctat tgaggttaag cctatcaacg cagaggatac 7320
ctatgacctt aggcatagag tgctcagacc aaaccagcct atcgaagcct gcatgtttga 7380
gtctgacctt actaggagtg catttcacct tggtggattc tacggaggta aactgatttc 7440
cgtggcttca ttccaccaag ctgagcactc tgaacttcaa ggtaagaagc agtaccagct 7500
tagaggtgtg gctaccttgg aaggttatag agagcagaag gctggttcca gtctcgtgaa 7560
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atctgcttca ggatactaca ggaagttggg attcagtgag caaggagagg tgttcgatac 7680
tcctccagtt ggacctcaca tcctgatgta taagaggatc acataactag ctagtcagtt 7740
aacctagact tgtccatctt ctggattggc caacttaatt aatgtatgaa ataaaaggat 7800
gcacacatag tgacatgcta atcactataa tgtgggcatc aaagttgtgt gttatgtgta 7860
attactagtt atctgaataa aagagaaaga gatcatccat atttcttatc ctaaatgaat 7920
gtcacgtgtc tttataattc tttgatgaac cagatgcatt tcattaacca aatccatata 7980
catataaata ttaatcatat ataattaata tcaattgggt tagcaaaaca aatctagtct 8040
aggtgtgttt tgcgaattca gtacattaaa aacgtccgca atgtgttatt aagttgtcta 8100
agcgtcaatt tg 8112
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<213>人工序列
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<211>25
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>引物DP098-3’-r12
<400>52
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)...(1)
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<221>misc_feature
<222>(32)...(32)
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<212>DNA
<213>人工序列
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<212>DNA
<213>人工序列
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<400>55
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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<222>(1)...(1)
<223>1位的核苷酸被修饰为具有FAM荧光团
<221>misc_feature
<222>(33)...(33)
<223>33位的核苷酸被修饰为具有TAMRA荧光团
<400>56
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<212>DNA
<213>人工序列
<220>
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tggaatgttg aaccctttgg cgatcgtcac gaaatctgga tatatctcac tttcattctc 240
tgggtttccc aagtatgtgt gcgctctgtt ggccttatag aacctgtcct ccaactgcac 300
caccatcccc aggtgctggt tgtttagcac aaagaccttc actgggaggt tctcaattcg 360
gatcatagct agctcctgaa cgttcatgag aaagctacca tctccatcga tgtcaacaac 420
agtgacacct gggtttgcca cagaagcacc agcagcagcc ggcaaaccaa atcccatagc 480
cccaagacca gctgaagaca accactgcct tggccgcttg taagtgtagt actgtgccgc 540
ccacatctgg tgctgcccaa cacctgtgcc gatgatggcc tcgcctttcg tcagctcatc 600
aagaacctga atagcatatt gtggctggat ctcctcatta gatgttttat acccaagggg 660
gaattccctc ttctgctgat ccaactcatc gttccatgag ccaaagtcaa agctcttctt 720
tgatgtgctt ccttcaagaa gagcattcat gccctgcaaa gcaagcttaa catctgcaca 780
gatggacaca tgtggctgct tgttcttgcc aatctcagcc ggatcaatat caacgtgcac 840
aatcttagcc ctgcttgcaa aagcctcaat cttccctgtc acgcgatcat caaaccgcac 900
accaagtgca agcaacagat cggccttatc c 931
Claims (45)
1.包含SEQ ID NO：5或6的分离的多核苷酸。
2.权利要求1的分离的多核苷酸，其中所述的多核苷酸选自：
(a)SEQ ID NO：48、7、8、9、10、49或50所示的核苷酸序列；
(b)包含SEQ ID NO：48、7、8、9、10、49或50的片段的核苷酸序列。
3.在生物样品中鉴定事件DP-098140-6的试剂盒，所述试剂盒包括第一和第二引物，其中所述第一和所述第二引物扩增包含DP-098140-6特异区域的多核苷酸。
4.权利要求3的试剂盒，其中所述试剂盒还包含用于检测DP-098140-6特异区域的多核苷酸。
5.权利要求3的试剂盒，其中所述的第一引物包含SEQ ID NO：48的第一片段，且所述的第二引物包含SEQ ID NO：48的第二片段，其中所述的第一和所述的第二引物在所述DP-098140-6特异区域的侧翼，且与所述的多核苷酸共享足以扩增所述DP-098140-6特异区域的序列同源性或互补性。
6.权利要求5的试剂盒，其中
a)所述的第一引物包含SEQ ID NO：47的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：1的片段；
b)所述的第一引物包含SEQ ID NO：47的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：46的片段；
c)所述的第一引物包含SEQ ID NO：46的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：1的片段。
7.权利要求5的试剂盒，其中所述的第一或所述的第二引物包含SEQ ID NO：48的至少8个连续多核苷酸。
8.权利要求6的试剂盒，其中所述的第一或所述的第二引物包含SEQ ID NO：1、46或47的至少8个连续多核苷酸。
9.权利要求5的试剂盒，其中所述的第一或所述的第二引物包含SEQ ID NO：24的至少8个连续多核苷酸。
10.权利要求3或4的试剂盒，其中所述的第一或所述的第二引物包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55或56。
11.DNA检测试剂盒，包括至少一种能够特异性检测DP-098140-6特异区域的多核苷酸，其中所述的多核苷酸包括至少一种足够长的与SEQ ID NO：48同一或互补的连续核苷酸的DNA分子。
12.权利要求11的DNA检测试剂盒，其中所述的能够特异性检测DP-098140-6特异区域的多核苷酸包含具有SEQ ID NO：5或6的多核苷酸。
13.权利要求11的DNA检测试剂盒，其中所述的多核苷酸包含在严格条件下与选自以下的序列杂交的序列：
(a)SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：47的序列；和
(b)SEQ ID NO：46和SEQ ID NO：47的序列。
14.具有稳定地整合至其基因组的权利要求1或2的多核苷酸的玉米植物。
15.权利要求14的玉米植物，其中所述的植物是从ATCC种子保藏PTA-8296的种子生长的植物后代。
16.来自权利要求14的植物的转基因种子。
17.ATCC种子保藏PTA-8296的转基因种子。
18.在生物样品中鉴定事件DP-098140-6的方法，包括：
(a)使所述样品与第一和第二引物接触；并且
(b)扩增包含DP-098140-6特异区域的多核苷酸。
19.权利要求18的方法，其中所述包含DP-098140-6特异区域的多核苷酸包含SEQ ID NO：5。
20.权利要求18的方法，其中所述包含DP-098140-6特异区域的多核苷酸包含SEQ ID NO：6。
21.权利要求18、19或20的方法，进一步包括检测DP-098140-6特异区域。
22.权利要求18、19或20的方法，其中所述的第一引物包含SEQID NO：48的第一片段，且所述的第二引物包含SEQ ID NO：48的第二片段，其中所述的第一和所述的第二引物在所述DP-098140-6特异区域的侧翼，且与所述的多核苷酸共享足以扩增所述DP-098140-6特异区域的序列同源性或互补性。
23.权利要求22的方法，其中
a)所述的第一引物包含SEQ ID NO：47的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：1的片段；
b)所述的第一引物包含SEQ ID NO：47的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：46的片段；
c)所述的第一引物包含SEQ ID NO：1的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：46的片段。
24.权利要求22的方法，其中所述的第一和或所述的第二引物包含SEQ ID NO：48的至少8个连续多核苷酸。
25.权利要求23的方法，其中所述的第一和所述的第二引物包含SEQ ID NO：1、46或47的至少8个连续多核苷酸。
26.权利要求18或19的方法，其中所述的第一和所述的第二引物包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55或56。
27.在生物样品中鉴定事件DP-098140-6的方法，包括：
(a)使所述样品与第一和第二引物接触；
(b)进行DNA扩增反应，由此产生DNA扩增子分子；以及
(c)检测所述的DNA扩增子分子，其中在所述DNA扩增反应中检测到所述DNA扩增子分子表明存在玉米事件DP-098140-6。
28.权利要求27的方法，其中所述的第一引物包含SEQ ID NO：48的第一片段，且所述的第二引物包含SEQ ID NO：48的第二片段，其中所述的第一和所述的第二引物在所述DP-098140-6特异区域的侧翼，且与所述的多核苷酸共享足以扩增所述DP-098140-6特异区域的序列同源性或互补性。
29.权利要求27的方法，其中所述的第一和第二引物选自：
(a)包含SEQ ID NO：13和SEQ ID NO：14的序列；
(b)包含SEQ ID NO：15和SEQ ID NO：16的序列；
(c)包含SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18的序列；
(d)包含SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21的序列；
(e)包含SEQ ID NO：51和SEQ ID NO：52的序列；以及
(f)包含SEQ ID NO：54和SEQ ID NO：55的序列。
30.在样品中检测与DP-098140-6事件相应的DNA存在的方法，所述方法包括：
(a)使所述样品与多核苷酸探针接触，其中所述的多核苷酸探针在严格杂交条件下与来自玉米事件DP-098140-6的DNA杂交并特异性地检测DP-098140-6事件；
(b)使所述样品和探针经历严格杂交条件；以及
(c)检测探针与DNA的杂交，其中检测到杂交表明存在DP-098140-6事件。
31.权利要求30的方法，其中所述的样品包括玉米组织。
32.包含选自如下序列的多核苷酸：SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、24、25、26、27、28、29、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56或其互补序列。
33.包含第一DNA分子和第二DNA分子的DNA分子对，所述的第一DNA分子包含SEQ ID NO：48的第一片段，且所述的第二DNA分子包含SEQ ID NO：48的第二片段，其中所述的第一和所述的第二DNA分子在SEQ ID NO：51的所述DP-098140-6特异区域的侧翼，且与所述的多核苷酸共享足以扩增所述DP-098140-6特异区域的序列同源性或互补性。
34.确定种子纯度的方法或在种子批中为DP-098140-6事件筛选种子的方法，包括：
(a)使所述样品与第一和第二引物接触；
(b)进行DNA扩增反应，由此产生DNA扩增子分子；以及
(c)检测所述的DNA扩增子分子，其中在所述DNA扩增反应中检测到所述DNA扩增子分子表明存在玉米事件DP-098140-6。
35.权利要求34的方法，其中所述的第一引物包含SEQ ID NO：48的第一片段，且所述的第二引物包含SEQ ID NO：48的第二片段，其中所述的第一和所述的第二引物在所述DP-098140-6特异区域的侧翼，且与所述的多核苷酸共享足以扩增所述DP-098140-6特异区域的序列同源性或互补性。
36.权利要求35的方法，其中
a)所述的第一引物包含SEQ ID NO：47的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：1的片段；
b)所述的第一引物包含SEQ ID NO：47的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：46的片段；
c)所述的第一引物包含SEQ ID NO：1的片段且所述的第二引物包含SEQ ID NO：46的片段。
37.权利要求35的方法，其中所述的第一或所述的第二引物包含SEQ ID NO：48的至少8个连续多核苷酸。
38.权利要求36的方法，其中所述的第二和所述的第一引物包含SEQ ID NO：1、46或47的至少8个连续多核苷酸。
39.权利要求38的方法，其中所述的第一或所述的第二引物包含SEQ ID NO：13、14、15、16、17、18、19、20、21、25、26、27、28、29、30、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、51、52、53、54、55或56。
40.确定种子纯度或在种子批中筛选DP-098140-6事件的存在的方法，包括：
(a)使包含玉米DNA的样品与多核苷酸探针接触，其中所述的多核苷酸探针在严格杂交条件下与来自玉米事件DP-098140-6的DNA杂交并特异性地检测DP-098140-6事件；
(b)使所述样品和探针经历严格杂交条件；以及
(c)检测探针与DNA的杂交，其中检测到杂交表明存在DP-098140-6事件。
41.产生草甘膦耐性和ALS抑制剂耐性植物的方法，包括繁殖权利要求13或14的植物，并且通过分析至少一种包含DP-098140-6特异区域的多核苷酸而选择后代。
42.权利要求41的方法，其中所述的多核苷酸包含SEQ ID NO：5。
43.权利要求41的方法，其中所述的多核苷酸包含SEQ ID NO：6。
44.权利要求40的方法，其中所述的多核苷酸选自：
(a)SEQ ID NO：48、7、8、9、10、49或50所示的核苷酸序列；
(b)包含SEQ ID NO：48、7、8、9、10、49或50的片段的核苷酸序列。
45.在栽培区域中控制杂草的方法，包括将有效量的草甘膦和/或ALS抑制剂施用于具有权利要求13或14的植物的栽培区域中。
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