CN104131106A - 转基因玉米98140结构特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 - Google Patents

转基因玉米98140结构特异定量pcr精准检测的引物和探针及方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量分析方法，具体是指转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物序列、下游引物序列、荧光探针序列、98140品系的DNA稀释液以及TaqmanMastermix（2×）和水配制成PCR反应体系，进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含转基因98140构建结构的生物成分检测。

Description

转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测的引物和探针及方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量的分析方法。
背景技术
国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。为了打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒，同时弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系，更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权，建立一种新型转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测方法已成为必要。
目前关于转基因玉米98140的检测技术，主要集中在普通定性PCR分析方法和标准，尚无关于检测转基因玉米98140及产品的结构特异性某特定位点（基因序列）的定量PCR精准检测技术。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测转基因玉米98140及产品的结构特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。
本发明通过下述技术方案实现：
转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测的引物和探针： 
上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'；
下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'；
荧光探针序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'。实现对pinⅡ终止子与zm-hra gene相连位置核酸片段的检测。
转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测的引物和探针：
上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'；
下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'；
荧光探针序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'。实现对Gate4621gene与pinⅡ终止子相接处核酸片段的检测。
上述转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测方法，包括以下步骤：当检测pinⅡ终止子与zm-hra gene相连位置核酸片段时，具体步骤如下：
（a1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'
下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'
荧光探针序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'；
（a2）制备98140品系的DNA稀释液；
（a3）配制PCR反应体系；
（a4）定量PCR检测。
当检测Gate4621gene与pinⅡ终止子相接处核酸片段时，具体步骤如下：
（b1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'
下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'
荧光探针序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'；
（b2）制备98140品系的DNA稀释液；
（b3）配制PCR反应体系；
（b4）定量PCR检测。
进一步地，步骤（a1）和（b1）中合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤（a2）和（b2）中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
再进一步地，步骤（a3）和（b3）中所述的配制PCR反应体系，即将DNA稀释液加入到20μl反应体系中，所述20μl的反应体系包括以下组分：
Taqman Master mix（2×）                 10μl
上游引物                                 1μl
下游引物                                 1μl
荧光探针                                 0.5μl
DNA稀释液                               3.0μl
50 ROX                                   0.4μl
水                                       4.1μl。
另外，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，57℃退火60s，45个循环。
本发明具有以下优点及有益效果：
（1）本发明打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；
（2）本发明弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系；
（3）本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权；
（4）本发明扩增效率高、准确度高。
附图说明
图1为本发明-实施例1对非目标转化体的转基因作物和非转基因作物的检测结果图。
图2为本发明-实施例2对非目标转化体的转基因作物和非转基因作物的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例1
转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测方法，在检测pinⅡ终止子与zm-hra gene相连位置核酸片段时，步骤如下：
（a1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'
下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'
荧光探针序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'。
本实施例引物及荧光探针的合成浓度均为10μmol/l。
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米98140及产品的构建结构中pinII终止子与zm-hra gene相连位点的特定位点设计；通过该设计就可以精准检测转基因玉米中98140的结构特异片段。
（2）制备98140品系的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米98140中提取出浓度为50ng/μl的DNA稀释液。
（3）配制PCR反应体系；即将制备好的DNA稀释液加入20μl反应体系中即可。
以上20μl反应体系包括以下组分：
Taqman Master mix（2×）                 10μl
上游引物                                 1μl
下游引物                                 1μl
荧光探针                                 0.5μl
DNA稀释液                               3.0μl
50 ROX                                   0.4μl
水                                       4.1μl。
（4）定量PCR检测。
根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，57℃退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。
采用本发明的方法对非转基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15个其他玉米转化体，5个水稻转化体，5个大豆转化体，3个棉花转化体，3个油菜转化体和1个甜菜转化体进行特异性检测，检测结果如图1所示，从图1可看出本发明设计的引物和探针对以上非转基因作物及除98140玉米外的其他转基因转化体均没有非特异扩增，另外图1中△Rn代表荧光原始信号减去背景信号的值。
同时，采用本发明的方法对0.5%的转基因玉米98140结构特性片段进行定量检测，连续重复做15个平行样品的检测，数据见表1。
表1
另外，采取0.5% 98140转基因玉米与非转基因玉米基因组混合的方式，配制0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0%五个不同转化体含量的模板（每μl模板DNA溶液浓度保持在50~100ng之间），相应于目标转化体含量的拷贝数分别为100、40、20、10、2、1、0.2、0个拷贝。每个浓度梯度设置16次重复，对本发明的灵敏度进行检测，数据见表2。
表2
ND：没有检测到信号。
采用本发明能够精准检测转基因玉米中pinⅡ终止子与zm-hra genen相连点的构建结构及其含量。获得标准曲线斜率，在-3.42～-3.31之间，相关系数大于0.99，扩增效率为98.79%，在90%～110%的范围内。待检样品的定量检测结果为（0.527%）非常接近真实值（0.5%），结果的偏差率小于国际认可的25%，检测结果的不确定度小于10%。本发明灵敏度测定结果表明，本发明最低能检测限为0.01%，相应的转化体含量为2个拷贝。
由以上检测结果可得知，本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方法的范围，本发明的扩增效率高、准确度高。
实施例2
转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测方法，在检测Gate4621gene与pinⅡ终止子相接处时，步骤如下：
（a1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'
下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'
荧光探针序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'。
本实施例引物及荧光探针的合成浓度均为10μmol/l。
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是针对转基因玉米98140及产品的构建结构中gat4621gene与pinII终止子相连位点的特定位点设计；通过该设计也可以精准检测转基因玉米中98140的结构特异片段。
（2）制备98140品系的DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米98140中提取出浓度为50ng/μl的DNA稀释液。
（3）配制PCR反应体系；即将制备好的DNA稀释液加入20μl反应体系中即可。
以上20μl反应体系包括以下组分：
Taqman Master mix（2×）                 10μl
上游引物                                 1μl
下游引物                                 1μl
荧光探针                                 0.5μl
DNA稀释液                               3.0μl
50 ROX                                   0.4μl
水                                       4.1μl。
（4）定量PCR检测。
根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，57℃退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。
采用本发明的方法对非转基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15个其他玉米转化体，5个水稻转化体，5个大豆转化体，3个棉花转化体，3个油菜转化体和1个甜菜转化体进行特异性检测，检测结果如图2所示，从图2可看出本发明设计的引物和探针对以上非转基因作物及除98140玉米外的其他转基因转化体均没有非特异扩增，另外图2中△Rn代表荧光原始信号减去背景信号的值。
同时，采用本发明的方法对0.5%的转基因玉米98140结构特性片段进行定量检测，连续重复做15个平行样品的检测，数据见表3。
表3
实验次数 zSSⅡbCt值 zSSⅡ绝对含量（ng） 结构特异片段Ct值 结构特异片段绝对含量（ng） 结构特异片段相对含量（%）
1 23.429 108.682 30.601 0.618 0.569
2 23.368 113.233 30.543 0.538 0.475
3 23.407 110.315 30.788 0.558 0.506
4 23.279 120.267 30.567 0.530 0.441
5 23.502 103.499 30.612 0.515 0.498
6 23.631 94.848 30.478 0.562 0.593
7 23.671 94.978 30.668 0.496 0.522
8 23.629 92.331 30.925 0.419 0.454
9 23.429 101.283 30.648 0.507 0.501
10 23.402 98.597 30.518 0.497 0.504
11 23.337 99.872 30.553 0.482 0.483
12 23.028 101.276 30.441 0.522 0.515
13 23.534 100.344 30.792 0.564 0.562
14 23.442 110.131 30.581 0.527 0.479
15 23.580 98.687 30.863 0.484 0.490
平均值 23.444 103.223 30.639 0.521 0.506
另外，采取0.5% 98140转基因玉米与非转基因玉米基因组混合的方式，配制0.5%、0.25%、0.1%、0.05%、0.01%、0.005%、0.001%、0%五个不同转化体含量的模板（每μl模板DNA溶液浓度保持在50~100ng之间），相应于目标转化体含量的拷贝数分别为100、40、20、10、2、1、0.2、0个拷贝。每个浓度梯度设置16次重复，对本发明的灵敏度进行检测，数据见表4。
表4
ND：没有检测到信号。
采用本发明能够精准检测转基因玉米中gat4621gene与pinII终止子相连位点的构建结构及其含量。获得标准曲线斜率，在-3.50～-3.37之间，相关系数大于0.99，扩增效率为96.69%，在90%～110%的范围内。待检样品的定量检测结果为（0.506%）非常接近真实值（0.5%），结果的偏差率小于国际认可的25%，检测结果的不确定度小于10%。本发明灵敏度测定结果表明，本发明最低能检测限为0.01%，相应的转化体含量为2个拷贝。
由以上检测结果可得知，本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方法的范围，本发明的扩增效率高、准确度高。
SEQUENCE LISTING
 
<110>  四川省农业科学院分析测试中心
 
<120>  转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测的引物和探针及方法
 
<130> 
 
<160>  6    
 
<170>  PatentIn version 3.3
 
<210>  1
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  上游引物（zm-F）
 
<400>  1
tggccaatcc agaagatgga                                          20
 
 
<210>  2
<211>  20
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  下游引物（zm-R）
 
<400>  2
tggtgatggc aggactgtgt                                        20
 
 
<210>  3
<211>  22
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  荧光探针（zm-P）
 
<400>  3
aagtctaggt taactgacta gc                                     22
 
 
<210>  4
<211>  21
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  上游引物（gat-F）
 
<400>  4
ttgggattca gtgagcaagg a                                        21
 
 
<210>  5
<211>  24
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  下游引物（gat-R）
 
<400>  5
ccaatccaga agatggacaa gtct                                     24
 
 
<210>  6
<211>  30
<212>  DNA
<213>  Artificial
 
<220>
<223>  荧光探针（gat-P）
 
<400>  6
aggtgttcga tactcctcca gttggacctc                             30
 

Claims (6)

1.转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测的引物和探针，其特征在于,
用于检测pinⅡ终止子与zm-hra gene相连位置的引物和探针如下：
上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'；
下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'；
荧光探针序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'；
用于检测Gate4621gene与pinⅡ终止子相接处的引物和探针如下：
上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'；
下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'；
荧光探针序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'。
2. 转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于,包括以下步骤：检测pinⅡ终止子与zm-hra gene相连位置：
（a1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，zm-F：5'-TGGCCAATCCAGAAGATGGA-3'
下游引物序列，zm-R：5'-TGGTGATGGCAGGACTGTGT-3'
荧光探针序列，zm-P：5'-FAM-AAGTCTAGGTTAACTGACTAGC-TAMRA-3'；
（a2）制备98140品系的DNA稀释液；
（a3）配制PCR反应体系；
（a4）定量PCR检测。
3. 根据权利要求2所述的转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，检测Gate4621gene与pinⅡ终止子相接处：
（b1）合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，gat-F：5'-TTGGGATTCAGTGAGCAAGGA-3'
下游引物序列，gat-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTCT-3'
荧光探针序列，gat-P：5'-FAM-AGGTGTTCGATACTCCTCCAGTTGGACCTC-TAMRA-3'；
（b2）制备98140品系的DNA稀释液；
（b3）配制PCR反应体系；
（b4）定量PCR检测。
4. 根据权利要求3所述的转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（a1）和（b1）中合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤（a2）和（b2）中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
5. 根据权利要求4所述的转基因玉米98140结构特异定量PCR精准检测方法，其特征在于，步骤（a3）和（b3）中所述的配制PCR反应体系，即将DNA稀释液加入到20μl反应体系中，所述20μl的反应体系包括以下组分：
Taqman Master mix（2×）                 10μl
上游引物                                 1μl
下游引物                                 1μl
荧光探针                                 0.5μl
DNA稀释液                               3.0μl
50 ROX                                   0.4μl
水                                       4.1μl。
6. 根据权利要求3或5所述的转基因玉米98140结构特异性定量PCR精准检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，57℃退火60s，45个循环。
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CN106701999A (zh) * 2017-02-24 2017-05-24 四川省农业科学院分析测试中心 含有gat‑tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针及方法

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