CN106701999A - 含有gat‑tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针及方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量分析方法，具体是指含有gat‑tpin Ⅱ结构转基因植物实时PCR精准检测方法。本发明采用设计的特异性上游引物序列、下游引物序列、荧光探针序列、DNA稀释液以及Taqman Master mix(2×)和水配制成PCR反应体系，进行定量PCR检测。本发明主要建立了一种高扩增效率、高准确度的Taqman定量PCR检测技术，适用于国内农业转基因生物及产品监督检验、进出境口岸转基因生物及产品检验、企业内部进口原材料含gat‑tpin Ⅱ结构的生物成分检测。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及基因的定量的分析方法。
背景技术
随着转基因技术的发展，全球转基因植物种植面积已累积超过20亿公顷。但其在许多国家和地区还未进入商业化发展，仍处于限制性的发展阶段。国际上很多国家对转基因产品实施限量标识和进口，而我国尚无具体的转基因产品标识阈值。转基因植物的种类和数量越来越多的同时，对发展转基因成分含量检测及风险评估技术的要求不断增加和提升，筛选性方法的重要性亦越来越凸显。比如针对转基因常用的35S启动子、NOS终止子等通用元件特异性以及Bt，bar/pat等外源基因特异性的检测技术在高通量的检测工作中已发挥了重要作用。但是这些单个元件特异性的检测方法的重要弊端就是无法避免因天然污染物存在时引发假阳性结果的发生。结构特异性PCR检测技术是基于结合元件与元件之间结构的筛选性方法，兼具筛选和对某元件特异性的优点，它可以有效解决这样的问题。不仅如此，因为相同构建结构的转基因事件通常都是由同一家公司生产的，对某结构的检测可直接溯源到它所属的生产机构。或许这已为人们所共识，现在关于结构特异性PCR检测技术在转基因成分检测中的应用报道也逐渐增多。
98140玉米、356043大豆、73496油菜都是由美国先锋公司生产的含有相同(似)构建结构的抗除草剂转基因转化事件。迄今为止，仅Dreo etal(2012)报道过对所有含有gat-tpriⅡ结构的转基因植物的检测方法，但他使用的Green染料进行实时PCR检测。众所周知，染料法没有涉及特异性探针，任何双链核酸片段的存在都会因非特异的燃料嵌入而产生荧光信号，因此，PCR反应过程中非特异性扩增或者引物二聚体的产生都可能被当做阳性信号，出现假阳性情况，准确性低。
发明内容
本发明的目的主要是提供一种扩增效率高、准确度高的检测特异性某特定位点的定量PCR精准检测技术。
本发明通过下述技术方案实现：
含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针：
上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；
下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；
荧光探针序列，
gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'。
上述含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测方法，包括以下步骤：
(1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；
下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；
荧光探针序列，
gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'；
(2)制备DNA稀释液；
(3)配制PCR反应体系；
(4)定量PCR检测。
进一步地，步骤(1)中合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤(2)中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
再进一步地，步骤(3)中所述的配制PCR反应体系，即将DNA稀释液加入到反应体系中，所述反应体系包括以下组分：
更进一步地，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火60s，45个循环。
本发明所示的探针法可以有效避免假阳性情况的产生，具有很高的准确性，可精准检测含有gat-tpinⅡ结构的转基因植物。
本发明具有以下优点及有益效果：
(1)本发明打破欧盟等国家和地区设置的转基因产品贸易技术壁垒；
(2)本发明弥补和完善我国转基因生物及产品定量检测技术体系；
(3)本发明提供的检测技术可更好地保护消费者对转基因产品的知情权和选择权；
(4)本发明特异性强、扩增效率高、准确度高。
附图说明
图1为本发明对非目标转化体的转基因作物和非转基因作物的检测结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步的说明，但本发明的实施方式并不限于此。
实施例
含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测方法，在检测gat基因与pinⅡ终止子相接处时，步骤如下：
(a1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；
下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；
荧光探针序列，
gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'。
本实施例引物及荧光探针的合成浓度均为10μmol/l。
以上引物和荧光探针的核苷酸序列是基于构建结构中gat基因与pinⅡ终止子相连位点的特定位点设计；通过该设计就可以精准检测到所有含有gat-tpinⅡ结构的转基因植物及产品。
(2)制备DNA稀释液；即采用常规的DNA提取手段，从转基因玉米98140、大豆356043、油菜73496中提取出DNA，并将浓度稀释为50ng/μl的DNA稀释液。
(3)配制PCR反应体系；即将制备好的DNA稀释液加入反应体系中即可。
以上反应体系包括以下组分：
(4)定量PCR检测。
根据上述PCR反应体系，在以下PCR反应条件下对产物进行扩增并检测，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火60s，45个循环。本实施例中采用的是ABI公司生产的7500型荧光定量PCR仪器。
采用本发明的方法对非转基因玉米、水稻、大豆、棉花、油菜、甜菜以及15个其他玉米转化体，3个水稻转化体，6个大豆转化体，5个棉花转化体，8个油菜转化体和1个甜菜转化体进行特异性检测，检测结果如图1所示，从图1可看出本发明设计的引物和探针对以上非转基因作物及除98140玉米、356043大豆、73496油菜外的其他转基因转化体均没有特异扩增信号，图1中△Rn代表荧光原始信号减去背景信号的值。
同时，用无菌水将0.5％98140转基因玉米梯度稀释至相应的目标转化体含量的拷贝数分别为200、100、40、10、5、2、1个拷贝；将1％356043转基因大豆和1％73496转基因油菜分别梯度稀释至相应的目标转化体含量的拷贝数分别为1000、100、40、10、5、2、1个拷贝。每个浓度梯度设置15次重复，对本发明的灵敏度进行检测，数据见表1。
表1
ND：没有检测到信号。
另外，采用本发明的方法对0.5％98140玉米、1％356043大豆以及1％73496油菜几种标准品(欧盟)作为未知样品进行定量检测，分别编号为S1、S2、S3。每个样品检测反应重复三次，每次3个平行，以验证方法的准确性数据见表2。
表2
采用本发明能够精准检测三种转基因事件中gat基因与pinⅡ终止子相连位点的构建结构及其外源基因含量。获得98140转基因玉米标准曲线斜率，在-3.50～-3.37之间；356043转基因大豆标准曲线斜率，在-3.40～-3.22之间；73496转基因油菜标准曲线斜率，在-3.50～-3.44之间。相关系数均大于0.99，在90％～110％的范围内。对待检样品S1的定量检测结果为0.564％，对待检样品S2的定量检测结果为1.024％，对待检样品S3的定量检测结果为1.092％，三个样品检测结果与其证书含量值(分别为0.5％、1.0％、1.0％)的偏差率分别为12.76％、2.38％、9.18％，均小于国际认可偏差标准25％。本发明灵敏度测定结果表明，本发明的转化体含量最低检测限5个拷贝。
由以上检测结果可得知，本方法的各指标均满足国际认可的精准基因定量检验方法的范围，本发明的扩增效率高、准确度高。
SEQUENCE LISTING
<110> 四川省农业科学院分析测试中心
<120> 含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针及方法
<130>
<160> 3
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 上游引物（gat-tpinⅡ-F1）
<400> 1
agttrggmtt cagygagcar ggaga 25
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 下游引物（gat-tpinⅡ-R）
<400> 2
ccaatccaga agatggacaa gtc 23
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> 荧光探针（gat-tpinⅡ-P2）
<400> 3
cckccagtwg gacctcacat cctgatgtat 30
Claims (5)
1.含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测的引物和探针，其特征在于,
上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；
下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；
荧光探针序列，
gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'。
2.含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测方法，其特征在于,包括以下步骤：
(1)合成以下引物及与引物配合使用的荧光探针，
上游引物序列，gat-tpinⅡ-F1：5'-AGTTRGGMTTCAGYGAGCARGGAGA-3'；
下游引物序列，gat-tpinⅡ-R：5'-CCAATCCAGAAGATGGACAAGTC-3'；
荧光探针序列，
gat-tpinⅡ-P2：5'-FAM-CCKCCAGTWGGACCTCACATCCTGATGTAT-TAMRA-3'；
(2)制备DNA稀释液；
(3)配制PCR反应体系；
(4)定量PCR检测。
3.根据权利要求2所述的含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测方法，其特征在于，步骤(1)中合成的引物及荧光探针的浓度均为10μmol/l，步骤(2)中制备的DNA稀释液的浓度为50ng/μl。
4.根据权利要求3所述的含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测方法，其特征在于，步骤(3)中所述的配制PCR反应体系，即将DNA稀释液加入到反应体系中，所述反应体系包括以下组分：
5.根据权利要求4所述的含有gat-tpinⅡ结构转基因植物实时PCR精准检测方法，其特征在于，所述PCR反应条件为：95℃预变性10min，1个循环；95℃变性15s，56℃退火60s，45个循环。
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