CN102876800A - 转植酸酶基因玉米或饲料中植酸酶基因的定量检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种转植酸酶基因玉米种子或含有该玉米种子的饲料中植酸酶基因的定量检测方法，包括以下步骤：(1)建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程；(2)以待检测样品的DNA为模板，分别以扩增玉米内参基因的一对特异引物、扩增植酸酶基因的一对特异引物或者扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，计算出Ct值差值，将Ct值差值代入所构建的标准曲线和线性方程，得到待检测样品中植酸酶基因的含量。本发明方法能够快速、准确、高通量的测定转基因玉米或添加了转植酸酶基因玉米饲料中的转植酸酶基因的含量，具有操作简便、准确、灵敏度高、避免交叉污染等优点。

Description

转植酸酶基因玉米或饲料中植酸酶基因的定量检测方法

技术领域

本发明涉及一种转基因种子或含有该转基因种子的饲料中转基因含量的检测方法，尤其涉及一种转植酸酶基因玉米或含有转植酸酶基因玉米饲料中植酸酶基因的定量检测方法，属于转植酸酶基因玉米的定量检测领域。

背景技术

自1996至2010年，全球转基因作物的种植面积在十五年间增长了87倍，截止2010年达到1.48亿公顷，且每年都以10％以上的速度增长。迄今为止，共有59个国家批准种植或进口生物技术作物用于食物和饲料，其中包括29个国家批准了生物技术作物的本地化种植，全世界75％的人口居住在这59个国家。

截至目前所发展的转基因植物中，转基因玉米、大豆、棉花、油菜籽和马铃薯等都与饲料有关，用于动物的日粮中，其中占转基因植物总种植面积80％以上的玉米和大豆在饲料中广泛应用。世界上每年约有4000万吨转基因玉米用于饲喂动物。大豆和豆粕是饲料中的主要蛋白原料，因此用作饲料的转基因大豆也有约7400多万吨。加上棉籽粕和油菜籽粕，每年用于饲料的转基因植物约为1.2亿吨以上。并且由于转基因技术的快速发展，目前已有60～70％的饲料原料与转基因植物相关，例如抗虫的转基因玉米和棉花，抗草甘膦的玉米和大豆等。正是由于转基因作物发展迅猛，因此对转基因植物及其产品的检测方法也成为当今关注的技术。

玉米为中国的第一大粮食作物。2011年，中国玉米播种面积已达到4.8亿亩，位居世界第二。中国玉米总需求量的近80％作为饲料，并且这个比例还在不断增加。转植酸酶基因玉米于2009年8月获中国农业部颁发的《农业转基因生物安全证书》，获准进行生产应用，它是中国第一例批准生产应用的转基因玉米。转植酸酶基因玉米是以玉米种子作为生物反应器来生产植酸酶，通过生物技术和传统育种方法相结合，将具有自主知识产权的植酸酶基因转化到玉米中，培育出具有高活性植酸酶并稳定遗传的转基因玉米。植酸酶在动物的胃中释放出来而降解饲料中的植酸磷，从而解决了饲料中植酸磷不能被动物吸收利用和导致环境污染等诸多问题。正是由于植酸酶所具有的安全、环保、高效、经济等特点以及很好的社会生态环境效益，因此，在欧洲大部分国家已强制在饲料中使用植酸酶，目前中国市场上的单胃动物饲料中已经有90％添加了植酸酶，植酸酶的推广应用可使植物性饲料中磷的利用率提高60％，粪便中磷的排出量减少40％，从而减少饲料中无机磷的添加量，降低饲料成本，减少高磷粪便造成的环境污染，还可降低植酸盐的抗营养作用，因此对提高畜牧生产效益及降低其对环境的污染有重要意义。在转植酸酶基因玉米诞生之前，在饲料中广泛使用的植酸酶是通过微生物发酵生产的，而转植酸酶基因玉米使用将更为经济、方便、有效。按照目前的饲料工业发展现状，预计转植酸酶基因玉米的市场需求量为每年5000万吨(1000单位植酸酶/公斤玉米种子)，应用后可替代饲料中所添加的磷酸氢钙80万吨，减少动物粪便中磷的排除量100万吨并降低饲料成本20亿元。

随着转基因玉米的不断商品化，针对该类产品的检测方法也需要尽快完善。目前，转基因作物的检测方法主要包括核酸水平和蛋白质水平的检测。其中，核酸水平检测分为定性和定量检测，定性常用的方法是PCR检测技术，通过对样品中可能含有的外源基因进行扩增，再利用琼脂糖凝胶电泳进行鉴定，如果电泳结果含有特异条带，说明样品中含有转基因成分。定量检测常用的是实时荧光定量PCR检测，通过收集荧光信号判断待测样品的初始拷贝数，从而判断待测样品中是否含有转基因成分。

对于转植酸酶基因玉米核酸水平上的检测，现有技术(中国专利申请公开号：CN101792811A、CN101792812A等)仅仅能够实现定性检测，有待改进。

发明内容

本发明的主要目的是提供一种定量检测转植酸酶基因玉米种子或含有转植酸酶基因玉米饲料中植酸酶基因含量的方法。

本发明的主要目的是通过以下技术方案来实现的：

一种转植酸酶基因玉米种子或含有转植酸酶基因玉米种子的饲料中植酸酶基因的定量检测方法，包括以下步骤：

(1)建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程；(2)以待检测样品的DNA为模板，以扩增玉米内参基因的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得待检测样品的DNA中内参基因的Ct值；以待检测样品的DNA为模板，以扩增植酸酶基因的一对特异引物或者是扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得待检测样品的DNA中植酸酶基因的Ct值；计算出二次实时荧光定量PCR扩增的Ct值差值，将Ct值差值代入步骤(1)所构建的标准曲线和线性方程，得到待检测样品中植酸酶基因的含量。

其中，所述转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程按照以下方法建立：

(1)制备转植酸酶基因玉米的标准品DNA或含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA；(2)以所制备的标准品DNA为模板，以扩增玉米内参基因的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得标准品DNA中内参基因Ct值；以所制备的标准品DNA为模板，以扩增植酸酶基因的一对特异引物或者是扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，获得标准品DNA中植酸酶基因的Ct值；(3)建立转植酸酶基因玉米或含有转植酸酶基因玉米饲料的定量检测标准曲线和线性方程；

所述转植酸酶基因玉米的标准品DNA按照以下方法制备得到：将转植酸酶基因玉米基因组DNA与非转基因玉米基因组DNA按梯度比例混合，混合后控制转基因玉米DNA含量(按质量百分比计)分别为0.5％，1％，2％，5％，10％；

所述含有转植酸酶基因玉米的饲料的标准品DNA按照以下方法制备得到：将添加有转植酸酶基因玉米的饲料基因组DNA与未添加转基因玉米的饲料基因组DNA按照梯度比例混合，混合后控制转植酸酶基因饲料的基因组DNA含量(按质量百分比计)分别为2％，5％，10％，20％，50％。

优选的，步骤(3)所述的转植酸酶基因玉米的定量检测标准标准曲线和线性方程按照以下方法建立：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的转植酸酶基因玉米标准品DNA中内参基因Ct值和转植酸酶基因玉米标准品DNA中植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以转植酸酶基因玉米标准品DNA中转植酸酶基因玉米基因组DNA含量(0.5％，1％，2％，5％，10％)(按质量百分比计)含量为横坐标，建立转植酸酶基因玉米的定量检测标准曲线和线性方程。

步骤(3)所述的含有转植酸酶基因玉米的饲料的定量检测标准标准曲线和线性方程按照以下方法建立：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA中内参基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以标准DNA中转植酸酶基因玉米饲料的基因组DNA含量(2％，5％，10％，20％，50％)(按质量百分比计)为横坐标，建立含有转植酸酶基因玉米的饲料的定量检测标准曲线和线性方程。

本发明中所述的玉米内参基因优选是Maize actin 1(MAc1)(Genbank登录号：No.J01238)；所述植酸酶基因优选是PhyAO基因(Genbank登录号：No.HQ233651)。

本发明中用于扩增玉米内参基因的一对特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述的扩增植酸酶基因的一对特异引物选自由SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示核苷酸序列组成的引物对或由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示核苷酸序列组成的引物对；所述扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

至于本发明中所述的实时荧光定量PCR扩增的反应体系以及扩增条件，本领域所属技术人员根据扩增时所用到的引物对的具体序列以及待扩增的产物的长度等很容易确定得到PCR扩增的反应体系以及相应的扩增条件，这些技术手段为均本领域技术人员所熟练掌握，作为参考，本发明中所述的实时荧光定量PCR扩增的反应体系可参照以下体系建立：

2×SYBR Green Realtime PCR Mix 10μL，待测样品DNA或者标准品DNA 1μL，4μmol/L的上游引物1μL，4μmol/L的下游引物1μL，加入双蒸水至总体积为20μL；

本发明中所述的实时荧光定量PCR的反应条件优选为：95°C预变性3分钟，然后反应40个循环，每个循环包括95°C 15秒，56°C 15秒，72°C 30秒。

本发明所提供的PCR检测用特异引物序列包括转入玉米中的植酸酶基因PhyAO特异序列以及植酸酶PhyAO基因表达框中构建载体终止子与基因结合区域的特异序列，保证了定量检测转植酸酶基因玉米的特异性和有效性。本发明方法能够快速、准确、高通量的测定转基因玉米以及添加了转基因玉米饲料中的转基因成分的含量，具有操作简便、准确、灵敏度高、避免交叉污染等优点。

附图说明

图1引物对A/B检测玉米种子的标准曲线和线性方程。

图2引物对C/D检测玉米种子的标准曲线和线性方程。

图3引物对E/F检测玉米种子的标准曲线和线性方程。

图4引物对A/B检测添加有转植酸酶基因玉米的饲料的标准曲线和线性方程。

图5引物对C/D检测添加有转植酸酶基因玉米的饲料的标准曲线和线性方程。

图6引物对E/F检测添加有转植酸酶基因玉米的饲料的标准曲线和线性方程。

具体实施方式

下面结合具体实施例来进一步描述本发明，本发明的优点和特点将会随着描述而更为清楚。但这些实施例仅是范例性的，并不对本发明的范围构成任何限制。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。

一、试剂与溶液

1.SDS溶液配制：100mM EDTA(pH：8.0)，20mM Tris-HCl(pH8)，500mM NaCl，1.5％SDS。

2.RNA酶母液：将RNA酶溶于10mmol/L Tris-HCl(pH7.5)、15mmol/L NaCl中，配成浓度为10mg/mL的溶液，100℃加热15分钟，缓慢冷却至室温，分装成小份保存于-20℃。

3.酚/氯仿/异戊醇(25∶24∶1)

4.氯仿/异戊醇(24∶1)

5.TE缓冲液：100mL去离子水中加入0.010mol/L Tris-HCl(pH8.0)，0.001mol/L EDTA(pH 8.0)，定容至200mL，高压灭菌，4℃保存。

6.SYBR Green Realtime PCR Mix(东洋纺(上海)生物科技有限公司)

二.检测用特异引物的设计及序列

查找获得玉米看家Maize actin 1(MAc1)基因序列，设计特异引物对CK1(5’ATGTTTCCTGGGATTGCCGAT3’)(SEQ ID No.1)和CK2(5’GCATCACAAGCCAGTTTAACC3’)(SEQ ID No.2)，作为内参基因检测样品模板量。

依据转入玉米中的植酸酶PhyAO基因序列设计特异引物对A(5’TTCGCATGATAACGGCATC3’)(SEQ ID No.3)和B(5’CCAAAGCATCAACCGGACAG3’)(SEQ ID No.4)，扩增片段长度为248bp。C(5’AACATTGTCCCGTTCATCCG3’)(SEQ ID No.5)和D(5’GTGAAATTGGCTTCGATGTC3’)(SEQ ID No.6)，扩增片段长度为239bp。同时，依据转化玉米时所用载体中表达框序列信息设计终止子与基因结合区域的特异引物对E(5’ATAGCTTCGTGAAGGGTTTG3’)(SEQ ID No.7)和F(5’CACGCAGTTTAACCATGAGC3’)(SEQ ID No.8)，扩增片段长度为170bp。

实施例1转植酸酶基因玉米种子中植酸酶基因定量测定方法的建立

1、玉米种子基因组DNA提取

操作步骤：

(1)将转植酸酶基因玉米种子或非转基因玉米种子研磨成粉末：

(2)研磨管中装入玉米种子，加入钢珠，放置在研磨仪中，速度定为1400strokes/min，每次30sec，每个样品要至少进行两次研磨。两次进行完毕后，取出查看研磨程度，假如不能达到要求，继续时每进行一次就要查看研磨程度是否达到要求。继续研磨时速度酌情增加至1500、1600、1700strokes/min，但最大不能超过1700strokes/min，研磨后的样品通过0.45mm的标准筛，充分混匀。

(3)取玉米粉末5g，加入预冷的研钵，加入液氮再次研磨。

(4)研磨后的粉末使用植物基因组提取试剂盒(天根生化科技(北京)有限公司)提取基因组DNA。

2、检测转植酸酶基因玉米中植酸酶基因含量的标准品DNA的制备

将提取的转基因玉米基因组DNA和非转基因玉米基因组DNA各取1微升，用NanoDrop分光光光度计测定DNA浓度，然后用TE缓冲液调整这两种DNA浓度到50ng/μl，再将转植酸酶基因玉米基因组DNA与非转基因玉米基因组DNA按梯度比例混合，混合后控制转植酸酶基因玉米基因组DNA含量(按质量百分比计)分别为0.5％，1％，2％，5％，10％。

3、实时荧光定量PCR检测

PCR检测的反应体系：

PCR反应条件：95°C预变性3分钟，然后反应40个循环，每个循环包括95°C 15秒，56°C 15秒，72°C 30秒。

4、标准品DNA的定量和标准曲线的确定

以玉米标准DNA为模板，分别用引物对CK1/CK2，A/B，C/D，E/F按照上述步骤3中所述的PCR反应体系和反应条件进行扩增。荧光信号强度变化由实时荧光定量PCR仪自动收集，检测在统计学上显著荧光发射时所对应的PCR循环次数(Ct值)。实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的标准DNA中内参基因MAc1和植酸酶基因PhyAO的Ct值，以植酸酶基因PhyAO的Ct值或植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的Ct值与内参基因MAc1 Ct值的差值(ΔCt)为纵坐标，标准品DNA中转基因玉米基因组DNA含量(按质量百分比计)(0.5％，1％，2％，5％，10％)为横坐标，制定出转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程(图1-图3)。

5、样品的测定和计算定量

以检测样品基因组DNA为模板，分别用引物对CK1/CK2，A/B，C/D，E/F按照上述步骤3中所述的PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增。从实时荧光定量PCR仪检测软件中得到的Ct值差值(ΔCt)(植酸酶基因PhyAO的Ct值或植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的Ct值与内参基因MAc1 Ct值的差值)代入标准曲线公式，得到样品中转基因成分的含量，检测结果见表1。

表1转植酸酶基因玉米种子样品定量测定结果

实施例2添加有转植酸酶基因玉米的饲料中植酸酶基因定量测定方法的建立

1、饲料基因组DNA的提取

(1)对于饲料样品，使用分析研磨机进行研磨，研磨后的样品也通过0.45mm的标准筛，充分混匀。取5g饲料样品在研钵中加入液氮再次研磨成粉末。取300mg样品到2mL离心管中。

(2)离心管中加入1.5ml 65°C SDS提取缓冲液(65°C水浴预热)，65°C保温15min，并不断颠倒混匀，15000r/min室温离心15min。

(3)取上清1mL于新的1.5ml离心管中，加入RNA酶(终浓度10μg/mL)，37°C保温30min。

(4)冷却至室温后，加入等体积的Tris饱和酚，颠倒混匀，4°C下13000r/min离心15min上清液转移至新的1.5mL离心管，加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，颠倒混匀，4°C下13000r/min离心10min(如果蛋白太多重复此步骤)。上清液转移至新的1.5mL离心管，在加入氯仿/异戊醇，颠倒混匀，4°C下13000r/min离心5min。

(5)DNA沉淀

取上清液加入两倍体积预冷(-20°C)的异丙醇中，旋转混匀，冰浴10min。13000r/min离心5min。

(6)DNA洗涤

加入适量70％乙醇浸泡洗涤，10000r/min离心5min，倒掉乙醇，重复3次，自然干燥后加100μL TE溶解沉淀，-20℃保存。

2、检测添加转植酸酶基因玉米饲料中植酸酶基因含量的标准品DNA的制备

将提取的添加有转植酸酶基因玉米的饲料基因组DNA和未添加转植酸酶基因玉米的饲料基因组DNA各取1微升，用NanoDrop分光光光度计测定DNA浓度，然后用TE缓冲液调整这两种DNA浓度到100ng/μl，再将这两种基因组DNA按梯度比例混合，混合后控制添加了转植酸酶基因玉米饲料的基因组DNA含量分别为2％，5％，10％，20％，50％(按质量百分比计)。

3、实时荧光定量PCR检测

按照实施例1中步骤3中所述的实时荧光定量PCR的反应体系和反应条件进行PCR检测

4、标准品的定量和标准曲线的确定

以饲料基因组标准DNA为模板，分别用引物对CK1/CK2，A/B，C/D，E/F按照3中所述的PCR体系进行扩增。荧光信号强度变化由实时荧光定量PCR仪自动收集，检测在统计学上显著荧光发射时所对应的PCR循环次数(Ct值)。实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的饲料标准品DNA中内参基因MAc1的Ct值、植酸酶基因PhyAO的Ct值或植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的Ct值，以植酸酶基因PhyAO的Ct值或植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的Ct值与内参基因MAc1 Ct值的差值(ΔCt)为纵坐标，饲料标准品DNA中添加了转植酸酶基因玉米饲料DNA含量(2％，5％，10％，20％，50％)(按质量百分比计)为横坐标，制定出转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程(图4-6)。

5、以待检测饲料样品基因组DNA为模板，分别用引物对CK1/CK2，A/B，C/D，E/F按照实施例1步骤3中所述的PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增。从实时荧光定量PCR仪检测软件中得到的Ct值差值(ΔCt)(植酸酶基因PhyAO的Ct值或植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的Ct值与内参基因MAc1 Ct值的差值)代入标准曲线公式，得到饲料样品中转基因成分的含量，测定结果见表2。

表2饲料样品中转植酸酶基因定量测定结果

由上述实验结果可知，本发明利用荧光定量PCR的方法能够快速、高通量的测定转植酸酶基因玉米以及添加了转植酸酶基因玉米的饲料中的转基因成分的含量。

                        序列表

 

<110>  中国农业科学院生物技术研究所

 

<120>  转植酸酶基因玉米或饲料中植酸酶基因的定量检测方法

 

<130>  DQXL-0012

 

<160>  8    

 

<170>  PatentIn version 3.5

 

<210>  1

<211>  21

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  1

atgtttcctg ggattgccga t                                                 21

 

 

<210>  2

<211>  21

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  2

gcatcacaag ccagtttaac c                                                 21

 

 

<210>  3

<211>  19

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  3

ttcgcatgat aacggcatc                                                    19

 

 

<210>  4

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  4

ccaaagcatc aaccggacag                                                   20

 

 

<210>  5

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  5

aacattgtcc cgttcatccg                                                   20

 

 

<210>  6

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  6

gtgaaattgg cttcgatgtc                                                   20

 

 

<210>  7

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  7

atagcttcgt gaagggtttg                                                   20

 

 

<210>  8

<211>  20

<212>  DNA

<213>  artifical sequence

 

<400>  8

cacgcagttt aaccatgagc                                                   20

Claims (10)

1.一种转植酸酶基因玉米种子或含有转植酸酶基因玉米种子的饲料中植酸酶基因的定量检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程；(2)以待检测样品的DNA为模板，分别以扩增玉米内参基因的一对特异引物、扩增植酸酶基因的一对特异引物或者是扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，计算出二次实时荧光定量PCR扩增的Ct值差值，将Ct值差值代入步骤(1)所构建的标准曲线和线性方程，得到待检测样品中植酸酶基因的含量。

2.按照权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程按照以下方法建立：

(1)制备转植酸酶基因玉米的标准品DNA或含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA；(2)以所制备的标准品DNA为模板，以扩增玉米内参基因的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准品DNA中内参基因Ct值；以所制备的标准品DNA为模板，以扩增植酸酶基因的一对特异引物或者是扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物进行实时荧光定量PCR扩增，得到标准品DNA中植酸酶基因的Ct值；(3)建立转植酸酶基因玉米或含有转植酸酶基因玉米饲料的定量检测标准曲线和线性方程。

3.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的转植酸酶基因玉米的定量检测标准曲线和线性方程按照以下方法建立：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的标准品DNA中内参基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以标准品DNA中转植酸酶基因玉米基因组DNA含量为横坐标，建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程；

步骤(3)所述的含有转植酸酶基因玉米饲料的标准曲线和线性方程按照以下方法建立：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA中内参基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以标准DNA中转植酸酶基因玉米饲料的基因组DNA含量为横坐标，建立定量检测标准曲线和线性方程。

4.按照权利要求3所述的方法，其特征在于：步骤(3)所述的转植酸酶基因玉米的定量检测标准曲线和线性方程按照以下方法建立：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的标准品DNA中内参基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以转植酸酶基因玉米标准品DNA中植酸酶基因组DNA含量的0.5％，1％，2％，5％，10％为横坐标，建立转植酸酶基因玉米定量检测标准曲线和线性方程；

步骤(3)所述的含有转植酸酶基因玉米饲料的标准曲线和线性方程按照以下方法建立：根据实时荧光定量PCR仪中的软件记录下检测得到的含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA中内参基因Ct值和植酸酶基因的Ct值，以植酸酶基因的Ct值与内参基因Ct值的差值为纵坐标，以标准DNA中转植酸酶基因玉米饲料的基因组DNA含量的2％，5％，10％，20％，50％为横坐标，建立定量检测标准曲线和线性方程。

5.按照权利要求2所述的方法，其特征在于：所述转植酸酶基因玉米的标准品DNA按照以下方法制备得到：将转植酸酶基因玉米基因组DNA与非转基因玉米基因组DNA按梯度比例混合，即得；

所述含有转植酸酶基因玉米的饲料的标准品DNA按照以下方法制备得到：将添加有转植酸酶基因玉米的饲料基因组DNA与未添加转基因玉米的饲料基因组DNA按照梯度比例混合，即得。

6.按照权利要求5所述的方法，其特征在于：所述转植酸酶基因玉米的标准品DNA按照以下方法制备得到：将转植酸酶基因玉米基因组DNA与非转基因玉米基因组DNA按梯度比例混合，控制转基因玉米中植酸酶基因DNA含量分别为0.5％，1％，2％，5％，10％；

所述含有转植酸酶基因玉米饲料的标准品DNA按照以下方法制备得到：将添加有转植酸酶基因玉米的饲料基因组DNA与未添加转基因玉米的饲料基因组DNA按照梯度比例混合，控制转植酸酶基因玉米饲料基因组DNA含量分别为2％，5％，10％，20％，50％。

7.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的玉米内参基因是Maize actin 1；所述植酸酶基因是PhyAO基因。

8.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：用于扩增玉米内参基因的一对特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示；所述的扩增植酸酶基因的一对特异引物选自由SEQ ID No.3和SEQ IDNo.4所示核苷酸序列组成的引物对或由SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示核苷酸序列组成的引物对；所述扩增植酸酶基因表达框中构建载体终止子与植酸酶基因结合区域的一对特异引物的核苷酸序列分别为SEQ ID No.7和SEQ ID No.8所示。

9.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR扩增的反应体系为：2×SYBR Green Realtime PCR Mix 10μL，待测样品DNA或者玉米标准品DNA 1μL，4μmol/L的上游引物1μL，4μmol/L的下游引物1μL，加入双蒸水至总体积为20μL。

10.按照权利要求1或2所述的方法，其特征在于：所述的实时荧光定量PCR扩增的反应条件为：95°C预变性3分钟，然后反应40个循环，每个循环包括95°C 15秒，56°C 15秒，72°C 30秒。

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