CN105861500A - 一套用于转基因作物检测的多核苷酸、方法和试剂盒 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于转基因作物检测的多核苷酸、方法和试剂盒。具体地本发明中公开了可用作转基因作物实时荧光PCR检测标准分子的多核苷酸构建物pLW10及其配套引物探针的序列。本发明的质粒标准分子解决了转基因作物实时荧光PCR检测中标准物质缺乏的难题，保证转基因作物实时荧光PCR方法检测结果的可比性，为转基因作物实时荧光PCR方法检测提供了可靠质量控制方法。

Description

一套用于转基因作物检测的多核苷酸、方法和试剂盒
技术领域
本发明涉及一套生物工程技术领域的质粒分子，具体涉及一套用于转基因作物检测的多核苷酸、方法和试剂盒。
背景技术
转基因技术将基因在不同物种之间转移，改造生物的遗传物质，使其在性状、营养品质、消费品质等方面向人类所需要的目标转变，满足人类的各种需求，例如提高产量、表达特殊营养成分甚至获得抗除草剂抗病毒或抗虫害的能力。但是随着转基因作物在全世界范围内的广泛种植，其食用安全和环境安全问题也引起了广大消费者和各国政府及相关机构人员的重视。转基因产品标识已成为各国转基因产品监管的重要部分。已有欧盟、日本、韩国、澳大利亚、新西兰等多个国家和地区出台了对转基因生物产品实施强制性标签的制度，规定了食品中转基因成分含量的最低标识限量。我国2002年于1月5日颁布了《农业转基因生物标识管理办法》，该管理办法明确规定对转基因生物的标识管理就是为了规范农业转基因生物的销售行为，引导农业转基因生物的生产和消费，保护消费者的知情权。因此，针对不断商品化的转基因产品建立相应的定量检测方法，对检测过程进行严格的计量学考察，提高转基因检测的量值溯源水平，建立完整的转基因检测量值溯源规范，保证转基因检测结果的可靠、可比和通用性。
转基因检测方法常通过检测核酸来实现，其中实时荧光定量PCR是核酸检测的主要方法。实时荧光定量PCR作为一种相对定量方法，需要有准确量值的阳性标准物质制作标准曲线，根据标准曲线给被测物赋值。阳性标准物质的量值准确可靠对定量工作有重要意义，此外在以定性为目的的PCR检测过程中，也需要用阳性标准物质进行方法质量控制和结果确认。因此，研制转基因质粒DNA标准物质，有助于转基因产品检测检验能力提升。
目前，转基因生物检测的标准物质尤其是质粒DNA标准物质还很缺乏。现在国内的转基因作物标准物质种类少，而且传统转基因基体标准物质采用质量百分比量值作为关键量值，基因组大小差异、DNA提取效率差异对荧光定量PCR检测的拷贝数含量结果都有影响，往往不确定度较大。例如玉米种子，胚是二倍体，而胚乳是三倍体。同样是玉米，其不同品种的基因组大小差异很大，单倍体基因组大小在2.45pg(2364Mb)到3.35pg(3233Mb)之间，因此很难通过质量准确计算其拷贝数。而质粒DNA标准物质可以通过人工构建，使转基因序列和内标基因的拷贝数比例为1:1，计算简单，增强了量值过程中的可溯源性和量值的可靠性。质粒分子可以通过微生物进行大量培养，DNA易于扩增，所以可提供无限稳定量的标准物质，并且纯度较高；且操作容易，稳定性高。此外，对于加工食品和饲料中同时含有多个组分，如玉米、大豆、马铃薯等组分或一个组分有多个不同品系的转基因产品的检测，检测工作就十分繁复。对这种多组分、多品系的转基因产品检测，使用单一的转基因标准物质不仅用量大，而且配制方法复杂，工作量大，还很容易出现漏检的情况。研制包含多个通用转基因靶标的转基因检测通用质粒DNA标准分子才能满足转基因检测实验室对样品中的多组分、多品系转基因成分的定量检测需求。
发明内容
本发明的目的在于提供一套适用于转基因作物检测的质粒标准分子及其应用。
本发明的第一方面，提供了一种分离的多核苷酸，所述多核苷酸包含：
花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列、NOS终止子基因序列、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列、和玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列。
在另一优选例中，所述分离的多核苷酸还包括植物内标准基因18s rRNA编码序列。
在另一优选例中，所述花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列如SEQ ID NO.1所示。
在另一优选例中，所述NOS终止子基因序列如SEQ ID NO.2所示。
在另一优选例中，所述新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列如SEQ ID NO.3所示。
在另一优选例中，所述玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列如SEQ ID NO.4所示。
在另一优选例中，所述植物内标准基因18s rRNA编码序列如SEQ ID NO.5所示。
本发明的第二方面，提供了一种分离的DNA构建物，所述DNA构建物中包含本发明第一方面所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、和/或载体序列。
在另一优选例中，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
在另一优选例中，所述DNA构建物为质粒。
在另一优选例中，所述的质粒或表达载体作为转基因作物检测的标准分子(质粒标准分子)。
在另一优选例中，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pcDNA3.1(+)，pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK和pGEM。
在另一优选例中，所述分离的DNA构建物如SEQ ID NO.6所示。
本发明的第三方面，提供了一套试剂盒，所述试剂盒中包括本发明第一方面所述的多核苷酸或者本发明第二方面所述的DNA构建物。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括第一引物对，所述第一引物对特异性扩增所述花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列。
在另一优选例中，所述第一引物对序列如SEQ ID NO.7和SEQ ID NO.8所示。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括第二引物对，所述第二引物对特异性扩增所述NOS终止子基因序列。
在另一优选例中，所述第二引物对序列如SEQ ID NO.9和SEQ ID NO.10所示。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括第三引物对，所述第三引物对特异性扩增所述新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列。
在另一优选例中，所述第三引物对序列如SEQ ID NO.11和SEQ ID NO.12所示。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括第四引物对，所述第四引物对特异性扩增所述玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列。
在另一优选例中，所述第四引物对序列如SEQ ID NO.13和SEQ ID NO.14所示。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括第五引物对，所述第五引物对特异性扩增所述植物内标准基因18s rRNA编码序列。
在另一优选例中，所述第五引物对序列如SEQ ID NO.15和SEQ ID NO.16所示。
在另一优选例中，所述试剂盒中还包括选自下组的一个或多个探针序列：
第一探针序列，所述第一探针序列如SEQ ID NO.:17所示；
第二探针序列，所述第二探针序列如SEQ ID NO.:18所示；
第三探针序列，所述第二探针序列如SEQ ID NO.:19所示；
第四探针序列，所述第四探针序列如SEQ ID NO.:20所示；
第五探针序列，所述第五探针序列如SEQ ID NO.:21所示。
本发明的第四方面，提供了如本发明第一方面所述的多核苷酸、本发明第二方面所述的DNA构建物、或本发明第三方面所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于转基因植物的检测。
在另一优选例中，所述检测为荧光定量PCR检测。
本发明的第五方面，提供了一种转基因作物实时荧光定量PCR检测方法，所采用的标准物质是如本发明第一方面所述的多核苷酸或本发明第二方面所述的DNA构建物。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1是18s rRNA扩增的标准曲线。
图2是CaMV35S基因扩增的标准曲线。
图3是NOS基因扩增的标准曲线。
图4是NPTII基因扩增的标准曲线。
图5是FMV基因扩增的标准曲线。
图6本发明质粒分子的结构示意图。
具体实施方式
本发明人通过广泛而深入的研究，获得一段能够用于转基因作物实时荧光PCR检测的多核苷酸序列以及与之相配合的引物对，实验结果表明，采用合适的骨架质粒将所述多核苷酸序列制备为标准质粒分子，并配合本发明的引物对进行实时荧光PCR检测，具有极佳的特异性和灵敏度，并且稳定性良好。
本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的转基因作物实时荧光PCR检测方法中缺乏阳性标准品和阳性标准品配置的问题，提供了一套适用于转基因作物实时荧光PCR检测的质粒标准分子以及该质粒标准分子的构建方法、定量方法和应用。
实时荧光PCR检测转基因作物的原理
采用实时荧光PCR技术可特异性扩增转基因作物的外源基因序列，设计针对外源基因的引物和两端标记荧光的探针，扩增测试样品DNA。实时荧光PCR可以通过检测荧光信号的增加来实时监测PCR产物。与此同时，用相同的引物、探针和条件扩增已知浓度的阳性标准物质(或阳性标准分子)。PCR方法中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以作为阳性对照；实时荧光PCR中，阳性标准物质(或阳性标准分子)可以构建稳定的标准曲线，根据标准曲线可分别计算出样品中对应基因的绝对含量(拷贝数或浓度)。
标准物质
标准物质是具有一套或多种足够均匀和量值确定了的特性值，用以校准设备，评价测量方法或给材料赋值的材料或物质。
质粒标准分子
本发明中涉及检测转基因作物中外源基因的特异性序列并在此基础上设计了一种质粒标准分子，优选地为质粒pLW10。
在本发明的一个优选地实施方式中，所述质粒标准分至包含：
花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列、NOS终止子基因序列、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列、和玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列。
在另一个优选地实施方式中，所述分离的多核苷酸还包括植物内标准基因18srRNA编码序列。
在另一个优选地实施方式中，所述花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列如SEQID NO.1所示：
在另一个优选地实施方式中，所述NOS终止子基因序列如SEQ ID NO.2所示：
在另一个优选地实施方式中，所述新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列如SEQID NO.3所示：
在另一个优选地实施方式中，所述玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列如SEQID NO.4所示：
在另一个优选地实施方式中，所述植物内标准基因18s rRNA编码序列如SEQ IDNO.5所示：
在另一个优选地实施方式中，所述质粒标准分子的序列如SEQ ID NO.6所示：
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了特异性扩增所述花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列的引物对：
正向引物：GGCTCCTACAAATGCCATCATT(SEQ ID NO.7)；和
反向引物：GGCAGAGGCATCTTCAACGA(SEQ ID NO.8)。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了特异性扩增所述NOS终止子基因序列的引物对：
正向引物：GATTAGAGTCCCGCAATTATACATTTAA(SEQ ID NO.9)；和
反向引物：TTATCCTAGTTTGCGCGCTATATTT(SEQ ID NO.10)。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了特异性扩增所述新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列：
正向引物：TGCCGAATATCATGGTGGAA(SEQ ID NO.11)；和
反向引物：CGGCCACAGTCGATGAATC(SEQ ID NO.12)。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了特异性扩增所述玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列：
正向引物：TCGAGCAGCTGGCTTGTG(SEQ ID NO.13)；和
反向引物：CGCCTAACAATTCTGCACCAT(SEQ ID NO.14)。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了特异性扩增所述植物内标准基因18s rRNA编码序列：
正向引物：TGACGGAGAATTAGGGTTCGA(SEQ ID NO.15)；和
反向引物：GGATGTGGTAGCCGTTTCTCA(SEQ ID NO.16)。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明还提供了如下的探针序列：
第一探针序列，特异性针对花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列：
CGATAAAGGAAAGGCC(SEQ ID NO.:17)；
第二探针序列，特异性针对所述NOS终止子基因序列：
ACGCGATAGAAAAC(SEQ ID NO.:18)；
第三探针序列，特异性针对所述新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列：
TGGCCGCTTTTCT(SEQ ID NO.:19)；
第四探针序列，特异性针对所述玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列：
ACCAGACAAAAAAG(SEQ ID NO.:20)；
第五探针序列，特异性针对所述植物内标准基因18s rRNA编码序列:
TCCGGAGAGGGAGC(SEQ ID NO.:21)。
本研究中设计的引物探针和模板分子的配套性好，相比SNT 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》中的引物探针对，PCR扩增效率可提高10％-20％，从而引起检测灵敏度的显著提高，检测限提高了5～10倍。如：采用本发明中CaMV35S基因的引物探针可使CaMV35S基因的拷贝数含量检测限提高了10倍，提高至13copies/μL。
本研究克服现有的转基因作物核酸定量PCR检测中阳性标准品缺乏和阳性标准品配制的难题，提供一种转基因作物通用的的质粒标准分子，可用于转基因作物中转基因成分的定性及定量检测。
在本发明的一个具体的实施方式中，本发明提供了一种转基因作物检测通用质粒分子，包含四个转基因通用元件：花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子(269bp)、NOS终止子(256bp)、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ(831bp)、玄参花叶病毒FMV 35S启动子(523bp)；以及在真核生物植物中高度保守的内标准基因18s rRNA。
在优选地实施方式中，在所述质粒分子中各转基因通用元件和内标准基因的拷贝数比例为1:1。
本发明的质粒DNA分子中包含四个转基因通用元件：花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子(269bp)、NOS终止子(256bp)、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ(831bp)、玄参花叶病毒FMV35S启动子(523bp)，涵盖大部分现有转基因作物的插入元件序列，因此可用于大部分转基因产品的定性检测。选取的插入元件序列涵盖现有转基因检测PCR方法的目标基因序列，因此该阳性标准分子可与转基因检测实验室中的已有引物探针或转基因检测试剂盒配套使用，普适性广。
在质粒分子中转基因插入元件和内标准基因的拷贝数比例固定为1:1，即按照GB19495.5-2004《转基因产品检测核酸定量PCR检测方法》中转基因成分含量计算方法，质粒分子中的转基因含量为100％，方便实际应用中转基因含量百分比的计算。
表1 质粒DNA标准分子的外源序列信息
试剂盒
本发明提供了一种检测转基因作物的试剂盒，所述试剂盒中包括：
上述质粒标准分子。
本发明提供的试剂盒中包含了特异性扩增该质粒标准分子中各转基因通用元件的引物对，能够方便的进行PCR检测，而且特异性强，灵敏度高，线性良好。
本发明的主要优点在于：
(1)包含本发明多核苷酸序列的质粒标准分子具有均匀性强，稳定性高的优点，同时本发明解决了转基因作物检测中标准物质缺乏的难题，保证转基因作物检测结果的可比性，为转基因作物PCR检测提供质量控制；
(2)使用本发明的质粒标准分子配合本发明的引物对制备的产品，用于实时荧光PCR检测转基因作物时，特异性强，灵敏度高，线性良好。
(3)本发明提供的试剂盒中包含了检测转基因作物的质粒标准分子(pLW10质粒标准分子)，该质粒的转基因含量为100％,采用拷贝数相比的计算方式，用此质粒做阳性标准品，转基因含量计算方便。质粒标准分子选取的四种插入元件序列涵盖现有转基因检测PCR方法的目标基因序列，可与转基因检测实验室中的已有引物探针或转基因检测试剂盒配套使用，普适性广。
(4)本发明提供的探针和模板分子的配套性好，检测灵敏度较高。
下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor LaboratoryPress,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。本发明实施例中所用的生物材料和试剂，如无特别说明，均可从市售渠道获得。
实施例1 质粒标准分子的构建
根据本发明的转基因作物通用质粒DNA标准物质的构建流程：
a.利用数据库(比如Genbank、上海市转基因生物安全性检测评估共享服务平台http://www.shgmo.org/welcome.htm)进行生物信息学分析，选取涵盖现有转基因元件检测方法的插入元件基因保守序列片段：花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子(269bp)、NOS终止子(256bp)、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ(831bp)、玄参花叶病毒FMV 35S启动子(523bp)。
b.将处理后的序列按一定顺序单拷贝连接起来，本实施例中连接顺序为花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子(269bp)－NOS终止子(256bp)－新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ(831bp)－玄参花叶病毒FMV 35S启动子(523bp)，人工合成序列(宝生物工程(大连)有限公司)，并将所得的全长基因克隆至质粒载体pcDNA3.1(+)(购自英潍捷基(上海)贸易有限公司)，构建获得包含目的基因序列的质粒pLW09。
c.在genbank中搜索真核生物内标准基因18s rRNA编码序列。
d.利用软件Primer 5.0设计引物用于扩增真核生物植物内标准基因18s rRNA。各引物的两端加上分子克隆所需的酶切位点及保护碱基。具体的引物序列见表2。PCR反应体系见表3，PCR反应步骤见表4。
表2 构建质粒DNA标准分子的PCR引物序列
表3 质粒标准分子中18sRNA序列的PCR扩增体系
反应试剂 用量(μL)
10×buffer 2
dNTP(2.5mM) 1
上游引物(10μM) 1
下游引物(10μM) 1
Ex Taq酶(5单位/反应) 0.5
DNA模板 1
ddH2O 补足至20μL
表4 质粒标准分子中18sRNA序列的PCR扩增条件
e.将扩增片段通过分子克隆手段将PCR扩增序列插入到质粒载体pLW09中，得到既包含转基因通用元件序列，又包含植物内标准基因序列的质粒DNA标准分子pLW10，转基因通用元件序列与植物内标准基因序列的拷贝数比例为1:1。
具体基因序列的克隆步骤：分别用限制性内切酶Sam I消化扩增得到真核生物18srRNA扩增片段与质粒pLW09，回收酶切后的PCR扩增序列及线性质粒pLW09，T4连接酶进行连接，连接产物转化大肠杆菌DH5α，得到质粒标准物质pLW10。
表5 酶切反应体系
表6 目的DNA片段连接反应体系
反应试剂 用量(μL)
10×T4连接酶buffer 2
T4连接酶 1
DNA片段 6
质粒载体 7
ddH2O 补足至20μL
实施例2 转基因作物通用检测质粒标准分子的应用
本实施例提供了一种所述的转基因作物通用检测质粒标准分子、配套引物对和探针在转基因荧光PCR检测法中的应用办法，包括以下步骤：
选用市场接受度较高的方法SNT 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》(中国出入境检验检疫行业标准)中的引物探针和PCR反应体系和反应时间温度程序作为转基因检测的标准方法，用实时荧光定量PCR法同时扩增外源转基因元件CaMV35S、FMV35S、NOS、NPTII和内源植物内标准基因扩增得到的Ct值相比。可在质粒DNA分子的具体浓度未知的情况下，将质粒DNA分子梯度稀释(至少5个浓度梯度)，分别扩增质粒DNA分子中的插入元件基因和内标准基因，制作标准曲线，横坐标为核酸拷贝数含量梯度稀释浓度，纵坐标为荧光PCR中的Ct值。同时扩增待检测转基因样品中的插入元件基因和内标准基因，得出两者的浓度含量(或稀释梯度)，转基因样品中插入元件基因和内标准基因的含量比值即为转基因含量的百分比。
具体步骤如下：
a.梯度稀释质粒DNA标准分子，浓度从106copies/μL～100copies/μL；
b.采用SNT 1204-2003《植物及其加工产品中转基因成分实时荧光PCR定性检验方法》中的实时荧光PCR反应程序，以梯度稀释的质粒DNA标准物质为模板进行实时荧光PCR扩增。每个反应重复三次，根据不同浓度模板扩增的Ct值与浓度之间的关系，建立标准曲线。
c.以各质粒DNA标准物质为模板建立的实时荧光PCR标准曲线见图1～5：
以各质粒DNA标准物质建立的标准曲线中相关系数均达到0.99，线性良好，3个平行反应间和3次不同重复实验间获得的Ct值标准偏差基本都小于0.2，定量PCR反应的重复性和重演性好，表明质粒DNA标准分子适合应用于实时荧光PCR检测，可作为实时荧光PCR扩增目前转基因作物检测常用的靶基因序列的阳性标准分子。
讨论：
本发明的质粒标准分子中包含了四种转基因通用元件，具有较广的覆盖度。由于质粒载体的容量有限，需要对转基因通用元件的长度进行选择，而且还需要避免PCR过程中不同转基因通用元件间可能存在的干扰。通过大量实验验证，本发明最终选用的各个具体的转基因通用元件长度合理，互不干扰，能够通过质粒进行大量扩增，制备简单，而且在PCR检测中具有良好的重复性和重演性，对引物的适用性好。由于本发明的标准分子包含多个转基因通用元件，对于加工食品和饲料中同时含有多个组分或多个不同品系的转基因产品的检测，可以仅需配制一次梯度稀释的标准溶液就能检测其转基因含量，极大地降低了检测过程中的工作量。对于转基因产品的定性检测，只要产品中检测出本质粒分子中插入元件的1种，即可认为是转基因产品，因此本发明的质粒分子适用范围很广。本发明的质粒分子中各转基因插入检测元件和植物内标准基因的比例是1:1,这和国家标准中转基因含量采用拷贝数百分比的形式一样，相较于普通的植物种子粉末标准物质采用质量比的方式，用本发明中质粒标准分子做阳性标准品无需单位转换，计算简单。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (10)

1.一种分离的多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸包含：
花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列、NOS终止子基因序列、新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列、和玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列；优选地，所述分离的多核苷酸还包括植物内标准基因18s rRNA编码序列。
2.如权利要求1所述的多核苷酸，其特征在于，所述花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列如SEQ ID NO.1所示；和/或
所述NOS终止子基因序列如SEQ ID NO.2所示；和/或
所述新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列如SEQ ID NO.3所示；和/或
所述玄参花叶病毒FMV 35S启动子基因序列如SEQ ID NO.4所示；和/或
所述植物内标准基因18s rRNA编码序列如SEQ ID NO.5所示。
3.一种分离的DNA构建物，其特征在于，所述DNA构建物中包含权利要求1所述的多核苷酸，以及任选的标签序列、酶切序列、和/或载体序列；优选地，所述DNA构建物为线性DNA构建物或环状DNA构建物。
4.如权利要求3所述的DNA构建物，其特征在于，所述质粒或表达载体的骨架质粒选自下组：pcDNA3.1(+)，pUC19，pUC18，pUC118，pUC119，pBlueScript II SK和pGEM。
5.如权利要求3所述的DNA构建物，其特征在于，所述分离的DNA构建物具有SEQ IDNO.6所示的核苷酸序列。
6.一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括权利要求1所述的多核苷酸或者权利要求2所述的DNA构建物。
7.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括第一引物对，所述第一引物对特异性扩增所述花椰菜花叶病毒CaMV35S启动子基因序列；和/或
所述试剂盒中还包括第二引物对，所述第二引物对特异性扩增所述NOS终止子基因序列；和/或
所述试剂盒中还包括第三引物对，所述第三引物对特异性扩增所述新霉素磷酸转移酶基因NPTⅡ基因序列；和/或
所述试剂盒中还包括第四引物对，所述第四引物对特异性扩增所述玄参花叶病毒FMV35S启动子基因序列；和/或
所述试剂盒中还包括第五引物对，所述第五引物对特异性扩增所述植物内标准基因18s rRNA编码序列。
8.如权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中还包括选自下组的一个或多个探针序列：
第一探针序列，所述第一探针序列如SEQ ID NO.:17所示；
第二探针序列，所述第二探针序列如SEQ ID NO.:18所示；
第三探针序列，所述第二探针序列如SEQ ID NO.:19所示；
第四探针序列，所述第四探针序列如SEQ ID NO.:20所示；
第五探针序列，所述第五探针序列如SEQ ID NO.:21所示。
9.如权利要求1所述的多核苷酸、权利要求2所述的DNA构建物、或权利要求3所述的试剂盒的用途，其特征在于，用于转基因植物的检测。
10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，所述检测为荧光定量PCR检测。
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Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107488732A (zh) * 2017-10-09 2017-12-19 贵州省产品质量监督检验院 检测辣椒转基因成分的三重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法
CN108624709A (zh) * 2018-06-20 2018-10-09 中国农业大学 一种检测转基因植物中目的基因表达的通用引物及检测方法
CN111020053A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 广州迪澳生物科技有限公司 一种可避免假阴性的转基因camv35s恒温荧光检测引物组及其试剂盒
CN111363840A (zh) * 2020-03-30 2020-07-03 上海市计量测试技术研究院 一种检测基于RNAi转基因植物双链RNA的试剂盒及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1485438A (zh) * 2002-09-24 2004-03-31 深圳市匹基生物工程股份有限公司 荧光PCR定性检测含有NptⅡ基因转基因作物探针序列及试剂盒

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1485438A (zh) * 2002-09-24 2004-03-31 深圳市匹基生物工程股份有限公司 荧光PCR定性检测含有NptⅡ基因转基因作物探针序列及试剂盒

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FRAITURE ET AL: "Integrated DNA walking system to characterize a broad spectrum of GMOs in food/feed matrices", 《BMC BIOTECHNOLOGY》 *
梁文等: "转基因大豆质粒DNA标准物质的研制", 《实验室研究与探索》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107488732A (zh) * 2017-10-09 2017-12-19 贵州省产品质量监督检验院 检测辣椒转基因成分的三重荧光pcr引物组、探针组、试剂盒及方法
CN108624709A (zh) * 2018-06-20 2018-10-09 中国农业大学 一种检测转基因植物中目的基因表达的通用引物及检测方法
CN111020053A (zh) * 2019-12-24 2020-04-17 广州迪澳生物科技有限公司 一种可避免假阴性的转基因camv35s恒温荧光检测引物组及其试剂盒
CN111363840A (zh) * 2020-03-30 2020-07-03 上海市计量测试技术研究院 一种检测基于RNAi转基因植物双链RNA的试剂盒及其应用

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