EA036151B1 - Выделение геномной днк из остающихся, подвергнутых экстракции образцов семян - Google Patents

Выделение геномной днк из остающихся, подвергнутых экстракции образцов семян Download PDF

Info

Publication number
EA036151B1
EA036151B1 EA201591107A EA201591107A EA036151B1 EA 036151 B1 EA036151 B1 EA 036151B1 EA 201591107 A EA201591107 A EA 201591107A EA 201591107 A EA201591107 A EA 201591107A EA 036151 B1 EA036151 B1 EA 036151B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
seed
dna
sample
samples
nucleic acids
Prior art date
Application number
EA201591107A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591107A1 (ru
Inventor
Брэндон Рэйпир
Кэрол Пауэрз
Кристоф Штолль
Original Assignee
Агридженетикс, Инк.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Агридженетикс, Инк. filed Critical Агридженетикс, Инк.
Publication of EA201591107A1 publication Critical patent/EA201591107A1/ru
Publication of EA036151B1 publication Critical patent/EA036151B1/ru

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C12Q1/6888—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms
    • C12Q1/6895—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes for detection or identification of organisms for plants, fungi or algae
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
    • C12Q2563/143—Magnetism, e.g. magnetic label
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2600/00—Oligonucleotides characterized by their use
    • C12Q2600/13—Plant traits

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

Изобретение относится к выделению нуклеиновых кислот (например, геномной ДНК) из материала семени растения, который был обезжирен. В некоторых вариантах осуществления такие нуклеиновые кислоты имеют удовлетворительное качество и имеются в таком количестве, что они могут использоваться в основанном на амплификации методе генетического анализа, например и без ограничения, чтобы осуществлять отборы в ходе программы селекции растений.

Description

NANT EXTRACTED SEED SAMPLES.
Область техники
Настоящее изобретение относится к области биотехнологии растений. Варианты осуществления относятся к системам и/или способам получения и анализа генетической информации о растениях, исходя из остающихся образцов семян, например, в автоматическом режиме. Такие системы и/или способы могут использоваться, например и без ограничения, для эффективного отбора растений в ходе программы селекции растений.
Предпосылки создания изобретения
Цель селекции растений заключается в разработке новых, уникальных и лучших сортов и гибридов. Селекционер сначала отбирает и скрещивает две или более родительских линий с последующим повторным самоопылением и отбором, чтобы в конечном итоге получить много новых генетических комбинаций. Селекционер может теоретически создать миллиарды различных генетических комбинаций посредством скрещивания, самоопыления и мутагенеза. Такой селекционер не имеет прямого контроля над процессом на клеточном уровне. Следовательно, два селекционера никогда не создадут одну и ту же линию или даже очень похожие линии, имеющие одинаковые признаки.
Существуют многочисленные шаги при создании любой новой желательной зародышевой плазмы растений. В программах селекции растений объединяются желательные признаки от двух или более сортов или различных универсальных источников в селекционные пулы, исходя из которых создаются сорта путем самоопыления и отбора желаемых фенотипов. Новые сорта оцениваются для определения того, какие из них имеют коммерческий потенциал. Селекция растений начинается с анализа и определения проблем и недостатков существующей зародышевой плазмы, установления программных целей и определения конкретных целей селекции. Следующим шагом является выбор зародышевой плазмы, которая обладает признаками для достижения целей программы. Цель состоит в том, чтобы объединить в одном сорте улучшенную комбинацию желательных признаков из родительской зародышевой плазмы. Эти важные признаки могут включать более высокий урожай семян, устойчивость к болезням и насекомым, лучшие стебли и корни, устойчивость к засухе и жаре и лучшее агрономическое качество.
Выбор способов селекции и отбора зависит от способа возобновления растений, наследуемости признака(ов), который совершенствуется, и типа сорта, используемого коммерчески (например, F1 гибридного сорта и чистолинейного сорта). В случае высоконаследуемых признаков выбор лучших отдельных растений, оцениваемых в одном месте, может быть эффективен, в то время как в случае признаков с низкой наследуемостью выбор должен быть основан на средних значениях, полученных из повторенных оценок семейств родственных растений. Популярные методы отбора обычно включают выбор родословной, модифицированный выбор родословной, массовый отбор и периодический отбор.
Сложность наследования влияет на выбор способов селекции и отбора. Например, возвратное скрещивание может использоваться для передачи одного (или нескольких) подходящего гена для в высокой степени наследуемого признака желательной зародышевой плазме. Этот подход широко использовался для селекции устойчивых к болезням сортов. Различные методы периодического отбора могут использоваться для улучшения количественных наследственных признаков, контролируемых многочисленными генами.
Селекционная программа, как правило, включает периодическую объективную оценку эффективности процедуры селекции. Критерии оценки изменяются в зависимости от целей и задач, но критерии могут включать, например и без ограничения, выигрыш от селекции в год (на основе сравнения с соответствующим стандартом); общую ценность селекционных линий с улучшенными характеристиками и количество успешных сортов, полученных на единицу затрат (например, за год и на каждый потраченный доллар).
Перспективные селекционные линии с улучшенными характеристиками затем тщательно проверяют и сравнивают с соответствующими стандартами в окружающих средах, отражающих коммерческую целевую область(и), обычно в течение трех или более лет. Кандидаты на новые коммерческие сорта выбирают из лучших линий; линии, в которых еще недостает нескольких признаков, могут использоваться в качестве родителей для получения новых популяций для дальнейшей селекции. Эти процессы, которые приводят к конечной стадии маркетинга и распределения, обычно занимают от 8 до 12 лет с момента осуществления первого скрещивания. Следовательно, создание новых сортов является трудоемким процессом, который требует точного перспективного планирования, эффективного использования ресурсов и минимального количества изменений курса.
В селекционных программах объединяются желательные признаки от двух или более инбредных линий или различных универсальных источников в селекционные пулы, исходя из которых создаются новые инбредные линии путем самоопыления и отбора желаемых фенотипов. Г ибридный сорт - это гибрид двух таких инбредных линий, каждая из которых может иметь одну или более желательных характеристик, которые отсутствуют в одной линии или дополняют другую. Новые инбредные растения скре- 1 036151 щивают с другими инбредными линиями, и гибриды, полученные в результате этих скрещиваний, оценивают для определения того, какие из них являются лучшими или обладают желательными признаками. Г ибридное семя получают путем скрещивания вручную выбранных родителей с мужской фертильностью или используя системы мужской фертильности. Эти гибриды отбирают по определенным признакам, определяемым отдельными генами (например, цвету стручков, цвету цветов, цвету пушка и устойчивости к гербицидам), которые указывают на то, что семя действительно представляет собой гибрид. Данные о родительских линиях, а также фенотип гибрида оказывают влияние на решение селекционера, переходить ли к скрещиванию конкретных гибридов.
Соответственно, создание новых сортов требует отбора родительских сортов, скрещивания этих сортов и отбора гибридов с лучшими характеристиками. Задача идентификации генетически улучшенных индивидуумов является особенно трудной. Одним из способов идентификации растения с лучшими характеристиками является определение одного или более фенотипов у растения, например, относительно других экспериментальных растений и широковыращиваемого стандартного сорта. Эта задача является чрезвычайно трудной, поскольку другие, запутывающие признаки растений или факторы окружающей среды маскируют истинно генотипическое значение (в случае большинства признаков). Таким образом, обычно необходимо определить точный генотип конкретного растения, и его фенотип, для того чтобы компетентно оценить и идентифицировать сорта и гибриды с лучшими характеристиками.
Состав конкретного сорта растений, созданного в ходе селекции выборочных растений, является непредсказуемым. Эта непредсказуемость обусловлена, в частности, выбором селекционера, который происходит в уникальных условиях, и который не позволяет осуществлять контроль на уровне ДНК (с использованием обычных селекционных процедур), с созданием миллионов различных возможных генетических комбинаций. Селекционер со средней компетентностью в данной области техники не может предсказать конечные результирующие линии, которые он создаст, за исключением, возможно, в очень грубой и общей форме. Точно так же тот же селекционер не может получить один и тот же сорт дважды, используя абсолютно таких же исходных родителей и те же методы отбора. Эта непредсказуемость приводит к расходованию больших количеств ресурсов в денежном и ином отношении для создания новых сортов с лучшими характеристиками.
Чистолинейное разведение обычно используется для улучшения самоопыляющихся культур. В случае чистолинейного разведения двух родителей, которые обладают подходящими, дополняющими признаками, скрещивают для получения Fj потомства. F2 популяцию получают посредством самоопыления одного или нескольких растений из Fj поколения потомства. Отбор лучших индивидуумов может начинаться в F2 популяции; затем, начиная с F3, отбирают лучшие индивидуумы в семействах с лучшими характеристиками. Для увеличения эффективности отбора по признакам с низкой наследуемостью повторяемые проверки семейств могут начинаться в F4 поколении. На продвинутой стадии инбридинга (например, F6 или F7) лучшие линии или смеси линий со схожими фенотипами проверяют на возможный выпуск в качестве новых сортов.
Массовые и текущие отборы могут использоваться для улучшения популяции или само-, или перекрестно опыляющихся культур. Генетически вариабельную популяцию гетерозиготных индивидуумов можно или идентифицировать, или создать посредством перекрестного опыления нескольких различных родителей. Лучшие растения могут быть отобраны на основе индивидуального превосходства, выдающегося потомства или отличной скрещиваемости. Отобранные растения подвергают перекрестному опылению с получением новой популяции, в которой может быть продолжены дальнейшие циклы селекции.
Возвратное скрещивание было использовано для передачи генов легко и высокой степени наследуемого признака желательному гомозиготному сорту или инбредной линии, который является рекуррентным родителем. Источником передаваемого признака является родитель-донор. Полученное растение, как ожидается, будет обладать признаками рекуррентного родителя (например, сорта) и желаемым признаком, передаваемым от родителя-донора. После первоначального скрещивания индивидуумы, обладающие фенотипом родителя-донора, отбирают и повторно скрещивают (подвергают возвратному скрещиванию) с рекуррентным родителем. Полученное растение, как ожидается, будет обладать признаками рекуррентного родителя и желаемым признаком, передаваемым от родителя-донора. Во время селекции с использованием возвратного скрещивания растения потомства, имеющие желаемый фенотип, как правило, отбирают в каждом поколении. Где уместно, растения потомства могут также подвергаться отбору в отношении присутствия молекулярных маркеров; например аллелей генетических маркеров и изоферментных маркеров.
Способ с использованием поколения одного семени относится к посадке расщепляющейся популяции, с последующим отбором образца одного семени на результирующее растение и использованием отобранного образца одного семени для посадки следующего поколения. Когда популяция прошла путь от F2 поколения до желаемого уровня инбридинга, каждое из растений, от которых происходят линии, будет прослеживаться в различных F2 индивидуумах. Количество растений в популяции снижается каждое поколение из-за неспособности некоторых семян к прорастанию или некоторых растений к образованию по меньшей мере одного семени. В результате, не все из F2 растений, первоначально отобранных в популяции, будут представлены в потомстве после завершения продвижения генерации.
- 2 036151
В способе с использованием множества семян селекционеры обычно собирают семена от каждого растения в популяции и обмолачивают их вместе с образованием массы. Часть массы используется для посадки следующего поколения, а часть помещается в резерв. Этот способ был назван модифицированным способом с использованием поколения одного семени. Способ с использованием множества семян использовался для экономии труда, затрачиваемого на сбор. Значительно быстрее извлекать семена с помощью машины, чем отделять одно семя от другого вручную в случае способа с использованием одного семени. Способ с использованием множества семян также делает возможной посадку одинакового количества семян в совокупности для каждой генерации инбридинга. Собирают количество семян, достаточное для компенсации количества растений, которые не проросли или не образовали семян.
Одной совокупностью признаков, которые могут быть интересны селекционеру масличных культур, являются особенности масла (например, выход и состав). Это в значительной степени обусловлено тем, что растительные масла постепенно заменили масла и жиры животного происхождения в качестве основного источника потребления входящих в рацион жиров. Тем не менее, потребление насыщенных жиров в большинстве промышленно развитых стран остается на уровне, составляющем приблизительно 15-20% от общего потребления калорий. В рамках усилий по пропаганде здорового образа жизни Министерство сельского хозяйства США (USDA) недавно рекомендовало, чтобы насыщенные жиры составляли менее 10% от суточного потребления калорий. Для способствования информированности потребителей в текущих директивах, касающихся маркировки, опубликованных USDA, теперь требуются для способствования получению маркировки низкий уровень насыщенных жирных кислот общие уровни насыщенных жирных кислот, составляющий менее 1,0 г на 14 г, а для способствования получению маркировки без насыщенных жирных кислот - менее 0,5 г на 14 г. Это означает, что содержание насыщенных жирных кислот в растительных маслах должно составлять менее 7% и 3,5%, чтобы получить маркировку низкий уровень насыщенных жирных кислот и без насыщенных жирных кислот соответственно. С момента опубликования этих директив был всплеск потребительского спроса на масла с низким уровнем насыщенных жирных кислот и без насыщенных жирных кислот. На сегодняшний день этой потребности отвечает в основном масло канолы и в гораздо меньшей степени подсолнечное и сафлоровое масло.
Помимо непосредственного потребления человеком растительное масло повышает ценность корма для скота из-за его более высокой энергетической ценности, а также во все возрастающей степени используется в качестве основного источника для производства биодизельного топлива, особенно в Европе. Растительные масла с высоким содержанием олеиновой кислоты (мононенасыщенной жирной кислоты) и/или низкими уровнями насыщенных жирных кислот приносят значительную пользу здоровью и обеспечивают кулинарные преимущества по сравнению с насыщенными и полиненасыщенными жирными кислотами. Kinney et al. (2002) Biochem. Soc. Trans. 30: 1099-103; White and Weber (2003) Lipids of the kernel, in Corn: Chemistry and Technology. 2nd Ed., Vol. 10, Eds. White & Johnson, American Association of Cereal Chemists, Inc., St. Paul, MN, pp. 355-95.
Описание
В настоящее описание включены системы и способы для выделения высококачественных нуклеиновых кислот (например, геномной ДНК) из остающегося обезжиренного материала семени растения для использования в генетическом анализе на основе амплификации. Варианты осуществления тем самым позволяют определить и профили масла, и генетические профили, исходя из источника ткани одного семени, причем особая часть семени может быть сохранена для посадки или отброшена в соответствии с установленными профилями. В конкретных примерах высококачественные нуклеиновые кислоты, выделенные и проанализированные с использованием системы и/или способа по настоящему изобретению, могут представлять данные о зиготности с возвратом данных, превышающим 99% и составляющим более чем приблизительно 96% соответствием с контрольным образцом листа. Определение и профиля масла, и генетического профиля, исходя из источника в виде одной половины семени, может позволить селекционеру растений отбирать только те растения (выращенные из содержащей зародыш части семени), которые обладают желаемыми характеристиками для пересадки, тем самым снижая трудоемкость отбора образцов в поле и повышения эффективности селекции. Посредством получения профиля масла и генетического профиля, исходя из источника в виде одного семени, частично не в режиме разрушения, используя систему и/или способ по настоящему изобретению, количество семян, которые высаживают, может быть значительно снижено путем отбора только зародышевой плазмы с выгодными признаками для продвижения генерации.
В некоторых вариантах осуществления система для определения генотипа растения по меньшей мере для одного представляющего интерес гена может включать, например и без ограничения, образец семени, который был подвергнут экстракции масла; солюбилизацию ДНК из обезжиренной матрицы семени, магнитные частицы (например, магнитные шарики), которые связывают нуклеиновые кислоты из образца семени для получения образца высококачественной нуклеиновой кислоты; средства для амплификации образца высококачественной нуклеиновой кислоты (например, полимеразную цепную реакцию (ПЦР)) для получения амплифицированных нуклеиновых кислот; зонд, который обнаруживает аллель гена или локус, представляющий интерес, (например, олигонуклеотидные зонды, специфичные для каж
- 3 036151 дого из двух аллелей представляющего интерес гена); и осуществляемые с помощью компьютера средства для определения генотипа образца семени на основе гибридизации олигонуклеотидного зонда с амплифицированными нуклеиновыми кислотами или ее отсутствия. В конкретных вариантах осуществления система для определения генотипа растения по меньшей мере для одного представляющего интерес гена может быть полностью автоматизирована, например, при использовании программируемого автоматического устройства.
Образцы семени, которые могут применяться в некоторых вариантах осуществления, включают материал семени, который был обезжирен, например, под воздействием органического растворителя (например, гексана). В конкретных примерах материал семени был обезжирен с помощью экстракции гептаном. Экстрагированное масло превращают в метиловые эфиры жирных кислот (FAME) путем переэтерификации. Индивидуальные жирные кислоты подвергают количественному анализу методом газовой хроматографии. В конкретных примерах образец семени может включать образец семени масличного растения (например, Brassica spp., например, канолы; Glycine max и подсолнечника (Helianthus annuus)).
В некоторых вариантах осуществления способ определения генотипа растения по меньшей мере для одного представляющего интерес гена может включать, например и без ограничения, обеспечение с растения образца семени, который был подвергнут экстракции масла; выделение высококачественных нуклеиновых кислот из обезжиренного образца семени; амплификацию высококачественных нуклеиновых кислот и определение аллельного состава амплифицированных нуклеиновых кислот. В конкретных вариантах осуществления способ полностью автоматизирован, что может обеспечить значительную экономию средств и производительность в программе селекции растений.
Выделенные образцы нуклеиновых кислот, полученные с помощью систем и методов в соответствии с конкретными вариантами осуществления настоящего изобретения, могут быть достаточно чистыми, чтобы они могли использоваться в методах генетического анализа на основе ПЦР. Например, конкретные системы и способы по настоящему изобретению могут обеспечивать и/или включать образец высококачественной нуклеиновой кислоты, полученный из обезжиренного материала семени. Образец высококачественный нуклеиновой кислоты может характеризоваться, например, отношением коэффициентов поглощения А260/А280 между приблизительно 1,7 и приблизительно 2,0, и он может быть амплифицирован с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР).
В некоторых вариантах осуществления способ использования информации, полученной с помощью генетического анализа высококачественных нуклеиновых кислот, может включать использование метода анализа на основе ПЦР (например, анализа KASPar и анализа TaqMan®). Полученная таким образом информация может быть использована в конкретных вариантах применения, в том числе, например и без ограничения, для идентификации и генотипирования сорта; для осуществления отборов в ходе программы селекции растений; для идентификации маркеров, связанных с представляющим интерес признаком (например, представляющей интерес особенностью масла); и для описания связи гена с представляющим интерес признаком.
В конкретных вариантах осуществления информация, полученная с помощью генетического анализа экстрагированных нуклеиновых кислот, может быть использована для передачи данных в программу селекции растений и/или ее ведения. Такая информация может быть использована, например и без ограничения, для отбора для посадки и селекции семян, которые содержат желаемую комбинацию по меньшей мере одного признака, представляющего интерес, и по меньшей мере одного представляющего интерес гена.
Вышеизложенные и другие признаки станут более очевидными из нижеследующего подробного описания нескольких вариантов осуществления, которое выполнено со ссылкой на сопроводительные чертежи.
Краткое описание чертежей
Фиг. 1(a-d) включает профили FAME, определенные исходя из образцов половин семян канолы путем анализа с использованием газовой хроматографии;
фиг. 2 - изображение, демонстрирующее гель-электрофорез ДНК канолы, выделенной из материала семени, обезжиренного путем экстракции растворителем. Полоса с высокой М.м. = 10 т.п.о. очевидна для всех образцов в геле с некоторой небольшой размытостью;
фиг. 3 - данные Rfo-специфического анализа Taqman ДНК канолы, выделенной из материала семени (только Rfo), обезжиренного путем экстракции растворителем. Гомозиготные (синие), гемизиготные (зеленые) и нулевые (красные) контроли анализа, происходящие из MagAttract, были включены для контроля зиготности. Отсутствие контролей для матрицы (NTC) указано черным цветом;
фиг. 4 - данные Rfo-специфического анализа Taqman ДНК канолы, выделенной из материала семени (Rfo, Fad2a, Fad3a и Fad3c), обезжиренного путем экстракции растворителем. Гомозиготные (синие), гемизиготные (зеленые) и нулевые (красные) контроли анализа (листовая ДНК) могут быть идентифицированы по их ромбовидной форме (◊). Зиготность образцов, указанных оранжевым цветом, невозможно было определить. NTC указано черным цветом;
фиг. 5 - данные Fad2a-, Fad3a- и Fad3c-специфического анализа Taqman ДНК канолы, выделенной
- 4 036151 из материала семени (Rfo, Fad2a, Fad3a и Fad3c), обезжиренного путем экстракции растворителем. Зиготность определяли, используя происходящие из MagAttract контроли (◊). Образцы, указанные розовым цветом, не генерировали детектируемый сигнал;
фиг. 6 - данные анализа KASPar двух репрезентативных маркеров SNP (маркера 1 (выше) и маркера 2 (ниже)) из ДНК канолы, выделенной из материала семени (Rfo, Fad2a, Fad3a и Fad3c), обезжиренного путем экстракции растворителем. Два микролитра лиофилизированной ДНК использовали на 1,3 мкл реакции в жидкой среде KASPar. Образцы с достаточным качеством и выходом, безусловно, группировались как АА, АВ или ВВ генотип, что отражают красные, зеленые и синие кластеры соответственно. Розовые точки ввода данных означают, что измеримый сигнал не генерировался, и определяются как неудачи. Представлены данные для двух проверенных маркеров (маркера 1=004-052 15792; маркера 2=040-0547 61844) с использованием разбавленной ДНК (2Х, 5Х и 10Х). Изображения листовой контрольной ДНК включены для сравнения;
фиг. 7(а-с) - сравнение профилей масел, определенных исходя из образцов половин семян канолы с помощью анализа FAME, и генотипов, определенных в остающихся обезжиренных образцах;
фиг. 8(а-Ь) - фотографию примерного устройства, которое может использоваться для резки семени для получения экстрагируемого материала семени (фиг. 8а; вверху), и фотографию сои с маркерами, обозначающими некоторые особенности сои (фиг. 8Ь; внизу);
фиг. 9(а-с) - профили масел, определенные исходя из образцов семян сои путем анализа FAME;
фиг. 10 - изображение, демонстрирующее гель-электрофорез ДНК сои, выделенной из материала семени, обезжиренного путем экстракции растворителем. Полоса с высокой М.м. = 10 т.п.о. очевидна для всех образцов в геле с некоторой небольшой размытостью;
фиг. 11 - данные для RR1- и КВ.2-специфического анализа Taqman ДНК сои, выделенной из материала семени (совокупность 1), обезжиренного путем экстракции растворителем. Зиготность определяли, используя полученные из MagAttract гомозиготные (синие), гемизиготные (зеленые) и нулевые (красные) листовые контроли, для указания на которые использована ромбовидная форма (◊). Зиготность образцов, указанных оранжевым цветом, была неопределяемой. Отсутствие контролей для матрицы (NTC) указано черным цветом;
фиг. 12 - данные для RR1- и RR2-специфического анализа Taqman ДНК сои, выделенной из материала семени (совокупность 2), обезжиренного путем экстракции растворителем. Гомозиготные (синие), гемизиготные (зеленые) и нулевые (красные) контроли анализа могут быть идентифицированы по их ромбовидной форме. Зиготность образцов, указанных оранжевым цветом, была неопределяемой. Образцы, указанные розовым цветом, не генерировали детектируемый сигнал. NTC снова указано черным цветом;
фиг. 13 - данные AAD12-специфического Taqman анализа в режиме реального времени ДНК сои, выделенной из материала семени (группа В,) обезжиренного экстракцией растворителем. Листовая ДНК, экстрагированная из проросшей части семени, была также проверена для подтверждения зиготности образцов семян. Гомозиготные (синие), гемизиготные (зеленые) и нулевые (красные) контроли анализа, происходящие из MagAttract, были включены для контроля зиготности. Отсутствие контролей для матрицы (NTC) указано черным цветом;
фиг. 14 - описание примерных совокупностей семян подсолнечника, использованных для оценки систем и способов для выделения нуклеиновых кислот из обезжиренного материала семени подсолнечника;
фиг. 15(а-е) - профили масел, определенные исходя из 1/4 части семени подсолнечника группы А2 (фиг. 15а) и 1/2 части семени подсолнечника группы В (фиг. 15(Ь-е)) с помощью FAME. Показатели качества были получены, и все значения содержания олеиновой кислоты находились в пределах ожидаемого диапазона. Стандарты и выполненные контроли качества в соответствии с ожиданиями;
фиг. 16 - профили масел, определенные исходя из совокупности 1/4 части семени подсолнечника путем анализа FAME;
фиг. 17 - изображение, демонстрирующее гель-электрофорез ДНК подсолнечника, выделенной из материала семени, обезжиренного путем экстракции FAME. Полоса с М.м.= 10 т.п.о. очевидна для всех образцов в геле с некоторой небольшой размытостью, что означает, что присутствуют высокомолекулярная и фрагментированная ДНК;
фиг. 18 - изображение, демонстрирующее гель-электрофорез ДНК подсолнечника, выделенной из материала семени, обезжиренного путем экстракции растворителем;
фиг. 19 - данные анализа KASPar 9 репрезентативных (ложной мучнистой росы) маркеров SNP из ДНК подсолнечника, выделенной из материала семени, обезжиренного экстракцией растворителем. Два микролитра разбавленной в 2 раза лиофилизированной ДНК использовали на 4,0 мкл реакции KASPar (384-луночный формат). Образцы с достаточным качеством и выходом, безусловно, группировались как АА, АВ или ВВ генотип, что отражают красные, зеленые и синие кластеры соответственно. Розовые точки ввода данных означают, что измеримый сигнал не генерировался, и определяются как неудачи. Черные точки ввода данных означают отсутствие контролей для матриц (NTC). Представлены данные для
- 5 036151 из проверенных маркеров;
фиг. 20 - данные анализа KASPar тех же 9 репрезентативных (ложной мучнистой росы) маркеров
SNP, что и на фиг. 19, из ДНК подсолнечника, полученной из семенного материала, обезжиренного экстракцией растворителем;
фиг. 21 - данные анализа KASPar репрезентативных маркеров SNP из ДНК подсолнечника, выделенной из материала семени, обезжиренного экстракцией FAME, после длительного хранения при температуре окружающей среды до выделения ДНК. Те же 9 маркеров ложной мучнистой росы, которые были проанализированы на фиг. 19 и 20, были снова использованы в комбинации с 5 дополнительными очень полиморфными SNP для признака уменьшенное содержание насыщенных жирных кислот (0430186, 043-0568, 043-0916, 043-1231 и 043-1811). ДНК разводили в 20 раз и ПЦР KASPar выполняли в 1536-луночном формате. Объем ПЦР-реакции уменьшали до 1,3 мкл (с 4 мкл). Включены данные для четырех из 14 проверенных маркеров.
Вариант(ы) осуществления настоящего изобретения
I. Обзор некоторых вариантов осуществления.
Некоторые варианты осуществления настоящего изобретения обеспечивают системы и/или способы для генотипирования и фенотипирования образца семени растения, в которых остальная часть семени (содержащая зародыш) может быть избрана для выращивания и/или возделывания. В конкретных вариантах осуществления признаком растений, определяемым в таком семени, является особенность масла.
Профиль масла конкретного растения представляет собой сложный признак, который вытекает из плохо понятого взаимодействия множества генов. Два растения с аналогичными фенотипическими особенностями масла могут иметь весьма различные генотипы, которые приводят к этому фенотипу через различные механизмы. Следовательно, при селекции растений на желательные особенности масла может быть желательным определение генотипов отдельных растений и использование этой информации в соответствии с информацией о фенотипах, чтобы сделать селекционные выборы.
Например, профиль содержащего жирные кислоты омега-9 масла определенной зародышевой плазмы канолы зависит от наличия мутаций в генах fad2, fad3a и fad3c. Кроме того, в случае мужских линий гибридной системы цитоплазматической мужской стерильности Ogura канолы, присутствие гена Rfo (восстановителя фертильности) требуется зародышевой плазме для восстановления мужской фертильности. Таким образом, для идентификации новых, содержащих жирные кислоты омега-9 мужских селекционных линий должна присутствовать соответствующая комбинация вариантов всех 4 генов. Из-за сложного взаимодействия между генами вполне возможно, что простой фенотипический отбор будет приводить к нежелательным и скрытым генетическим изменениям в отобранных растениях, причем желательный генотип трудно восстановить на последующих стадиях селекции, если растения потомства также не генотипируются во время селекции.
В отличие от конкретных вариантов осуществления при традиционном подходе, используемом при селекции масличных растений, идентифицируются расщепляющиеся популяции, которые обладают желательными признаками и генетикой, во-первых, определяя профиль жирных кислот в масле семян посредством экстракции растворителем с последующей переэтерификацией и газохроматографическим анализом метиловых эфиров жирных кислот (FAME) из материала половины семени (содержащего семядолю), с последующим выращиванием растений из оставшейся половины семени (содержащей зародыш) и анализом с помощью ПЦР ДНК из ткани листа для идентификации зиготности представляющих интерес генов. Растения, обладающие желаемым генотипом, выращенные из семени, обладающего желаемой особенностью масла, могут быть отобраны для дальнейшей селекции и/или выращивания. Этот обычный процесс занимает много времени и является дорогостоящим в сравнении с вариантами осуществления настоящего изобретения, поскольку остающаяся половина семени, образец половины семени которого был взят для фенотипического анализа, должна быть посажена, и ей должна быть предоставлена возможность вырасти, прежде чем ткань листьев может быть получена, и генетическое тестирование может быть выполнено. Этот дополнительный шаг обуславливает существенные расходы ресурсов во время селекции растений. Van Deynze & Stoffel (2006) Seed Sci. & Technol. 34: 741-745.
Представленные здесь примеры включают системы и способы для выделения геномной ДНК с высокой степенью чистоты из остающегося обезжиренного (например, подвергнутого экстракции растворителем) материала семени (например, обезжиренного материала семени, который не содержит зародыш семени). В обычных системах и способах такую ДНК с высокой степенью чистоты, которая подходит для амплификации и генотипирования, не выделяют из остающегося материала семени, и материал отбрасывается. Некоторые примеры включают автоматизированное выделение геномной ДНК из остающегося обезжиренного материала семени любого из различных масличных растений; например, материала половины семени канолы, материала семена подсолнечника и материала семени сои. Таким образом, было установлено, что варианты осуществления настоящего изобретения широко применимы к разным видам растений, в то время как экстракция ДНК из даже необработанного материала семени была непредсказуемой и часто неуспешной. Van Deynze & Stoffel (2006), выше. Например, не думали, что используя протокол экстракции ДНК на основе шариков MAGATTRACT® (Qiagen), можно экстрагировать любую ДНК (не говоря уже о высококачественной ДНК) из материала семени Brassica, а также не думали, что с
- 6 036151 его помощью можно получить ДНК от остающегося после FAME материала.
Некоторые варианты осуществления включают системы и/или способы, которые могут позволить предоставить высококачественную, амплифицируемую ДНК из остающегося обезжиренного материала семени, так что ДНК может быть использована, например и без ограничения, для генотипирования на основе ПЦР (например, для использований для генотипирования SNP с помощью Taqman® и KASPar). В обычных способах не используется обезжиренный материал семени для получения высококачественной, чистой, ДНК для генетических приложений, таких как генотипирование. Выделение такой ДНК с высокой степенью чистоты не является тривиальным, поскольку достаточное количество крупных нуклеиновых кислот должны быть выделено с тем, чтобы сделать возможным анализ всего генома с низким коэффициентом ошибок.
Получая профили масла и генетические профили из источника в виде одного семени, количество растений, которые пересаживают, может быть уменьшено в результате обеспечения того, что только растения с желаемым генотипическим или фенотипическим профилем продвигают до следующего поколения. Таким образом, конкретные варианты осуществления настоящего изобретения могут привести к значительной экономии времени и ресурсов путем устранения или существенного сокращения требований к отбору образца ткани. Дополнительная возможность проводить селекцию с помощью маркеров (MAS) по всему геному, используя ДНК высокой степени чистоты, выделенную с использованием системы и/или способа по настоящему изобретению, упростит и сделает более возможным использование генотипических данных для касающихся интрогрессии и пересмотра проектов, в которых в настоящее время не используются данные о маркерах.
Варианты осуществления настоящего изобретения могут оказать существенное влияние на селекцию выборочных масличных растений. Например, коллекция из одной половины семени может позволить определить необходимый профиль жирных кислот и генотипические данные (или данные о зиготности) для отбора выгодной зародышевой плазмы до пересадки. Семя, у которого отсутствует желаемый профиль жирных кислот и генотип, может не засеваться, или растения, соответствующие такому семени, могут быть отброшены, таким образом минимизируя усилия по отбору образцов тканей и пересадки и сокращая относящиеся к теплицам средства, необходимые для продвижения проекта по селекции растений.
Помимо анализа гибридных материалов генетический анализ ДНК, выделенной с помощью систем и/или способов в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения, может иметь любое из множества других возможных применений. Например, практикующий специалист может проанализировать выделенную ДНК из обезжиренного образца семени для определения того, использует ли незаконно субъект права запатентованную зародышевую плазму. В качестве еще одного примера ДНК, выделенную из семени с помощью систем и/или способов по настоящему изобретению, можно генотипировать так, что новые QTL или сцепленные маркеры, соответствующие фенотипу (например, сложному фенотипу), определяемому в семени, могут быть выведены или определены.
II. Сокращения.
CMS - цитоплазматическая мужская стерильность.
FAM - карбоксифлуоресцеин,
FAME - метиловый эфир жирной кислоты,
KASPar - система генотипирования SNP с помощью конкурентной аллель-специфической ПЦР Kbioscience,
LIMS - система управления лабораторной информацией,
MAS - селекция с помощью маркеров,
М.м. - молекулярная масса,
QTL - локус количественных признаков,
RS - уменьшенное содержание насыщенных жирных кислот,
SNP - однонуклеотидный полиморфизм,
SSR - простой повтор последовательности,
WOSR - озимый масличный рапс.
III. Термины.
В следующем описании и таблицах используется ряд терминов. Для обеспечения ясного и последовательного понимания описания и формулы изобретения, в том числе объема, предоставляемого таким терминам, приводятся следующие определения:
Возвратное скрещивание: Методы возрастного скрещивания могут использоваться для введения последовательности нуклеиновой кислоты в растения. Метод возвратного скрещивания широко использовался в течение многих десятилетий, чтобы привнести новые признаки в растения. Jensen, N., Ed. Plant Breeding Methodology, John Wiley & Sons, Inc., 1988. В типичном протоколе возвратного скрещивания исходный сорт, представляющий интерес (рекуррентного родителя), скрещивают со вторым сортом (нерекуррентным родителем), который содержит представляющий интерес ген, который должен быть передан. Полученное в результате этого скрещивания потомство затем снова скрещивают с рекуррентным родителем, и процесс повторяют до тех пор, пока не будет получено растение, в котором, по существу,
- 7 036151 все желаемые морфологические и физиологические характеристики рекуррентного растения не будут восстановлены у преобразованного растения, в дополнение к переданному от нерекуррентного родителя гену.
Цитоплазматическая мужская стерильность (CMS).
Генетическая мужская стерильность является методом, который может использоваться при получении гибридных семян. В отсутствие гена-восстановителя фертильности растения от инбредного растения с CMS обладают мужской стерильностью в результате факторов, вытекающих из цитоплазматического, а не ядерного генома. Следовательно, признак мужской стерильности наследуется исключительно по материнской линии, поскольку только женское растение дает оплодотворенному семени цитоплазму. Растения с CMS оплодотворяют пыльцой другого инбредного растения, которое не обладает мужской стерильностью. Пыльца второго инбредного растения может обеспечивать или может не обеспечивать гены, которые делают гибридные растения обладающими мужской фертильностью.
Высококачественная ДНК относится к выделенной.
Выделенный биологический компонент (например, нуклеиновая кислота или белок) был, по существу, отделен, получен отдельно от или очищен от других биологических компонентов в клетке организма, в котором компонент встречается в природе (т.е. другой хромосомной и экстрахромосомной ДНК и РНК, а также белков), при осуществлении химического или функционального изменения компонента (например, нуклеиновая кислота может быть выделена из хромосомы посредством разрыва химических связей, соединяющих нуклеиновую кислоту с оставшейся ДНК в хромосоме).
Молекула нуклеиновой кислоты.
Используемый здесь термин молекула нуклеиновой кислоты может относиться к полимерной форме нуклеотидов, которая может включать как смысловую, так и антисмысловую цепи РНК, кДНК, геномной ДНК и их синтетические формы и смешанные полимеры. Нуклеотид может относиться к рибонуклеотиду, дезоксирибонуклеотиду и/или модифицированной форме того или другого типа нуклеотида. Молекула нуклеиновой кислоты, как здесь используется, является синонимом термина нуклеиновая кислота и полинуклеотид. Последовательность нуклеотидов в молекуле нуклеиновой кислоты обычно считывается с 5'- к 3'-концу молекулы. Комплемент нуклеотидной последовательности относится к последовательности, от 5' к 3' нуклеиновых оснований, которые образуют пары оснований с нуклеиновыми основаниями нуклеотидной последовательности (т.е. A-T/U и G-C). Обратный комплемент последовательности нуклеиновой кислоты относится к последовательности от 3' к 5' нуклеиновых оснований, которые образуют пары оснований с нуклеиновыми основаниями нуклеотидной последовательности.
Молекулы нуклеиновых кислот включают одно- и двухцепочечные формы ДНК; одноцепочечные формы РНК и двухцепочечные формы РНК (дцРНК). Термин нуклеотидная последовательность или последовательность нуклеиновой кислоты относится к порядку нуклеотидов, встречающихся как в смысловой, так и антисмысловой цепи нуклеиновой кислоты, или в виде отдельных одиночных цепей, или в виде дуплекса.
Термин рибонуклеиновая кислота (РНК) включает ингибиторную РНК, дцРНК (двухцепочечную РНК), короткую интерферирующую РНК, мРНК (информационную РНК), микроРНК, шпилечную РНК, тРНК (транспортную РНК, или заряженную, или разряженную с помощью соответствующей ацилированной аминокислоты), и кРНК (комплементарную РНК). Термин дезоксирибонуклеиновая кислота (ДНК) включает кДНК, геномную ДНК и гибриды ДНК-РНК. Термины сегмент нуклеиновой кислоты и сегмент нуклеотидной последовательности или в общем сегмент будут пониматься специалистами в данной области техники в качестве функционального термина, который включает как геномные последовательности, последовательности рибосомных РНК, последовательности транспортных РНК, последовательности информационных РНК, последовательности оперонов, так и сконструированные нуклеотидные последовательности меньшего размера, которые кодировали пептиды, полипептиды или белки или могут быть адаптированы для их кодирования.
Молекула нуклеиновой кислоты может включать встречающиеся в природе или модифицированные нуклеотиды, которые связаны друг с другом с помощью встречающихся в природе и/или не встречающихся в природе нуклеотидных связей. Молекулы нуклеиновых кислот могут быть химически или биохимически модифицированными или могут содержать неприродные или дериватизированные нуклеотидные основания, как будет без труда понятно квалифицированным в данной области техники специалистам. Такие модификации включают, например, метки; метилирование; замещение одного или более встречающихся в природе нуклеотидов аналогом, межнуклеотидные модификации (например, незаряженные связи, например метилфосфонаты, фосфотриэфиры, фосфорамидаты, карбаматы и т.д.; заряженные связи, например фосфоротиоаты, фосфородитиоаты и т.д.; боковые компоненты, например пептиды; интеркаляторы, например акридин, псорален и т.д.; комплексоны; алкилаторы и модифицированные связи, например α-аномерные нуклеиновые кислоты). Термин молекула нуклеиновой кислоты также включает любую топологическую конформацию, в том числе одноцепочечную, двухцепочечную, отчасти дуплексную, триплексную, шпилечную, замкнутую в круг и запертую конформацию.
Олигонуклеотид.
- 8 036151
Олигонуклеотид представляет собой короткий полимер нуклеиновых кислот. Олигонуклеотиды могут быть получены путем расщепления более длинных сегментов нуклеиновых кислот или путем полимеризации отдельных предшественников нуклеотидов. Автоматизированные синтезаторы позволяют синтезировать олигонуклеотиды длиной вплоть до нескольких сотен пар оснований. Поскольку олигонуклеотиды могут связываться с комплементарной нуклеотидной последовательностью, они могут использоваться в качестве зондов для обнаружения ДНК или РНК. Олигонуклеотиды, состоящие из ДНК (олигодезоксирибонуклеотидов), могут использоваться в ПЦР, методе амплификации небольших последовательностей ДНК. В ПЦР олигонуклеотид обычно называют праймером, который позволяет ДНКполимеразе удлинять олигонуклеотид и реплицировать комплементарную цепь.
Геном.
Используемый здесь термин геном относится к хромосомной ДНК, обнаруживаемой в ядре клетки, а также относится к ДНК органелл, обнаруживаемой в субклеточных компонентах клетки.
Идентичность последовательностей.
Термин идентичность последовательностей или идентичность, как здесь используется в контексте двух последовательностей нуклеиновых кислот, относится к остаткам в двух последовательностях, которые являются одинаковыми при совмещении для максимального соответствия в заданном окне сравнения.
Используемый здесь термин процент идентичности последовательностей может относиться к значению, определенному путем сравнения двух оптимально совмещенных последовательностей (например, последовательностей нуклеиновых кислот) в окне сравнения, причем часть последовательности в окне сравнения может содержать добавления или делеции (т.е. пропуски) по сравнению с контрольной последовательностью (которая не содержит добавления или делеции) для оптимального совмещения двух последовательностей. Процент рассчитывается путем определения числа положений, в которых идентичный нуклеотид или аминокислотный остаток встречается в обеих последовательностях, с получением числа совпадающих положений, деления числа совпадающих положений на общее число положений в окне сравнения и умножения результата на 100 для получения процента идентичности последовательностей. Последовательность, которая идентична в каждом положении при сравнении с контрольной последовательностью, как говорят, идентична на 100% контрольной последовательности, и наоборот.
Методы совмещения последовательностей для сравнения хорошо известны в данной области техники. Различные программы и алгоритмы для совмещения описаны, например, в Smith and Waterman (1981) Adv. Appl. Math. 2: 482; Needleman and Wunsch (1970) J. Mol. Biol. 48: 443; Pearson and Lipman (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 2444; Higgins and Sharp (1988) Gene 73: 237-44; Higgins and Sharp (1989) CABIOS 5: 151-3; Corpet et al. Nucleic Acids Res. (1988) 16: 10881-90; Huang et al. (1992) Comp. Appl. Biosci. 8: 155-65; Pearson et al. (1994) Methods Mol. Biol. 24: 307-31; Tatiana et al. (1999) FEMS Microbiol. Lett. 174: 247-50. Детальное рассмотрение методов совмещения последовательностей и расчетов гомологии можно найти в Altschul et al. (1990) J. Mol. Biol. 215: 403-10. Basic Local Alignment Search Tool (BLAST; Altschul et al. (1990)) Национального центра биотехнологической информации (NCBI) доступно из нескольких источников, включая Национальный центр биотехнологической информации (Bethesda, MD), и в Интернете для использования в связи с несколькими программами для анализа последовательностей. Описание того, как определить идентичность последовательностей с помощью этой программы, доступно в Интернете в разделе Помощь для BLAST. Для сравнений последовательностей нуклеиновых кислот функция Blast 2 sequences программы BLAST (Blastn) может использоваться с использованием параметров по умолчанию. Последовательности нуклеиновых кислот с даже большей степенью схожести с контрольными последовательностями покажут увеличение процента идентичности при оценке этим методом.
Специфически гибридизуемая/определенно комплементарная.
Используемые здесь термины специфически гибридизуемая и определенно комплементарная являются терминами, которые указывают на достаточную степень комплементарности, так что происходит устойчивое и специфическое связывание между молекулой нуклеиновой кислоты и молекулой нуклеиновой кислоты-мишенью. Гибридизация между двумя молекулами нуклеиновых кислот включает антипараллельное совмещение последовательностей нуклеиновых кислот двух молекул нуклеиновых кислот. Две молекулы затем могут образовывать водородные связи с соответствующими основаниями на противоположной цепи с образованием молекулы дуплекса, которая, если она достаточно стабильна, поддается обнаружению с помощью способов, хорошо известных в данной области. Молекула нуклеиновой кислоты может не быть на 100% комплементарна являющейся ее мишенью последовательности, чтобы быть специфически гибридизуемой. Тем не менее, величина комплементарности последовательностей, которая должна существовать для того, чтобы гибридизация была специфической, зависит от используемых условий гибридизации.
Условия гибридизации, приводящие к конкретным степеням жесткости, будут варьировать в зависимости от природы предпочтительного метода гибридизации и состава и длины гибридизующихся последовательностей нуклеиновых кислот. Как правило, температура гибридизации и ионная сила (особенно концентрации Na+ и/или Mg) буфера для гибридизации будут определять жесткость гибридизации,
- 9 036151 хотя продолжительности отмывок также влияют на жесткость. Расчеты, касающиеся условий гибридизации, необходимых для достижения конкретных степеней жесткости, известны специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники и обсуждаются, например, в Sambrook et al. (ed.) Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2nd ed., vol. 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989, chapters 9 and 11; и Hames and Higgins (eds.) Nucleic Acid Hybridization, IRL Press, Oxford, 1985. Более подробную инструкцию и рекомендации в отношении гибридизации нуклеиновых кислот можно найти, например, в Tijssen, Overview of principles of hybridization and the strategy of nucleic acid probe assays, in Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology-Hybridization with Nucleic Acid Probes, Part I, Chapter 2, Elsevier, NY, 1993; и Ausubel et al., Eds., Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 2, Greene Publishing and Wiley-Interscience, NY, 1995.
Как здесь используются, жесткие условия охватывают условия, в которых гибридизация будет происходить только при наличии составляющего менее 20% несоответствия между молекулой для гибридизации и гомологичной последовательностью в являющейся мишенью молекуле нуклеиновой кислоты. Жесткие условия включают дополнительные конкретные уровни жесткости. Таким образом, как здесь используются, условиями средней жесткости являются те, в которых молекулы с составляющим более чем 20% несоответствием последовательностей не будут гибридизоваться; условиями высокой жесткости являются те, в которых последовательности с составляющим более чем 10% несоответствием не будут гибридизоваться; и условиями очень высокой жесткости являются те, в которых последовательности с составляющим более чем 5% несоответствием не будут гибридизоваться.
Ниже приведены репрезентативные, не ограничивающие условия гибридизации.
Условие высокой степени жесткости (позволяют выявить последовательности с составляющей по меньшей мере 90% идентичностью последовательностей): гибридизация при 65°С в 5х буфере SSC в течение 16 ч; две промывки в течение 15 мин каждая в 2х буфере SSC при комнатной температуре и две промывки в течение 20 мин каждая в 0,5х буфере SSC при 65°С.
Условие средней степени жесткости (позволяют выявить последовательности с составляющей по меньшей мере 80% идентичностью последовательностей): гибридизация при 65-70°С в 5х-6х буфере SSC в течение 16-20 ч; две промывки в течение 5-20 мин каждая в 2х буфере SSC при комнатной температуре и две промывки в течение 30 мин каждая в 1х буфере SSC при 55-70°С.
Нежесткое контрольное условие (будут гибридизоваться последовательности с составляющей по меньшей мере 50% идентичностью последовательностей): гибридизация при комнатной температуре 55°С в 6х буфере SSC в течение 16-20 ч; по меньшей мере две промывки в течение 20-30 мин каждая в 2х-3х буфере SSC при комнатной температуре 55°С.
Используемый здесь термин по существу, гомологичные или существенная гомология в связи с непрерывной последовательностью нуклеиновой кислоты относится к непрерывным нуклеотидным последовательностям, которые гибридизуются в жестких условиях с контрольной последовательностью нуклеиновой кислоты. Например, последовательностями нуклеиновых кислот, которые, по существу, гомологичны контрольной последовательности нуклеиновой кислоты, являются те последовательности нуклеиновых кислот, которые гибридизуются в жестких условиях (например, в условиях умеренной жесткости, изложенных выше) с контрольной последовательностью нуклеиновой кислоты. По существу, гомологичные последовательности могут обладать идентичностью последовательностей, составляющей по меньшей мере 80%. Например, по существу, гомологичные последовательности могут обладать идентичностью последовательностей, составляющей от приблизительно 80 до 100%, например приблизительно 81%; приблизительно 82%; приблизительно 83%; приблизительно 84%; приблизительно 85%; приблизительно 86%; приблизительно 87%; приблизительно 88%; приблизительно 89%; приблизительно 90%; приблизительно 91%; приблизительно 92%; приблизительно 93%; приблизительно 94%, приблизительно 95%; приблизительно 96%; приблизительно 97%; приблизительно 98%; приблизительно 98,5%; приблизительно 99%; приблизительно 99,5% и приблизительно 100%. Свойство существенной гомологии тесно связано со специфической гибридизацией. Например, молекула нуклеиновой кислоты специфически гибридизуется, когда существует достаточная степень комплементарности, чтобы избежать неспецифического связывания нуклеиновой кислоты с не являющимися мишенями последовательностями в условиях, когда специфическое связывание является желательно, например в жестких условиях гибридизации.
Как здесь используется, две молекулы нуклеиновой кислоты, как говорят, демонстрируют полную комплементарность, когда каждый нуклеотид смысловой цепи при прочтении в направлении от 5' к 3' комплементарен каждому нуклеотиду антисмысловой цепи при прочтении в направлении от 5' к 3'. Нуклеотидная последовательность, которая является комплементарной контрольной нуклеотидной последовательности, будет демонстрировать последовательность, идентичную последовательности обратного комплемента контрольной нуклеотидной последовательности. Эти термины и описания в достаточной степени определены в данной области и являются без труда понятными специалистам со средним уровнем компетентности в данной области.
Сцепленные, тесно сцепленные и очень тесно сцепленные.
- 10 036151
Как здесь используется, сцепление между генами и маркерами может относиться к явлению, когда гены и маркеры на хромосоме демонстрируют поддающуюся определению вероятность быть переданными вместе индивидуумам в следующем поколении. Чем ближе два гена и маркера друг к другу, тем ближе к 1 становится эта вероятность. Таким образом, термин сцепленные может относиться к одному или более генов или маркеров, которые передаются вместе с геном с вероятностью, превышающей 0,5 (что можно ожидать от независимого расхождения, когда маркеры/гены расположены на разных хромосомах). Когда присутствие гена вносит вклад в фенотип у индивидуума, можно сказать, что маркеры, которые сцеплены с геном, связаны с фенотипом. Таким образом, термин сцепленные может относиться к взаимосвязи между маркером и геном, или между маркером и фенотипом. Поскольку близость двух генов или маркеров на хромосоме имеет непосредственное отношение к вероятности того, что гены или маркеры будут передаваться вместе индивидуумам в следующем поколении, термин связанный (сцепленный) может также здесь относиться к одному или более генам или маркерам, которые расположены в непосредственной близости друг от друга на одной и той же хромосоме.
Сцепленные генетические маркеры фенотипа могут использоваться в программах селекции с помощью маркеров для идентификации сортов растений, имеющих заданный фенотип, и для воспроизведения фенотипа в других сортах.
Локус.
Используемый здесь термин локус относится к положению в геноме, которое соответствует поддающейся измерению характеристике (например, признаку). Локус SNP определяют с помощью зонда, который гибридизуется с ДНК, содержащейся в локусе.
Маркер.
Как здесь используется, маркер относится к последовательности гена или нуклеотидной последовательности, которая может использоваться для идентификации растений, имеющих конкретную аллель. Маркер может быть описан как вариант в данном геномном локусе. Генетический маркер может быть короткой последовательностью ДНК, такой как последовательность, окружающая изменение одной пары оснований (однонуклеотидный полиморфизм или SNP), или длинной последовательностью, например микросателлитом/повтором простой последовательности (SSR). Аллель-маркер относится к варианту маркера, который присутствует в конкретном растении. Термин маркер, используемый здесь, может относиться к клонированному сегменту ДНК и может также или альтернативно называться молекулой ДНК, комплементарной клонированному сегменту ДНК.
В некоторых вариантах осуществления присутствие маркера в растении можно обнаружить посредством использования зонда в виде нуклеиновой кислоты. Зондом может быть молекула ДНК или молекула РНК. РНК-зонды можно синтезировать способами, известными в данной области техники, например, с использованием молекулы ДНК в качестве матрицы. Зонд может содержать всю или часть нуклеотидной последовательности маркера и дополнительную, прилегающую нуклеотидную последовательность из генома растения. Его называют здесь прилегающим зондом. Дополнительную, прилегающую нуклеотидную последовательность называют находящейся вверху или внизу от исходного маркера, в зависимости от того, находится ли прилегающая нуклеотидная последовательность из хромосомы растения с 5'- или 3'-стороны от исходного маркера, в обычном понимании. Как будет понятно специалистам со средним уровнем компетентности в данной области техники, процесс получения дополнительной, прилегающей нуклеотидной последовательности для включения в маркер может быть повторен почти до бесконечности (ограничен только длиной хромосомы), таким образом, определяя дополнительные маркеры вдоль хромосомы. Все описанные выше маркеры могут использоваться в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения.
Последовательность олигонуклеотидного зонда может быть получена синтетически или путем клонирования. Подходящие векторы для клонирования хорошо известны квалифицированным в данной области техники специалистам. Олигонуклеотидный зонд может быть меченым или немеченым. Существует широкий ряд методов для мечения молекул нуклеиновых кислот, в том числе, например и без ограничения, мечение радиоактивным изотопом с использованием ник-трансляции; случайное праймирование, снабжение хвостом с помощью концевой дезокситрансферазы или т.п., причем используемые нуклеотиды являются меченными, например, радиоактивным 32Р. Другие метки, которые могут использоваться, включают, например и без ограничения, флуорофоры (например, FAM и VIC); ферменты; субстраты для ферментов; кофакторы ферментов, ингибиторы ферментов и т.п. Альтернативно, использование метки, которая обеспечивает детектируемый сигнал, сама по себе или в сочетании с другими активными агентами, может быть заменено лигандами, с которыми связываются рецепторы, причем рецепторы являются меченными (например, указанными выше метками) для обеспечения детектируемых сигналов, либо самих по себе, либо в сочетании с другими реагентами. См., например, Leary et al. (1983) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80: 4045-9.
Зонд может содержать нуклеотидную последовательность, которая не является прилегающей к последовательности исходного маркера; этот зонд называют здесь неприлегающим зондом.
Последовательность неприлегающего зонда может быть расположена достаточно близко к последовательности исходного маркера в геноме, так что неприлегающий зонд генетически сцеплен с тем же
- 11 036151 геном или признаком, что и исходный маркер.
Зонд может быть точной копией маркера, который детектируют. Зондом может также быть молекула нуклеиновой кислоты, включающая или состоящая из нуклеотидную(ой) последовательность(и), которая, по существу, идентична клонированному сегменту хромосомной ДНК рассматриваемого субъекта. Используемый здесь термин по существу, идентична может относиться к нуклеотидным последовательностям, которые идентичны на более чем на 85%. Например, по существу, идентичная нуклеотидная последовательность может быть идентична на 85,5; 86; 87; 88; 89; 90; 91; 92; 93; 94; 95; 96; 97; 98; 99 или 99,5% контрольной последовательности. Зондом может быть также молекула нуклеиновой кислоты, которая может специфически гибридизоваться с или является определенно комплементарной точной копией(ии) детектируемого маркера (ДНК-мишени).
Селекция с помощью маркеров.
Используемый здесь термин селекция с помощью маркеров может относиться к способу селекции непосредственно в отношении одного или более признаков. В современной практике селекционеры растений пытаются определить легко обнаруживаемые признаки, такие как цвет цветка, вид покрытия семян, или варианты изоферментов, которые связаны с агрономически желаемым признаком. Затем селекционеры растений следят за агрономическим признаком в расщепляющейся, размножающейся популяции, следя за расщеплением легко обнаруживаемого признака. Однако в распоряжении имеется очень мало этих связей для использования при селекции растений. В процессе селекции с помощью маркеров наличие или отсутствие конкретных молекулярных маркеров используется для принятия решений, касающихся селекции (селекции с помощью маркеров (MAS)), в селекционной программе.
Селекция с помощью маркеров обеспечивает экономически эффективный процесс с минимальными затратами времени для улучшения сортов растений. Несколько примеров применения селекции с помощью маркеров включают использование изоферментных маркеров. См., например, Tanksley and Orton, eds. (1983) Isozymes in Plant Breeding and Genetics, Amsterdam: Elsevier. Одним из примеров является изоферментный маркер, связанный с геном устойчивости к вредителю помидоров - угрице. Устойчивость, контролируемая геном, названным Mi, находится на хромосоме 6 помидоров и очень тесно сцеплена с Aps1 изоферментом кислой фосфатазы. Использование изоферментного маркера Aps1 для непрямого отбора гена Mi давало преимущества, заключающиеся в том, что сегрегация в популяции может быть однозначно определена с помощью стандартных электрофоретических методов; оценка изоферментного маркера может быть осуществлена в ткани проростков, устраняя необходимость сохранения растений до созревания; и кодоминирование аллелей изоферментного маркера позволяет провести различие между гомозиготами и гетерозиготами. См. Rick (1983) в Tanksley and Orton выше.
Однонуклеотидный полиморфизм.
Используемый здесь термин однонуклеотидный полиморфизм (SNP) может относиться к изменению последовательности ДНК, имеющему место, когда один нуклеотид в геноме (или другой общей последовательности) отличается между членами одного вида или парными хромосомами у индивидуума. В популяции SNP могут определять незначительную частоту аллеля, которая является самой низкой частотой аллеля в локусе, которая наблюдается в определенной популяции. Она является просто меньшей из двух частот аллелей для однонуклеотидных полиморфизмов. Различные популяции, как ожидается, будут демонстрировать, по меньшей мере, немного различные частоты аллелей. Конкретные популяции могут демонстрировать в значительной степени различные частоты аллелей. В некоторых примерах маркером, используемым при селекции растений с помощью маркеров, является маркер SNP в составе материнской ДНК околоплодника семени.
SNP могут находиться в кодирующих последовательностях генов, некодирующих областях генов или в межгенных районах между генами. SNP в кодирующей последовательности не будут обязательно изменять аминокислотную последовательность белка, который образуется из-за вырожденности генетического кода. SNP, в случае которого обе формы приводят к одной и той же последовательности полипептида, называется синонимичным (иногда называемым молчащей мутацией). Если образуется отличная полипептидная последовательность, они называются несинонимичными. Несинонимичное изменение может быть либо миссенс- или нонсенс-изменением, причем миссенс-изменение приводит к отличной аминокислоте, а нонсенс-изменение приводит к преждевременному стоп-кодону. SNP, которые не находятся в кодирующих белок областях, еще могут иметь последствия для сплайсинга гена, связывания факторов транскрипции или последовательности некодирующей РНК. SNP являются, как правило, биаллельными и, таким образом, легко анализируются в растениях и животных. Sachidanandam (2001) Nature 409: 928-33.
Образец семени.
Используемый здесь термин образец семени может относиться к одному или более материалов и/или веществ, полученных из семян. Например, образец семени может содержать одну или более половин семян и/или фрагментов, срезов или частей семян из представляющего интерес растения. Образец семени может также включать коллекцию семенного материала. В качестве конкретных примеров вариантов осуществления настоящего изобретения образец семени может включать всю или часть семядоли(ю) семени, но может не включать зародыш семени.
- 12 036151
Признак или фенотип.
Термины признак и фенотип используются здесь взаимозаменяемо. Для целей настоящего изобретения представляющие особый интерес признаки включают агрономически важные признаки (например, особенности масла), которые могут быть выражены, например, в культурном растении. Если специально не объясняются по-другому, все технические и научные термины, используемые здесь, имеют то же значение, что и значение, в котором они обычно понимаются специалистами со средним уровнем компетентности в области техники, к которой относится это изобретение. Определения общих терминов в области молекулярной биологии можно найти, например, в Lewin В., Genes V, Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9); Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9); и Meyers R.A. (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: A Comprehensive Desk Reference, VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN I-56081-569-8). Все проценты даны по весу, а все пропорции в смесях растворителей - по объему, если не указано иное. Все температуры приведены в градусах Цельсия.
IV. Автоматизированное выделение нуклеиновых кислот высокой степени чистоты из остающегося обезжиренного материала семени.
Варианты осуществления настоящего изобретения включают системы и/или способы для выделения образца высококачественной нуклеиновой кислоты (например, геномной ДНК) из обезжиренного материала семени. В некоторых вариантах осуществления обезжиренным материалом семени может быть остающийся материал семени, полученный путем экстракции растворителем (например, экстракции масла для анализа FAME) образца семени, например и без ограничения, небольшой части семени или материала в виде половины семени. Хотя квалифицированному в данной области техники специалисту будет понятно, что варианты осуществления настоящего изобретения включают выделение нуклеиновых кислот из материала семени других растений, некоторые примеры включают выделение из Brassica (например, канолы), подсолнечника и/или сои. Конкретные варианты осуществления включают системы и/или способы, которые приводят к выделению нуклеиновых кислот, которые имеют такую высокую степень чистоты (например, в которых нет примеси меньшего количества материала, не являющегося нуклеиновыми кислотами) и которые обеспечивают настолько полный охват генома, что нуклеиновые кислоты могут использоваться в процессе генотипирования на основе амплификации (например, анализе на основе ПЦР).
В некоторых вариантах осуществления способ выделения нуклеиновых кислот может включать разрушение клеток или лизис клеток (например, путем размалывания или разрушения ультразвуком материала семени); удаление мембранных липидов (например, с помощью детергента) и осаждение ДНК (например, с помощью холодного этанола или IPA). Способ экстракции нуклеиновой кислоты может также включать удаление белков из образца; удаление солей из образца и/или удаление молекул РНК из образца. В случае использований для выделения ДНК выход в некоторых вариантах осуществления может колебаться между популяциями. В некоторых вариантах осуществления А260/А280 может находиться между приблизительно 1,7 и приблизительно 2,0 (т.е. соответствовать чистому образцу ДНК). Значение А260/А280, равное менее 1,7, может указывать на загрязнения образца белком, в то время как значение, превышающее 2,0, может указывать на переброс остаточного количества РНК, фенола, солей и/или спирта.
Как продемонстрировано на нескольких примерах, описанных подробно ниже, ДНК, выделенная из различных обезжиренных материалов семян, используя системы и способы в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, продемонстрировала средний выход в диапазоне от приблизительно 0,5 до приблизительно 20,0 нг/мкл, а степень чистоты в диапазоне от приблизительно 1,7 до 2,0 (А260/А280). Кроме того, нуклеиновые кислоты, выделенные с помощью систем и способов по настоящему изобретению, могут обеспечить достаточный охват генома, чтобы сделать возможным осуществление точных определений генотипа семени из любого источника. Таким образом, варианты осуществления настоящего изобретения являются подходящими для экстракции высококачественной ДНК из образцов семян, полученных из любого из широкого множества растений.
Соответственно, высококачественная ДНК, выделенная в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, может быть получена со степенью чистоты (А260/А280) в диапазоне от приблизительно 1,7 до около 2,0. Например, ДНК может быть получена со степенью чистоты (А260/А280), равной приблизительно 1,70; приблизительно 1,72; приблизительно 1,74; приблизительно 1,76; приблизительно 1,78; приблизительно 1,80; приблизительно 1,82; приблизительно 1,84; приблизительно 1,86; приблизительно 1,88 и приблизительно 2,0, или со значениями и в диапазонах, которые включают любое из вышеприведенных значений. Кроме того, высококачественная ДНК, выделенная в соответствии с некоторыми вариантами осуществления, может служить в качестве субстрата для амплификации, например, олигонуклеотида любой и всякой последовательности геномной ДНК, обнаруживаемой в этом являющемся источником материале семени.
В конкретных примерах молекулы нуклеиновых кислот выделяют из обезжиренного материала семени путем экстракции ДНК, используя химический процесс на основе шариков MAGATTRACT® (Qiagen, Valencia, CA). В конкретных примерах экстракция ДНК с использованием
- 13 036151 химического процесса на основе шариков MAGATTRACT® может выполняться в полностью автоматическом режиме (например, с использованием автоматического устройства для переноса и обработки образцов), что значительно сокращает время и затраты, которые влечет за собой процедура. Например и без ограничения, ДНК можно выделить, используя полностью автоматизированный, модифицированный процесс экстракции ДНК MAGATTRACT®, осуществляемый в автоматическом устройстве (например, автоматических устройствах BIOCEL® 1600 и 1800 (Agilent, Technologies, Inc., Santa Clara, CA).
В конкретных вариантах осуществления обезжиренный материал семени может храниться (например, при температуре окружающей среды или при 4°) перед выделением нуклеиновых кислот. Этот период хранения может быть равен 24, 48, 72, 96 ч, неделе, десяти дням или даже больше. Удивительно, но даже после длительного хранения таких материалов семян достаточные количества высококачественных нуклеиновых кислот можно выделить из материала, так что генетический анализ на основе амплификации может использоваться для определения генетических характеристик семени. В некоторых примерах обезжиренный материал семени может храниться при температуре окружающей среды в течение нескольких дней, недель и/или месяцев. Например и без ограничения, обезжиренный материал семени может храниться в течение по меньшей мере 1 дня; по меньшей мере 2 дней; по меньшей мере 3 дней; по меньшей мере 4 дней; по меньшей мере 5 дней; по меньшей мере 6 дней; по меньшей мере 1 недели; по меньшей мере 8 дней; по меньшей мере 9 дней; по меньшей мере 10 дней; по меньшей мере 11 дней; по меньшей мере 12 дней; по меньшей мере 13 дней; по меньшей мере приблизительно 2 недель или больше.
V. Определение характеристик растения и генетического профиля.
В вариантах осуществления настоящего изобретения можно с успехом определить характеристики растения путем анализа образца семени, например и без ограничения, используя способ, включающий экстракцию жирных кислот, а также определить, исходя из того же образца семени, генотип растения в одном или более генетических локусов.
В некоторых вариантах осуществления характеристики растения (например, особенность масла) определяются путем подвергания образца семени анализу жирных кислот. Экстракция растворителем, а также методы экстракции других липидов могут использоваться для определения состава масла из масличного семени. Например, анализ FAME может использоваться для определения количеств различных жирных кислот (например, олеиновой кислоты, стеариновой кислоты, пальмитиновой кислоты) и их классов (например, насыщенных, ненасыщенных и мононенасыщенных жирных кислот). В частности, при селекции масличных растений, такая информация может быть использована для эффективных решений в отношении характеристик новых и/или не охарактеризованных сортов.
Удаление жирных кислот из образца семени создает обезжиренный образец семени, который ранее расценивали только в качестве отходов. Поскольку считалась невозможной экстракция высококачественной ДНК для генетического анализа из такого обезжиренного образца семени, обычные методики селекции растений включали дополнительный и дорогостоящий шаг выращивания остальной части семени для получения материала листьев для экстракции ДНК и последующего подтверждения маркеров. Особенностью некоторых вариантов осуществления настоящего изобретения является то, что потребность в этом шаге отпадает, например, так что только те семена, которые в соответствии с определением имеют желаемые характеристики, отбираются для выращивания и дальнейшего анализа.
Соответственно, в некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения высококачественные нуклеиновые кислоты, которые были выделены из обезжиренного образца семени, могут быть проанализированы для определения по меньшей мере части генотипа семени, из которого был получен образец семени. В конкретных вариантах осуществления нуклеиновые кислоты могут быть достаточно высокого качества и достаточного размера, чтобы сделать возможным генетический анализ по всему геному с помощью метода на основе амплификации. Например, зиготность семени может быть определена в одном или более локусов; например, по маркерам, связанным с представляющим интерес фенотипом, и связанным с кандидатом маркерам. Определение зиготности семени с помощью анализа обезжиренного образца семени может использоваться для осуществления селекции с помощью маркеров. Такие определения могут быть, по существу, такими же точными, как те, которые выполняются с использованием ДНК, выделенной из материала листьев растения или ростков растений с помощью обычных способов.
Анализ высококачественной ДНК, экстрагированной из обезжиренного образца семени, может, в случае конкретных примеров, выполняться с использованием любой системы или способа генетического анализа, известного в данной области, например и без ограничения, методов анализа на основе ПЦР (например, платформы для генотипирования SNP KASPar (Kbioscience Ltd., Hoddesdon, Великобритания), и анализа Taqman®). Последовательности ДНК-мишени, используемые для разработки молекулярных маркеров для генотипирования на основе ПЦР, могут быть идентифицированы исходя из баз данных о геноме или посредством независимого секвенирования.
Олигонуклеотидные праймеры для использования при амплификации ДНК могут быть синтезированы соответственно.
В анализе генотипирования Taqman® используются олигонуклеотидные зонды для выявления амплифицированных генетических маркеров с образца. В этом методе используются праймеры, которые
- 14 036151 являются специфическими для генетического маркера (например, маркера, связанного с геном или фенотипом, представляющим интерес), и флуоресцентные меченые зонды, сконфигурированные для обнаружения различных аллелей маркеров. Зонд, связываемый с одним аллелем, метят флуоресцентным красителем, например FAM, в то время как зонд, связываемый с другим аллелем, метят другим флуоресцентным красителем, например VIC® (Applied Biosystems). Относящиеся к гибридизации анализируются в присутствии или в отсутствие сигнала от флуоресцентного красителя. Система обнаружения может быть использована с высокой пропускной способностью и в удобном формате.
KASPar представляет собой имеющуюся в продаже гомогенную флуоресцентную систему для определения генотипов SNP (Kbioscience Ltd., Hoddesdon, Великобритания). Анализ KASPar включает специфическую для SNP смесь для анализа, которая содержит три немеченых праймера, и реакционную смесь, которая содержит все другие необходимые компоненты; например универсальную флуоресцентную индикаторную систему. В дополнение к этим смесям пользователь обеспечивает, в числе прочего, способное к FRET (резонансному переносу энергии флуоресценции) считывающее устройство для планшетов, титрационный микропланшет(ы) и образцы ДНК, которые содержат приблизительно 5 нг/л высококачественной ДНК.
Типичный анализ KASPar включает следующие стадии: разработка аллель-специфических праймеров (например, используя Primer Picker, которая бесплатно доступна через Интернет на веб-сайте KBiosciences); приготовление реакционной смеси, включающей аллель-специфические праймеры; вмешивание реакционной смеси в образцы ДНК в титрационном микропланшете; термоциклирование; считывание планшета во флуоресцентном планшетном считывающем устройстве; и нанесение на график и оценка данных о флуоресценции. Данные от каждого образца наносят вместе на двумерный график, где оси X и Y соответствуют значениям флуоресценции FAM и VIC. Образцы, имеющие один и тот же генотип SNP, группируются вместе на графике (т.е. А/А; А/а и а/а). Дополнительную техническую информацию о системе KASPar, в том числе руководства решений общих проблем, можно получить из KBiosciences Ltd. (например, KASPar SNP Genotyping System Reagent Manual).
При использовании в конкретных вариантах осуществления генетический анализ ДНК, выделенной из обезжиренного материала семени, может быть выполнен в полностью автоматическом режиме. Например, обезжиренный материал семени, соответствующий различным семенам, может быть загружен в планшет, снабженный дискретными лунками, так что планшет обрабатывается без дальнейшей манипуляции специалистом-практиком для обеспечения данных, используемых для определений зиготности и/или для обеспечения самих определений такого рода.
VI. Использование выделенной ДНК при селекции растений.
В некоторых вариантах осуществления настоящего изобретения генотипическая информация, полученная с использованием системы и/или способов для выделения образца высококачественной нуклеиновой кислоты (например, геномной ДНК) из обезжиренного материала семени, может быть использована для передачи данных и/или определения решений при селекции растений, например, которые могут выноситься при выборочной селекции растения по одному или нескольким признакам, представляющим интерес.
Например, может быть отобран образец семени, полученного от растения, полученного с помощью скрещивания родительских генотипов, причем образец подвергают фенотипическому анализу, включающему экстракцию жирных кислот (например, определение особенности масла), а затем впоследствии используют в качестве исходного материала для выделения образца нуклеиновой кислоты. Любой фенотипический анализ, который поддается измерению или поддается иному определению в семени, может выполняться на семени и/или образце семени. Например, могут быть выполнены анализы, которые не включают экстракцию жирных кислот. Способ, с помощью которого образец семени обезжиривают перед выделением нуклеиновой кислоты, изменяется в конкретных вариантах осуществления.
В некоторых вариантах осуществления представляющим интерес признаком у растения, обезжиренный образец семени которого генотипируют, является особенность масла. Например, представляющим интерес признаком может быть особенность масла в растении, полученном в ходе выполнения стратегии по интрогрессии особенности масла в новую зародышевую плазму и/или по интрогрессии отличного признака в зародышевую плазму, обладающую представляющим интерес признаком, причем желательным является сохранение представляющего интерес признака у растения. В некоторых примерах представляющей интерес особенностью масла является особенность, которую исключают или изменяют с помощью программы селекции растений.
Множество генетической информации может быть определено в образце высококачественной нуклеиновой кислоты из обезжиренного материала семени, выделенного с помощью системы и/или способа в соответствии с некоторыми вариантами осуществления настоящего изобретения. Например, образец семени может быть подвергнут генотипированию в отношении одного или более информационных молекулярных маркеров (например, маркеров, связанных с геном и/или признаком, представляющим интерес). В качестве еще одного примера, образец семени может быть подвергнут генотипированию в отношении одного или более полиморфных маркеров, которые не имеют известной связи с геном и/или признаком, представляющим интерес, например, для идентификации информационного маркера из пула
- 15 036151 маркеров-кандидатов. В зависимости от конкретного использования селекции различная генетическая информация может быть полезна при отборе семени, например, для выращивания в растение или росток растения.
В некоторых вариантах осуществления семя, полученное путем порождения растений в результате скрещивания в программе селекции растений, может быть подвергнуто проверке с помощью фенотипического анализа и генотипического анализа образца семени из него. Например, образец может быть взят из семени, причем образец включает семядолю семени, но не зародыш семени, и образец семени может быть подвергнут фенотипированию (например, в отношении особенности масла, веса семени, белкового состава и т.д.). Во время фенотипирования семени или отдельно от него, образец семени может быть подвергнут обезжириванию, и нуклеиновые кислоты могут быть впоследствии выделены из обезжиренного материала образца семени в соответствии с системой и/или способом по настоящему изобретению. Такая фенотипическая и генетическая проверка образца семени, при сохранении жизнеспособного материала семени, включающего зародыш и любое количество остающейся семядоли, позволяет осуществить отбор семени без выращивания растения или ростка растения из семени.
Конкретные иллюстративные примеры включают выборочную селекцию растений на особенности масла, в том числе, например и без ограничения, особенности масла, заключающиеся в содержании жирных кислот омега-9 (Dow AgroSciences, LLC), включая высокое содержание олеиновой кислоты, низкое содержание линоленовой кислоты и низкое содержание насыщенных жирных кислот. Интрогрессия и сохранение особенностей масла, заключающихся в содержании жирных кислот омега-9, в каноле зависит от присутствия конкретных аллелей fad2, fad3a и fad3c, которые могут быть определены в семени с помощью генетической проверки в отношении одного или более сцепленных маркеров. Кроме того, при селекции по этим и другим признакам может быть желательным одновременная проверка в отношении дополнительного гена и/или признака, представляющего интерес, например и без ограничения, гена восстановителя фертильности (например, восстановителя фертильности Rfo системы цитоплазматической мужской стерильности Ogura). В таких примерах, как эти, два анализа используются для выбора зародышевой плазмы: оценка профиля масла, что касается состава жирных кислот, посредством анализа жирных кислот материала семени; и анализ зиготности генов fad2, fad3a и fad3c (и, возможно, Rfo для определения присутствия восстановителя фертильности). В соответствии с некоторыми системами и/или вариантами осуществления настоящего изобретения, оба эти два анализа могут быть проведены на одном и том же образце семени. Профили масла получают исходя из одного семени (в случае канолы, из наружной части семядоли одного семени), в результате этого процесса образуется остающийся обезжиренный материал семени, который затем подвергают генетическому анализу. Если желательно сравнение профиля масла (и/или других признаков, определенных в семени) и результатов генетического анализа, остальная часть зародыша и внутренняя часть семядоли могут быть посажены для продвижения и/или дополнительной проверки зиготности.
Следующие примеры представлены для иллюстрации некоторых конкретных признаков и/или вариантов осуществления. Не следует делать вывод, что примеры ограничивают описание конкретными признаками или вариантами осуществления, примеры которых приведены.
Примеры
Пример 1. Выделение ДНК из обезжиренного материала половины семени канолы для использования в генотипировании.
Профиль содержащего жирные кислоты омега-9 масла определенной зародышевой плазмы канолы и озимого рапса (WOSR) зависят от наличия мутаций в генах fad2, fad3a и fad3c. Кроме того, в случае мужских линий гибридной системы цитоплазматической мужской стерильности Ogura, присутствие гена Rfo (восстановителя фертильности) требуется для восстановления мужской фертильности. Для идентификации новых, содержащих жирные кислоты омега-9 мужских селекционных линий должна присутствовать соответствующая комбинация вариантов всех четырех генов. Для введения значительной экономии времени и затрат в получении и идентификации зародышевой плазм WOSR был разработан новый метод генетического и фенотипического анализа материала семени, в случае которого посадка и прорастание семени может не потребоваться для выполнения анализа.
Материалы и методы.
Были использованы две группы материала в виде половины семени канолы. Группа А была расщепляющейся по гену Rfo, a группа В была расщепляющейся по генам Rfo, Fad2a, Fad3a и Fad3c (табл. 1).
Процесс посева половины семени канолы повлек за собой замачивание семени в воде в течение 1-2 дней для отделения семенной оболочки от зародыша и семядолей. Семенную оболочку удаляли, наружную часть семядоли отправляли на аналитические и генетические анализы, а внутреннюю часть семядоли/зародыша сажали в теплицу. Контрольный листовой материал был позже собран на стадии развития четвертого листа, подвергнут лиофилизации и отправлен для генетической проверки. Геномную ДНК выделяли и из материала семени, и из контрольного материала листьев, используя одну и ту же процедуру для экстракции и выделения на основе шариков. Гомозиготные, гетерозиготные и нулевые контроли для генов Fad2a, Fad3a, Fad3c и Rfo в ПЦР-анализе Taqman® были также экстрагированы с помощью того же химического процесса на основе шариков.
- 16 036151
Таблица 1
Используемые для проверки F2 совокупности семян канолы
Г руппа А была расщепляющейся по Rfo
Группа В была расщепляющейся по Rfo, Fad2a, Fad3a и Fad3c
ID генотипа F2 совокупности Группа
231741 А
231743 А
200281 А
231761 А
231757 В
200278 В
231755 В
231753 В
Экстракцию масла с последующим анализом метиловых эфиров жирных кислот (F AME) выполняли на образцах половин семян канолы для определения профиля масла для каждого семени (фиг. 1). Для измельчения образцов половин семян для экстракции растворителем образцы измельчали с помощью стального шарика 1/8. Остаточный от процесса экстракции гептан удаляли, используя роторный испаритель CENTRIVAP® (7810010, Labconco, Kansas City, МО) при 65°C в течение 15 мин, а остающийся материал семени готовили для экстракции ДНК.
Измельченную, подвергнутую экстракции растворителем половину семени канолы в подвеске типа матрицы (RB (с зауженным внутренним диаметром) пробирках/аналитический стальной шарик) инкубировали при температуре окружающей среды в течение ночи для испарения остаточного гептана. На следующий день 300 мкл буфера RLT (79216, Qiagen) добавляли в каждую лунку с образцом и подвески укупоривали. Образцы измельчали в течение 5 мин при 1500 об/мин для инициации высвобождения ДНК из материала семени, с последующим конечным центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин для осаждения взвешенного тканевого дебриса. Подвески затем загружали в инкубатор под автоматическим устройством BIOCEL® 1800. Остальная часть протокола происходила в Biocel® 1800.
ДНК выделяли с использованием полностью автоматизированной процедуры экстракции, инициируемой с помощью программного обеспечения Velocity 11.
Магнитные шарики в виде суспензии G MAGATTRACT® ресуспендировали с использованием энергичного встряхивания или интенсивного перемешивания. 10 мкл ресуспендированных шариков в виде суспензии G переносили в каждую лунку для образца планшета с 1-мл половинным объемом лунок AB-GENE®. Подвеску для микропробирок типа матрица, содержащую мацерированную ткань, центрифугировали при 3000 об/мин в течение 45 с. 200-мкл образец супернатанта из каждой микропробирки переносили в планшет с 1-мл половинным объемом лунок AB-GENE®, содержащий шарики в виде суспензии G и буфер для связывания. Образцы перемешивали с помощью наконечника и инкубировали в течение 90 с при комнатной температуре для инициации связывания ДНК (15-25°С).
Затем образцы помещали в блоки на шейкере для титрационных планшетов для тщательного перемешивания в течение 20 с, убеждаясь, что всякие видимые комки разбиты. Образцы инкубировали в течение еще 90 с при комнатной температуре. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной стойке MAGNARACK™ 200-мкл образец супернатанта переносили обратно в подвеску для микропробирок типа матрица. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что они содержат только шарики, и что вся жидкость удалена.
200 мкл буфера RPW (Qiagen) добавляли в каждую лунку с образцом, и образцы затем помещали на шейкер для титрационных планшетов для тщательного перемешивания в течение 20 с. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной стойке. 200-мкл образец супернатанта переносили обратно в подвеску для микропробирок типа 2D матрица. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что они содержат только шарики, и что вся жидкость удалена.
200 мкл EtOH (96-100%) добавляли в каждую лунку с образцом блока, который помещали на шейкер для титрационных планшетов и встряхивали в течение 20 с, чтобы гарантировать, что магнитные частицы были суспендированы. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной стойке. 200 мкл супернатанта переносили в подвеску для микропробирок типа 2D матрицы. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что вся жидкость удалена.
200 мкл EtOH (96-100%) добавляли в каждую лунку с образцом блока, который помещали на шейкер для титрационных планшетов и встряхивали в течение 20 с, чтобы гарантировать, что магнитные частицы были равномерно суспендированы. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной
- 17 036151 стойке. 200 мкл супернатанта переносили в подвеску для микропробирок типа 2D матрицы. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что вся жидкость удалена.
Магнитные частицы инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы гарантировать, что весь EtOH выпарен. 100 мкл буфера АЕ (Qiagen) добавляли в каждую лунку блока, который затем помещали на шейкер на 1 мин, чтобы гарантировать, что магнитные частицы были равномерно суспендированы. Магнитные частицы отделяли на магнитной стойке в течение 30 с. 100 мкл супернатанта переносили в планшет для сбора с маркированными 500-мкл лунками с V-образным дном. Планшет для сбора герметизировали с помощью термогерметизации, используя PLATELOC® с установкой на 2,1 с при 175°С. 90 мкл ДНК выделяли для каждого образца и хранили при 4°С.
После экстракции ДНК на основе шариков образцы количественно оценивали на считывающем устройстве для планшетов SINERGY® 5 (BIOTEK, Winooski, VT), используя реагент PICOGREEN® (Р7581, Invitrogen, Carlsbad, CA) (интеркалирующий дцДНК краситель). Последовательные разведения (0, 2,5, 5,0 и 10 нг/мкл) λ-ДНК загружали для получения стандартной кривой. Степень чистоты ДНК (А260/А280 и А260/А230) оценивали на NANODROP® 8000 (Thermo Fisher), используя 2 мкл неразбавленной ДНК. Качество ДНК (например, молекулярную массу) также определяли, визуализируя 5 мкл неразбавленной ДНК в 1,0% агарозном E-Gel® (G5518-01, Life Technologies, Grand Island, NY) против лэддера высокомолекулярной ДНК размером 10 т.п.о.
ДНК проверяли на присутствие и зиготность генов Rfo и/или FAD (Fad2, Fad3a и Fad3c), используя ПЦР TaqMan®. 1 мкл неразбавленной ДНК использовали на 10 мкл реакции. Для проверки SNP по всему геному использовали химический процесс KASPar. Результаты зиготности по FAD сравнивали с данными анализа FAME для каждого образца семени, чтобы выбрать профиль масла с высоким содержанием олеиновой кислоты.
Для проверки ПЦР KASPar три коэффициента разбавления (1:2, 1:5 и 1:10) были проверены на ДНК из половин семян и сравнены с результатами, полученными с листовой контрольной ДНК (в разведении 1:25). Оценивали шестнадцать маркеров, при этом все образцы ДНК присутствовали в одном и том же планшете для ПЦР. 2 мкл разбавленной ДНК доставляли в 1536-луночный планшет, а затем сушили при 65°С в течение 2 ч. После высушивания ДНК 1,3 мкл приготовленной смеси для ПЦР (1X KASPar смесь плюс праймеры) распределяли в каждую лунку с помощью MERIDIAN® (KBioSciences, Великобритания). Планшеты герметизировали и подвергали термоциклированию, используя протокол касания в HYDROCYCLE®r (KbioSciences, Великобритания), с использованием конечной температуры отжига=55°С. Планшеты считывали, используя считывающее устройство для планшетов PHERASTA®r (BMG Labtech, Offensburg, Германия), и данные оценивали, используя комплекс программного обеспечения KRAKEN® (KbioSciences).
Оценка выхода, чистоты и качества ДНК из обезжиренной половины семени канолы.
Экстракцию масла и анализ FAME выполняли на каждой группе образцов половин семян канолы и получали профиль масла (фиг. 1). ДНК успешно выделяли из остающейся, подвергнутой экстракции растворителем ткани обеих групп, используя автоматизированную процедуру BIOCEL® на основе шариков. Количественный анализ PicoGreen® показал, что концентрации были достаточно постоянными в заданной группе (среднеквадратические отклонения: совокупность (А): 0,24; совокупность (В): 0,09) (табл. 23). В среднем 1,05 нг/мкл ДНК выделяли из группы А, и 0,4 нг/мкл ДНК выделяли из группы В.
Качество ДНК оценивали с помощью визуализации 5 мкл геномной ДНК из группы В в 1,0% агарозном E-Gel® вес/EtBr. Репрезентативный набор образцов ДНК из группы В (планшет # 673-768) использовали для анализа. 10 мкл лэддера высокомолекулярной геномной ДНК HIGHRANGE® добавляли в качестве контроля. Присутствовала полоса с высокой М.м. (10 т.п.о.) с небольшой размытостью (фиг. 2).
Таблица 2
Показатели выхода ДНК (нг/мкл) и степени чистоты для группы A (Rfo)
- 18 036151
Таблица 3
Показатели выхода ДНК (нг/мкл) и степени чистоты для группы В (Rfo:Fad2a:Fad3a:Fad3b)
Оценка эффективности ДНК из обезжиренной половины семени канолы в ПЦР-приложениях.
Выполнение анализа с помощью ПЦР использовали для оценки каждой группы ДНК, используя признак-специфические праймеры (группа A: Rfo, и группа В: Rfo, fad2a, fad3a и fad3c). ПЦР в режиме реального времени проводили на 3 мкл неразбавленной ДНК, выделенной из остающейся, подвергнутой экстракции растворителем ткани для идентификации образцов, расщепляющихся по гену Rfo (фиг. 3-4). ДНК листьев, экстрагированную из проросшей части семени, также проверяли для подтверждения правильности определения зиготности семени (фиг. 3-4). Анализы Fad проводили в виде анализов по конечной точке Taqman (фиг. 5). Эксплуатационные качества образцов определяли путем вычисления процента возврата данных, коэффициента несовпадений запросов, коэффициента вовсе не запросов и коэффициента неудач. В совокупности вовсе не запросы и неудачи были подсчитаны на фоне возврата всех данных. ДНК не нормализовали до анализа.
Высококачественные данные о зиготности были получены во всех анализах с возвратом данных, превышающим 99% и составляющим более 99% соответствием между образцами половины семени и контрольными листовыми образцами для генов FAD (табл. 4). Также отмечалось составляющее 97% соответствием между образцом листьев и образцом семени для гена Rfo (табл. 4). Были обнаружены ожидаемые картины расщепления образцов, и отмечалось соответствующее расщепление между гомозиготными, гемизиготными и нулевыми кластерами. В общей сложности 330 значений было получено в случае каждого анализа. Все критерии проверки зиготности были удовлетворены.
Таблица 4
Статистика проверки с помощью ПЦР ДНК канолы, выделенной из обезжиренного материала семени
Эксплуатационные качества ДНК из семени канолы, выделенной из обезжиренного материала семени, оценивали, используя набор из 16 маркеров SNP. Один планшет с ДНК из группы В разбавляли 2х, 5х и 10х водой перед анализом. Контрольную листовую ДНК разбавляли в 25 раз. После ПЦР каждую совокупность необработанных данных загружали в KRAKEN® и графически наносили для визуализации картин расщепления аллелей (фиг. 6). Образцы с недостаточным качеством будут появляться или как выбросы, или как неудачи на графических представлениях данных.
Сравнение характеристик масла и генотипа.
Профиль масла, что касается содержания 18:1, 18:2 и 18:3 ненасыщенных жирных кислот, совмещали с данными запроса зиготности для генов FAD2, Fad3a и Fad3c во всех образцах (фиг. 7). Соответствие между содержанием 18:1 ненасыщенных жирных кислот и гомозиготностью по FAD2 было сильным, при этом у всех гомозиготных индивидуумов содержание олеиновой кислоты превышало 70%. Для содержания линоленовой кислоты (18:3), Fad3a и Fad3c снижают уровни (<3,5%) при нахождении в гомозиготном мутантном состоянии. Авторы настоящего изобретения заметили, что некоторые индивидуумы, гомозиготные по обоим генам, имели содержание 18:3 ненасыщенных жирных кислот, превышающее
- 19 036151 ожидаемые 3,5%. Все индивидуумы с этим профилем произошли из одной популяции, что означает, что гены от не содержащего жирные кислоты омега-9 родителя обуславливают превышающее ожидаемое значение содержание 18:3 ненасыщенных жирных кислот.
Комбинация профиля масла и результатов по зиготности будет использоваться для отбора и продвижения самого перспективного, содержащего жирные кислоты омега-9 материала. В приложении определение как профиля масла, так и генетического профиля, исходя из источника в виде одной половины семени, позволит в ходе программ селекции канолы и WOSR отбирать только те растения (выращенные из содержащей зародыш части семени), которые обладают желаемыми характеристиками, для пересадки на основе одного образца, тем самым уменьшая загруженность работой в поле и увеличивая эффективность селекции.
Химический процесс был автоматизирован для экстракций с высокой пропускной способностью в автоматическом устройстве BIOCEL® 1800, и автоматизированная система способна обрабатывать до семидесяти 96-луночных планшетов с тканями (6300 проб) в день. Этот способ является надежным. При текущей стоимости, составляющей $0,62 для экстракции масла/анализа FAME и $0,59 для экстракции ДНК, возможность получения профиля масла и генетического профиля, исходя из источника в виде одного семени, за менее чем $1,23 представляет значительную экономию при эксплуатации в поле и лаборатории. До этого исследования генетический профиль мог быть только получен путем выращивания популяции до стадии по меньшей мере 4-го листа, и транспортировка ткани листьев наносит удар по экстракции ДНК. Хотя мало ДНК выделяют из остающегося, подвергнутого экстракции растворителем материала, она является ДНК с высокой молекулярной массой и высокой степенью чистоты, позволяя генерировать надежные данные о SNP и зиготности.
Пример 2. Выделение ДНК из обезжиренного материала семени сои для использования в генотипировании.
В этом примере используется автоматизированная процедура, схожая с той, которая описана в примере 1, для выделения высококачественной геномной ДНК из остающегося, подвергнутого экстракции растворителем материала семени сои, с последующим анализом с помощью ПЦР, специфической для RR1, RR2 и AAD12, ДНК из семени для определения зиготности этих представляющих интерес генов. Контрольные образцы листьев, выращенные из содержащей зародыш части семени, были использованы для проверки правильности определений зиготности.
Материалы и методы.
Были использованы две группы семян сои. Материал семени группы А состоял из отдельных совокупностей расщепляющихся по RR1 и RR2 семян, которые были смешены до выполнения эксперимента для создания одной синтетической совокупности, в то время как материал группы В состоял из одной совокупности зародышевой плазмы, которая была расщепляющейся по признаку AAD12 (табл. 5).
Все семена хранились при температуре окружающей среды в течение 1 года до выполнения этого эксперимента. В связи с тем, что достаточное количество RR1/RR2 семян было доступно для отбора проб, два планшета с материалом семени были приготовлены из этой совокупности (называемые совокупностью 1 и совокупностью 2 группы А). Материал семени группы В отбирали только один раз.
Таблица 5
Используемые для проверки F2 совокупностей семян сои
Группа Совокупность ID источника Классификация материала
А Синтетическая смесь (1 & 2) 09BIW057118 Расщепляющийся по RR2
09В1Х056130 Расщепляющийся по RR1
В 1 GX08KX036929.008 Расщепляющийся по AAD12
Целые семена пропитывали в течение периода, составляющего 10 мин, погружением в diH2O перед удалением небольшой части, чтобы эндосперм был более мягким. Щипцы для ногтей на пальцах ноги (TopCare) (фиг. 8а) использовали для удаления части семядоли (т.е. со стороны, противоположной зародышу, но не включая рубчик семени), равной приблизительно 1/3 от общего размера семени (фиг. 8b). Каждый образец семени помещали в назначенную лунку 96-луночного аналитического планшета и содержащую зародыш часть семени помещали в соответствующую лунку другого 96-луночного аналитического планшета.
Все части семени обрабатывали для экстракции масла и анализа профиля жирных кислот, в то время как содержащие зародыши части семени высаживали в почву METRO-MIX® 360 и выращивали в передвижной камере для роста с использованием суточного цикла (день - 16 ч, 27°С: ночь - 8 ч, 21°С; влажность 60%) в течение периода, составляющего 2 недели. На этапе роста 2-го листа одну 6 мм выко- 20 036151 лотку ткани получали из каждого растения и подвергали экстракции ДНК с целью получения контрольной ДНК для запросов о зиготности.
Анализ метиловых эфиров жирных кислот (FAME) выполняли на экстракте растворителем семени для определения профиля жирных кислот для каждого семени (фиг. 9). Для измельчения образцов семян для экстракции растворителем образцы измельчали с помощью стального шара 1/16. Остаточный от процесса FAME гептан выпаривали, используя роторный испаритель CENTRIVAP® (Labconco), при 65°С в течение 15 мин, и остающийся материал семени готовили для экстракции ДНК.
В пределах 24 ч 350 мкл буфера RLT (Qiagen) добавляли в каждую лунку с образцом подвески типа матрица и укупоривали. Образцы измельчали в течение 2 мин при 1500 об/мин для инициации высвобождения ДНК из материала семени, с последующим конечным центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин для осаждения взвешенного тканевого дебриса. Подвески затем открывали и загружали в BIOMEC® NX для переноса 200 мкл супернатанта в новую подвеску типа матрица, в которую предварительно были внесены шарики (шарики 1/8), так что образцы будут относительно центрифуги в автоматическом устройстве BIOCEL® 1800. Подвески затем загружали в инкубатор под автоматическим устройством и ДНК выделяли, используя ту же полностью автоматизированную процедуру экстракции, описанную в примере 1, инициируемую с использованием программного обеспечения Velocity 11. 90 мкл ДНК выделяли для каждого образца и хранили при 4°С.
После экстракции ДНК на основе шариков ДНК характеризовали с помощью количественного анализа PICOGREEN®, количественного анализа NANODROP® и гель-электрофореза. Для количественного анализа PICOGREEN® 50 мкл красителя PICOGREEN® добавляли к 10 мл 1х ТЕ-буфера и перешивали (для каждого планшета с ДНК, подвергаемого количественному анализу). 90 мкл разбавленного реагента PICOGREEN® и 10 мкл образца ДНК добавляли в каждую лунку белого планшета NUNC® (236108, Nalge Nunc International, Rocheseter, NY) и осуществляли тщательное перемешивание. Оптическую плотность измеряли в считывающем устройстве для планшетов SYNERGY® 5 и концентрации корректировали с учетом коэффициента разбавления.
Для оценки степени чистоты ДНК 2 мкл неразбавленной ДНК из семени сои из каждой лунки добавляли непосредственно на основание считывающего устройства NANODROP® 8000 (Thermo Scientific) и записывали отношение А260/А280, отражающее степень чистоты. Как правило, считается, что значение измерения между приблизительно 1,8 и 2,0 указывает на чистую ДНК, в то время как значения вне этого диапазона могут указывать на наличие белков, фенольных смол, солей и других загрязнений. Качество ДНК также оценивали путем визуализации 5 мкл неразбавленной ДНК в 1,0% агарозном EGel® (Life Technologies). Гель визуализировали в устройстве для визуализации GELDOC® XR (170-8195, BioRad Laboratories, Hercules, CA).
После сбора показателей качества ДНК для образцов в виде половин семян, ДНК проверяли на присутствие и зиготность генов RR1, RR2 и AAD12, используя ПЦР TaqMan®. Исследование зиготности было разработано в системе KRAKEN® LIMS, так что данные анализа могли быть импортированы и просмотрены для определения картины расщепления образцов.
Ниже перечислены компоненты мастер-микс для ПЦР и условия термоциклирования для RR1/RR2(табл. 6) и AAD12 GS-специфических (табл. 7) анализов TaqMan®. Все планшеты с ПЦР анализировали в считывающем устройстве для микропланшетов SYNERGY® 5, и данные о зиготности загружали в KRAKEN® для анализа. Данные от каждого планшета с образцами сортировали в соответствии с числом вовсе не запросов, несовпадений запросов или неудач. Вовсе не запрос определяется как значение, которое не образует кластер с гомозиготными, нулевыми или гетерозиготными контролями. Несовпадением запроса является образец, который не соответствует контрольному (лист) запросу. Неудачные образцы, которые не амплифицировались (не порождали сигнал), оставались в начале координат на графическом представлении данных.
- 21 036151
Таблица 6a-b
RR1- и ИК2-специфическая TaqMan® ПЦР-реакция и условия термоциклирования, используемые для ДНК семени
a) RR1- и RR2-специфическая TaqMan® (с детектированием по конечной точке) ПЦР Образец #
100
Реагенты Рабочая концентрация IX объем (мкл) Общий объем
Н2О 0,25 27,5
GTExpress 2Х 1,50 165
Смесь для анализа 8Х 0,25 27,5
Общий объем смеси (мкл) 2,00 220
+
ДНК 1,00 Каждая
Конечный объем ПЦР (мкл) 3, 00
b) условия TaqMan® ПЦР с детектированием по конечной точке
Стадия # Температура (°C) Время Циклы
1 50 2:00 мин IX
2 95 10:00 IX
3 95 0:15 ЮХ 64 1:00 -1°С/цикл
4 95 0:15 зох
Таблица 7a-b
AAD12-специфическая TaqMan® ПЦР-реакция и условия термоциклирования, используемые для ДНК семени
а) Ген AAD12-специфическая TaqMan® ПЦР
Образец #:
100
Реагенты Рабочая концентрация Требуемая концентрация IX объем (мкл) Общий объем
PVP 2, 0% 0,15% 1,37 150,7
Мастер-микс (для экспрессии гена или генотипирования) 2Х IX 5, 00 550
Смесь для анализа 8Х 0, 5Х 0, 63 69, 3
Н2О 1,00 110
Общий объем смеси (мкл) 8,00 880
+
ДНК 2,00 Каждая
Конечный объем ПЦР (мкл) 10,00
- 22 036151
b) TaqMan® ПЦР в режиме реального времени
Стадия # Температура (°C) Время Циклы
1 50 2:00 мин IX
2 95 10:00 IX
3 95 0:15 4 0Х
60 1: 00
4 4 Выдержка времени
Оценка выхода, чистоты и качества ДНК из обезжиренного семени сои.
ДНК успешно выделяли из остающихся, подвергнутых экстракции растворителем пересланных образцов семян сои группы А (совокупностей 1 и 2) и группы В, используя автоматизированную процедуру BIOCEL® на основе шариков. Данные количественного анализа PicoGreen® показали, что средняя концентрация ДНК во всех планшетах варьировала от 7,52 до 16,25 нг/мкл, с максимальным выделением = 43 нг/мкл, зарегистрированным в одной лунке планшета #Y120067 (табл. 8). Качество ДНК также оценивали путем визуализации 5 мкл геномной ДНК из репрезентативного ряда каждого планшета в агарозном E-GEL® вес/EtBr. Присутствовала полоса с большой М.м. (10 т.п.о.) с небольшой размытостью, что указывает на то, что часть каждого образца ДНК была фрагментирована (фиг. 10). Степень чистоты ДНК (А260/А280) была постоянной во всех проверенных планшетах с семенами и была в пределах допустимого диапазона 1,7-2,0, что указывает на то, остатки загрязняющих веществ были маловероятны.
Таблица 8
Выход ДНК (нг/мкл) и степень чистоты для групп А и В _________Группа А__________Группа В______ Совокупность 1 Совокупность 2 Совокупность 1
Y120065 Y120066 Y120067
Лунка Пико (нг/мкл) 260/ 280 Пико (нг/мкл) 260/ 280 Пико (нг/мкл) 260/ 280
Среднее значение 7,52 1, 86 10, 63 1,79 16, 35 1, 96
Минимальное значение 1,49 0, 07 0,27 0, 05 5, 88 1, 83
Максимальное значение 10, 21 2, 07 17,64 1, 95 43, 16 2,20
Среднеквад- ратическое отклонение 1, 67 0, 21 3,35 0, 20 7, 85 0, 22
Оценка эффективности ДНК из обезжиренного семени сои в ПЦР-приложениях.
Выполнение анализа с помощью ПЦР использовали для оценки каждой группы ДНК из семени, используя признак-специфические праймеры (группа A: RR1 и RR2 и группа В: AAD12). RR1- и RR2специфические ПЦР проводили в формате ПЦР с детектированием по конечной точке (фиг. 11 и 12), в то время как ген AAD12-специфическая TaqMan® ПЦР была выполнена как анализ с помощью ПЦР в режиме реального времени (фиг. 13). Эксплуатационные качества образцов измеряли путем вычисления процента коэффициента возврата данных, коэффициента несовпадений запросов, вовсе не запросов и неудач. В совокупности, вовсе не запросы и неудачи были подсчитаны на фоне возврата всех данных. Всего 180 значений было получено среди образцов ДНК из семян группы А для RR1- и RR2специфических анализов, и 90 значений было получено среди образцов семян группы В для AAD12специфического анализа. Наблюдались ожидаемые картины расщепления образцов, и отмечалось соответствующее расщепление между гомозиготными, гемизиготными и нулевыми кластерами.
Высококачественные данные о зиготности были получены для всех совокупностей ДНК из семян с коэффициентом возврата данных, составляющим 98,4, 99,5 и 100% в RR1-, RR2- и AAD12 GSспецифических анализах соответственно (табл. 9). В свою очередь, 100% соответствие отмечалось между сравнимыми образцами семян и контрольными листовыми образцами в RR1- и RR2-специфических анализах, и составляющее 92,3% соответствие отмечалось между листом и семенем в AAD12 GSспецифическом анализе (табл. 9).
- 23 036151
а)
b)
Таблица 9а-с
Статистические данные для проверки ПЦР в случае соевой ДНК, выделенной из обезжиренного материала семени
Значения Вовсе не запросы Несовпадения Неудачи % возврата данных (факторы в семени, которое не прорастало*) % возврата данных (от проросших образцов) Сравнимые значения (от проросших образцов**) Коэффициент совпадений (%) RRl-специфическая Taqman ПЦР с детектированием по конечной точке
Совокупность 1 Совокупность 2
Y120082 (лист) 33* 0 нет данных 0 36, 7 100 32 1 Y120065 (семя) 90 1 0 0 100 Ϊ** 00 Y120064 (лист) 39* 0 нет данных 3 40, 0 92,3 39 1( Y120066 (семя) 90 3 0 0 96, 7 )0
НИ2-специфическая Taqman ПЦР с детектированием по конечной точке
Совокупность 1 Совокупность 2
Y120082 (лист) Y120065 (семя) Y120064 (лист) Y120066 (семя)
Значения 33* 90 39* 89
Вовсе не запросы 0 0 0 1
Несовпадения нет данных 0 п/а 0
Неудачи 0 0 3 0
% возврата данных (факторы в семени, которое не прорастало*) 36, 7 100 40, 0 98,9
% возврата данных (от проросших образцов) 100 92,3
Сравнимые значения (от проросших образцов**) 33** 39**
Коэффициент совпадений (%) 100 100
- 24 036151
с) ____________________________________________________
AAD12 GS-специфическая Taqman ПЦР в режиме реального времени
Совокупность 1
Y20066 (лист) Y120067 (семя)
Значения 39* 90
Вовсе не запросы 1 0
Несовпадения нет данных 3
Неудачи 0 0
% возврата данных (факторы в семени, которое не прорастало) 42,2 100
% возврата данных (от проросших образцов) 97,4
Сравнимые значения 39**
Коэффициент совпадений (%) 92,3
* Содержащие зародыш части 90 разделенных на части семян были посажены.
Число проросших частей указано звездочкой.
* * Сравнивали только те части семян, для которых имелись запросы о контроле в виде листа.
Вышеизложенная система и способ для экстракции и амплификации ДНК из семени из остающейся, подвергнутой экстракции растворителем ткани является надежной. При стоимости, составляющей $0,62 для экстракции масла (FAME) и $0,61 для экстракции геномной ДНК, можно получить профиль масла и генетический профиль, исходя из источника в виде одного семени, за менее чем $1,23. При применении селекционеры могут выбрать только те семена, которые обладают желаемым профилем масла и генетическим профилем, для посадки и просто отбросить нежелательную зародышевую плазму, тем самым уменьшая загруженность работой в поле и повышая производительность.
Пример 3/ Выделение ДНК из обезжиренного материала семени подсолнечника для использования в генотипировании.
В этом примере используется автоматизированная процедура, схожая с той, которая описана в примере 1, для выделения высококачественной геномной ДНК из остающегося, подвергнутого экстракции растворителем материала семени подсолнечника. Выделенную ДНК использовали для генотипирования одной группы подвергнутых экстракции растворителем образцов половин семян (группы А) по 9 маркерам SNP, которые, как было ранее определено, связаны с устойчивостью к ложной мучнистой росе. ДНК выделяли из второй группы подвергнутых экстракции растворителем образцов (группы В), расщепляющейся по признакам устойчивости к ложной мучнистой росе и уменьшенного содержания насыщенных жирных кислот в масле, и использовали в ПЦР-анализе (в отношении 14 маркеров SNP), чтобы продемонстрировать, что планшеты с подвергнутым экстракции растворителем материалом можно хранить при температуре окружающей среды в течение вплоть до 11 дней до выделения ДНК, и что процедура может быть выполнена в небольшом объеме для уменьшения стоимости и увеличения пропускной способности. Эти особенности могут быть использованы для вызова значительного снижения стоимости при использовании в больших масштабах.
Материалы и методы.
Были использованы две группы материала в виде половин семян подсолнечника (фиг. 14). Материал группы А (расщепляющийся по устойчивости к ложной мучнистой росе) разделяли на содержащую семядолю часть семени (1/4 часть семени) и содержащую зародыш часть семени (3/4 частей семени). Части семени подвергали процессам экстракции растворителем и выделения ДНК. ДНК также выделяли из дополнительного контрольного набора материала в виде 1/4 семени, который не был подвергнут обезжириванию. Все ДНК разбавляли 2х до анализа SNP.
Материал семени (1/4 семени) группы В использовали для оценки стабильности нуклеиновых кислот в остающемся, подвергнутом экстракции растворителем материале семени, который хранили в течение длительного периода (пяти или одиннадцати дней) до выделения ДНК. Подвергнутый экстракции растворителем материал группы В обрабатывали с использованием модифицированного варианта авто- 25 036151 матизированной процедуры выделения ДНК (иначе называемой LowVol), описанной в примере 1, для уменьшения стоимости процедуры. Образцы ДНК группы В разбавляли в 20 раз до анализа SNP, приспосабливаясь к использованию большого проекционного набора маркеров.
В отличие от материала в виде половины семени канолы и сои, материал семени подсолнечника не замачивали и семенную оболочку не удаляли до разделения. Извлекаемые части семени перемещали вручную с помощью скальпеля. Поскольку относящиеся к родителям контроли для групп А и В уже были выделены, используя схожую процедуру, и каталогизированы в библиотеке маркеров, контрольный материал ткани листьев не выращивали в этом примере.
Экстракцию растворителем выполняли на 1/4 части семени и 3/4 частях семени из группы А для определения профиля масла для каждого образца (фиг. 15). Материал группы В измельчали, используя стальной шарик 3/8, и обезжиривали. Также определяли профиль масла из дополнительной, подвергнутой экстракции растворителем совокупности в виде 1/4 части семени (фиг. 16). Остаточный от процесса экстракции растворителем гептан выпаривали, используя роторный испаритель CENTRIVAP® (Labconco), при 65°С в течение 15 мин, и остающийся материал семени готовили для экстракции ДНК. После обезжиривания подвергнутый экстракции растворителем материал группы В хранили в вытяжном шкафу в течение периода, составляющего 5 (группа В1) или 11 (группа В2) дней при температуре окружающей среды (~25°С).
Для подвергнутого экстракции растворителем материала семени группы А 350 мкл буфера RLT (Qiagen) добавляли в каждую лунку с образцом подвески типа матрица в пределах приблизительно 24 ч от экстракции. Образцы измельчали, используя стальной шарик 3/8, в течение 2 мин при 1500 об/мин для инициации высвобождения ДНК из материала семени, с последующим конечным центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин для осаждения взвешенного тканевого дебриса. Подвески затем загружали в инкубатор LICONIC® под автоматическим устройством BIOCEL® 1800 и ДНК выделяли, используя ту же полностью автоматизированную процедуру экстракции, описанную в примере 1, инициируемую с использованием программного обеспечения Velocity 11. 90 мкл ДНК выделяли для каждого образца и хранили при 4°С.
Способ приготовления ткани слегка варьировал для образцов в виде 1/4 семени, которые не обезжиривали до экстракции ДНК (группа А1). Первоначальный сухой размол с использованием 1/8стального шарика выполняли при 1500 об/мин в течение 5 мин для мацерации ткани семени. Затем 300 мкл буфера RLT добавляли в каждую лунку с образцом подвески типа матрица и образцы укупоривали. Затем образцы измельчали в течение еще 5 мин при 1500 об/мин для гомогенизации образца и высвобождения ДНК, с последующим конечным центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин для осаждения взвешенного тканевого дебриса. Как и в случае с обезжиренными образцами, подвеску затем открывали и загружали в инкубатор под автоматической платформой для экстракции, используя автоматизированный процесс. 90 мкл ДНК выделяли для каждого образца группы А и хранили при 4°С.
Малообъемный вариант автоматизированной процедуры выделения ДНК использовали для экстрагирования образцов группы В. В осуществляемом в малом объеме способе используется меньшее количество магнитных шариков для связывания ДНК, разбавленные буферы для промывки и разбавленный буфер для элюирования (концентрирования ДНК).
Для приготовления образцов для экстракции ДНК 300 мкл буфера RLT добавляли в каждую лунку подвески типа матрица.
Образцы измельчали в течение 2 мин при 1500 об/мин для инициации высвобождения ДНК из материала семени, с последующим конечным центрифугированием при 6000 об/мин в течение 5 мин для осаждения взвешенного тканевого дебриса. Поскольку лунки с образцами все же содержали магнитные шарики 3/8, подвески не могли быть предназначены для уравновешивания относительно центрифуги BIOCEL®. По этой причине 200 мкл образца супернатанта переносили в новую подвеску типа матрица, содержащую шарики 1/8, используя BIOMEK® NX. Подвеску с образцами открывали и помещали в инкубатор. Автоматизированный малообъемный протокол начинали, используя программное обеспечение Velocity 11, и 75 мкл ДНК выделяли для каждого образца и хранили при 4°С.
Осуществляемая в малом объеме процедура для выделения ДНК из обезжиренного материала семени.
Измельченную, подвергнутую экстракции растворителем половину семени подсолнечника в подвеске типа матрица инкубировали при температуре окружающей среды в течение ночи для выгорания остаточного гептана. На следующий день 300 мкл буфера RLT добавляли в каждую пробирку. Подвеску укупоривали и образцы в ней измельчали в течение 20 мин при 1500 об/мин. Подвеску затем центрифугировали при 6000 об/мин в течение 5 мин. Подвеску типа матрица затем переносили в инкубатор LICONIC® в BIOCEL® 1800. Остальная часть протокола происходила в BIOCEL® 1800.
Магнитные шарики в виде суспензии G MAGATTRACT® ресуспендировали с использованием энергичного встряхивания или интенсивного перемешивания. 10 мкл ресуспендированных шариков в виде суспензии G переносили в каждую лунку для образца планшета с 1-мл половинным объемом лунок AB-GENE®. Подвеску для микропробирок типа матрица, содержащую мацерированную ткань, цен- 26 036151 трифугировали при 3000 об/мин в течение 45 с. 100 мкл супернатанта из каждой микропробирки переносили в соответствующую лунку планшета с 1-мл половинным объемом лунок AB-GENE®, содержащую мкл суспензии G. Образцы перемешивали с помощью наконечника и инкубировали в течение 90 с при комнатной температуре для инициации связывания ДНК (15-25°С).
Затем образцы помещали в блоки на шейкере для титрационных планшетов для тщательного перемешивания в течение 20 с, убеждаясь, что всякие видимые комки разбиты. Образцы инкубировали в течение еще 90 с при комнатной температуре. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной стойке MAGNARACK™. 150-мкл образец супернатанта переносили обратно в подвеску для микропробирок типа 2D матрица. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что они содержат только шарики, и что вся жидкость удалена.
100 мкл буфера RPW (Qiagen) добавляли в каждую лунку с образцом и образцы затем помещали на шейкер для титрационных планшетов для тщательного перемешивания в течение 20 с. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной стойке. Приблизительно 150-мкл образец супернатанта переносили обратно в подвеску для микропробирок типа 2D матрицы. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что они содержат только шарики, и что вся жидкость удалена.
100 мкл EtOH (96-100%) добавляли в каждую лунку с образцом блока, который затем помещали на шейкер для титрационных планшетов и встряхивали в течение 20 с, чтобы гарантировать, что магнитные частицы были суспендированы. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной стойке. Приблизительно 150 мкл супернатанта переносили в подвеску для микропробирок типа 2D матрица. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что вся жидкость удалена.
200 мкл EtOH (96-100%) добавляли в каждую лунку с образцом блока, который затем помещали на шейкер для титрационных планшетов и встряхивали в течение 20 с, чтобы гарантировать, что магнитные частицы были равномерно суспендированы. Магнитные частицы отделяли в течение 15 с на магнитной стойке. 200 мкл супернатанта переносили в подвеску для микропробирок типа 2D матрица. Лунки проверяли, чтобы убедиться, что вся жидкость удалена.
Магнитные частицы инкубировали при комнатной температуре в течение 5 мин, чтобы гарантировать, что весь EtOH выпарен. 75 мкл буфера АЕ (Qiagen) добавляли в каждую лунку блока, который затем помещали на шейкер на 1 мин, чтобы гарантировать, что магнитные частицы были равномерно суспендированы. Магнитные частицы отделяли на магнитной стойке в течение 30 с. 75 мкл супернатанта переносили в планшет для сбора с маркированными 500-мкл лунками с V-образным дном. Планшет для сбора герметизировали с помощью термогерметизации, используя PLATELOC® с установкой на 2,1 с при 175°С.
мкл ДНК выделяли для каждого образца и хранили при 4°С.
После экстракции ДНК на основе шариков образцы ДНК характеризовали с помощью количественного анализа PICOGREEN®, количественного анализа NANODROP® и электрофореза в агарозном геле. Для количественного анализа PICOGREEN® 50 мкл красителя PICOGREEN® добавляли к 10 мл 1х ТЕбуфера и перешивали (для каждого планшета с ДНК, подвергаемого количественному анализу). 90 мкл разбавленного реагента PICOGREEN® и 10 мкл образца ДНК добавляли в каждую лунку белого планшета NUNC® и осуществляли тщательное перемешивание. Оптическую плотность измеряли в считывающем устройстве для планшетов SYNERGY® 5 при длинах волн 285/520 и 535/10. Последовательное разведение 10,0, 5,0, 2,5 и 0 нг/мкл стандарта в виде λ-ДНК (N3011L, New England Biolabs, Ipswitch, MA) добавляли в соседние лунки для получения стандартной кривой и концентрации корректировали с учетом коэффициента разбавления.
Для оценки степени чистоты ДНК 2 мкл неразбавленной ДНК из 1/4 семени группы А, ДНК из 3/4 семени группы А и неразбавленной ДНК из 1/4 семени группы В добавляли непосредственно на каждое основание считывающего устройства NANODROP® 8000 (Thermo Scientific) и записывали отношение А260/А280, отражающее степень чистоты. Как правило, считается, что значение измерения между приблизительно 1,8 и 2,0 указывает на чистую ДНК, в то время как значения вне этого диапазона могут указывать на наличие белков, фенольных смол, солей и других загрязнений. Качество ДНК каждого образца также оценивали путем визуализации 5 мкл неразбавленной ДНК в 1,0% агарозном E-Gel® (Life Technologies), содержащем EtBr. Лэддер ДНК с высокой М.м. 400-10000 п.о. HIGHRANGE™ вносили на один конец геля для сравнения. Г ель визуализировали в устройстве для визуализации GELDOC® XR.
Образцы ДНК, выделенные из образцов 1/4 и 3/4 семени, которые были обезжирены, и образцов 1/4 семени, которые не были обезжирены, были обследованы в отношении зиготности по совокупности маркеров SNP, используя протокол на основе ПЦР KASPar. 9 маркеров, имеющих отношение к признаку ложная мучнистая роса, оценивали, используя материал группы А. Контрольную ДНК для обоих родителей получали и разбавляли в 20 раз.
мкл разбавленной в 2 раза ДНК семян доставляли в каждую лунку 384-луночного планшета, а затем сушили при 65°С в течение 2 ч. В конце периода высушивания 4 мкл 1X смеси для ПЦР KASPar (с праймерами) (табл. 10) добавляли в каждую лунку планшета для ПЦР, используя коллектор для жидкости MERIDIAN® (KBS-0002-001, KBioscience, Hertfordshire, Великобритания), с добавлением относя- 27 036151 щихся к родителям контролей. Планшеты герметизировали, используя устройство для термогерметизации FLEXISEAL™ (Kbioscience), и ПЦР с использованием протокола касания (табл. 10) выполняли в
HYDROCYCLE®r-16 (KbioSciences, Великобритания), с использованием конечной температурой отжига =
55°С. После ПЦР планшеты центрифугировали при 3000 об/мин в течение 1 мин и считывали, используя считывающее устройство для планшетов PHERASTA®r (470-0268, BMG Labtech, Offensburg, Германия).
Анализ данных SNP выполняли, используя KRAKEN®.
Таблица 10а-с ПЦР KASPar и условия выполнения циклов для 384-луночных и 1536-луночных планшетов
а) Приготовление смеси для анализа
Концентрация в смеси для анализа (мкМ) Объем в смеси для анализа (мкл)
Аллель-специфический праймер 1 (100 мкМ) 12 36
Аллель-специфический праймер 2 (100 мкМ) 12 36
Общий (обратный) праймер (100 мкМ) 30 90
Tris-HCl (100 мкМ, pH 8,3) 138
b) Набор установок для ПЦР-реакции KASPar (мкл)
Приготовление смеси в большом объеме для ПЦР KASPar На объем реакции (мкл)
Распределить матрицу по Объем смеси для SNP Объем 1х мастер-микс для ПЦР KASPar Общий объем смеси ДНК в жидкости * Смесь KASPar Общий объем реакции
1536-лункам (96 образцов, 16 анализов) 4 246 250 2,0 1,3 1,3
1536-лункам (192 образца, 8 анализов) 6 374 380 2,0 1,3 1,3
384-лункам (48 образцов, 8 анализов) 5 295 300 2,0 4,0 4,0
* Высушенная до добавления мастер-микс для ПЦР KASPar
с) Параметры термоциклирования ПЦР
Стадия 1 94°С 15 мин 1 цикл
Стадия 2 94°С 2 0 сек 10 циклов
65°С до 57°С 1 мин
Стадия 3 94°С 2 0 сек 29 циклов
57°С 1 мин
Оценка выхода, степени чистоты и качества ДНК из обезжиренного семени подсолнечника.
ДНК успешно выделяли и из остающейся, подвергнутой экстракции растворителем ткани 1/4 и 3/4 семени и из не подвергнутой воздействию ткани 1/4 семени, используя процедуры на основе шариков. Данные количественного анализа PicoGreen® показали, что средняя концентрация ДНК в планшетах варьировала от 4,87 (не подвергнутые воздействию образцы 1/4 семени) до 19,50 нг/мкл (обезжиренные образцы 1/4 семени) (табл. 8). В среднем 18,21 нг/мкл ДНК выделяли из обезжиренных образцов 3/4 семени.
Наблюдаемая вариация выхода планшетами с 1/4 семени группы А1 и группы А2, по-видимому, была обусловлена различиями в размере части семени и, скорее всего, не была результатом процесса экстракции FAME. Поскольку FAME-экстракцию (если имеется) выполняют до экстракции ДНК, материал семени измельчали до анализа ДНК, и было невозможно подтвердить размер части семени на стадии экстракции ДНК. Из-за этой неопределенности, дополнительный планшет с образцами 1/4 семени (названный дополнительной совокупностью) был использован для сбора дополнительных данных о составе масла (фиг. 16) и данных о ДНК (фиг. 20). Средний выход, составляющий 6,42 нг/мкл, ДНК был получен в случае этой дополнительной совокупности, что сопоставимо с показателями ДНК, собранными для не
- 28 036151 подвергнутого воздействию образца 1/4 семени из группы А1.
Гель-электрофорез всех совокупностей группы А показал, что интенсивность полосы для образцов ДНК из 1/4 семени из группы А2 больше всего соответствует такой для обезжиренных образцов 3/4 семени из группы А1, что, в свою очередь, означает, что образцы 1/4 семени группы А2, скорее всего, были ближе по размеру к образцам 3/4 семени после получения (фиг. 17). Гель-электрофорез также показал по присутствию небольшой размытости, что часть каждого образца ДНК была разбита на куски.
Таблица 11
Показатели выхода ДНК (нг/мкл) и степени ее чистоты для образцов семян группы А, экстрагированных с помощью стандартного метода MagAttract
Совокупность А1 Совокупность А2
части семени (обезжиренные) Ч часть семени (не подвергнутая воздействию) >4 части семени (обезжиренной)
Конц. 260/280 Конц. 260/280 Конц. 260/280
Среднее значение 18,21 1, 61 4,87 2,67 19, 50 1,75
Минимальное значение 3, 16 1, 39 1, 64 1,44 5, 56 1, 61
Максималь- ное значение 33,90 1, 74 10,47 3,95 25, 63 1,86
Среднеквад- ратическое отклонение 7, 00 0, 09 2,10 0,41 4, 58 0,01
Примечание: концентрации представлены в нг/мкл; ДНК элюировали в 100 мкл.
ДНК также успешно выделяли из остающегося, подвергнутого экстракции растворителем материала семени, используя осуществляемую в малом объеме процедуру. Данные количественного анализа PicoGreen® показали, что средняя концентрация ДНК из этих образцов варьировала от 24,54 нг/мкл до 30,49 нг/мкл (обезжиренные пробы хранились при температуре окружающей среды в течение 11 дней) и от 8,21 нг/мкл до 19,87 нг/мкл (обезжиренные образцы хранились при температуре окружающей среды в течение пяти дней) (табл. 12). В среднем 2,06 мкг ДНК выделяли из подвергнутого экстракции растворителем материала, который хранили в течение одиннадцати дней, в то время как 1,49 мкг и 0,62 мкг ДНК выделяли из двух планшетов с подвергнутым экстракции растворителем материалом, который хранили в течение пяти дней.
Степень чистоты ДНК (А260/А280) была сопоставимой в случае всех проверенных образцов, составляя в среднем от 1,72 до 1,75.
Таблица 12
Показатели выхода ДНК (нг/мкл) и степени ее чистоты для ДНК, выделенной из хранимых обезжиренных образцов семян (группа В)
Полученная с использованием малообъемной процедуры MagAttract ДНК из семени подсолнечника
Примечание: концентрации представлены в нг/мкл; ДНК элюировали в 75 мкл.
- 29 036151
Также определяли выход ДНК и степень ее чистоты в дополнительной совокупности подвергнутой экстракции растворителем 1/4 семени (табл. 13 и фиг. 18).
Таблица 13
Показатели выхода ДНК (нг/мкл) и степени ее чистоты (А260/А280) для ДНК, выделенной из обезжиренной дополнительной совокупности 1/4 семени подсолнечника, используя процедуру MaqAttract
Концентрация (нг/мкл в 100 мкл) 260/280
Среднее значение 6, 42 нет данных
Минимальное значение 2,58 нет данных
Максимальное значение 13, 11 нет данных
Среднеквадратическое отклонение 1, 91 нет данных
Оценка эффективности ДНК из обезжиренного семени подсолнечника в ПЦР-приложениях.
Выполнение анализа с помощью ПЦР использовали для оценки каждой группы образцов ДНК из семян для определения зиготности по набору из 9 маркеров SNP (т.е. ID SNP: 67988; 68382; 68442; 69337; 69424; 65952; 92237; 95348 и 89986) (фиг. 19-20). Каждый планшет образцов ДНК из обезжиренной (группа А2) и необезжиренной (группа А1) 1/4 части семени проверяли дважды, чтобы обеспечить воспроизводимость данных. Кроме того, образцы ДНК из обезжиренных 3/4 частей семени (содержащих зародыши) оценивали с использованием тех же 9 маркеров для определения, будет ли присутствие и мужской, и женской генетики искажать данные, касающиеся маркеров. Все ДНК из семян разбавляли в 2 раза водой перед анализом, а более концентрированные контрольные ДНК из листьев родителей разводили в 20 раз. После ПЦР каждую совокупность необработанных данных ПЦР загружали в KRAKEN® и графически наносили для визуализации картин расщепления аллелей. Образцы с недостаточным качеством будут появляться или как выбросы, или как неудачи на графических представлениях данных.
Надежные данные, касающиеся маркеров SNP, были получены во всех проверенных сценариях. Кроме того, сравнение данных, касающихся маркеров, между 1/4 частью семени и соответствующими 3/4 частями семени выявило высокий уровень соответствия межу запросами.
Эксплуатационные в ПЦР-анализе качества ДНК, выделенной из остающегося, подвергнутого экстракции растворителем материала семени, который хранился в течение пяти или одиннадцати дней до выделения, также оценивали. В этих анализах ДНК разбавляли в 20 раз водой перед сушкой 2 мкл ДНК и анализом в 1,3 мкл анализе KASPar (1536-луночный формат). Набор из 14 маркеров SNP (ID SNP: 67988; 68382; 68442; 68862; 69337; 69424; 65952; 65992; 66345; 92237; 95348; 94512; 89986; 93920) использовали для генотипирования этих образцов. После ПЦР каждую совокупность необработанных данных загружали в KRAKEN® и графически наносили для визуализации картин расщепления аллелей.
Данные включали образцы с сильной кластеризацией с предполагаемым родителем, что показывает надежность этих образцов в системе генотипирования с помощью ПЦР (фиг. 21). Для образцов, которые не расщеплялись по набору маркеров (в первую очередь группы В2 (планшеты # 2012-092_1 & 2)), отмечалось соответствующее разделение между генотипами АА, АВ и ВВ (фиг. 21). Мало неудач или несовпадений запросов отмечалось в той или другой совокупности образцов.
Малообъемный вариант процедуры выделения ДНК был подтвержден, и было установлено, что длительное хранение подвергнутого экстракции растворителем материала семени не влияет существенно на выделение ДНК и ее эксплуатационные качества.

Claims (7)

  1. ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
    1. Способ определения представляющего интерес генотипа в локусе растения, включающий получение из одного семени масличного растения, где масличное растение представляет собой Brassica spp., Glvcine max или Helianthus annuus (i) образца семени, содержащего часть семядоли одного семени, и (ii) оставшейся части семени, которая содержит зародыш одного семени;
    экстракцию масел из образца семени путем экстракции растворителем, получая таким образом обезжиренный образец семени;
    превращение экстрагированных масел в метиловые эфиры жирных кислот (FAME) путем переэтерификации и количественный анализ FAME с использованием газовой хроматографии, определяя таким образом, что семя содержит представляющую интерес особенность масла;
    выделение нуклеиновых кислот из обезжиренного образца семени, используя магнитные частицы, которые связывают нуклеиновые кислоты в экстракции ДНК на основе шариков;
    - 30 036151 амплификацию нуклеиновых кислот в представляющем интерес локусе с помощью полимеразной цепной реакции;
    определение аллельного состава амплифицированных нуклеиновых кислот из семени, содержащего представляющий интерес генотип в локусе;
    высаживание оставшейся части семени и выращивание растения из посаженной части семени.
  2. 2. Способ по п.1, в котором локусом является ген.
  3. 3. Способ по π. 1, в котором определение аллельного состава амплифицированных нуклеиновых кислот включает гибридизацию аллель-специфического зонда с амплифицированными нуклеиновыми кислотами.
  4. 4. Способ по п.1, в котором выделение нуклеиновых кислот, амплификацию нуклеиновых кислот в представляющем интерес локусе и определение аллельного состава амплифицированных нуклеиновых кислот осуществляют последовательно в автоматическом режиме.
  5. 5. Способ по п.1, в котором высаживание оставшейся части семени включает размещение части семени в почве.
  6. 6. Способ по п.1, в котором высаживание оставшейся части семени включает помещение части семени в поддерживающую рост среду.
  7. 7. Способ по любому из пи. 1-6, в котором масличное растение представляет собой Brassica spp.
EA201591107A 2012-12-10 2013-12-09 Выделение геномной днк из остающихся, подвергнутых экстракции образцов семян EA036151B1 (ru)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261735485P 2012-12-10 2012-12-10
PCT/US2013/073826 WO2014093204A2 (en) 2012-12-10 2013-12-09 Recovery of genomic dna from remnant extracted seed samples

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591107A1 EA201591107A1 (ru) 2016-05-31
EA036151B1 true EA036151B1 (ru) 2020-10-06

Family

ID=50931345

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591107A EA036151B1 (ru) 2012-12-10 2013-12-09 Выделение геномной днк из остающихся, подвергнутых экстракции образцов семян

Country Status (14)

Country Link
US (1) US9631232B2 (ru)
EP (1) EP2929055A4 (ru)
CN (1) CN105229167A (ru)
AR (1) AR093878A1 (ru)
AU (1) AU2013359768B2 (ru)
BR (1) BR112015013425A2 (ru)
CA (1) CA2892163C (ru)
CL (1) CL2015001601A1 (ru)
EA (1) EA036151B1 (ru)
HK (1) HK1219114A1 (ru)
MX (1) MX2015007370A (ru)
UY (1) UY35180A (ru)
WO (1) WO2014093204A2 (ru)
ZA (1) ZA201503832B (ru)

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5773295A (en) * 1995-10-19 1998-06-30 Turyan; Yaakov I. Determination of acid values in oil seeds
US6100030A (en) * 1997-01-10 2000-08-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of selective DNA fragment amplification products for hybridization-based genetic fingerprinting, marker assisted selection, and high-throughput screening
US20070048872A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-01 Deppermann Kevin L High throughput screening of fatty acid composition

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7832143B2 (en) * 2004-08-26 2010-11-16 Monsanto Technology Llc High throughput methods for sampling seeds
KR20090033840A (ko) * 2006-05-26 2009-04-06 몬산토 테크놀로지 엘엘씨 형질전환 계통 ｍｏｎ８９０３４에 해당하는 옥수수 식물 및 종자와 이의 검출 방법 및 사용
US9000276B2 (en) * 2007-05-31 2015-04-07 Agrigenetics, Inc. Inbred corn line 3HK232
CN101792757A (zh) * 2010-03-30 2010-08-04 上海鼎国生物技术有限公司 一种用磁珠分离基因组dna试剂盒及其应用
BR112013001330B1 (pt) * 2010-07-20 2019-04-02 Monsanto Technology Llc Sistemas de retirada de amostra de semente e método automatizado para remover amostras de tecido de sementes
EP2596135A2 (en) * 2010-07-23 2013-05-29 Beckman Coulter, Inc. System and method including analytical units
CN101956011B (zh) * 2010-09-20 2012-09-05 暨南大学 一种快速鉴定棉花中转基因成分的检测方法及其应用
UY33856A (es) * 2011-01-03 2012-08-31 Agrigenetics Inc ?gen y variaciones asociadas con el fenotipo bm1, marcadores moleculares y su uso?.

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5705628A (en) * 1994-09-20 1998-01-06 Whitehead Institute For Biomedical Research DNA purification and isolation using magnetic particles
US5773295A (en) * 1995-10-19 1998-06-30 Turyan; Yaakov I. Determination of acid values in oil seeds
US6100030A (en) * 1997-01-10 2000-08-08 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Use of selective DNA fragment amplification products for hybridization-based genetic fingerprinting, marker assisted selection, and high-throughput screening
US20070048872A1 (en) * 2005-08-26 2007-03-01 Deppermann Kevin L High throughput screening of fatty acid composition

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
CHUNWONGSE et al., "Pre-germination genotypic screening using PCR amplification of half-seeds" Theoretical and Applied Genetics, Vol. 86, No. 6, pp. 694-698 (1993) See abstract; and pages 694-696 *

Also Published As

Publication number Publication date
AU2013359768B2 (en) 2019-05-09
AU2013359768A1 (en) 2015-06-11
WO2014093204A2 (en) 2014-06-19
UY35180A (es) 2014-07-31
EP2929055A4 (en) 2016-07-27
EP2929055A2 (en) 2015-10-14
EA201591107A1 (ru) 2016-05-31
CA2892163C (en) 2021-03-02
ZA201503832B (en) 2016-08-31
MX2015007370A (es) 2015-10-14
BR112015013425A2 (pt) 2017-07-11
CL2015001601A1 (es) 2015-10-02
WO2014093204A3 (en) 2014-10-23
CN105229167A (zh) 2016-01-06
US20140170651A1 (en) 2014-06-19
CA2892163A1 (en) 2014-06-19
HK1219114A1 (zh) 2017-03-24
US9631232B2 (en) 2017-04-25
AR093878A1 (es) 2015-06-24

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Gady et al. Implementation of two high through-put techniques in a novel application: detecting point mutations in large EMS mutated plant populations
JP5762400B2 (ja) イネ遺伝子組換え事象１７０５３およびその使用方法
JP5769698B2 (ja) 遺伝子組換えイネ事象１７３１４およびその使用方法
Xin et al. Applying genotyping (TILLING) and phenotyping analyses to elucidate gene function in a chemically induced sorghum mutant population
JP6393478B2 (ja) トランスジェニック事象ｍｏｎ８７７１２に対応するダイズ植物および種子、ならびにそれを検出するための方法
US11032986B2 (en) Methods of creating drought tolerant corn plants using markers linked to cold shock domain-containing proteins and compositions thereof
AU2004303836A1 (en) High lysine maize compositions and methods for detection thereof
Wilson et al. Advanced backcross quantitative trait loci (QTL) analysis of oil concentration and oil quality traits in peanut (Arachis hypogaea L.)
US20180371483A1 (en) Molecular markers for low palmitic acid content in sunflower (helianthus annus), and methods of using the same
RU2717017C2 (ru) Молекулярные маркеры гена rlm2 резистентности к черной ножке brassica napus и способы их применения
AU2014318042B2 (en) Molecular markers for blackleg resistance gene Rlm4 in Brassica napus and methods of using the same
US9631232B2 (en) Recovery of genomic DNA from remnant extracted seed samples
US20130095485A1 (en) Materials and Methods for Detecting the Aryloxyalkanoate Dioxygenase Gene (AAD-12) Containing Event pDAB4472-1606 in Plants
CN114514330A (zh) 用于检测甘蓝型油菜中染色体易位的组合物和方法
US20140212877A1 (en) Maize linkage drag and genome analysis process

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ BY KZ KG TJ TM