EA031973B1 - Способ получения растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам - Google Patents

Способ получения растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам Download PDF

Info

Publication number
EA031973B1
EA031973B1 EA201591130A EA201591130A EA031973B1 EA 031973 B1 EA031973 B1 EA 031973B1 EA 201591130 A EA201591130 A EA 201591130A EA 201591130 A EA201591130 A EA 201591130A EA 031973 B1 EA031973 B1 EA 031973B1
Authority
EA
Eurasian Patent Office
Prior art keywords
als
sugar beet
protoplasts
leu
ser
Prior art date
Application number
EA201591130A
Other languages
English (en)
Other versions
EA201591130A1 (ru
Inventor
Ги Вейенс
Марк Лефебвр
Рюдигер Хайн
Герхард Иоганн
Original Assignee
Сесвандерхаве Н.В.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Сесвандерхаве Н.В. filed Critical Сесвандерхаве Н.В.
Publication of EA201591130A1 publication Critical patent/EA201591130A1/ru
Publication of EA031973B1 publication Critical patent/EA031973B1/ru

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H3/00—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria
    • A01H3/04—Processes for modifying phenotypes, e.g. symbiosis with bacteria by treatment with chemicals
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01H—NEW PLANTS OR NON-TRANSGENIC PROCESSES FOR OBTAINING THEM; PLANT REPRODUCTION BY TISSUE CULTURE TECHNIQUES
    • A01H4/00—Plant reproduction by tissue culture techniques ; Tissue culture techniques therefor
    • A01H4/008—Methods for regeneration to complete plants
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
    • C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
    • C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
    • C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
    • C12N15/8274—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for herbicide resistance
    • C12N15/8278—Sulfonylurea

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Developmental Biology & Embryology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Environmental Sciences (AREA)
  • Botany (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)

Abstract

Способ получения устойчивого к гербицидам растения сахарной свеклы, включающий стадии получения протопластов из замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы; применения в отношении клеток композиции, содержащей гербицид ALS в концентрации, которая является смертельной для указанных клеток; и регенерации растений сахарной свеклы из выживших клеток.

Description

Область изобретения
Настоящее изобретение относится к способу получения растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам, например ингибитору(ам) фермента синтазы ацетогидроксикислоты (ALS).
Настоящее изобретение также относится к растениям, которые получают при помощи этого способа.
Сахарная свекла представляет собой важную сельскохозяйственную культуру в умеренных и субтропических областях.
В современном сельском хозяйстве гербициды широко используются для того, чтобы контролировать размножение сорняков.
Выведение растений сахарной свеклы, устойчивых к гербициду(ам), таким как ингибиторы ALS, может быть осуществлено путем использования трансгенных подходов.
Действительно, введение чужеродной ДНК, несущей ген, придающий устойчивость в отношении гербицида, успешно проводили в различных полевых культурах, включая сахарную свеклу.
В WO 95/10178 раскрыта трансгенно-индуцированная устойчивость к гербициду биалафосу. Ген, кодирующий устойчивость, вводят в протопласты замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы, затем эти протопласты регенерируют в растения сахарную свеклу. Эти растения также устойчивы к химическому фосфинотрицину и его производному глюфосинату. Не трансформированные растения не приобретают устойчивость к биалафосу.
В лучшем случае, 28 трансформированных каллусов регенерировали из 83000 протопластов; в худшем случае, 1 каллус регенерировали из 190000 протопластов. Впоследствии, некоторые из этих каллусов могли демонстрировать соматический эмбриогенез и растения сахарной свеклы могли регенерировать с эффективностью, составляющей 1% и обнаруженной весьма благоприятной характеристикой до 30%.
Тем не менее, этот подход обычно не используется в области техники, в которой более широко используется более прямая трансформация каллусов из эксплантатов, полученных из органов сахарной свеклы, таких как зародыши и/или диски листочка.
Все же сохраняется важная потребность в выведении устойчивых к гербицидам растений, таких как среди сельскохозяйственной культуры сахарной свеклы, и которые не основаны на векторах ДНК и/или на внедрении чужеродных генов.
С другой стороны, выведение растения сахарной свеклы, устойчивой к гербициду(ам), таким как ингибиторы ALS, теоретически может быть осуществлено при помощи классического скрещивания с растением сахарной свеклы, естественным образом содержащим ген устойчивости. Тем не менее, такой подход требует затрат времени и, в соответствии с имеющимися у авторов изобретения сведениями, не приводит в результате к успеху, несмотря на тот факт, что имеется информация о встречающихся в природе растениях, устойчивых к ингибитору ALS, по меньшей мере, для видов, отличающихся от сахарной свеклы, включающих различные виды сорняков. В особенности, весьма маловероятно, что двойной мутант (т.е. растение, имеющее две мутации в одном и том же гене ALS) встречается в природе.
В заявке на патент WO 98/02527 раскрыт способ получения растения сахарной свеклы, устойчивого к некоторым ингибиторам ALS, таким как гербициды на основе сульфонилмочевины, при котором осуществляют стадии воздействия сульфонилмочевиной на каллусы, полученные из эксплантатов В. vulgaris, и регенерации растений из немногих спонтанных мутантов, которые могут расти в присутствии этого гербицида.
Этот способ позволяет получать растение, имеющее мутацию в гене ALS, где пролин в позиции 188 кодируемого фермента ALS (соответствующей позиции 197 фермента ALS Arabidopsis thaliana) заменен на серин. Тем не менее, этот мутант не используется коммерчески, поскольку обработка предпочтительными современными гербицидами ALS на основе сульфонилмочевины (например, форамсульфуроном) демонстрируют некоторую фитотоксичность в полевых исследованиях при необходимом уровне дозы.
Заявка на патент WO 2012/049268 основана на том же самом способе за исключением того, что каллусы, полученные из эксплантатов B. Vulgaris, подвергают воздействию форамсульфуроном, и, таким образом, они приводят в результате к растению сахарной свекле, устойчивой к нескольким ингибиторам ALS, включающим форамсульфурон.
Этот способ позволяет получать растение, имеющее мутацию в гене ALS, где триптофан в позиции 569 кодируемого фермента ALS (соответствующей позиции 574 в ферменте ALS Arabidopsis thaliana) заменен на лейцин.
Полевые исследования этого гомозиготного мутанта 569/569 продемонстрировали хорошую устойчивость к форамсульфурону, к йодосульфурону (еще один ингибитор ALS), а также к смесям различных ингибиторов ALS.
Оба этих опубликованных метода имеют выгоду хорошо известных стадий выделения каллусов из отдельных эксплантатов, таких как эмбрионы. Тем не менее, этот подход представляет собой подход, отнимающий много времени, включающий (1) выделение большого количества свежих эмбрионов, (2) их повторное выращивание на культуральной среде с затвердевшим агаром и (3) выбор регенерируемых каллусов с использованием подходов морфологического отбора.
- 1 031973
Разработаны другие стратегии переноса генетических признаков сахарной свекле, основанные на протопластах мезофилла (которые отличаются от протопластов замыкающих клеток устьиц) в качестве исходного материала (Krens et al., 1990, Theor. appl. Genet., vol. 79, с. 390-396).
В Gurel et al. 2008, Critical reviews in Plant Science, 27, 108-140, раскрыты биотехнологические применения сахарной свеклы. Раскрыты семь различных способов культивирования in vitro. Среди них используют культуру протопластов из замыкающих клеток устьиц для задач трансформации, или из рыхлого каллуса из этиолированных эксплантатов гипокотиля, причем последние являются гораздо более эффективными. Тем не менее, этот подход с использованием протопластов ассоциируется со значительными трудностями.
В Hall et al. 1997, J. Exp. Botany, 48, 255-263 используется культура 500000 протопластов замыкающих клеток устьиц для проведения эксперимента по трансформации чужеродной ДНК. Эффективность трансформации была больше 2%. С другой стороны сообщали о том, что выращивание растений in vitro сопровождается неудачей в случае устьиц, свидетельствуя о проблемах с соответствующими клетками, и, таким образом, получают очень большое количество протопластов замыкающих клеток устьиц, таких как количества, необходимые для осуществления способа, включающего наличие мутацию.
Краткое описание изобретения
В широком аспекте, в настоящем изобретении раскрыт способ получения мутантного растения сахарной свеклы, устойчивого к гербициду, при котором осуществляют стадии получения протопластов из замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы;
применения в отношении культуры in vitro указанных протопластов композиции, содержащей указанный гербицид в концентрации, которая является смертельной для более чем 99% культивируемых in vitro клеток; и регенерации растений сахарной свеклы из выживших указанных культивируемых in vitro клеток, возможно отбор регенерированных растений сахарной свеклы, имеющих мутацию в гене, кодирующем пептид(ы), являющийся мишенью указанного гербицида, при этом указанные протопласты замыкающих клеток устьиц предварительно отбирают по их способности регенерировать в растение сахарной свеклы, и при этом указанный гербицид применяют в отношении более чем 20000000 из этих протопластов.
Гербицид, используемый в способе по настоящему изобретению, может представлять собой гербицид, не направленный против гена ALS.
Предпочтительные гербициды (не направленные против ALS) выбирают из группы, состоящей из ингибиторов 4-HPPD (4-гидроксифенилпируватдиоксигеназа) (таких как мезотрион, изоксафлутол, пирасульфотол, бензобициклон, бензофенап, пиразолинат, пиразоксифен, темботрион, топрамезон, сулькотрионе и сулькотрион), ингибиторов биосинтеза каротеноидов (таких как флуртамон, флуридон, флурохлоридон, бефлубутамид, норфлуразон, пиколинафен и дифлуфеникан);
ингибиторов синтазы EPSP (5-енолпирувилшикимат-3-фосфат) (таких как глифосат или глифосаттримезиум);
ингибиторов фосфосистемы II (таких как фенилкарбаматы) (например, фенмедифам или десмедифам), пиридазинонов (например, хлоридазон=пиразон), триазинов (например, цианазин, ремтал, эглиназин-этил, проглиназин-этил, аметрин, атразин, десметрин, диметаметрин, прометон, прометрин, пропазин, симазин, симетрин, тербуметон, тербутилазин, тербутрин, метопротин), триазинонов (например, метамитрон, метрибузин, гексазинон, метрибузин), урацилов (бромацил, ленацил, тербацил), мочевин (димефурон, изопротурон, линурон, монолинурон, этидимурон, метабензтиазурон, тебутиурон, диурон, фенурон, небурон, сидурон, изоурон, хлорбромурон, хлоротолурон, хлороксурон, флуометурон, метобромурон метоксурон, тиазафлурон, могурон, циклурон, монолинурон) или амикарбазона, солана, пропанила, бентазона, бромоксинила, иоксинила, бромофеноксима, пиридата, пиридафола;
ингибиторов фосфосистемы I (таких как дикват или параква);
ингибиторов клеточного деления (таких как карбетамид, хлорпрофам, профам, напроанилид, дифенамид, напропамид, бутенахлор, метазахлор, диэтатил-этил, ацетохлор, алахлор, бутахлор, пропахлор монсанто, прописохлор, диметахлор, диметенамид, метолахлор, претилахлор, S-метолахлор, петоксамид, тенилхлор, анилофос, кафенстрол, инданофан, бромобутид, пиперофос, флуфенацет, мефенацет, фентразамид);
ингибиторов сборки микротрубочек (таких как пропизамид=пронамид, тебутам, хлорталдиметил=DCPA, флухлоралин, пендиметалин, бутралин, бенефин=бенфлуралин, эталфлуралин, оризалин, трифлуралин, продиамин, динитрамин, бутамифос, дитиопир, тиазопир);
ингибиторов протопорфириноген оксидазы (таких как дифениловые эфиры (ацифлуорфен-натрий, бифенокс, этоксифен-этил, хлорнитрофен, флуорогликофен-этил, оксифлуорфен, хлометоксифен, флуордифен, фомезафен, лактофен, нитрофен, аклонифен), N-фенилфталимиды (цинидон-этил, флумиклорак-пентил, флумиоксазин, флумиклорак-пентил), оксадиазолы (оксадиаргил, оксадиазон) оксазолидиндионы, (пентоксазон), фенилпиразолы (флуазолат, флуазолат, пирафлуфен-этил), пиримидиндионы (сафлуфенацил, бензфендизон, бутафенацил), тиадиазолы (тидиазимин, флутиацет-метил), триазолиноны (азафенидин, карфентразон-этил сульфентразон), пираклонил, профлуазол, флуфенпир-этил);
- 2 031973 ингибиторов ацетил КоА карбоксилазы (таких как арилоксифеноксипропионаты (такие как клодинафоп-пропаргил, цигалофоп-бутил, диклофоп-метил, феноксапроп-Р-этил, флуазифоп-Р-бутил, галоксифоп-этотил, галоксифоп-метил, галоксифоп-Р-метил, пропаквизафоп, квизалофоп-Р-этил или квизалофоп-Р-тефурил), циклогександионы (такие как аллоксидим, бутроксидим, клетодим, циклоксидим, профоксидим, сетоксидим, тепралоксидим или тралкоксидим) или фенилпиразолин (пиноксаден));
ингибиторов синтеза клеточной стенки (таких как индазифлам, изоксабен, хлортиамид, дихлобенил, квинклорак или флупоксам);
ингибиторов глутамин синт(ет)азы (глюфосинат-аммоний или биалафос=биланафос) и синтетического ауксина (такого как TBA, дикамба, хлорамбен, беназолин-этил 4, дихлорпроп-Р, мекопроп-Р, 2,4,5T (Weedar) 2,4-D (Weedar), 2,4-DB (бутирол), дихлорпроп, МСРВВ, мекопроп, МСРВ-тиоэтил, кломепроп, агроксон 4, аминопиралид, клопиралид, флуроксипир, галауксифен-метил, пиклорам, триклопир, хинклорак или хинмерак), более предпочтительно, из группы, состоящей из ингибиторов 4-HPPD, ингибиторов биосинтеза каротиноидов, ингибиторов синтазы EPSP, ингибиторов фосфосистемы II, ингибиторов фосфосистемы I, ингибиторов сборки микротрубочек, ингибиторов протопорфириноген оксидазы и синтетического ауксина.
Еще один весьма предпочтительный гербицид представляет собой ингибитор ALS.
Таким образом, настоящее изобретение относится к способу получения мутантного растения сахарной свеклы, устойчивой к одному или более чем одному ингибитору(ам) фермента синтазы ацетогидроксикислоты (ALS), включающему стадии получения протопластов из замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы;
применения в отношении культуры in vitro указанных протопластов композиции, содержащей один или более ингибитор ALS в концентрации, которая является смертельной в отношении более чем 99% (предпочтительно более чем 99,9% или даже более чем 99,99%) культивируемых in vitro клеток (даже позволяя некоторым мутантам приобрести устойчивость); и регенерации растений сахарной свеклы из выживших указанных культивируемых in vitro клеток, при этом указанные протопласты замыкающих клеток устьиц предварительно отбирают по их способности регенерировать в растение сахарной свеклы и/или где указанный(е) ингибитор(ы) ALS применяют для более 2000000 (предпочтительно более 10000000, более предпочтительно для более 20000000 или даже более 50000000) указанных протопластов.
Предпочтительно способ включает подстадии выделения протопластов замыкающих клеток устьиц из растений сахарной свеклы различных генотипов и измерения для каждого генотипа доли указанных протопластов, растущих при помещении указанных протопластов в культуру.
Предпочтительно способ дополнительно включает стадию секвенирования генома регенерированных растений из жизнеспособных культивируемых in vitro клеток, преимущественно для идентификации мутации в гене ALS и/или для отбора регенерированных растений сахарной свеклы, имеющих одну или несколько, предпочтительно одну, две или несколько мутаций в гене ALS.
Преимущественно, растение сахарной свеклы, имеющую одну или несколько мутаций в гене ALS в позициях, кодирующих аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из глицина 112, аланина 113, метионина 115, аргинина 133, валина 187, аргинина 190, аланина 196, фенилаланина 197, лизина 247, метионина 346, гистидина 347, аргинина 368, аспартата 370, аспартата 371, аргинина 372, метионина 565, валина 566, фенилаланина 573, серина 648 и глицина 649, предпочтительно выбранные из группы, состоящей из аланина 196, аспартата 371, аргинина 372, серина 648 и глицина 649, получают и/или отбирают при помощи способа по настоящему изобретению.
Еще одно предпочтительное растение сахарной свеклы, имеющую мутацию пролина в позиции 188 и триптофана в позиции 569, получают и/или отбирают при помощи способа по настоящему изобретению.
Предпочтительно растение сахарной свеклы, имеющее две или несколько мутаций, имеет две мутации в одной аллели, т.е. кодируемый пептид содержит две мутации, оказывающие синергическое действие в отношении устойчивости к ингибиторам ALS (особенно в отношении композиций, содержащих несколько ингибиторов ALS). Примеры наиболее предпочтительного растения сахарной свеклы представляют собой сахарную свеклу, имеющую мутацию пролина в позиции 188 и триптофана в позиции 569 в одной аллели (и, возможно, те же самые мутации во второй аллели; альтернативно, вторая аллель содержит различные мутации).
Альтернативно, сахарная свекла, имеющая две мутации, имеет одну мутацию в каждой аллели.
Способ по настоящему изобретению позволяет регенерировать растению сахарной свеклы, имеющему одну мутацию в гене ALS в позициях, кодирующих пролин 188, и одну или несколько мутаций в гене ALS в позициях, кодирующих глицин 112, аланин 113, метионин 115, аргинин 133, валин 187, аргинин 190, аланин 196, фенилаланин 197, лизин 247, метионин 346, гистидин 347, аргинин 368, аспартат 370, аспартат 371, аргинин 372, метионин 565, валин 566, триптофан 569 (предпочтительно мутирован в глицин), фенилаланин 573, серин 648 и глицин 649. Примеры предпочтительного растения сахарной свеклы представляют собой сахарную свеклу, имеющую мутацию пролина в позиции 188 и еще одну
- 3 031973 мутацию (возможно не триптофан 569 или Trp569Gly) в той же самой аллели.
Способ по настоящему изобретению позволяет регенерировать растению сахарной свеклы, имеющему одну мутацию в гене ALS в позиции, кодирующей триптофан 569 (предпочтительно мутирован до лейцина) и одну или несколько мутаций в гене ALS в позициях, кодирующих глицин 112, аланин 113, метионин 115, аргинин 133, валин 187, пролин 188 (предпочтительно мутированы до треонина, аргинина, лейцина, глутамина или аланина), аргинин 190, аланин 196, фенилаланин 197, лизин 247, метионин 346, гистидин 347, аргинин 368, аспартат 370, аспартат 371, аргинин 372, метионин 565, валин 566, фенилаланин 573, серин 648 и глицин 649.
Примеры предпочтительного растения сахарной свеклы представляют собой сахарную свеклу, имеющую мутацию триптофана в позиции 569 и еще одну мутацию (возможно не пролин 188 или Pro188Ser) в той же самой аллели.
Способ по настоящему изобретению позволяет регенерировать растению сахарной свеклы, имеющему одну или несколько мутаций в гене ALS, при этом указанную мутацию(и) выбирают из группы, состоящей из аланина 113, пролина 188, аланина 196, аспартата 371, аргинина 372, триптофана 569, серина 648 и глицина 649, при этом указанный аланин 113 мутирован до валина или треонина, указанный пролин 188 мутирован до треонина, аргинина, лейцина, глутамина или аланина, указанный аланин 196 мутирован до валина, указанный аспартат 371 мутирован до глутамата, указанный аргинин 372 мутирован до гистидина, указанный триптофан 569 мутирован до глицина, указанный серин 648 мутирован до треонина и указанный глицин 649 мутирован до аспартата.
Предпочтительно сахарная свекла, имеющая две или несколько из этих специфических мутаций, имеет две мутации в одной аллели, т.е. кодируемый пептид содержит две мутации, оказывающие синергическое действие в отношении устойчивости к ингибиторам ALS (в особенности в отношении композиций, содержащих несколько ингибиторов ALS).
Способ по настоящему изобретению позволяет регенерировать растению сахарной свеклы, имеющему одну мутацию в гене ALS в позиции, кодирующей пролин 188, и одну мутацию в гене ALS в позиции, кодирующей триптофан 569.
Преимущественно, способ включает предварительную стадию определения концентрации одного или более ингибитора ALS, при которой композиция (содержащая один или более ингибитор ALS) смертельна для по меньшей мере 99% (предпочтительно по меньшей мере 99,9 или даже 99,99%) культивируемых in vitro клеток (позволяя некоторым мутантам приобрести устойчивость).
Предпочтительный ингибитор ALS, представленный в композиции (указанная композиция содержит дополнительно к другому ингибитору ALS, предпочтительно из класса, отличающегося от ингибитора ALS на основе сульфонилмочевины, такого как тиенкарбазон-метил), добавляемый к культивируемым in vitro протопластам замыкающих клеток устьиц, представляет собой форамсульфурон, предпочтительно в концентрации от 10-9 моль/л до (более предпочтительно) 10-6 моль/л.
Еще один подходящий ингибитор ALS, представленный в композиции, добавляемой к культивируемым in vitro протопластам замыкающих клеток устьиц, представляет собой этоксисульфурон (возможно эта композиция также содержит другие ингибиторы ALS).
Связанный аспект настоящего изобретения представляет собой мутантное растение сахарной свеклы, получаемое при помощи способа по настоящему изобретению, такое как сахарную свеклу, имеющую мутацию по триптофану 569 и/или пролину 188.
Еще один связанный аспект настоящего изобретения представляет собой мутантное растение сахарной свеклы, содержащее последовательность SEQ ID NO: 3 (или SEQ ID NO: 4) и/или последовательность SEQ ID NO: 5 (или SEQ ID NO: 6).
Предпочтительное растение сахарной свеклы по настоящему изобретению соответствует номеру NCIMB (Национальная коллекция промышленных, морских и пищевых бактерий Великобритании) 42050 или NCIMB 42051.
Настоящее изобретение также относится к ткани или части растения (например, замыкающим клеткам устьиц или листовым пластинкам) или семенам, полученным из мутантных растений по изобретению, а также к их применению для получения еще одного генетического признака.
Настоящее изобретение также относится к применению (хорошая регенерация) протопластов замыкающих клеток устьиц, полученных в настоящем изобретении, для введения генетического признака, отличающегося от устойчивости к ингибиторам ALS.
Подробное описание изобретения
Авторы изобретения обнаружили, что протопласты из замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы представляют собой хороший исходный материал для того, чтобы вызывать устойчивость к гербицидам, таким как ингибиторы ALS, несмотря на тот факт, что регенерация растения сахарной свеклы из протопластов замыкающих клеток устьиц является очень сложной, обладает низкой частотой и требует более длительных и более сложных процедур, чем прямая регенерация из каллусов, полученных из эксплантатов, обычно используемая в области техники.
Действительно, каллус (каллусы) из эксплантатов представляет(ют) собой массу недифференцированных (или дифференцированных) клеток, которые в подходящих условиях культивирования диффе- 4 031973 ренцируются (или редифференцируются) и регенерируют в полностью функциональное растение сахарной свеклы. В таком способе семена собирают в больших количествах, затем немного стерилизуют и, таким образом, эксплантаты получают в больших количествах. Такой способ является удобным, поскольку дает возможность для осуществления значительной части работы без сложностей стерильных условий.
С другой стороны, замыкающие клетки устьиц обладают хорошо определенной организацией в растении, и их выделение из растительной ткани приводит в результате к отдельной(ым) клетке(ам) с последующей обработкой на отдельные протопласты.
В способе по настоящему изобретению проростки должны выращиваться in vitro и поддерживаться в стерильных условиях, затем замыкающие клетки устьиц выделяют из этих небольших проростков, и протопласты получают при поддержании стерильных условий. Затем эти отдельные протопласты вновь индуцируют для продукции своей клеточной стенки, для выращивания сначала в микрокаллусы, а затем в растение сахарной свеклы.
Обнаружено, что протопласт замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы является весьма уязвимым, уменьшая объем их применения: например обнаружено, что добавление мутагена вместо того, чтобы благоприятствовать появлению желательного генетического признака, является для протопластов во множестве случаев смертельным.
Другими словами, достижение успеха при использовании протопластов замыкающих клеток устьиц в качестве исходного материала для выведения растения сахарной свеклы, имеющей приобретенный и желаемый генетический признак путем мутации, было совершенно неожиданным.
Кроме того, авторы изобретения обнаружили, что способность протопластов замыкающих клеток устьиц к делению, зависит от генотипов растений сахарной свеклы: протопласты замыкающих клеток устьиц из большинства генотипов демонстрируют очень низкую (почти нулевую) способность к делению (росту), тогда как протопласты из некоторых специфических генотипов обладают масштабируемой значительной способностью расти in vitro.
Авторы изобретения обнаружили, что выращивание на твердой среде (среда, содержащая полимер, такой как альгинат, или среда, содержащая агарозу) в очень больших количествах указанных протопластов замыкающих клеток устьиц, затем воздействие на выращенный материал (обычно в форме регенерированных каллусов) гербицидами, такими как ингибитор(ы) ALS, приводит в результате к отбору некоторых мутантных клеток, устойчивых к этой молекуле гербицида, несмотря на то, что в отсутствие добавленных мутагенов известно, что спонтанные мутации являются очень редкими, и этот способ не может обеспечить преимущество генетического разнообразия в популяции, при отборе уже существующего мутантного растения, демонстрирующего желаемую устойчивость к одному или более чем одному ингибитору ALS.
Некоторые из этих мутантных клеток, обладающих приобретенной устойчивостью к гербицидам, таким как ингибирование ALS, также способны регенерировать в живое растение сахарной свеклы. Хотя протопласты очень сложно применять на практике, тем не менее, способ по настоящему изобретению позволяет очень быстро получать стабильные мутанты, обладающие приобретенной устойчивостью к гербициду.
Способ по настоящему изобретению позволяет получать устойчивые к гербицидам (устойчивые к ингибитору ALS) растения сахарной свеклы, имеющих одну или несколько мутаций, включающих одну или несколько мутации в ферменте, являющимся мишенью для гербицида, например ингибитора ALS (такую как мутация гена ALS, где ген ALS кодирует белок ALS, содержащий аминокислоту, отличающуюся от триптофана, в позиции 569 белка ALS; соответствующую позиции 574 ALS Arabidopsis thaliana), возможно дополнительно по меньшей мере к еще одной мутации в этом гене и/или к другим мутациям в других генах.
Таким образом, аспект настоящего изобретения представляет собой способ получения растения сахарной свеклы (Beta vulgaris; таким образом, также Beta vulgaris maritima ssp), устойчивого к одному или более ингибитору ALS, включающий стадии получения (протопластов из) замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы (чувствительной к ингибиторам ALS);
применения в отношении указанных культивируемых in vitro клеток композиции, содержащей один или более ингибитор ALS в концентрации, которая является смертельной для культивируемых in vitro клеток (по меньшей мере 99% (дикого типа) клеток уничтожаются ингибитором ALS, но некоторые мутанты могут приобрести устойчивость к обработке); и регенерации растений сахарной свеклы из выживших клеток.
Этот способ можно рассматривать как альтернативный к введению трансгена (например, раскрытого в WO 95/10178). Тем не менее, способ, основанный на мутации эндогенного(ых) гена(ов), является более трудным по сравнению с трансгенным подходом. Действительно, введение трансгенного (мутантного) гена является гораздо более быстрым, гибким и предсказуемым.
Отсутствие вызванной трансгеном устойчивости связано с тем фактом, что приобретенная устойчивость к ингибитору(ам) ALS не прямо вызывается встраиванием in vitro (чужеродной) ДНК в протопласт
- 5 031973 замыкающих клеток устьиц (или в полученные из него клетки), такой как (чужеродная) ДНК, кодирующая белок, непосредственно обеспечивающий устойчивость к ингибитору (ам) ALS, такой как белок, локально уменьшающий токсичность ингибитора(ов) ALS (например, фермент, деградирующий ингибитор(ы) ALS или уменьшающий его внутриклеточную концентрацию), или белок ALS, устойчивый к ингибитору(ам) ALS, такой как мутантный фермент ALS, который сохраняет значительную активность и функциональность даже в присутствии ингибитора(ов).
Тем не менее, растение, полученное при помощи способа по изобретению, может также быть скрещено с трансгенным растением для передачи потомству еще одного генетического признака. Растение (или его часть), полученное при помощи настоящего изобретения, также может быть использовано в последующем трансгенном способе для введения еще одного генетического признака (отличающегося от генетического признака, полученного в способе по настоящему изобретению).
Возможно, в этом способе также осуществляют стадию добавления агента-мутагена в культуру выделенных протопластов замыкающих клеток устьиц.
Подходящие агенты-мутагены представляют собой физическое (такое как УФ (ультрафиолетовое) или рентгеновское) воздействие или воздействие химических агентов (таких как этилметансульфонат (EMS), например в концентрации 0,05, 0,1, 0,15, 0,2 или даже 2,5%). Тем не менее, показано, что на жизнеспособность протопластов пагубно влияют некоторые обычно проводимые мутагенные обработки, такие как обработка более чем 0,2% EMS.
Альтернативно, этот способ не содержит стадию добавления мутагенного агента.
В контексте настоящего изобретения гербицид предпочтительно относится к любой молекуле, которая, примененная в заданной дозе, используется для контроля уровня сорняков.
Предпочтительные гербициды, используемые в способе по настоящему изобретению (для получения растений сахарной свеклы, устойчивой к этому гербициду) обладают специфической известной активностью в отношении одного пептида (таким образом, что единичная мутация в соответствующем гене может придавать устойчивость к этому гербициду). Другими словами, предпочтительные гербициды являются специфическими в отношении одной пептидной мишени (обычно специфически ингибируя активность одного растительного фермента) и/или их пептид-мишень известна (таким образом, что находится в позиции для скрининга устойчивой сахарной свеклы в отношении мутации в гене-мишени)
В контексте настоящего изобретения ингибитор ALS относится к любой молекуле, ингибирующей функцию гена ALS.
Предпочтительно ингибитор(ы) ALS, используемый(е) в настоящем изобретении не ингибирует(ют) ферменты (сахарная свекла), отличающиеся от ALS.
Предпочтительно ингибитор(ы) ALS выбирают и используют в настоящем изобретении в такой концентрации, что более чем 90% (более чем 95%, более чем 99%, более чем 99,9%) функции фермента ALS дикого типа ингибировано, но по существу нет влияния на функцию неродственных ферментов.
Подходящие ингибиторы ALS (для осуществления способа) выбраны из группы, состоящей из гербицидов на основе сульфонилмочевины, гербицидов на основе сульфониламинокарбонилтриазолинона, гербицидов на основе имидазолинона, гербицидов на основе триазолопиримидина и гербицидов на основе пиримидинил(тио)бензоата. Предпочтительно гербицидная композиция содержит по меньшей мере один гербицид на основе сульфонилмочевины и по меньшей мере один триазолопиримидин.
Предпочтительные ингибиторы ALS (для осуществления способа) представляют собой форамсульфурон, амидосульфурон, тиенкарбазон-метил, этоксисульфурон и их смесь (в особенности композиция, содержащая тиенкарбазон-метил и форамсульфурон или амидосульфурон); тем не менее, регенерированный мутант сахарной свеклы благоприятно устойчив в отношении нескольких ингибиторов ALS.
Могут быть использованы другие ингибиторы ALS (включающие смеси ингибиторов ALS), и специалисту в данной области техники известно, какая мутация обеспечивает сильную устойчивость к данному ингибитору ALS (например, известно, что мутация триптофана в позиции 569 ассоциируется с устойчивостью к форамсульфурону); следовательно, учитывая гибкость и эффективность способа по настоящему изобретению, специалист в данной области техники может сконструировать растения сахарной свеклы, имеющие несколько приобретенных мутаций, и, таким образом, более широкую устойчивость к гербицидам, таким как ингибиторы ALS (например, смеси ингибиторов ALS).
Более предпочтительно способ включает предварительную стадию отбора генотипа (линии) растения сахарной свеклы в отношении способности ее протопласта замыкающих клеток устьиц регенерировать в полностью функциональное растение сахарной свеклы, и/или способ по настоящему изобретению осуществляют на протопластах замыкающих клеток устьиц, выделенных из хорошо регенерирующих генотипов (линий) сахарной свеклы.
На подходящей предварительной стадии (отбор генотипов растения сахарной свеклы в отношении способности протопластов ее замыкающих клеток устьиц регенерировать в растение сахарной свеклы) осуществляют сравнение (независимо от их возможных благоприятных особенностей, таких как выход или устойчивость к паразитическим инфекциям) по меньшей мере 10 различных генотипов растения сахарной свеклы (из различных генотипов), предпочтительно по меньшей мере 15 различных генотипов, или даже по меньшей мере 30 различных генотипов, в отношении способности протопластов их замы- 6 031973 кающих клеток устьиц регенерировать в растение сахарной свеклы (гораздо более предпочтительно их способность расти in vitro и/или с образованием каллусов), и отбор хорошо регенерирующего генотипа (линии) для осуществления способа по настоящему изобретению.
В контексте настоящего изобретения хорошо регенерирующий протопласт замыкающих клеток устьиц относится к протопластам, имеющим вероятность более чем 0,25% (количество растущих протопластов: общее количество протопластов в культуре; растущих: общему количеству), предпочтительно более чем 1% (растущих: общему количеству), более предпочтительно, более чем 5% (растущих: общему количеству), еще более предпочтительно более чем 10% (растущих: общему количеству) или даже более чем 20% (растущих: общему количеству) или 50% (растущих: общему количеству) для деления и/или для роста, и/или регенерации в жизнеспособный каллус сахарной свеклы (при росте в подходящих культуральных средах и без экзогенного давления отбора, такого как токсичные молекулы/гербицид, применяемые в способе по настоящему изобретению).
Каллус (каллусы) относится к массе недифференцированных клеток. В области техники каллусы могут быть получены из эксплантатов, таких как эмбрионы, или полученных из паренхимы эксплантатов из листьев или семядоли. Тем не менее, в контексте настоящего изобретения каллусы представляют собой результат роста (хорошо регенерирующих) протопластов замыкающих клеток устьиц.
Благоприятно, каллусы, полученные при помощи этих хорошо регенерирующих протопластов, имеют более чем 10% (количество каллусов, продуцирующих побеги: общее количество каллусов; побегов: общее количество), предпочтительно более чем 20% (побегов: общее количество) или даже более чем 30% (побегов: общее количество) способности давать побеги.
Предпочтительно хорошо регенерирующий протопласт замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы относится к протопластам, имеющим более чем 0,1% (растение сахарной свеклы: общее количество протопластов) (более предпочтительно более чем 1%) способности регенерировать в жизнеспособное растение сахарной свеклы.
Также предпочтительно, в этом способе композиция, содержащая гербицид (например, один или более чем один ингибитор(ы) ALS) применяют в отношении клеточной культуры in vitro более чем 2000000 из этих (хорошо регенерирующих) протопластов замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы.
Альтернативно, или более предпочтительно, дополнительно к стадии предварительного отбора композицию, содержащую гербицид (например, один или более чем один ингибитор(ы) ALS) применяют в отношении клеточной культуры in vitro более чем 5000000, или даже более чем 10000000, 20000000, или 50000000 из этих (хорошо регенерирующих) протопластов замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы.
Предпочтительно по меньшей мере 50000, приблизительно 100000 (хорошо регенерирующих) протопластов замыкающих клеток устьиц на миллилитр выращивали на содержащей полимер среде (такой как среда, содержащая альгинат или агарозу).
Возможно, указанные (хорошо регенерирующие) протопласты замыкающих клеток устьиц сахарной свеклы выращивают в течение по меньшей мере приблизительно одной недели (предпочтительно приблизительно 3 недель и/или менее чем 4 недель) в содержащей полимер (альгинат) среде до применения композиции, содержащей гербицид (например, один или более чем один) ингибитор(ы) ALS, такой как форамсульфурон и, возможно, тиенкарбазон-метил.
Предпочтительно в этом способе также осуществляют стадию сравнения роста мутантных замыкающих клеток устьиц и роста замыкающих клеток устьиц дикого типа (и/или наивных и/или еще не обработанных гербицидом) на среде, которая не содержит ингибитор ALS, и возможно отбор мутанта(ов), сохраняющих по меньшей мере 75% роста, предпочтительно по меньшей мере 90% роста соответствующей клетки дикого типа.
Предпочтительно или дополнительно способ включает стадию сравнения роста и/или выхода регенерированной из мутантной клетки сахарной свеклы и роста и/или выхода сахарной свеклы дикого типа (и/или наивной и/или еще не обработанной ингибитором ALS) в тепличных анализах и в агротехнических условиях без какого-либо ингибитора ALS, и возможно стадию отбора устойчивых к ингибитору ALS мутантных растений сахарной свеклы, сохраняющих по меньшей мере 75% роста и/или выхода, предпочтительно по меньшей мере 90% роста и/или выхода сахарной свеклы дикого типа.
Предпочтительно способ включает дополнительную стадию секвенирования регенерированных растений из жизнеспособных протопластов и/или идентификации одной или нескольких мутаций, которые (могут быть) ассоциированы с устойчивостью к гербициду (например, одному или более ингибитору ALS).
В контексте настоящего изобретения термин мутация предпочтительно относится к одному (единичному) изменению нуклеотидной последовательности, кодирующей пептид, являющийся мишенью гербицида (например, белок ALS), которое вызывает одно изменение соответствующей аминокислоты, такое, что получающееся в результате растение приобретает некоторую устойчивость к гербициду, такому как ингибиторы ALS. Другими словами, в контексте настоящего изобретения мутацию предпочтительно понимают как эквивалент точечной мутации, которая позволяет приобретать некоторую устойчивость к гербициду (ингибитор ALS). Соответственно, несколько мутаций предпочтительно в на- 7 031973 стоящем изобретении относится к (набору) множеству точечных мутаций, где каждая точечная мутация вызывает изменение кодируемой аминокислоты, придающее некоторую устойчивость к гербициду (например, ингибитору ALS и/или гербициду, отличающемуся от ингибитора ALS). Таким образом, предпочтительно, в контексте настоящего изобретения мутация не включает изменение нуклеотидной последовательности, которое не модифицирует кодируемый белок (такое как изменение третьей аминокислоты кодирующего триплета), изменение аминокислот, которые не ассоциируются с устойчивостью к гербициду (такому как ингибитор ALS), а также множественные одновременные изменения нуклеотидной последовательности.
Преимущественно, эту стадию идентификации мутации(й), ассоциирующихся с устойчивостью к (одному или более) ингибитору ALS (предпочтительно одна или две мутации в гене ALS), сочетают с разработкой олигонуклеотидных праймеров, включающих эту мутацию.
Преимущественно, за стадией идентификации мутации(й) в гене ALS следуют измерения (in vitro) ферментативной активности белка, кодируемого геном ALS дикого типа и мутантным геном ALS.
Предпочтительно ферментативные измерения фермента ALS дикого типа и мутантного фермента ALS осуществляют в присутствии одного или более ингибитора ALS (в одной или в нескольких концентрациях для построения кривой ингибирования).
Возможно, это ферментативное измерение фермента дикого типа и мутантного фермента (также) осуществляют в отсутствие ингибиторов ALS (для сравнения ферментативной активности мутантного фермента; предпочтительно в отсутствие ингибитора ALS, мутантный фермент сохраняет по меньшей мере 50% активности фермента дикого типа, более предпочтительно по меньшей мере 75%, еще более предпочтительно по меньшей мере 90%, по меньшей мере 95% или даже по меньшей мере 99%).
Предпочтительно способ по настоящему изобретению включает стадию сравнения композиций, содержащих один или более ингибитор ALS в различных концентрациях, и установления концентрации, при которой ингибитор ALS и/или ингибитор ALS в специальном препарате в этой композиции является смертельным для культуры in vitro протопластов замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы (таких как протопласты замыкающих клеток устьиц, выращиваемые на альгинате в течение по меньшей мере одной недели).
Например, эту стадию определения концентрации, при которой (один или более) ингибитор ALS является смертельным для протопластов замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы, осуществляют в культуре in vitro протопластов замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы дикого типа (и/или наивного и/или еще не обработанного ингибитором ALS).
В контексте настоящего изобретения смертельная концентрация композиции, содержащей (один или более) ингибитор ALS, относится к концентрации, достаточной для того, чтобы убить по меньшей мере 99%, предпочтительно по меньшей мере 99,9%, более предпочтительно по меньшей мере 99,99% культивируемых клеток (все же позволяя некоторым мутантам приобрести устойчивость).
Альтернативно или дополнительно указанную стадию определения концентрации, при которой (один или более) ингибитор ALS является смертельным для культуры in vitro протопластов замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы, (также) осуществляют в культуре in vitro мутантных замыкающих клеток устьиц (клеток, имеющих приобретенную мутацию в гене ALS и устойчивых к ингибиторам ALS)).
Сравнение смертельной концентрации ингибитора ALS (в композиции, содержащей этот ингибитор ALS) с использованием наивных и мутантных клеток благоприятно выражают в виде отношения (или в виде нескольких отношений, одно тестируемое отношение на ингибитор ALS).
Предпочтительно для одного ингибитора ALS смертельная концентрация в отношении наивной(ых) клетки(ок) в 50 раз меньше, чем смертельная концентрация в отношении мутантной(ых) клетки(ок), более предпочтительно, смертельная концентрация в отношении наивной(ых) клетки(ок) в 200 раз меньше чем смертельная концентрация в отношении мутантной(ых) клетки(ок), еще более предпочтительно, смертельная концентрация в отношении наивной(ых) клетки(ок) в 1000 раз меньше чем смертельная концентрация в отношении мутантной(ых) клетки(ок).
Гербицид (используемый в способе по настоящему изобретению) может представлять собой смесь (ингибиторов), содержащую по меньшей мере один ингибитор ALS, такой как форамсульфурон.
Возможно, ингибитор ALS, используемый в способе по изобретению, представляет собой смесь ингибиторов ALS, таких как сульфонилмочевина (например, форамсульфурон), и еще один ингибитор ALS, выбранный из группы, состоящей из йодосульфурона, амидосульфурона и тиенкарбазон-метила.
Предпочтительно ингибитор ALS, используемый в способе по изобретению, представляет собой (или содержит) форамсульфурон, такой как форамсульфурон, применяемый в отношении однонедельной (или трехнедельной) культуры in vitro протопластов (конкретней культуры in vitro, содержащей каллусы, регенерированные из этих культивируемых протопластов), на содержащей альгинат среде, и поддерживается в течение выращивания in vitro культуры клеток в концентрации 10-9-10-6 моль/л (или 10-9-10-6 моль/л).
Связанный аспект настоящего изобретения представляет собой мутантное растение сахарной свеклы, получаемую при помощи этого способа (например, когда в этих способах применяют один или более
- 8 031973 чем один гербицид (не ингибиторы ALS) или применяют один или более чем один ингибитор ALS, или применяют один ингибитор ALS и один гербицид, не представляющий собой ингибитор ALS).
Таким образом, один из аспектов настоящего изобретения представляет собой сахарную свеклу (получаемую при помощи способа по настоящему изобретению), имеющую одну или несколько мутаций в гене ALS в позициях, кодирующих аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из глицина 112, аланина 113, метионина 115, аргинина 133, валина 187, аргинина 190, аланина 196, фенилаланина 197, лизина 247, метионина 346, гистидина 347, аргинина 368, аспартата 370, аспартата 371, аргинина 372, метионина 565, валина 566, фенилаланина 573, серина 648 и глицина 649.
Предпочтительная сахарная свекла (получаемая при помощи способа по настоящему изобретению) имеет одну или несколько мутаций в гене ALS в позициях, кодирующих аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из аланина 113 (например, мутированного до валина или треонина), пролина 188, мутированного до треонина, аргинина, лейцина, глутамина или аланина, аланина 196 (например, мутированного до валина), аспартата 371 (например, мутированного до глутамата), аргинина 372 (например, мутированного до гистидина), триптофана 569, мутированного до глицина, серина 648 (например, мутированного до треонина) и глицина 649 (например, мутированного до аспартата).
Связанный аспект настоящего изобретения представляет собой мутантное растение сахарной свеклы (или клетку мутантного растения сахарной свеклы, такую как мутантные замыкающие клетки устьиц, выделенные из сахарной свеклы), содержащую мутацию в гене ALS, где триптофан в позиции 569 в кодируемом ферменте ALS (соответствующей позиции 574 в ферменте ALS Arabidopsis thaliana) заменен на другую аминокислоту (такую как лейцин), и возможно еще другую (одну или несколько) мутаций, предпочтительно еще другую (одну или несколько) мутаций в гене ALS, такую как мутацию, вызывающую еще одну аминокислотную замену в гене ALS.
Еще одно предпочтительное растение сахарная свекла имеет мутацию триптофана до лейцина в позиции 569 и одну или несколько мутации в гене ALS в позициях, кодирующих аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из глицина 112, аланина 113, метионина 115, аргинина 133, валина 187, аргинина 190, аланина 196, фенилаланина 197, лизина 247, метионина 346, гистидина 347, аргинина 368, аспартата 370, аспартата 371, аргинина 372, метионина 565, валина 566, фенилаланина 573, серина 648 и глицина 649.
Предпочтительная сахарная свекла (получаемая при помощи способа по настоящему изобретению) имеет одну мутацию триптофана до лейцина в позиции 569 и одну или несколько мутаций в гене ALS в позициях, кодирующих аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из аланина 113 (например, мутированного до валина или треонина), пролина 188, мутированного до треонина, аргинина, лейцина, глутамина или аланина, аланина 196 (например, мутированного до валина), аспартата 371 (например, мутированного до глутамата), аргинина 372 (например, мутированного до гистидина), серина 648 (например, мутированного до треонина) и глицина 649 (например, мутированного до аспартата).
Это мутантное растение сахарная свекла устойчива к одному или нескольким используемым ингибиторам ALS, таким как сульфонилмочевина (например, форамсульфурон) и благоприятно к другому(им) ингибитору(ам) ALS, предпочтительно выбранному(ым) из группы, состоящей из йодосульфурона, амидосульфурона и тиенкарбазон-метила.
Связанный аспект настоящего изобретения представляет собой мутантное растение сахарной свеклы (или клетку мутантного растения сахарной свеклы, такую как мутантные замыкающие клетки устьиц, выделенных из сахарной свеклы), содержащую мутацию в гене ALS, где пролин в позиции 188 в кодируемом ферменте ALS (соответствующем позиции 197 в ферменте ALS Arabidopsis thaliana) заменен на другую аминокислоту (такую как серин).
Альтернативно, предпочтительное растение сахарной свеклы (получаемое при помощи способа по настоящему изобретению) имеет мутацию пролина до серина в позиции 188 и одну или несколько мутаций в гене ALS в позициях, кодирующих аминокислоты, выбранные из группы, состоящей из глицина 112, аланина 113, метионина 115, аргинина 133, валина 187, аргинина 190, аланина 196, фенилаланина 197, лизина 247, метионина 346, гистидина 347, аргинина 368, аспартата 370, аспартата 371, аргинина 372, метионина 565, валина 566, фенилаланина 573, серина 648 и глицина 649.
Предпочтительная растение сахарной свеклы (получаемое при помощи способа по настоящему изобретению) имеет одну мутацию пролина до серина в гене ALS в позиции 188 и одну или несколько мутаций гена ALS в позициях, кодирующих аланин 113 (например, мутированный до валина или треонина), аспартат 371 (например, мутированный до глутамата), аргинин 372 (например, мутированный до гистидина), триптофан 569, мутированный до глицина, серин 648 (например, мутированный до треонина) и глицин 649 (например, мутированный до аспартата).
Еще один связанный аспект настоящего изобретения представляет собой мутантное растение сахарной свеклы (или мутантные клетки растения сахарной свеклы, такие как мутантные замыкающие клетки устьиц, выделенные из сахарной свеклы), содержащую мутацию триптофана в позиции 569 в ферменте ALS и мутацию пролина в позиции 188 в ферменте ALS, а также возможно еще одну (одну или несколько) мутацию, предпочтительно еще одну (одну или несколько) мутаций в гене ALS.
Предпочтительно (одна аллель) гена ALS этого мутантного растения сахарной свеклы соответству- 9 031973 ет SEQ ID NO: 3 или SEQ ID NO: 5.
Предпочтительно мутантное растение сахарной свеклы по настоящему изобретению содержит последовательность SEQ ID NO: 3 (в одной аллели) и последовательность SEQ ID NO: 5 (во второй аллели).
Возможно, мутантное растение сахарная свекла по настоящему изобретению содержит SEQ ID NO:
(в одной аллели) и SEQ ID NO: 1 или SEQ ID NO: 7 (во второй аллели).
Еще один связанный аспект настоящего изобретения представляет собой нуклеотидный фрагмент (по меньшей мере 20 или по меньшей мере 25 последовательных нуклеотидов, но меньше чем 200 последовательных нуклеотидов, предпочтительно меньше чем 50 последовательных нуклеотидов), охватывающий одну или более чем одну мутацию; возможно, этот фрагмент предназначен для применения в качестве праймера или зонда (включающего нуклеотидный зонд, также меченный, например ненуклеотидной группировкой или с использованием радиоактивности, зонд, меченный последовательностью нуклеиновой кислоты, чужеродной для гена ALS сахарной свеклы).
Еще один связанный аспект настоящего изобретения представляет собой применение этого нуклеотидного фрагмента, включающего мутацию, для выбора с помощью маркера растений сахарной свеклы, обладающих устойчивостью к токсической молекуле (гербициду).
Примеры
Сравнительный пример.
Поскольку мутантное растение сахарной свеклы успешно получали в области техники (например, в WO 98/02527) при добавлении гербицида ALS к каллусам, представляющим собой эксплантаты из сахарной свеклы дикого типа, авторы изобретения, во-первых, выбрали генотип (линию) сахарной свеклы, полученный из линии WO 98/02527, и выделили протопласты из замыкающих клеток устьиц.
Несколько миллионов из указанных протопластов (в среднем приблизительно от 2 до приблизительно 5 млн, и до 11 млн в эксперименте; всего, гербицид ALS применяли в отношении приблизительно 150 миллионов протопластов) выделяли как в WO 95/10178, помещали в культуральную среду, содержащую альгинат, и обрабатывали культуральной средой MS (Мурасиге-Скуга), содержащей от 10-9 до 106 моль/л форамсульфурона.
Авторы изобретения затем проводили регенерацию растения сахарной свеклы в соответствии с протоколом, описанным в WO 95/10178, и обнаружили только несколько каллусов, выживших под действием ингибитора ALS. Тем не менее, за одним исключением, ни один из этих регенерированных каллусов не был способен развиться в растение сахарной свеклы. Единственное регенерированное растение сахарной свеклы демонстрировало отсутствие мутации в гене ALS (кодирующем фермент-мишень для форамсульфурона).
Таким образом, эта линия сахарной свеклы, родительская линия которой на основе прямого воздействия на каллусы (из эксплантата) гербицидом приобретает вызванную мутацией устойчивость к этому гербициду, не является пригодной для этой же самой задачи, когда способ включает протопласт замы кающих клеток устьиц.
Пример 1.
Отбор генотипов (линий) сахарной свеклы для хорошо регенерирующих протопластов.
Авторы изобретения сравнили несколько генотипов растений сахарной свеклы в отношении их способности к регенерации из протопластов замыкающих клеток устьиц.
Авторы изобретения обнаружили генотипы, обладающие приблизительно 0,01% (или даже меньшей) способностью регенерировать, и несколько генотипов, обладающих (гораздо) большей чем 0,1% способностью регенерировать.
Авторы изобретения также установили различие между ростом протопластов (их способностью к росту и делению in vitro), способностью к росту каллусов с образованием побегов и долей растущих каллусов, регенерирующих до растения.
Таблица 1
Сравнение нескольких генотипов сахарной свеклы
Генотип Протопласты/грамм Процентная доля растущих клеток Процентная доля образования побегов Процентная доля полученных растений
F06R38309 1500000 0,02 55,67 3,43
F06R38313 500000 0,04 0,14 0,00
F06R38323 1000000 0,19 0,49 10,81
F07R38836 500000 0,26 10,51 0,73
REL1 1000000 0,07 70,00 44,00
Хотя величины, отражающие способность протопластов замыкающих клеток устьиц регенерировать в целое растение сахарной свеклы, взятые в общем, были выше для клеточной линии Rel1, эту клеточную линию рассматривали как не достаточно подходящую для настоящего изобретения.
Авторы изобретения также сделали заключение о том, что параметр процент растущих клеток го- 10 031973 раздо более важен для настоящего изобретения, чем другие параметры.
Авторы изобретения выбрали генотип, имеющий более чем 0,25% протопластов замыкающих клеток устьиц, способных расти in vitro.
Пример 2.
Обработка протопластов гербицидом.
Авторы изобретения применили тот же самый подход как в сравнительном примере, но основываясь на хорошо растущих протопластах замыкающих клеток устьиц (например, идентифицированных в примере 1; также могут быть использованы растения, размещенные под номерами NCIMB 42050 или NCIMB 42051, а также другие растения сахарной свеклы, имеющие высокую долю растущих протопластов замыкающих клеток устьиц).
В общем, приблизительно 68 млн хорошо растущих протопластов замыкающих клеток устьиц обрабатывали композицией гербицида ALS, содержащей до 10-6 М форамсульфурона.
Авторы изобретения получили 46 каллусов.
Нескольких регенерированных растений демонстрируют мутацию в гене-мишени, гена ALS: в каждом случае мутация в кодоне триптофана в позиции 569 (W569L; соответствующей триптофану в позиции 574 у Arabidopsis thaliana). Две аллели гена ALS этого мутанта кодируются последовательностями SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 7. Другие растущие каллусы были секвенированы и имели мутации в гене ALS, (включающие мутации в других позициях), но не регенерировали в растение.
Таким образом, авторы изобретения сделали заключение о том, что способ по настоящему изобретению может быть применен для получения растений, имеющих выявленные мутации, вызывающие устойчивость к гербициду, в особенности, поскольку этот способ не требует применения чужеродной ДНК и/или введения векторов ДНК, кодирующих генетические элементы, которые, как уже известно, придают устойчивость к ингибиторам ALS и позволяют получить положительные результаты в течение всего лишь нескольких месяцев.
Авторы изобретения затем повторили указанный способ и также применили мутаген (от 0,05% до 0,2% EMS) к протопластам для увеличения количества мутаций.
Пример 3.
Обработка сахарной свеклы ингибитором ALS.
Авторы изобретения сравнили поведение регенерированных растений сахарной свеклы, имеющих мутантную последовательность SEQ ID NO: 3 (гетерозигота для этой мутации), и сахарной свеклы дикого типа (наивной), имеющейся в продаже.
Мутантный (гетерозиготный) сорт демонстрировал хорошую устойчивость к форамсульфурону (12,5 г/га; до 3 применений), даже тогда, когда гербицид комбинировали с органическим соединением (25 г/га метилового эфира рапсового масла) для усиления его действия.
Как ожидалось, растение дикого типа (наивное) было очень чувствительным к форамсульфурону, даже после первого применения.
Тот же самый эксперимент осуществляли с использованием амидосульфурона (15 г/га) и добивались того же уровня устойчивости у мутантных растений.
С другой стороны, растения дикого типа (наивные) были весьма чувствительны к амидосульфурону, особенно, будучи комбинированными с органическим соединением, и/или после нескольких применений амидосульфурона.
Тот же самый эксперимент проводили с использованием йодосульфурона (3,5 г/га) и продемонстрировали хороший уровень устойчивости у мутантных растений при добавлении йодосульфурона, но эта устойчивость уменьшалась при применении йодосульфурона вместе с органическим соединением.
Как ожидалось, растение дикого типа (наивное) было очень чувствительным к йодосульфурону, даже после одного применения и без органического соединения.
Тот же самый эксперимент провели с использованием 7,5 г/га тиенкарбазон-метила, и получили приблизительно тот же самый уровень устойчивости, как для йодосульфурона у мутантных растений. Растение дикого типа (наивное) было очень чувствительным к тиенкарбазон-метилу при всех тестируемых концентрациях и независимо от добавления органического соединения.
Авторы изобретения сделали заключение о том, что при сравнении с диким типом мутантное растение сахарная свекла, содержащая SEQ ID NO: 3 (размещенная в соответствии с Будапештским договором под номером NCIMB 42051), обеспечивает наилучшую устойчивость к форамсульфурону.
Авторы изобретения также сделали заключение о том, что эти (гетерозиготные) мутантные растения также приобретают некоторую (хотя и частичную) устойчивость к другим ингибиторам ALS, включающим ингибиторы, относящиеся к другим химическим классам.
Пример 4.
Обработка ингибитором ALS растения сахарной свеклы, имеющей дополнительные мутации в гене ALS.
Авторы изобретения получили мутантное растение сахарной свеклы, содержащее последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5 (в двух различных аллелях). Такой получившийся в результате двойной мутант был размещен в соответствии с Будапештским договором под номером NCIMB 42050. Расте- 11 031973 ние, содержащее последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5, может быть создано, основываясь на нескольких способах, включающих, например, последующую стадию мутагенеза, применяемую к единичному мутанту NCIMB 42051.
Авторы изобретения сравнили устойчивость указанного растения двойного мутанта (мутация в одной аллели по аминокислоте 569 и мутация в другой аллели по аминокислоте 188) с устойчивостью единичного мутанта (мутация в позиции 569) сахарной свеклы.
Линия растения с двойной мутацией, по меньшей мере, сохраняет все свойства устойчивости, как в примере 3, и также приобретает хорошую устойчивость (совместимую с полевым применением) к обработке тиенкарбазон-метилом и амидосульфуроном, даже при погружении в композицию с органическими соединениями.
Таким образом, указанный двойной мутант демонстрирует улучшенную синергическую устойчивость к нескольким ингибиторам ALS при сравнении с устойчивостью, характерной для растения с единичной мутацией (в позиции 569 в гене ALS).
Пример 5.
Тепличные исследования: обработка ингибитором ALS различных растений сахарной свеклы для прямого сравнения.
Мутантные растения сахарной свеклы, содержащие последовательности SEQ ID NO: 3 и SEQ ID NO: 5 (в двух различных аллелях) в соответствии с настоящим изобретением (как описано в примере 4 выше, Линия A) обрабатывали различными ингибиторами ALS для прямого сравнения с растениями сахарной свеклы, где триптофан в позиции 569 кодируемого фермента ALS заменен на лейцин (Линия B), растениями сахарной свеклы, описанными в WO 98/02527, где пролин в позиции 188 кодируемого фермента ALS заменен на серин (Линия C), и традиционными сортом (дикий тип) растений сахарной свеклы, не имеющих мутацию в позициях 569 и 188 (Линия WT).
Несколько групп семян четырех различных упомянутых растений сахарной свеклы сеяли отдельно в теплице и выращивали до стадии BBCH 14 для Beta vulgaris L. ssp. vulgaris (т.е. 4 не развернувшихся листа (вторая пара)) в соответствии с монографией Entwicklungsstadien mono- und dikotyler Pflanzen, 2nd edition, 2001, ed. Uwe Meier, Biologische Bundesanstalt fur Land und Forstwirtschaft. Затем каждую из получающихся в результате отдельных групп растений сахарной свеклы индивидуально обрабатывали ингибитором ALS (ALS-ин) в количествах (г/га), представленным в таблице 2.
На 14 сутки после применения соответствующего ингибитора ALS поражение (т.е. фитотоксичность) для каждого растения сахарной свеклы оценивали по шкале от 0% (т.е. отсутствие поражения, отсутствие фитотоксичности) до 100% (т.е. растения полностью погибали). Средняя оценка для каждой группы растений также представлена в табл. 2.
Таблица 2
ALS-ин ALS-ин г/га Линия А Линия В Линия С Линия WT
Форамсульфурон 13 26,9% 45,6% 77,5% 80,0%
Йодосульфуронметил Na 3,5 22,5% 38,8% 80,0% 82,5%
Амидосульфурон 15 6,3% 37,5% 51,9% 73,1%
Тиенокарбазон- метил 7,5 8,1% 35,6% 37,5% 84,4%
Бисбирибак-Na 50 17,5% 38,1% 71,7% 80,0%
Метосулам 15 13,1% 40,6% 69,4% 79,4%
Дополнительно, типичные ранние фенотипы каждого растения сахарной свеклы проверяли после обработки смесью, содержащей тиенкарбазон-метил и форамсульфурон. Типичный ранний фенотип каждой линии представлен на фигуре.
Фигура также демонстрирует, что растения сахарной свеклы в соответствии с настоящим изобретением (Линия A) демонстрируют улучшенную устойчивость к ингибитору ALS, т.е. обнаружен превосходный рост и меньше фитотоксических эффектов по сравнению с другими ранними фенотипами.
Пример 6.
Полевые исследования: обработка ингибитором ALS различных растений сахарной свеклы для прямого сравнения.
- 12 031973
Таблица 3
Действие ингибиторов ALS на растение сахарной свеклы. Значения представляют собой средние процентные величины измеренного поражения
Чувствительный 574 гетеро 574 197 и 574 гомо
1 Не обработанные 0 0 0 0
2 АЕ F 130360 00 WG50 А1 25 г/га 97 22 5 0
(Форамсульфурон)
3 BYH18636 15 г/га (тиенкарбазон) 97 339 5 0
4 Ае f115008 00 wg 10 а2 7 г/га (йодосульфурон) 98 65 23 28
5 АЕ F130060 00 WG75 А2 60 г/га (мезозульфурон) 91 24 18 0
6 HOESTAR 30 г/га (амидосульфурон) 97 34 0 0
7 AEF095404 00 WG60 А2 60 г/га (этокси сул ь фу ро н) 99 39 0 0
8 RAPTOR 40 г/га (имазамокс) 98 44 35 8
9 ТАССО 30 г/га (метосулам) 97 27 0 3
10 NOMINEE 50 г/га (биспирибак) 98 78 70 28
11 MOTIVELL 60 г/га (никосульфурон) 98 53 28 13
12 GROPPER SX 8 г/га (метосульфурон) 100 74 50 35
13 LEXUS 50 DF 10 г/га (флупирсульфурон) 70 0 0 0
14 ATTRIBUT 70 г/га (пропоксикарбазон) 91 25 0 5
15 SIMPLICITY 50 г/га (пироксисулам) 97 45 28 0
16 PRIMUS 10 г/га (флорасулам) 99 55 38 0
17 POINTER SX 30 г/га 98 74 28 20
(трибенурон)
18 САТО 13 г/га (римсульфурон) 68 8 0 0
19 MONITOR 80WG 10 г/га (сульфосульфурон) 93 23 0 0
20 DEBUT YX1 15 г/га (трифлусульфурон) 0 0 0 0
21 EVEREST 40 г/га (флукарбазон) 93 18 0 0
22 HARMONY 7,5 г/га (тиенсульфурон) 98 39 0 0
23 №2 и №3 (форамсульфурон + тиенкарбазон) 1 л/га 100 65 35 5
Авторы изобретения протестировали имеющиеся в продаже композиции в дозе, обеспечивающей гибель сорняков.
Контроль чувствительности (т.е. сахарная свекла, не имеющая мутацию в гене ALS) погибал под
- 13 031973 действием всех гербицидов за исключением одного. Авторы изобретения измерили небольшие поражения по сравнению с контрольным (не обработанным) растением, которые достигали иногда 35% или даже 40%. Эти поражения отражают агротехнические условия полевого исследования.
С другой стороны, растение сахарная свекла, представляющая собой гетерозиготу в позиции 569 (574), приобретает частичную устойчивость к нескольким гербицидным композициям. Растение, включающее мутацию 569 (574) в обеих аллелях и, таким образом, являющееся гомозиготой (569/569), также обладает увеличенной устойчивость: только 7 гербицидных композиций умеренно токсичны (от 5% до 35%).
Растение сахарной свеклы, имеющее мутацию в позиции 569 (574) в одной аллели гена ALS и мутацию в позиции 188 (197) во второй аллели гена ALS, также приобретает улучшенную устойчивость, поскольку 9 гербицидных композиций умеренно токсичны и только 3 весьма токсичны. Неожиданно обнаружено, что такое растение, в котором утрачена мутация, обеспечивающая сильную устойчивость (569), и добавлена мутация, обеспечивающая только слабую устойчивость (188) к ингибитору ALS, обеспечивает еще более хорошую устойчивость по сравнению с гомозиготным (569/569) растением в 3 различных условиях указанного полевого теста.
ПЕРЕЧЕНЬ ПОСЛЕДОВАТЕЛЬНОСТЕЙ <110> SES <120> Способ получения растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам <130> SES0010
<140> PCT/EP2013/076618
<141> 2013-12-13
<150> EP12196858
<151> 2012-12-13
<150> US61/736817
<151> 2012-12-13
<160> 8
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 1998
<212> ДНК
<213> Свекла обыкновенная
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(1998)
<223> 4D6834 WT al1
<400> 1
atg Met 1 gcg Ala gct Ala acc Thr ttc Phe 5 aca Thr aac Asn cca Pro aca Thr ttt Phe 10 tcc Ser cct Pro tcc Ser tca Ser act Thr 15 cca Pro 48
tta acc aaa acc cta aaa tcc caa tct tcc atc tct tca acc ctc ccc 96
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
ttt tcc acc cct ccc aaa acc cca act cca ctc ttt cac cgt ccc ctc 144
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
caa atc tca tcc tcc caa tcc cac aaa tca tcc gcc att aaa aca caa 192
- 14 031973
Gln Ile 50 Ser Ser Ser Gln Ser 55 His Lys Ser Ser Ala 60 Ile Lys Thr Gln
act caa gca cct tct tct cca gct att gaa gat tca tct ttc gtt tct 240
Thr Gln Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ile Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
cga ttt ggc cct gat gaa ccc aga aaa ggg tcc gat gtc ctc gtt gaa 288
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
gct ctt gag cgt gaa ggt gtt acc aat gtg ttt gct tac cct ggt ggt 336
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
gca tct atg gaa atc cac caa gct ctc aca cgc tct aaa acc atc cgc 384
Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr Ile Arg
115 120 125
aat gtc ctc cct cgc cat gaa caa ggc ggg gtt ttc gcc gcc gag gga 432
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
tat gct aga gct act gga aag gtt ggt gtc tgc att gcg act tct ggt 480
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
cct ggt gct acc aac ctc gta tca ggt ctt gct gac gct ctc ctt gat 528
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
tct gtc cct ctt gtt gcc atc act ggc caa gtt cca cgc cgt atg att 576
Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile
180 185 190
ggc act gat gct ttt cag gag act cca att gtt gag gtg aca agg tct 624
Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser
195 200 205
att act aag cat aat tat tta gtt ttg gat gta gag gat att cct aga 672
Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg
210 215 220
att gtt aag gaa gcc ttt ttt tta gct aat tct ggt agg cct gga cct 720
Ile Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
gtt ttg att gat ctt cct aaa gat att cag cag caa ttg gtt gtt cct 768
Val Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val Pro
245 250 255
gat tgg gat agg cct ttt aag ttg ggt ggg tat atg tct agg ctg cca 816
Asp Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro
260 265 270
aag tcc aag ttt tcg acg aat gag gtt gga ctt ctt gag cag att gtg 864
Lys Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile Val
275 280 285
agg ttg atg agt gag tcg aag aag cct gtc ttg tat gtg gga ggt ggg 912
Arg Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
- 15 031973
960
tgt Cys 305 ttg Leu aat Asn tct Ser agt Ser gag Glu 310 gag Glu ttg Leu agg Arg aga Arg ttt Phe 315 gtt Val gag Glu ttg Leu aca Thr ggg Gly 320
att ccg gtg gct agt act ttg atg ggg ttg ggg tct tac cct tgt aat
Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
gat gaa ctg tct ctt cat atg ttg ggg atg cac ggg act gtt tat gcc
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
aat tat gcg gtg gat aag gcg gat ttg ttg ctt gct ttc ggg gtt agg
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
355 360 365
ttt gat gat cgt gtg acc ggg aag ctc gag gcg ttt gct agc cgt gct
Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala
370 375 380
aag att gtg cat att gat att gac tct gct gag att ggg aag aac aag
Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys
385 390 395 400
cag ccc cat gtg tcc att tgt gct gat gtt aaa ttg gca ttg cgg ggt
Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg Gly
405 410 415
atg aat aag att ctg gag tct aga ata ggg aag ctg aat ttg gat ttc
Met Asn Lys Ile Leu Glu Ser Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu Asp Phe
420 425 430
tcc aag tgg aga gaa gaa tta ggt gag cag aag aag gaa ttc cca ctg
Ser Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gln Lys Lys Glu Phe Pro Leu
435 440 445
agt ttt aag aca ttt ggg gat gca att cct cca caa tat gcc att cag
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln
450 455 460
gtg ctt gat gag ttg acc aat ggt aat gct att ata agt act ggt gtt
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val
465 470 475 480
ggg cag cac caa atg tgg gct gcg cag cat tac aag tac aga aac cct
Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg Asn Pro
485 490 495
cgc caa tgg ctg acc tct ggt ggg ttg ggg gct atg ggg ttt ggg cta
Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu
500 505 510
cca gcc gcc att gga gct gca gtt gct cga cca gat gca gtg gtt gtc
Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val Val Val
515 520 525
gat att gat ggg gat ggc agt ttt att atg aat gtt caa gag ttg gct
Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala
530 535 540
aca att agg gtg gaa aat ctc cca gtt aag ata atg ctg cta aac aat
Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu Asn Asn
545 550 555 560
1008
1056
1104
1152
1200
1248
1296
1344
1392
1440
1488
1536
1584
1632
1680
- 16 031973
caa Gln cat His tta Leu ggt Gly atg Met 565 gtt Val gtc Val caa Gln tgg Trp gaa Glu 570 gat Asp agg Arg ttc Phe tat Tyr aaa Lys 575 gct Ala 1728
aac cgg gca cat aca tac ctt gga aac cct tcc aaa tct gct gat atc 1776
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala Asp Ile
580 585 590
ttc cct gat atg ctc aaa ttc gct gag gca tgt gat att cct tct gcc 1824
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp Ile Pro Ser Ala
595 600 605
cgt gtt agc aac gtg gct gat ttg agg gcc gcc att caa aca atg ttg 1872
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Gln Thr Met Leu
610 615 620
gat act cca ggg ccg tac ctg ctc gat gtg att gta ccg cat caa gag 1920
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu
625 630 635 640
cat gtg ttg cct atg att cca agt ggt gcc ggt ttc aag gat acc att 1968
His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr Ile
645 650 655
aca gag ggt gat gga aga acc tct tat tga 1998
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660 665
<210> 2
<211> 665
<212> PRT
<213> Свекла обыкновенная
<400> 2
Met Ala Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr Phe Ser Pro Ser Ser Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
Gln Ile Ser Ser Ser Gln Ser His Lys Ser Ser Ala Ile Lys Thr Gln
50 55 60
Thr Gln Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ile Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
- 17 031973
Ala Ser Met 115 Glu Ile His Gln Ala 120 Leu Thr Arg Ser Lys 125 Thr Ile Arg
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile
180 185 190
Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser
195 200 205
Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg
210 215 220
Ile Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
Val Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val Pro
245 250 255
Asp Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro
260 265 270
Lys Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile Val
275 280 285
Arg Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly
305 310 315 320
Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
- 18 031973
355
360
365
Phe
Lys
385
Gln
Met
Ser
Ser
Val
465
Gly
Arg
Pro
Asp
Thr
545
Gln
Asn
Phe
Asp 370 Asp Arg Val Thr Gly Lys 375 Leu Glu Ala Phe 380 Ala Ser Arg
Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn
390 395
Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg
405 410 415
Asn Lys Ile Leu Glu Ser Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu Asp
420 425 430
Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gln Lys Lys Glu Phe Pro
435 440 445
Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile
450 455 460
Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly
470 475
Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg Asn
485 490 495
Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly
500 505 510
Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val Val
515 520 525
Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu
530 535 540
Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu Asn
550 555
His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys
565 570 575
Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala Asp
580 585 590
Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp Ile Pro Ser
595 600 605
Ala
Lys
400
Gly
Phe
Leu
Gln
Val
480
Pro
Leu
Val
Ala
Asn
560
Ala
Ile
Ala
- 19 031973
Arg Val 610 Ser Asn Val Ala Asp 615 Leu Arg Ala Ala Ile 620 Gln Thr Met Leu
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu
625 630 635 640
His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr Ile
645 650 655
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660 665
<210> 3 <211> 1998 <212> ДНК <213> Свекла обыкновенная <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1998) <223> 4D6834 W574 <220>
<221> CDS <222> (1)..(1998) <223> 4D6834 W574 <400> 3
atg Met 1 gcg Ala gct Ala acc Thr ttc Phe 5 aca Thr aac Asn cca Pro aca Thr ttt Phe 10 tcc Ser cct Pro tcc Ser tca Ser act Thr 15 cca Pro 48
tta acc aaa acc cta aaa tcc caa tct tcc atc tct tca acc ctc ccc 96
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
ttt tcc acc cct ccc aaa acc cca act cca ctc ttt cac cgt ccc ctc 144
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
caa atc tca tcc tcc caa tcc cac aaa tca tcc gcc att aaa aca caa 192
Gln Ile Ser Ser Ser Gln Ser His Lys Ser Ser Ala Ile Lys Thr Gln
50 55 60
act caa gca cct tct tct cca gct att gaa gat tca tct ttc gtt tct 240
Thr Gln Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ile Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
cga ttt ggc cct gat gaa ccc aga aaa ggg tcc gat gtc ctc gtt gaa 288
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
gct ctt gag cgt gaa ggt gtt acc aat gtg ttt gct tac cct ggt ggt 336
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
gca tct atg gaa atc cac caa gct ctc aca cgc tct aaa acc atc cgc 384
Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr Ile Arg
- 20 031973
115 120 125
aat Asn gtc Val 130 ctc Leu cct Pro cgc Arg cat His gaa Glu 135 caa Gln ggc Gly ggg Gly gtt Val ttc Phe 140 gcc Ala gcc Ala gag Glu gga Gly 432
tat gct aga gct act gga aag gtt ggt gtc tgc att gcg act tct ggt 480
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
cct ggt gct acc aac ctc gta tca ggt ctt gct gac gct ctc ctt gat 528
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
tct gtc cct ctt gtt gcc atc act ggc caa gtt cca cgc cgt atg att 576
Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile
180 185 190
ggc act gat gct ttt cag gag act cca att gtt gag gtg aca agg tct 624
Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser
195 200 205
att act aag cat aat tat tta gtt ttg gat gta gag gat att cct aga 672
Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg
210 215 220
att gtt aag gaa gcc ttt ttt tta gct aat tct ggt agg cct gga cct 720
Ile Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
gtt ttg att gat ctt cct aaa gat att cag cag caa ttg gtt gtt cct 768
Val Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val Pro
245 250 255
gat tgg gat agg cct ttt aag ttg ggt ggg tat atg tct agg ctg cca 816
Asp Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro
260 265 270
aag tcc aag ttt tcg acg aat gag gtt gga ctt ctt gag cag att gtg 864
Lys Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile Val
275 280 285
agg ttg atg agt gag tcg aag aag cct gtc ttg tat gtg gga ggt ggg 912
Arg Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
tgt ttg aat tct agt gag gag ttg agg aga ttt gtt gag ttg aca ggg 960
Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly
305 310 315 320
att ccg gtg gct agt act ttg atg ggg ttg ggg tct tac cct tgt aat 1008
Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
gat gaa ctg tct ctt cat atg ttg ggg atg cac ggg act gtt tat gcc 1056
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
aat tat gcg gtg gat aag gcg gat ttg ttg ctt gct ttc ggg gtt agg 1104
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
355 360 365
ttt gat gat cgt gtg acc ggg aag ctc gag gcg ttt gct agc cgt gct 1152
- 21 031973
Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala
370 375380 aag att gtg cat att gat att gac tct gct gag att ggg aag aac aag1200
Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys AsnLys
385 390 395400 cag ccc cat gtg tcc att tgt gct gat gtt aaa ttg gca ttg cgg ggt1248
Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu ArgGly
405 410415 atg aat aag att ctg gag tct aga ata ggg aag ctg aat ttg gat ttc1296
Met Asn Lys Ile Leu Glu Ser Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu AspPhe
420 425430 tcc aag tgg aga gaa gaa tta ggt gag cag aag aag gaa ttc cca ctg1344
Ser Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gln Lys Lys Glu Phe ProLeu
435 440445 agt ttt aag aca ttt ggg gat gca att cct cca caa tat gcc att cag1392
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala IleGln
450 455460 gtg ctt gat gag ttg acc aat ggt aat gct att ata agt act ggt gtt1440
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr GlyVal
465 470 475480 ggg cag cac caa atg tgg gct gcg cag cat tac aag tac aga aac cct1488
Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg AsnPro
485 490495 cgc caa tgg ctg acc tct ggt ggg ttg ggg gct atg ggg ttt ggg cta1536
Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe GlyLeu
500 505510 cca gcc gcc att gga gct gca gtt gct cga cca gat gca gtg gtt gtc1584
Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val ValVal
515 520525 gat att gat ggg gat ggc agt ttt att atg aat gtt caa gag ttg gct1632
Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu LeuAla
530 535540 aca att agg gtg gaa aat ctc cca gtt aag ata atg ctg cta aac aat1680
Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu AsnAsn
545 550 555560 caa cat tta ggt atg gtt gtc caa ttg gaa gat agg ttc tat aaa gct1728
Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr LysAla
565 570575 aac cgg gca cat aca tac ctt gga aac cct tcc aaa tct gct gat atc1776
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala AspIle
580 585590 ttc cct gat atg ctc aaa ttc gct gag gca tgt gat att cct tct gcc1824
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp Ile Pro SerAla
595 600605 cgt gtt agc aac gtg gct gat ttg agg gcc gcc att caa aca atg ttg1872
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Gln Thr MetLeu
610 615620
- 22 031973
1920
gat Asp 625 act Thr cca Pro ggg Gly ccg Pro tac Tyr 630 ctg Leu ctc Leu gat Asp gtg Val att Ile 635 gta Val ccg Pro cat His caa Gln gag Glu 640
cat gtg ttg cct atg att cca agt ggt gcc ggt ttc aag gat acc att
His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr Ile
645 650 655
aca gag ggt gat gga aga acc tct tat tga
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660 665
<210> . 4
<211> 665
<212> PRT
<213> Свекла обыкновенная
<400> 4
Met Ala Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr Phe Ser Pro Ser Ser Thr Pro
1 5 10 15
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
Gln Ile Ser Ser Ser Gln Ser His Lys Ser Ser Ala Ile Lys Thr Gln
50 55 60
Thr Gln Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ile Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr Ile Arg
115 120 125
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
1968
1998
- 23 031973
Ser
Gly
Ile
Ile
225
Val
Asp
Lys
Arg
Cys
305
Ile
Asp
Asn
Phe
Lys
385
Gln
Met
Val Pro Leu 180 Val Ala Ile Thr Gly 185 Gln Val Pro Arg Arg 190 Met
Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg
195 200 205
Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro
210 215 220
Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly
230 235
Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val
245 250 255
Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu
260 265 270
Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile
275 280 285
Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly
290 295 300
Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr
310 315
Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys
325 330 335
Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr
340 345 350
Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val
355 360 365
Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg
370 375 380
Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn
390 395
Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg
405 410 415
Asn Lys Ile Leu Glu Ser Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu Asp
420 425 430
Ile
Ser
Arg
Pro
240
Pro
Pro
Val
Gly
Gly
320
Asn
Ala
Arg
Ala
Lys
400
Gly
Phe
- 24 031973
Ser Lys Trp 435 Arg Glu Glu Leu Gly Glu 440 Gln Lys Lys Glu 445 Phe Pro
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile
450 455 460
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly
465 470 475
Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg Asn
485 490 495
Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly
500 505 510
Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val Val
515 520 525
Asp Ile 530 Asp Gly Asp Gly Ser 535 Phe Ile Met Asn Val 540 Gln Glu Leu
Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu Asn
545 550 555
Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Leu Glu Asp Arg Phe Tyr Lys
565 570 575
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala Asp
580 585 590
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp Ile Pro Ser
595 600 605
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp 615 Leu Arg Ala Ala Ile 620 Gln Thr Met
610
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln
625 630 635
His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr
645 650 655
Leu
Gln
Val
480
Pro
Leu
Val
Ala
Asn
560
Ala
Ile
Ala
Leu
Glu
640
Ile
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660 665 <210> 5
- 25 031973 <211> 1998 <212> ДНК <213> Свекла обыкновенная <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1998) <223> Pro мутантный <220>
<221> CDS <222> (1)..(1998) <400> 5
atg Met 1 gcg Ala gct Ala acc Thr ttc Phe 5 aca Thr aac Asn cca Pro aca Thr ttt Phe 10 tcc Ser cct Pro tcc Ser tca Ser act Thr 15 cca Pro 48
tta acc aaa acc cta aaa tcc caa tct tcc atc tct tca acc ctc ccc 96
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
ttt tcc acc cct ccc aaa acc cca act cca ctc ttt cac cgt ccc ctc 144
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
caa atc tca tcc tcc caa tcc cac aaa tca tcc gcc att aaa aca caa 192
Gln Ile Ser Ser Ser Gln Ser His Lys Ser Ser Ala Ile Lys Thr Gln
50 55 60
act caa gca cct tct tct cca gct att gaa gat tca tct ttc gtt tct 240
Thr Gln Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ile Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
cga ttt ggc cct gat gaa ccc aga aaa ggg tcc gat gtc ctc gtt gaa 288
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
gct ctt gag cgt gaa ggt gtt acc aat gtg ttt gct tac cct ggt ggt 336
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
gca tct atg gaa atc cac caa gct ctc aca cgc tct aaa acc atc cgc 384
Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr Ile Arg
115 120 125
aat gtc ctc cct cgc cat gaa caa ggc ggg gtt ttc gcc gcc gag gga 432
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
tat gct aga gct act gga aag gtt ggt gtc tgc att gcg act tct ggt 480
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
cct ggt gct acc aac ctc gta tca ggt ctt gct gac gct ctc ctt gat 528
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
tct gtc cct ctt gtt gcc atc act ggc caa gtt tca cgc cgt atg att 576
Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser Arg Arg Met Ile
180 185 190
- 26 031973
ggc Gly act Thr gat Asp 195 gct Ala ttt Phe cag Gln gag Glu act Thr 200 cca Pro att Ile gtt Val gag Glu gtg Val 205 aca Thr agg Arg tct Ser 624
att act aag cat aat tat tta gtt ttg gat gta gag gat att cct aga 672
Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg
210 215 220
att gtt aag gaa gcc ttt ttt tta gct aat tct ggt agg cct gga cct 720
Ile Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
gtt ttg att gat ctt cct aaa gat att cag cag caa ttg gtt gtt cct 768
Val Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val Pro
245 250 255
gat tgg gat agg cct ttt aag ttg ggt ggg tat atg tct agg ctg cca 816
Asp Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro
260 265 270
aag tcc aag ttt tcg acg aat gag gtt gga ctt ctt gag cag att gtg 864
Lys Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile Val
275 280 285
agg ttg atg agt gag tcg aag aag cct gtc ttg tat gtg gga ggt ggg 912
Arg Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
tgt ttg aat tct agt gag gag ttg agg aga ttt gtt gag ttg aca ggg 960
Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly
305 310 315 320
att ccg gtg gct agt act ttg atg ggg ttg ggg tct tac cct tgt aat 1008
Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
gat gaa ctg tct ctt cat atg ttg ggg atg cac ggg act gtt tat gcc 1056
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
aat tat gcg gtg gat aag gcg gat ttg ttg ctt gct ttc ggg gtt agg 1104
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
355 360 365
ttt gat gat cgt gtg acc ggg aag ctc gag gcg ttt gct agc cgt gct 1152
Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala
370 375 380
aag att gtg cat att gat att gac tct gct gag att ggg aag aac aag 1200
Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys
385 390 395 400
cag ccc cat gtg tcc att tgt gct gat gtt aaa ttg gca ttg cgg ggt 1248
Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg Gly
405 410 415
atg aat aag att ctg gag tct aga ata ggg aag ctg aat ttg gat ttc 1296
Met Asn Lys Ile Leu Glu Ser Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu Asp Phe
420 425 430
tcc aag tgg aga gaa gaa tta ggt gag cag aag aag gaa ttc cca ctg 1344
Ser Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gln Lys Lys Glu Phe Pro Leu
435 440 445
- 27 031973 agt ttt aag aca ttt ggg gat gca att cct cca caa tat gcc att cag 1392
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln
450 455 460 gtg ctt gat gag ttg acc aat ggt aat gct att ata agt act ggt gtt1440
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr GlyVal
465 470 475480 ggg cag cac caa atg tgg gct gcg cag cat tac aag tac aga aac cct1488
Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg AsnPro
485 490495 cgc caa tgg ctg acc tct ggt ggg ttg ggg gct atg ggg ttt ggg cta1536
Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe GlyLeu
500 505510 cca gcc gcc att gga gct gca gtt gct cga cca gat gca gtg gtt gtc1584
Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val ValVal
515 520525 gat att gat ggg gat ggc agt ttt att atg aat gtt caa gag ttg gct1632
Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu LeuAla
530 535540 aca att agg gtg gaa aat ctc cca gtt aag ata atg ctg cta aac aat1680
Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu AsnAsn
545 550 555560 caa cat tta ggt atg gtt gtc caa tgg gaa gat agg ttc tat aaa gct1728
Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr LysAla
565 570575 aac cgg gca cat aca tac ctt gga aac cct tcc aaa tct gct gat atc1776
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala AspIle
580 585590 ttc cct gat atg ctc aaa ttc gct gag gca tgt gat att cct tct gcc1824
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp Ile Pro SerAla
595 600605 cgt gtt agc aac gtg gct gat ttg agg gcc gcc att caa aca atg ttg1872
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Gln Thr MetLeu
610 615620 gat act cca ggg ccg tac ctg ctc gat gtg att gta ccg cat caa gag1920
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His GlnGlu
625 630 635640 cat gtg ttg cct atg att cca agt ggt gcc ggt ttc aag gat acc att1968
His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp ThrIle
645 650655 aca gag ggt gat gga aga acc tct tat tga1998
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660665 <210>6 <211>665 <212> PRT <213> Свекла обыкновенная
- 28 031973 <400> 6
Met 1 Ala Ala Thr Phe 5 Thr Asn Pro Thr Phe 10 Ser Pro Ser Ser Thr 15 Pro
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gln Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro
20 25 30
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
Gln Ile Ser Ser Ser Gln Ser His Lys Ser Ser Ala Ile Lys Thr Gln
50 55 60
Thr Gln Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ile Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr Ile Arg
115 120 125
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Ser Arg Arg Met Ile
180 185 190
Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser
195 200 205
Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg
210 215 220
Ile Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
Val Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val Pro
- 29 031973
255
245
250
Asp
Lys
Arg
Cys
305
Ile
Asp
Asn
Phe
Lys
385
Gln
Met
Ser
Ser
Val
465
Gly
Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly 265 Gly Tyr Met Ser Arg 270 Leu Pro
260
Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile Val
275 280 285
Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly
310 315 320
Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
355 360 365
Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala
370 375 380
Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys
390 395 400
Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg Gly
405 410 415
Asn Lys Ile Leu Glu Ser Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu Asp Phe
420 425 430
Lys Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gln Lys Lys Glu Phe Pro Leu
435 440 445
Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln
450 455 460
Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val
470 475 480
Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg Asn Pro
485 490 495
- 30 031973
Arg Gln
Trp Leu
500
Thr Ser
Pro Ala
Ala Ile
515
Gly Ala
Asp Ile
530
Asp Gly
Asp Gly
Thr Ile
545
Arg Val
Glu Asn
550
Gln His
Leu Gly
Met Val
565
Asn Arg
Ala His
580
Thr Tyr
Phe Pro
Asp Met
595
Leu Lys
Arg Val
610
Ser Asn
Val Ala
Asp Thr
625
Pro Gly
Pro Tyr
630
His Val
Leu Pro
Met Ile
645
Thr Glu
Gly Asp
660
Gly Arg
Gly Gly
Ala Val
520
Ser Phe
535
Leu Pro
Val Gln
Leu Gly
Phe Ala
600
Asp Leu
615
Leu Leu
Pro Ser
Thr Ser
Leu Gly
505
Ala Arg
Ile Met
Val Lys
Trp Glu
570
Asn Pro
585
Glu Ala
Arg Ala
Asp Val
Gly Ala
650
Tyr
665
Ala Met
Pro Asp
Asn Val
540
Ile Met
555
Asp Arg
Ser Lys
Cys Asp
Ala Ile
620
Ile Val
635
Gly Phe
Gly Phe
510
Ala Val
525
Gln Glu
Leu Leu
Phe Tyr
Ser Ala
590
Ile Pro
605
Gln Thr
Pro His
Lys Asp
Gly Leu
Val Val
Leu Ala
Asn Asn
560
Lys Ala
575
Asp Ile
Ser Ala
Met Leu
Gln Glu
640
Thr Ile
655 <210> 7 <211> 1998 <212> ДНК <213> Свекла обыкновенная <220>
<221> misc_feature <222> (1)..(1998) <223> 4D6834 al2 WT <220>
<221> CDS <222> (1)..(1998) <400> 7 atg gcg gct acc ttc aca aac cca aca ttt tcc cct tcc tca act caa
Met Ala Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr Phe Ser Pro Ser Ser Thr Gln
5 10 15
- 31 031973
tta Leu acc Thr aaa Lys acc Thr 20 cta Leu aaa Lys tcc Ser caa Gln tct Ser 25 tcc Ser att Ile tct Ser tca Ser acc Thr 30 ctc Leu ccc Pro 96
ttt tcc acc cct ccc aaa acc cca act cca ctc ttt cac cgt ccc ctc 144
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu
35 40 45
caa atc tca tcc tcc caa tcc cac aaa tca tcc gcc att aaa aca caa 192
Gln Ile Ser Ser Ser Gln Ser His Lys Ser Ser Ala Ile Lys Thr Gln
50 55 60
act caa gca cct tct tct cca gct att gaa gat tca tct ttc gtt tct 240
Thr Gln Ala Pro Ser Ser Pro Ala Ile Glu Asp Ser Ser Phe Val Ser
65 70 75 80
cga ttt ggc cct gat gaa ccc aga aaa ggg tcc gat gtc ctc gtt gaa 288
Arg Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val Glu
85 90 95
gct ctt gag cgt gaa ggt gtt acc aat gtg ttt gct tac cct ggt ggt 336
Ala Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly Gly
100 105 110
gca tct atg gaa atc cac caa gct ctg acg cgc tct aaa acc atc cgc 384
Ala Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr Ile Arg
115 120 125
aat gtc ctc ccc cgc cat gaa caa ggc ggg gtt ttc gcc gcc gag gga 432
Asn Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu Gly
130 135 140
tat gct aga gct act gga aag gtt ggt gtc tgc att gcg act tct ggt 480
Tyr Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser Gly
145 150 155 160
cct ggt gct acc aac ctc gta tca ggt ctt gct gac gct ctc ctt gat 528
Pro Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu Asp
165 170 175
tct gtc cct ctt gtt gcc atc act ggc caa gtt cca cgc cgt atg att 576
Ser Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met Ile
180 185 190
ggc act gat gct ttt cag gag act cca att gtt gag gta aca agg tct 624
Gly Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg Ser
195 200 205
att act aag cat aat tat ttg gtt ttg gat gta gaa gat att cct aga 672
Ile Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro Arg
210 215 220
att gtt aag gaa gcc ttt ttt tta gct aat tct ggc agg cct gga cct 720
Ile Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly Pro
225 230 235 240
gtt ttg att gat ctt cct aaa gat att cag cag caa ctg gtt gtt cct 768
Val Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val Pro
245 250 255
gat tgg gat agg cct ttt aag ttg ggt ggg tat atg tct agg ctg cca 816
Asp Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu Pro
- 32 031973
260 265 270
aag Lys tcc Ser aag Lys 275 ttt Phe tcg Ser acg Thr aat Asn gag Glu 280 gtt Val gga Gly ctt Leu ctt Leu gag Glu 285 cag Gln att Ile gtg Val 864
agg ttg atg agt gag tcg aag aag cct gtc ttg tat gtg gga ggt ggg 912
Arg Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly Gly
290 295 300
tgt ttg aat tct agt gag gag ttg agg aga ttt gtt gag ttg aca ggg 960
Cys Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr Gly
305 310 315 320
att ccg gtg gct agt act ttg atg ggg ttg ggg tct tac cct tgt aat 1008
Ile Pro Val Ala Ser Thr Leu Met Gly Leu Gly Ser Tyr Pro Cys Asn
325 330 335
gat gaa ctg tct ctt cat atg ttg ggg atg cac ggg act gtt tat gcc 1056
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr Ala
340 345 350
aat tat gcg gtg gat aag gcg gat ttg ttg ctt gct ttc ggg gtt agg 1104
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val Arg
355 360 365
ttt gat gat cgt gtg act ggg aag ctc gag gcg ttt gct agc cgt gct 1152
Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg Ala
370 375 380
aag att gtg cat att gat att gac tct gct gag att ggg aag aac aag 1200
Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn Lys
385 390 395 400
cag ccc cat gtg tcc att tgt gct gat gtt aaa ttg gca ttg cgg ggt 1248
Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg Gly
405 410 415
atg aat aag att ctg gag tct aga ata ggg aag ctg aat ttg gat ttc 1296
Met Asn Lys Ile Leu Glu Ser Arg Ile Gly Lys Leu Asn Leu Asp Phe
420 425 430
tcc agg tgg aga gaa gaa tta ggt gag cag aag aag gaa ttc cca ctg 1344
Ser Arg Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gln Lys Lys Glu Phe Pro Leu
435 440 445
agt ttt aag aca ttt ggg gat gca atc cct cca caa tat gcc att cag 1392
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile Gln
450 455 460
gtg ctt gat gag ttg acc aat ggt aat gct att ata agt act ggt gtt 1440
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly Val
465 470 475 480
ggg cag cac caa atg tgg gct gcg cag cat tac aag tac aga aac cct 1488
Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg Asn Pro
485 490 495
cgc caa tgg ctg acc tct ggt ggg ttg ggg gct atg ggg ttt ggg cta 1536
Arg Gln Trp Leu Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala Met Gly Phe Gly Leu
500 505 510
cca gcc gcc att gga gct gca gtt gct cga cca gat gca gtg gtt gtc 1584
- 33 031973
Pro Ala Ala 515 Ile Gly Ala Ala Val 520 Ala Arg Pro Asp Ala 525 Val Val Val
gat att gat ggg gat ggc agt ttt att atg aat gtt caa gag ttg gct 1632
Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu Ala
530 535 540
aca att agg gtg gaa aat ctc cca gtt aag ata atg ctg cta aac aat 1680
Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu Asn Asn
545 550 555 560
caa cat tta ggt atg gtt gtc caa tgg gaa gat agg ttc tat aaa gct 1728
Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys Ala
565 570 575
aat cgg gca cat aca tac ctt gga aac cct tcc aaa tct gct gat atc 1776
Asn Arg Ala His Thr Tyr Leu Gly Asn Pro Ser Lys Ser Ala Asp Ile
580 585 590
ttc cct gat atg ctc aaa ttc gct gag gca tgt gat att cct tct gcc 1824
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp Ile Pro Ser Ala
595 600 605
cgt gtt agc aac gtg gct gat ttg agg gcc gcc att caa aca atg ttg 1872
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Gln Thr Met Leu
610 615 620
gat act cca ggg ccg tac ctg ctc gat gtg att gta ccg cat caa gag 1920
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu
625 630 635 640
cat gtg ttg cct atg att cca agt ggt gcc ggt ttc aag gat acc att 1968
His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr Ile
645 650 655
aca gag ggt gat gga aga acc tct tat tga 1998
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660 665
<210>8 <211>665 <212> PRT <213> Свекла обыкновенная <400>8
Met Ala Ala Thr Phe Thr Asn Pro Thr Phe Ser Pro
Ser Ser Thr Gln
5 10
Leu Thr Lys Thr Leu Lys Ser Gln
Phe Ser Thr Pro Pro Lys Thr Pro
3540
Gln Ile Ser Ser Ser Gln Ser His
5055
Ser Ser Ile Ser Ser Thr Leu Pro
2530
Thr Pro Leu Phe His Arg Pro Leu 45
Lys Ser Ser Ala Ile Lys Thr Gln
- 34 031973
Thr
Arg
Ala
Ala
Asn
Tyr
145
Pro
Ser
Gly
Ile
Ile
225
Val
Asp
Lys
Arg
Cys
305
Gln Ala Pro Ser Ser 70 Pro Ala Ile Glu Asp 75 Ser Ser Phe Val
Phe Gly Pro Asp Glu Pro Arg Lys Gly Ser Asp Val Leu Val
85 90 95
Leu Glu Arg Glu Gly Val Thr Asn Val Phe Ala Tyr Pro Gly
100 105 110
Ser Met Glu Ile His Gln Ala Leu Thr Arg Ser Lys Thr Ile
115 120 125
Val Leu Pro Arg His Glu Gln Gly Gly Val Phe Ala Ala Glu
130 135 140
Ala Arg Ala Thr Gly Lys Val Gly Val Cys Ile Ala Thr Ser
150 155
Gly Ala Thr Asn Leu Val Ser Gly Leu Ala Asp Ala Leu Leu
165 170 175
Val Pro Leu Val Ala Ile Thr Gly Gln Val Pro Arg Arg Met
180 185 190
Thr Asp Ala Phe Gln Glu Thr Pro Ile Val Glu Val Thr Arg
195 200 205
Thr Lys His Asn Tyr Leu Val Leu Asp Val Glu Asp Ile Pro
210 215 220
Val Lys Glu Ala Phe Phe Leu Ala Asn Ser Gly Arg Pro Gly
230 235
Leu Ile Asp Leu Pro Lys Asp Ile Gln Gln Gln Leu Val Val
245 250 255
Trp Asp Arg Pro Phe Lys Leu Gly Gly Tyr Met Ser Arg Leu
260 265 270
Ser Lys Phe Ser Thr Asn Glu Val Gly Leu Leu Glu Gln Ile
275 280 285
Leu Met Ser Glu Ser Lys Lys Pro Val Leu Tyr Val Gly Gly
290 295 300
Leu Asn Ser Ser Glu Glu Leu Arg Arg Phe Val Glu Leu Thr
310 315
Ser
Glu
Gly
Arg
Gly
Gly
160
Asp
Ile
Ser
Arg
Pro
240
Pro
Pro
Val
Gly
Gly
320
- 35 031973
Ile Pro Val Ala Ser 325 Thr Leu Met Gly Leu 330 Gly Ser Tyr Pro Cys 335
Asp Glu Leu Ser Leu His Met Leu Gly Met His Gly Thr Val Tyr
340 345 350
Asn Tyr Ala Val Asp Lys Ala Asp Leu Leu Leu Ala Phe Gly Val
355 360 365
Phe Asp Asp Arg Val Thr Gly Lys Leu Glu Ala Phe Ala Ser Arg
370 375 380
Lys Ile Val His Ile Asp Ile Asp Ser Ala Glu Ile Gly Lys Asn
385 390 395
Gln Pro His Val Ser Ile Cys Ala Asp Val Lys Leu Ala Leu Arg
405 410 415
Met Asn Lys Ile 420 Leu Glu Ser Arg Ile 425 Gly Lys Leu Asn Leu 430 Asp
Ser Arg Trp Arg Glu Glu Leu Gly Glu Gln Lys Lys Glu Phe Pro
435 440 445
Ser Phe Lys Thr Phe Gly Asp Ala Ile Pro Pro Gln Tyr Ala Ile
450 455 460
Val Leu Asp Glu Leu Thr Asn Gly Asn Ala Ile Ile Ser Thr Gly
465 470 475
Gly Gln His Gln Met Trp Ala Ala Gln His Tyr Lys Tyr Arg Asn
485 490 495
Arg Gln Trp Leu 500 Thr Ser Gly Gly Leu Gly Ala 505 Met Gly Phe 510 Gly
Pro Ala Ala Ile Gly Ala Ala Val Ala Arg Pro Asp Ala Val Val
515 520 525
Asp Ile Asp Gly Asp Gly Ser Phe Ile Met Asn Val Gln Glu Leu
530 535 540
Thr Ile Arg Val Glu Asn Leu Pro Val Lys Ile Met Leu Leu Asn
545 550 555
Gln His Leu Gly Met Val Val Gln Trp Glu Asp Arg Phe Tyr Lys
565 570 575
Asn
Ala
Arg
Ala
Lys
400
Gly
Phe
Leu
Gln
Val
480
Pro
Leu
Val
Ala
Asn
560
Ala
- 36 031973
Asn Arg Ala His 580 Thr Tyr Leu Gly Asn 585 Pro Ser Lys Ser Ala 590 Asp Ile
Phe Pro Asp Met Leu Lys Phe Ala Glu Ala Cys Asp Ile Pro Ser Ala
595 600 605
Arg Val Ser Asn Val Ala Asp Leu Arg Ala Ala Ile Gln Thr Met Leu
610 615 620
Asp Thr Pro Gly Pro Tyr Leu Leu Asp Val Ile Val Pro His Gln Glu
625 630 635 640
His Val Leu Pro Met Ile Pro Ser Gly Ala Gly Phe Lys Asp Thr Ile
645 650 655
Thr Glu Gly Asp Gly Arg Thr Ser Tyr
660 665
ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ

Claims (9)

1. Способ получения мутантного растения сахарной свеклы, устойчивого к одному или более ингибитору фермента синтазы ацетогидроксикислоты (ALS), включающий стадии получения протопластов из замыкающих клеток устьиц, выделенных из растения сахарной свеклы; отбора протопластов по их способности регенерировать в растение сахарной свеклы;
обработки культивируемых in vitro указанных отобранных протопластов композицией, содержащей один или более ингибитор ALS в концентрации, которая является смертельной более чем для 99%, но менее чем для 100% протопластов; и регенерации растений сахарной свеклы из выживших указанных культивируемых in vitro протопластов, и при этом указанный(ые) ингибитор(ы) ALS применяют в отношении более чем 20000000 указанных протопластов.
2. Способ по п.1, отличающийся тем, что стадия отбора протопластов, способных регенерировать в растение сахарной свеклы, включает выделение протопластов замыкающих клеток устьиц из растений сахарной свеклы различных генотипов и измерения для каждого генотипа доли протопластов, способных к росту при их культивировании in vitro, для отбора хорошо регенерирующего генотипа.
3. Способ по п.1 или 2, дополнительно включающий стадию секвенирования генома регенерированных растений.
4. Способ по любому из пп.1-3, дополнительно включающий стадию секвенирования гена ALS в регенерированных растениях сахарной свеклы или каллусах, регенерированных из выживших протопластов, для идентификации мутации в гене ALS.
5. Способ по п.4, отличающийся тем, что регенерированное растение сахарной свеклы имеет одну или несколько мутаций в гене фермента ALS, имеющего любую из последовательностей SEQ ID NO: 1, 2 или 7, 8, при этом указанная мутация выбрана из группы, включающей замену аланина на валин или треонин в положении аминокислоты 113, замену пролина на треонин, аргинин, лейцин, глутамин или аланин в положении 188, замену аланина на валин в положении 196, замену аспартата на глутамат в положении 371, замену аргинина на гистидин в положении 372, замену триптофана на глицин в положении 569, замену серина на треонин в положении 648 и замену глицина на аспартат в положении 649.
6. Способ по любому из пп.1-5, отличающийся тем, что композиция, содержащая один или более ингибитор ALS, применяется в отношении клеточной in vitro культуры более чем 50000000 протопластов замыкающих клеток устьиц.
7. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что композиция, содержащая один или более ингибитор ALS, содержит форамсульфурон.
8. Способ по п.7, где форамсульфурон применяют в концентрации от 10-9 до 10-6 моль/л.
9. Способ по любому из пп.1-6, отличающийся тем, что композиция, содержащая один или более ингибитор ALS, содержит этоксисульфурон.
EA201591130A 2012-12-13 2013-12-13 Способ получения растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам EA031973B1 (ru)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201261736817P 2012-12-13 2012-12-13
EP12196858 2012-12-13
PCT/EP2013/076618 WO2014091021A1 (en) 2012-12-13 2013-12-13 Method to develop herbicide-resistant sugar beet plants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
EA201591130A1 EA201591130A1 (ru) 2015-11-30
EA031973B1 true EA031973B1 (ru) 2019-03-29

Family

ID=47351494

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
EA201591130A EA031973B1 (ru) 2012-12-13 2013-12-13 Способ получения растений сахарной свеклы, устойчивых к гербицидам

Country Status (18)

Country Link
US (1) US10517244B2 (ru)
EP (1) EP2931902B1 (ru)
JP (1) JP6276780B2 (ru)
CN (1) CN105209622B (ru)
CA (1) CA2890489C (ru)
CL (1) CL2015001274A1 (ru)
DK (1) DK2931902T3 (ru)
EA (1) EA031973B1 (ru)
ES (1) ES2684994T3 (ru)
HU (1) HUE039314T2 (ru)
IN (1) IN2015DN06097A (ru)
LT (1) LT2931902T (ru)
MA (1) MA38254A1 (ru)
PL (1) PL2931902T3 (ru)
SI (1) SI2931902T1 (ru)
TN (1) TN2015000173A1 (ru)
UA (1) UA117821C2 (ru)
WO (1) WO2014091021A1 (ru)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2760286C2 (ru) * 2020-04-03 2021-11-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Первомайская селекционно-опытная станция сахарной свеклы" Способ получения константной линии сахарной свеклы, устойчивой к глифосату

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2814591C (en) 2010-10-15 2021-08-31 Kws Saat Ag Als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris mutants
US20170335336A1 (en) * 2014-06-12 2017-11-23 Sesvanderhave N.V. Use of a selectable marker gene in sugar beet protoplasts transformation method and system
WO2015188870A1 (en) * 2014-06-12 2015-12-17 Sesvanderhave N.V. Use of selectable marker gene in sugar beet protoplasts transformation method and system
EP3628738A1 (en) 2018-09-25 2020-04-01 KWS SAAT SE & Co. KGaA Method for controlling weed beets and other weeds
EP3628160A1 (en) 2018-09-25 2020-04-01 KWS SAAT SE & Co. KGaA Use of glyphosate herbicide for controlling unwanted vegetation in beta vulgaris growing areas
EP4415527A1 (en) 2021-10-15 2024-08-21 KWS SAAT SE & Co. KGaA Als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris mutants

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0257993A2 (en) * 1986-08-26 1988-03-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
WO1995010178A1 (en) * 1993-10-14 1995-04-20 Zeneca Limited A method of plant tissue culture and regeneration
WO2012049266A1 (en) * 2010-10-15 2012-04-19 Bayer Cropscience Ag Use of als inhibitor herbicides for control of unwanted vegetation in als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris plants
WO2012049268A1 (en) * 2010-10-15 2012-04-19 Bayer Cropscience Ag Als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris mutants
WO2012150335A1 (en) * 2011-05-04 2012-11-08 Bayer Intellectual Property Gmbh Als inhibitor herbicide tolerant b. napus mutants

Family Cites Families (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3807801A1 (de) * 1988-03-10 1989-09-21 Merck Patent Gmbh Derivate des 2,3-difluorhydrochinons
WO1997002747A1 (en) * 1995-07-11 1997-01-30 Novartis Ag Selective herbicidal composition
WO1998002527A1 (en) 1996-07-17 1998-01-22 Michigan State University Imidazolinone herbicide resistant sugar beet plants
US5859348A (en) * 1996-07-17 1999-01-12 Board Of Trustees Operating Michigan State University Imidazolinone and sulfonyl urea herbicide resistant sugar beet plants
AU2006283504B2 (en) * 2005-08-24 2011-08-25 E. I. Du Pont De Nemours And Company Compositions providing tolerance to multiple herbicides and methods of use thereof
PL2700721T3 (pl) * 2007-10-05 2019-06-28 Cibus Europe B.V. Zmutowane geny kodujące syntazę kwasu acetohydroksylowego w brassica

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0257993A2 (en) * 1986-08-26 1988-03-02 E.I. Du Pont De Nemours And Company Nucleic acid fragment encoding herbicide resistant plant acetolactate synthase
WO1995010178A1 (en) * 1993-10-14 1995-04-20 Zeneca Limited A method of plant tissue culture and regeneration
WO2012049266A1 (en) * 2010-10-15 2012-04-19 Bayer Cropscience Ag Use of als inhibitor herbicides for control of unwanted vegetation in als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris plants
WO2012049268A1 (en) * 2010-10-15 2012-04-19 Bayer Cropscience Ag Als inhibitor herbicide tolerant beta vulgaris mutants
WO2012150335A1 (en) * 2011-05-04 2012-11-08 Bayer Intellectual Property Gmbh Als inhibitor herbicide tolerant b. napus mutants

Non-Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DUGGLEBY R G, SIEW SIEW PANG: "ACETOHYDROXYACID SYNTHASE", JOURNAL OF BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, KOREAN SOCIETY FOR BIOCHEMISTRY AND MOLECULAR BIOLOGY, KR, vol. 33, no. 01, 1 January 2000 (2000-01-01), KR, pages 01 - 36, XP001119823, ISSN: 1225-8687 *
DUGGLEBY, R.G. MCCOURT, J.A. GUDDAT, L.W.: "Structure and mechanism of inhibition of plant acetohydroxyacid synthase", PLANT PHYSIOLOGY AND BIOCHEMISTRY., GAUTHIER-VILLARS, PARIS., FR, vol. 46, no. 3, 14 January 2008 (2008-01-14), FR, pages 309 - 324, XP022550175, ISSN: 0981-9428 *
GUREL EKREM; GUREL SONGUL; LEMAUX PEGGY G: "Biotechnology applications for sugar beet", CRITICAL REVIEWS IN PLANT SCIENCES., CRC PRESS, BOCA RATON, FL., US, vol. 27, no. 2, 1 January 2008 (2008-01-01), US, pages 108 - 140, XP009167608, ISSN: 0735-2689, DOI: 10.1080/07352680802202000 *
HALL R. D., ET AL.: "SUGAR BEET GUARD CELL PROTOPLASTS DEMONSTRATE A REMARKABLE CAPACITYFOR CELL DIVISION ENABLING APPLICATIONS IN STOMATAL PHYSIOLOGY AND MOLECULAR BREEDING.", JOURNAL OF EXPERIMENTAL BOTANY, OXFORD UNIVERSITY PRESS, GB, vol. 48., no. 307., 1 February 1997 (1997-02-01), GB, pages 255 - 263., XP000893145, ISSN: 0022-0957, DOI: 10.1093/jxb/48.2.255 *
HORIKOSHI MAMORU; HIROOKA TAKASHI: "Selection of tobacco cell lines resistant to photobleaching herbicides", JOURNAL OF PESTICIDE SCIENCE - NIPPON NOYAKU GAKKAISHI, NIPPON NOYAKU GAKKAI, TOKYO, JP, vol. 24, no. 1, 1 January 1999 (1999-01-01), JP, pages 13 - 16, XP009167605, ISSN: 0385-1559, DOI: 10.1584/jpestics.24.13 *
JULES JANICK: "Horticultural Reviews", 1 January 1993, JOHN WILEY & SONS, US, ISBN: 978-0-471-57338-8, article DYER W E , HESS F D, HOLT J S AND DUKE S O: "Potential Benefits and Risks of Herbicide-Resistant Crops Produced by Biotechnology", pages: 367 - 408, XP002693215, DOI: 10.1002/9780470650547.ch9 *
REY P; EYMERY F; PELTIER G: "ATRAZINE AND DIURON RESISTANT PLANTS FROM PHOTOAUTOTROPHIC PROTOPLAST-DERIVED CULTURES OF NICOTIANA-PLUMBAGINIFOLIA", PLANT CELL REPORTS, SPRINGER, BERLIN/HEIDELBERG, vol. 9, no. 5, 1 January 1990 (1990-01-01), Berlin/Heidelberg, pages 241 - 244, XP009167607, ISSN: 0721-7714, DOI: 10.1007/BF00232292 *
TAN S, ET AL.: "IMIDAZOLINONE-TOLERANT CROPS: HISTORY, CURRENT STATUS AND FUTURE", PEST MANAGEMENT SCIENCE, WILEY & SONS, BOGNOR REGIS; GB, vol. 61, no. 03, 1 January 2005 (2005-01-01), BOGNOR REGIS; GB, pages 246 - 257, XP009058795, ISSN: 1526-498X, DOI: 10.1002/ps.993 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2760286C2 (ru) * 2020-04-03 2021-11-23 Федеральное государственное бюджетное научное учреждение "Первомайская селекционно-опытная станция сахарной свеклы" Способ получения константной линии сахарной свеклы, устойчивой к глифосату

Also Published As

Publication number Publication date
PL2931902T3 (pl) 2018-11-30
CA2890489A1 (en) 2014-06-19
TN2015000173A1 (en) 2016-10-03
CA2890489C (en) 2022-05-03
IN2015DN06097A (ru) 2015-07-31
CN105209622B (zh) 2018-08-10
EP2931902B1 (en) 2018-08-01
CN105209622A (zh) 2015-12-30
EP2931902A1 (en) 2015-10-21
US10517244B2 (en) 2019-12-31
MA38254A1 (fr) 2018-11-30
ES2684994T3 (es) 2018-10-05
DK2931902T3 (en) 2018-09-03
US20150289464A1 (en) 2015-10-15
CL2015001274A1 (es) 2016-05-13
HUE039314T2 (hu) 2018-12-28
UA117821C2 (uk) 2018-10-10
SI2931902T1 (sl) 2019-04-30
JP6276780B2 (ja) 2018-02-07
WO2014091021A1 (en) 2014-06-19
EA201591130A1 (ru) 2015-11-30
JP2016506245A (ja) 2016-03-03
LT2931902T (lt) 2018-09-10

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6375398B2 (ja) Ａｌｓインヒビター除草剤耐性ベータ・ブルガリス突然変異体
CA2890489C (en) Method to develop herbicide-resistant sugar beet plants
UA114716C2 (uk) Трасгенна рослина сої, стійка до гербіцидів
UA126894C2 (uk) Спосіб і композиція для стійкості рослин до гербіцидів
UA120741C2 (uk) Рослина з мутованою протопорфіриногеноксидазою
SK88599A3 (en) Glyphosate resistant transgenic plants
KR101899619B1 (ko) Aad-1 식물에 관련된 잡초 방제 방법 및 식재-전 및/또는 발아-전 제초제 적용
JP2024516693A (ja) 生物内で新規遺伝子を生成する方法およびその利用
US20210324403A1 (en) Methods and compositions for combinations of mutations associated with herbicide resistance/tolerance in rice
US7332661B2 (en) Natural herbicide resistance in wheat
US20230203523A1 (en) Hppd inhibitor herbicide tolerant plant
US20090275473A1 (en) Chemical selection of resistant gametes of plants in the field
TR201812130T4 (tr) Herbisitlere karşı dirençli şeker pancarı bitkilerini geliştirmek için yöntem.
CN117925555A (zh) 一种植物抗除草剂的epsps突变型蛋白及其应用
Dillon Relationship between EPSPS copy number, expression, and level of resistance to glyphosate in common waterhemp (Amaranthus rudis) from Kansas

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Lapse of a eurasian patent due to non-payment of renewal fees within the time limit in the following designated state(s)

Designated state(s): AM AZ KZ KG TJ TM