CN105209622B - 生产除草剂-抗性甜菜植物的方法 - Google Patents

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Abstract

一种生产除草剂‑抗性甜菜植物的方法，包括以下步骤：‑从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞中获得原生质体；‑向该细胞施加组合物，该组合物含有以下浓度的ALS除草剂，该浓度对于所述细胞是致死的；以及‑从存活细胞再生甜菜植物。

Description

生产除草剂-抗性甜菜植物的方法
技术领域
本发明涉及一种生产对除草剂(例如乙酰羟酸合成酶(ALS，acetohydroxyacidsynthase enzyme)的抑制剂)有抗性的甜菜(糖用甜菜，sugar beet)植物的方法。
本发明进一步涉及通过该方法获得的植物。
背景技术
甜菜在温带和亚热带地区是一种重要的农业作物。
在现代农业中，除草剂被广泛地用于管理杂草增殖。
通过使用转基因方法可以进行对一种或多种除草剂(如ALS抑制剂)有抗性的甜菜植物的生产(开发，develop)。
实际上，在各种大田作物中，包括在甜菜中，已经成功地完成了外源DNA的引入，该外源DNA携带赋予对除草剂的抗性的基因。
WO95/10178公开了一种转基因诱导的对除草剂双丙氨膦(bialaphos)的抗性。在甜菜的保卫细胞原生质体中引入编码该抗性的基因，随后将这些原生质体再生为甜菜植物。那些植物进一步对化学草胺膦和其衍生物草铵膦有抗性。
未转化植物无法获取对双丙氨膦的抗性。
最佳地，83000原生质体再生成28个转化的愈伤组织(calli)；最差地，190000原生质体再生成1个愈伤组织。随后，这些愈伤组织中的一些可以示出体细胞胚胎发生(体胚发生，somatic embryogenesis)并且可以再生成甜菜苗，具有1％的效率，而发现非常有利的特征是高达30％。
然而这种方法在本领域中并不常用，该方法广泛依赖于外植体的愈伤组织的更直接转化，该外植体获得自甜菜器官(如胚(胚芽，embryo))和/或叶盘。
对于开发抗除草剂植物(如在甜菜作物中)依然存在重要的需要，并且其不依赖于DNA载体和/或外源基因的插入。
另一方面，通过经典育种，利用将含有天然存在的抗性基因的甜菜植物在理论上可以进行对一种或多种除草剂(如ALS抑制剂)有抗性的甜菜植物的开发。然而，这样的方法是费时的，并且就申请人掌握的知识，该方法没有导致成功，尽管事实上至少对于除了甜菜以外的物种(包括各种杂草物种)，记载了天然存在的ALS抑制剂-抗性植物。特别地，双重突变体(即，在相同的ALS基因中具有两个突变的植物)在自然界非常不可能产生。
专利申请WO98/02527公开了一种制备对一些ALS抑制剂(如磺酰脲除草剂)有抗性的甜菜植物的方法，该方法包括以下步骤：将从甜菜(B.vulgaris)的外植体中获得的愈伤组织暴露于磺酰脲，并且从少数的自发突变体再生植物，该突变体可以在这种除草剂存在下生长。
这种方法产生在ALS基因中具有突变的植物，其中，编码的ALS酶的位置188(对应于拟南芥(Arabidopsis thaliana)ALS酶的197位置)处的脯氨酸由丝氨酸取代(代替)。然而，这种突变不是商业上使用的，因为利用优选的现代磺酰脲ALS除草剂(例如，甲酰胺磺隆)的处理在田间试验中以必需剂量率表现出一些植物毒性。
专利申请WO2012/049268依赖于相同方法，不同之处在于从甜菜(B.vulgaris)的外植体获得的愈伤组织暴露于甲酰胺磺隆，并因此导致甜菜植物对几种ALS抑制剂(包括对甲酰胺磺隆)有抗性。
这种方法产生在ALS基因中具有突变的植物，其中，编码的ALS酶的位置569(对应于拟南芥(Arabidopsis thaliana)ALS酶的574位置)处的色氨酸由亮氨酸取代。
这种纯合子569/569突变体的田间试验示出了对甲酰胺磺隆、对碘甲磺隆(另一种ALS抑制剂)、以及对不同ALS抑制剂的混合物表现出良好的抗性。
这两种公开的方法受益于从单个外植体(如胚(embryo))中分离愈伤组织的广为接受的步骤。然而，这是一种耗时的方法，其涉及(i)分离大量新鲜胚，(ii)将它们重复的培养在琼脂凝固培养基上，以及(iii)使用形态选择方法选择可再生的愈伤组织。
转移遗传性状至甜菜的其它策略已经得到发展并依靠叶肉原生质体(其不同于气孔保卫细胞原生质体)作为起始材料(Krens et al.,1990,Theor.appl.Genet.,vol 79,390-396)。
Gurel et al.2008,Critical reviews in Plant Science,27,108-140，公开了甜菜的生物技术应用。公开了7种不同的体外培养技术。其中有原生质体的培养，其或者来自于气孔保卫细胞(用于转化目的)、或者来自于黄化下胚轴外植体的易碎愈伤组织(松散愈伤组织)，后者显著地更为有效。然而，使用原生质体的这种方法与主要的难点相关联。
Hall et al.1997,J.Exp.Botany,48,255-263已经使用500000气孔保卫细胞原生质体的培养物，用于利用外源DNA进行转化实验。转化效率高于2％。另一方面，植物的体外培养被报道与气孔故障(stomatal failure)相关，指出相应细胞的问题，从而产生很高量(如进行涉及突变事件的方法所需要的量)的气孔保卫细胞原生质体。
发明内容
在广义方面，本发明公开了一种生产对除草剂有抗性的突变甜菜植物的方法，包括以下步骤：
-从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞(stomatal guard cells)中获得原生质体(protoplast)；
-向这些原生质体的体外培养物施加组合物，该组合物包含以下浓度的这种除草剂，该浓度对于大于99％的体外培养细胞是致死的；以及
-从这些体外培养细胞中的存活细胞(surviving cells)再生甜菜植物，
-可能地选择在编码肽的基因中具有突变的再生甜菜植物，该肽由这种除草剂靶向，
其中，这些气孔保卫细胞原生质体针对它们再生为甜菜植物的能力加以预先选择，并且其中，向大于20000000的这些原生质体施加这种除草剂。
在本发明方法中使用的除草剂可以是不靶向ALS基因的除草剂。
优选的除草剂(不靶向ALS)选自由以下各项组成的组：
-4-HPPD抑制剂(如甲基磺草酮、异噁唑草酮、磺酰吡唑醇、双环磺草酮、吡草酮、吡唑特、苄草唑、环磺酮、苯唑草酮、磺草酮和sulcotrion)，类胡萝卜素生物合成抑制剂(如呋草酮、氟啶草酮、氟咯草酮、氟丁酰草胺、氟草敏、氟吡酰草胺和吡氟草胺)；
-EPSP合酶抑制剂(如草甘膦或草甘膦三甲基硫盐)；
-光合体系(磷酸系统，phosphosystem)II抑制剂(如苯基-氨基甲酸酯类(Phenyl-carbamate)(例如甜菜宁(杀敌草，phenmedipham)或甜菜安(desmedipham))、哒嗪酮类(例如氯草敏(chloridazon)＝杀草敏)、三嗪类(例如草净津(cyanazine)、草达津(remtal)、甘草津(eglinazine-ethyl)、丙胺津(proglinazine-ethyl)、莠灭净(ametryn)、莠去津(atrazine)、敌草净(atrazine)、异戊乙净(dimethametryn)、扑灭通(prometon)、扑草净(prometryn)、扑灭津(propazine)、西玛津(simazine)、西草净(simetryn)、甲氧去草净(terbumeton)、特丁津(terbuthylazine)、去草净(terbutryn)、methoprotyn)、三嗪酮类(Triazinones)(例如苯嗪草酮(metamitron)、嗪草酮(metribuzin)、环嗪酮(hexazinone)、嗪草酮)、脲嘧啶类(除草定(bromacil)、环草定、特草定)、脲类(噁唑隆(dimefuron)、异丙隆、利谷隆(linuron)、绿谷隆(monolinuron)、磺噻隆(ethidimuron)、甲基苯噻隆、丁唑隆(tebuthiuron)、敌草隆(diuron)、非草隆(fenuron)、草不隆(neburon)、环草隆(siduron)、异隆(isouron)、氯溴隆、绿麦隆(chlorotoluron)、枯草隆(chloroxuron)、伏草隆(fluometuron)、秀谷隆(metobromuron)、甲氧隆(metoxuron)、噻氟隆(thiazafluron)、灭草隆(monuron)、环莠隆(cycluron)、绿谷隆(monolinuron))、或氨唑草酮(amicarbazone)、蔬草灭(solan)、敌稗(propanil)、灭草松(bentazon)、溴苯腈(bromoxynil)、碘苯腈(ioxynil)、杀草全(bromofenoxim)、哒草特(pyridate)、氯苯哒醇(pyridafol)；
-光合体系(磷酸系统，phosphosystem)I抑制剂(如敌草快(diquat)或百草枯(paraqua))；
-细胞分裂抑制剂(如草长灭(carbetamide)、氯苯胺灵(chlorpropham)、苯胺灵(propham)、萘丙胺(naproanilide)、草乃敌(diphenamid)、敌草胺(napropamide)、丁烯草胺(butenachlor)、吡唑草胺(metazachlor)、乙酰甲草胺(diethatyl-ethyl)、乙草胺(acetochlor)、甲草胺(alachlor)、丁草胺(butachlor)、毒草胺(Monsanto)、异丙草胺(propisochlor)、二甲草胺(dimethachlor)、二甲吩草胺(dimethenamid)、异丙甲草胺(metolachlor)、丙草胺(metolachlor)、S-异丙甲草胺、烯草胺(pethoxamid)、噻吩草胺(thenylchlor)、莎稗磷(anilofos)、唑草胺(cafenstrole)、茚草酮(indanofan)、溴丁酰草胺(bromobutide)、哌草磷(piperophos)、氟噻草胺(flufenacet)、苯噻草胺(mefenacet)、四唑酰草胺(fentrazamide))；
-微管组装抑制剂(如炔苯酰草胺(propyzamide)＝拿草特(pronamide)、牧草胺(tebutam)、敌草索(chlorthal-dimethyl)＝DCPA、氟消草(fluchloralin)、胺硝草(pendimethalin)、地乐胺(butralin)、氟草胺(benefin)＝氟草胺(benfluralin)、乙丁烯氟灵(ethalfluralin)、氨磺乐灵(oryzalin)、氟乐灵(trifluralin)、氨氟乐灵(prodiamine)、敌乐胺(dinitramine)、草胺磷(butamifos)、氟硫草定(dithiopyr)、噻草定(thiazopyr))；
-原卟啉原氧化酶抑制剂(如二苯醚类(三氟酸草醚钠(trifluralin)、甲羧除草醚(bifenox)、氯氟草醚(ethoxyfen-ethyl)、草枯醚(chlornitrofen)、乙羧氟草醚(fluoroglycofen-ethyl)、乙氧氟草醚(oxyfluorfen)、氯硝醚(chlomethoxyfen)、三氟硝草醚(fluordifen)、氟黄胺草醚(fomesafen)、乳氟禾草灵(lactofen)、除草醚(nitrofen)、苯草醚(aclonifen))、N-苯基酞酰亚胺类(N-phenylphthalimides)(吲哚酮草酯(cinidon-ethyl)、氟烯草酸(flumiclorac-pentyl)、丙炔氟草胺(flumioxazin)、氟烯草酸(flumiclorac-pentyl))、噁二唑类(丙炔恶草酮(oxadiargyl)、恶草酮(oxadiazon))、噁唑烷二酮类(环戊噁草酮(pentoxazone))、苯吡唑类(异丙吡草酯(fluazolate)、异丙吡草酯、氟唑草酯(pyraflufen-ethyl))、嘧啶二酮类(苯嘧磺草胺(saflufenacil)、双苯嘧草酮(benzfendizone)、氟丙嘧草酯(butafenacil))、噻二唑类(噻二唑胺(thidiazimin)、氟噻甲草酯(fluthiacet-methyl))、三唑啉酮类(唑啶草酮(azafenidin)、唑酮草酯磺酰唑草酮(carfentrazone-ethyl sulfentrazone))、双唑草腈(pyraclonil)、氟唑草胺(profluazol)、氟哒嗪草酯(flufenpyr-ethyl))；
-乙酰辅酶A羧化酶抑制剂(如芳氧基苯氧基丙酸酯类(Aryloxyphenoxypropionates)(如炔草酯(clodinafop-propargyl)、氰氟草酯(cyhalofop-butyl)、禾草灵(diclofop-methyl)、精噁唑禾草灵(fenoxaprop-P-ethyl)、精吡氟禾草灵(fluazifop-P-butyl)、吡氟甲禾灵(haloxyfop-etotyl)、氟吡甲禾灵(haloxyfop-methyl)、精氟吡甲禾灵(haloxyfop-P-methyl)、喔草酯(propaquizafop)、精喹禾灵(quizalofop-P-ethyl)或糖草酯(quizalofop-P-tefuryl)、环己烯酮类(Cyclohexanediones)(如禾草灭(alloxydim)、丁苯草酮(butroxydim)、烯草酮(clethodim)、噻草酮(cycloxydim)、环苯草酮(profoxydim)、稀禾定(sethoxydim)、吡喃草酮(tepraloxydim)或三甲苯草酮(tralkoxydim))或苯基吡唑啉(唑啉草酯(pinoxaden)))；
-细胞壁合成抑制剂(如茚嗪氟草胺(indaziflam)、异酰草胺(isoxaben)、草克乐(chlorthiamid)、敌草腈(dichlobenil)、二氯喹啉酸(quinclorac)或氟胺草唑(flupoxam))；
-谷氨酰胺合酶抑制剂(草铵膦(glufosinate-ammonium)或双丙氨膦(bialaphos)＝双丙氨膦(bilanaphos))和
-合成生长素(如TBA、麦草畏(dicamba)、草灭平(chloramben)、草除灵乙酯(benazolin-ethyl)4、高2,4-滴丙酸(dichlorprop-P)、高2甲4氯丙酸(mecoprop-P)、2,4,5-T(Weedar)2,4-D(Weedar)、2,4-DB(Butyrol)、2,4-滴丙酸(dichlorprop)、MCPB、2甲4氯丙酸(mecoprop)、2甲4氯乙硫酯(MCPA-thioethyl)、氯甲酰草胺(clomeprop)、二甲四氯4(Agroxone4)、氯氨吡啶酸(aminopyralid)、二氯吡啶酸(clopyralid)、氯氟吡氧乙酸(fluroxypyr)、氟氯吡啶酯(halauxifen-methyl)、氨氯吡啶酸(picloram)、三氯吡氧乙酸(triclopyr)、二氯喹啉酸(quinclorac)或喹草酸(quinmerac))，
更优选地，由以下组成的组：4-HPPD抑制剂、类胡萝卜素生物合成抑制剂、EPSP合酶抑制剂、光合体系II抑制剂、光合体系I抑制剂、微管组装抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂和合成生长素。
另一种非常优选的除草剂是ALS抑制剂。
因此，本发明涉及一种生产对乙酰羟酸合成酶(ALS)的一种或多种抑制剂有抗性的突变甜菜植物的方法，包括以下步骤：
-从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞中获得原生质体；
-向所述原生质体的体外培养物施加组合物，该组合物包含一种或多种以下浓度的ALS抑制剂，该浓度对于(大于99％(优选大于99.9％或甚至大于99.99％)的)体外培养细胞是致死的(仍允许一些突变体逃逸)；以及
-从所述体外培养细胞中的存活细胞再生甜菜植物，
其中，所述气孔保卫细胞原生质体针对它们再生为甜菜植物的能力加以预先选择和/或其中，将所述一种或多种ALS抑制剂施加于大于2000000(优选地，大于10000000，更优选地大于20000000或甚至大于50000000)的所述原生质体。
优选地，这种方法包括以下子步骤：分离来自于不同基因型的甜菜植物的气孔保卫细胞原生质体并且针对每种基因型测量当所述原生质体投入培养时进行生长的所述原生质体的比例。
优选地，这种方法进一步包括以下步骤：测序来自于存活的体外培养细胞的再生植物的基因组，有利地用于识别ALS基因中的突变和/或用于选择再生的甜菜植物，该甜菜植物在ALS基因中具有一个或多个，优选一个、两个、或更多突变。
有利地，通过本发明的方法获得和/或选择甜菜，该甜菜在ALS基因中编码氨基酸的位置处具有一个或多个突变，该氨基酸选自由以下各项组成的组：甘氨酸112、丙氨酸113、甲硫氨酸115、精氨酸133、缬氨酸187、精氨酸190、丙氨酸196、苯丙氨酸197、赖氨酸247、甲硫氨酸346、组氨酸347、精氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸371、精氨酸372、甲硫氨酸565、缬氨酸566、苯丙氨酸573、丝氨酸648和甘氨酸649，优选地选自由以下各项组成的组：丙氨酸196、天冬氨酸371、精氨酸372、丝氨酸648和甘氨酸649。通过本发明的方法获得和/或选择另一种优选的甜菜植物，该甜菜植物在位置188处具有脯氨酸的突变并且在位置569处具有色氨酸的突变。
优选地，具有两个或更多突变的甜菜在一个等位基因中具有两个突变，这意味着编码的肽具有协同加强对ALS抑制剂(尤其对于包含几种ALS抑制剂的组合物)的抗性的两种突变。最优选的甜菜的实例是在一个等位基因中在位置188处具有脯氨酸的突变并且在位置569处具有色氨酸的突变(以及可能地在第二等位基因中相同的突变；可替代地，第二等位基因含有不同突变)的甜菜。
可替代地，具有两个突变的甜菜在每一等位基因上具有一个突变。
本发明的方法允许再生甜菜植物，该甜菜植物在ALS基因中编码脯氨酸188的位置处具有一个突变并且在ALS基因中编码甘氨酸112、丙氨酸113、甲硫氨酸115、精氨酸133、缬氨酸187、精氨酸190、丙氨酸196、苯丙氨酸197、赖氨酸247、甲硫氨酸346、组氨酸347、精氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸371、精氨酸372、甲硫氨酸565、缬氨酸566、色氨酸569(优选地突变为甘氨酸)、苯丙氨酸573、丝氨酸648和甘氨酸649的位置处具有一个或多个突变。优选的甜菜的实例是在位置188处具有脯氨酸的突变并且在相同的等位基因中具有另一突变(可能不是色氨酸569或Trp569Gly)的甜菜。
本发明的方法允许再生甜菜植物，该甜菜植物在ALS基因中编码色氨酸569(优选地突变为亮氨酸)位置处具有一个突变并且在ALS基因中编码甘氨酸112、丙氨酸113、甲硫氨酸115、精氨酸133、缬氨酸187、脯氨酸188(优选地突变为苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸)、精氨酸190、丙氨酸196、苯丙氨酸197、赖氨酸247、甲硫氨酸346、组氨酸347、精氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸371、精氨酸372、甲硫氨酸565、缬氨酸566、苯丙氨酸573、丝氨酸648和甘氨酸649的位置处具有一个或多个突变。优选的甜菜的实例是在位置569处具有色氨酸的突变并且在相同的等位基因中具有另一突变(可能不是脯氨酸188或Pro188Ser)的甜菜。
本发明的方法允许再生甜菜植物，该甜菜植物在ALS基因中具有一个或多个突变，其中，所述一个或多个突变选自由以下各项组成的组：丙氨酸113脯氨酸188、丙氨酸196、天冬氨酸371、精氨酸372、色氨酸569、丝氨酸648和甘氨酸649，其中，所述丙氨酸113突变为缬氨酸或苏氨酸，其中，所述脯氨酸188突变为苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸，其中，所述丙氨酸196突变为缬氨酸，其中，所述天冬氨酸371突变为谷氨酸，其中，所述精氨酸372突变为组氨酸，其中，所述色氨酸569突变为甘氨酸，其中，所述丝氨酸648突变为苏氨酸并且其中，所述甘氨酸649突变为天冬氨酸。
优选地，具有两个或更多个这些特定突变的甜菜在一个等位基因中具有两个突变，这意味着编码的肽包含两种协同加强对ALS抑制剂(尤其对于包含几种ALS抑制剂的组合物)的抗性的突变。
本发明的方法允许再生甜菜植物，该甜菜植物在ALS基因中编码脯氨酸188的位置处具有一个突变和在ALS基因中编码色氨酸569的位置处具有一个突变。
有利地，这种方法包括以下预备步骤：推导一种或多种ALS抑制剂的浓度，在该浓度下，组合物(包含一种或多种ALS抑制剂)对于至少99％(优选地至少99.9％或甚至99.99％)的体外培养细胞是致死的(仍允许一些突变体逃逸)。
存在于待添加至体外培养的气孔保卫细胞原生质体的组合物(所述组合物另外包含另一种ALS抑制剂，该ALS抑制剂优选来自不同于磺酰脲ALS抑制剂的另一类，如噻酮磺隆(thiencarbazone-methyl))中的优选的ALS抑制剂是甲酰胺磺隆，优选地10-9mol/l至(更优选地)10-6mol/l的浓度。
存在于待添加至体外培养的气孔保卫细胞原生质体的组合物中的另一种合适的ALS抑制剂是乙氧嘧磺隆(可能这种组合物进一步包含其它ALS抑制剂)。
本发明的一个相关方面是通过本发明方法可获得的突变甜菜植物，如在色氨酸569和/或在脯氨酸188处具有突变的甜菜。
本发明的另一相关方面是包含SEQ.ID.NO:3(或SEQ.ID.NO:4)和/或SEQ.ID.NO:5(或SEQ.ID.NO:6)的突变甜菜植物。
根据本发明优选的甜菜植物对应于NCIMB42050或NCIMB42051的保藏。
本发明还涉及源自本发明的突变植物的组织或植物部分(例如气孔保卫细胞或叶带)或种子，以及它们引入另一种遗传性状的应用。
本发明还涉及在本发明中开发的(良好再生)气孔保卫细胞原生质体用于引入对ALS抑制剂更有抗性的另一种遗传性状的应用。
具体实施方式
本发明人已经发现，来自于甜菜气孔保卫细胞的原生质体代表用于诱导对除草剂(如ALS抑制剂)的抗性的良好起始材料，尽管事实上来自于气孔保卫细胞原生质体的甜菜植物的再生是非常困难的，具有较低的发生率，并且比从外植体获得的愈伤组织直接再生(如在本领域中通常使用的)需要更长和更复杂的操作程序。
实际上，来自于外植体的一个或多个愈伤组织是未分化的(或去分化的)细胞团，该细胞团在合适的培养条件下将分化(或再分化)并再生为全功能的甜菜植物。在这样的方法中，大量收集种子，随后容易地灭菌该种子并因此获得大量的外植体。这样的方法是方便的，因为允许进行大部分工作，没有无菌环境的困难。
另一方面，气孔保卫细胞具有在植物中良好限定的组织，并且它们从植物组织的分离产生单独的一个或多个细胞，随后在处理后成为单独的原生质体。
在本发明的方法中，苗(小植物，plantlets)必须在体外生长并且维持在无菌条件下，随后从这些小苗中分离气孔保卫细胞并在保持无菌条件的同时获得原生质体，随后诱导这些单独的原生质体再次产生它们的细胞壁，首先生长成微型愈伤组织，随后成为甜菜植物。
发现甜菜的气孔保卫细胞原生质体非常容易损坏，减少了它们应用的范围：例如在许多情况下，发现添加诱变剂(mutagen)(而不是促成希望的遗传性状的出现)对于原生质体是致死的。
换句话说，成功地使用气孔保卫细胞原生质体作为起始材料用于开发甜菜植物(其通过突变获得希望的遗传性状)，这是完全出乎意料的。
此外，本发明人已经发现气孔保卫细胞原生质体分裂能力非常取决于甜菜基因型：大部分基因型的气孔保卫细胞原生质体表现出非常低(几乎为零)的分裂(生长)能力，而一些特定基因型的原生质体则具有相当大的体外生长的能力。
本发明人已经确认在固体培养基(含聚合物的培养基，如，含藻酸盐或琼脂糖类的培养基)上培养非常大量的这些气孔保卫细胞原生质体，随后将培养的材料(通常以再生愈伤组织的形式)暴露于除草剂(如ALS抑制剂)导致选择出一些对这种除草剂分子有抗性的突变细胞，尽管事实上，在不存在添加的诱变剂的情况下，(人们)知道自发的突变是非常罕见的，并且该方法在选择已经存在的突变植物(其表现出对一种或多种ALS抑制剂希望的抗性)中，无法获益于群体内的遗传多样性。
这些突变细胞(其对于除草剂(如ALS抑制)已获得抗性)中的一些能够进一步再生成存活的一个或多个甜菜植物。虽然原生质体非常难以在实际中使用，但是本发明的方法中非常迅速地产生稳定的突变体(其对于除草剂已获得抗性)。
本发明的方法允许具有一个或多个突变的除草剂-抗性(ALS抑制剂-抗性)甜菜植物的生产，该突变包括在作为除草剂(例如ALS抑制剂)的靶标的酶中的一个或多个突变(如ALS基因的突变，其中，ALS基因编码在ALS蛋白位置569(对应于拟南芥ALS的位置574)处含有与色氨酸不同的氨基酸的ALS蛋白)，可能除此之外在该基因中具有至少另一种突变和/或在其它基因中具有其它突变。
本发明的一个方面因此是一种生产对一种或多种ALS抑制剂有抗性的甜菜植物(甜菜(Beta vulgaris)；因此也(被称为)野生甜菜(Beta vulgaris maritima ssp))的方法，包括以下步骤：
-获取分离自(对ALS抑制剂敏感的)甜菜植物的(来自)气孔保卫细胞(的原生质体)。
-向这些体外培养细胞施加组合物，该组合物包含一种或多种以下浓度的ALS抑制剂，该浓度对于这些体外培养细胞是致死的(至少99％的(野生型)细胞由ALS抑制剂杀死，但一些突变体可以躲避该处理)；以及
从存活细胞再生甜菜植物。
该方法可以被看作转基因引入(例如在WO 95/10178中公开)的替换方式。然而，通过与转基因方法比较，基于一个或多个内源基因的突变的方法是更费力的。实际上，转基因(突变)基因的引入是显著更快速、灵活和可预测的。
缺乏转基因诱导的抗性是指(以下)事实，获得的对ALS抑制剂的抗性不是由(外源)DNA体外插入至气孔保卫细胞原生质体(或至其获得的细胞)直接引起的，如(外源)DNA编码的蛋白质直接提供对ALS抑制剂的抗性，如蛋白质局部地降低了ALS抑制剂的毒性(例如，降解ALS抑制剂或降低其细胞内浓度的酶)，或ALS蛋白对ALS抑制剂有抗性，如ALS突变酶即使在抑制剂存在下保留显著活性和功能性。
然而，通过本发明的方法获得的植物可以进一步与转基因植物杂交以在子代中堆叠(累积)另一遗传性状。通过本发明获得的植物(或其部分)还可以进一步用于随后的转基因方法以引入另一遗传性状(不同于在本发明的方法中获得的遗传性状)。
可能地，该方法进一步包括以下步骤：向分离的气孔保卫细胞原生质体的培养物中添加诱变剂。
合适的诱变剂是物理(如UV或X-射线)暴露或暴露于化学制剂(如甲磺酸乙酯(EMS)，例如在0.05％、0.1％、0.15％、0.2％处或甚至在2.5％处)。然而，通过一些通常进行的诱变处理(如大于0.2％EMS的处理)显示原生质体存活能力受到不利地影响。
可替代地，这种方法因此并不包括添加诱变剂的步骤。
在本发明的背景下，除草剂优选地是指任何分子，当它以指定的剂量施加时，它是用于杂草对照(weed control)。
在本发明的方法(用于开发对除草剂有抗性的甜菜植物)中使用的优选的除草剂对于一种肽具有特定的已知活性(以使在相应基因中的单个突变对于这种除草剂可以赋予抗性)。换句话说，优选的除草剂对于一种肽靶标是特异性的(通常特异性地抑制一种植物酶的活性)和/或它们的靶标肽是已知的(以使它可用于对靶标基因中的突变筛选抗性甜菜)。
在本发明的背景下，ALS抑制剂是指任何抑制ALS基因功能的分子。
优选地，在本发明中使用的ALS抑制剂(基本上)不抑制其它不同于ALS的(甜菜)酶。
有利地，在本发明中在以下浓度下选择和使用ALS抑制剂，在该浓度下，抑制了大于90％(大于95％、大于99％，大于99.9％)的野生型ALS酶的功能，但基本上不影响非相关酶的功能。
适合的(用于实施本方法的)ALS抑制剂选自由以下各项组成的组：磺酰脲除草剂、磺酰胺羰基三唑啉酮除草剂、咪唑啉酮除草剂、三唑并嘧啶除草剂和嘧啶基(硫代)苯甲酸酯除草剂。有利地，除草剂组合物包含至少一种磺酰脲除草剂和至少一种三唑并嘧啶。
优选的(用于实施本方法的)ALS抑制剂是甲酰胺磺隆、酰嘧磺隆、噻酮磺隆、乙氧嘧磺隆和它们的混合物(尤其是一种包含噻酮磺隆和甲酰胺磺隆或酰嘧磺隆的组合物)；然而，再生甜菜突变体有利地对几种ALS抑制剂具有抗性。
可以使用其它ALS抑制剂(包括ALS抑制剂的混合物)，并且本领域技术人员知道哪个突变对给定的ALS抑制剂(例如，已知在位置569处的色氨酸突变与甲酰胺磺隆抗性相关)提供强的抗性；因此，考虑到本方法的灵活性和功效，本领域技术人员可以设计具有获得的几种突变的甜菜植物并且因此对于除草剂如ALS抑制剂(例如ALS抑制剂的混合物)具有更广泛的抗性。
更优选地，这种方法包括以下预备步骤：针对气孔保卫细胞原生质体再生为完全功能的甜菜植物的能力选择甜菜植物基因型(系)，和/或在分离自良好-再生甜菜基因型(系)的气孔保卫细胞原生质体上进行本发明的方法。
合适的预备步骤(针对它们的气孔保卫细胞原生质体再生为甜菜植物的能力，选择甜菜植物基因型)包括针对它们的气孔保卫细胞原生质体再生成甜菜植物的能力(显著更加优选地它们在体外生长和/或形成愈伤组织的能力)，比较(独立于它们的可能的有利特征，如产量或对寄生虫感染有抗性)至少10种不同的甜菜植物基因型(来自于不同基因型背景)，优选地至少15种不同的基因型，或甚至至少30种不同基因型，并且选择一种良好-再生基因型(系)用于实施本发明的方法。
在本发明的背景下，良好-再生气孔保卫细胞原生质体是指具有大于0.25％(生长的原生质体的数：投入培养的总原生质体数；生长：总数)概率的原生质体，优选地大于1％(生长：总数)，更优选地大于5％(生长：总数)，仍更优选大于10％(生长：总数)或甚至大于20％(生长：总数)或50％(生长：总数)分裂和/或生长和/或再生成存活的甜菜愈伤组织(当在合适的培养介质中并且没有外源选择压力(如，在本发明的方法中将要施加的毒性分子/除草剂)下生长时)。
一个或多个愈伤组织是指未分化的细胞团。在本领域中，愈伤组织可以获得自外植体(如胚)、或来自于叶或子叶的实质来源的外植体。然而，在本发明的背景下，愈伤组织是(良好-再生)的气孔保卫细胞原生质体生长的结果。
有利地，通过这些良好-再生原生质体获得的愈伤组织具有大于10％(产生芽的愈伤组织数：总愈伤组织数；芽：总数)，优选地大于20％(芽：总数)或者甚至大于30％(芽：总数)的发芽的能力。
优选地，良好-再生甜菜气孔保卫细胞原生质体是指具有大于0.1％(甜菜植物：总原生质体数)(更优选大于1％)的再生为存活的甜菜植物的能力的原生质体。
同样优选地，在该方法中，向大于2000000的这些(良好-再生)甜菜气孔保卫细胞原生质体的体外培养物施加包含除草剂(例如，一种或多种ALS抑制剂)的组合物。
可替代地，或者更优选地除了预选步骤之外，向大于5000000，或甚至大于10000000、20000000、或50000000的这些(良好-再生)甜菜气孔保卫细胞原生质体体外培养物施加包含除草剂(例如，一种或多种ALS抑制剂)的组合物。
优选地，使每毫升至少50000，如约100000，(良好-再生)气孔保卫细胞原生质体在含聚合物的培养基(如含藻酸盐或含琼脂糖的培养基)上生长。
可能地，在施加包含除草剂(例如，一种或多种ALS抑制剂，如甲酰胺磺隆和可能地噻酮磺隆)的组合物之前，使这些，(良好-再生)甜菜气孔保卫细胞原生质体在含聚合物(藻酸盐)的培养基上生长至少约一周(优选地约3周和/或少于4周)。
优选地，这种方法进一步包括以下步骤：在培养基上比较突变气孔保卫细胞的生长和野生型气孔保卫细胞(和/或天然的和/或还没有用除草剂-处理的)的生长，该培养基不包括ALS抑制剂，并且可能地选择保持相应野生型细胞至少75％的生长，优选地，至少90％的生长的突变体。
优选地，或另外地，这种方法进一步包括以下步骤：在温室试验中和在没有任何ALS抑制剂的农业条件下，比较来自于突变细胞的再生甜菜的生长和/或产量和野生型(和/或天然的和/或还没有通过除草剂-处理的)甜菜的生长和/或产量，并且可能地选择保持野生型甜菜至少75％的生长和/或产量，优选地至少90％的生长和/或产量的ALS抑制剂-抗性突变甜菜植物。
优选地，该方法进一步包括以下步骤：测序来自于存活的原生质体的再生植物和/或识别(可能)与除草剂(例如，一种或多种ALS抑制剂)的抗性相关的一个或多个突变。
在本发明的背景下，术语“突变”优选地是指在编码由除草剂靶向的肽(例如ALS蛋白)的核苷酸序列中的一个(单一)变化，其引起相应的氨基酸中的一个变化，使得作为结果的植物已经获得对除草剂(如ALS抑制剂)的一些抗性。
换句话说，在本发明的背景下，“突变”优选地被理解为等同于“点突变”，该“点突变”允许对除草剂(ALS抑制剂)的一些抗性。
因此，在本发明中，“几个突变”优选地是指(一堆)多点突变，每个点突变导致编码的氨基酸的变化以提供对除草剂(例如，ALS抑制剂和/或不是ALS抑制剂的除草剂)的一些抗性。
因此，优选地，在本发明的背景下，“突变”不包括在核苷酸序列中不更改编码蛋白质的变化(如在编码三联体的第三个氨基酸的变化)，在与除草剂(如ALS抑制剂)抗性无关的氨基酸的变化，或在核苷酸序列中的多个同时变化。
有利地，对(一种或多种)ALS抑制剂抗性相关的突变(优选地，在ALS基因中的一种或两种突变)的识别步骤与横跨这种突变的寡核苷酸引物的开发相关联。
有利地，在ALS基因中的突变的识别步骤之后是由野生型和由突变ALS基因编码的蛋白质的(体外)酶活性测量。
优选地，在一种或多种ALS抑制剂存在下，进行野生型ALS酶和突变ALS酶的这些酶测量(在一个或多个浓度处以便导出抑制曲线)。
可能地，在缺乏ALS抑制剂的情况下，(进一步)进行野生型酶和突变酶的这些酶测量(以比较突变酶的酶活性；优选地，在缺乏ALS抑制剂的情况下，突变酶保持至少50％，更优选地至少75％，仍更优选至少90％、至少95％或甚至至少99％的野生型酶的活性)。
优选地，本发明的方法包括以下步骤：比较包含一种或多种ALS抑制剂(在不同浓度下)的组合物，并推导了以下浓度，在该浓度下，ALS抑制剂，和/或在这种组合物内以专门配方的ALS抑制剂对于分离自甜菜植物的气孔保卫细胞原生质体的体外培养物(如，在藻酸盐上生长至少一周的气孔保卫细胞原生质体)是致死的。
例如，在分离自野生型(和/或天然的和/或还没有通过ALS抑制剂处理的)甜菜植物的气孔保卫细胞原生质体体外培养物上进行推导浓度(在该浓度下，(一种或多种)ALS抑制剂对于分离自甜菜植物的气孔保卫细胞原生质体是致死的)的这种步骤。
在本发明的背景下，包含(一种或多种)ALS抑制剂的组合物的致死浓度是指足以杀死至少99％，优选地至少99.9％，更优选地至少99.99％的培养细胞(仍允许一些突变逃脱这种处理)的浓度。
可替代地，或另外地，在突变气孔保卫细胞的体外培养物上(在已经获取ALS基因中的突变并且对ALS抑制剂有抗性的细胞上)，(进一步)进行推导浓度(在该浓度下，(一种或多种)ALS抑制剂对于分离自甜菜植物的气孔保卫细胞原生质体的体外培养物是致死的)的这种步骤。
天然的(细胞)上和突变细胞上的ALS抑制剂(在包含这种ALS抑制剂的组合物中)致死浓度的比较有利地表示为比率(或作为几种比例，每个测试的ALS抑制剂一种比率)。
优选地，对于一种ALS抑制剂，天然细胞上的致死浓度比突变细胞上的致死浓度低50倍，更优选地，天然细胞上的致死浓度比突变细胞上的致死浓度低200倍，仍更优选地，天然细胞上的致死浓度比突变细胞上的致死浓度低1000倍。
除草剂(在本发明的方法中使用的)可以是包含至少一种ALS抑制剂(如甲酰胺磺隆)的(抑制剂的)混合物。
可能地，在本发明的方法中使用的ALS抑制剂是ALS抑制剂(如磺酰脲(例如甲酰胺磺隆))和另一ALS抑制剂(选自由以下各项组成的组：碘甲磺隆、酰嘧磺隆和噻酮磺隆)的混合物。
优选地，在本发明的方法中使用的ALS抑制剂是(或包括)甲酰胺磺隆，如甲酰胺磺隆，其在含有藻酸盐的培养基上，向原生质体的一周龄(或三周龄)体外培养物(更特别地，体外培养物，该体外培养物包括从这些培养的原生质体再生的愈伤组织)施加，且在细胞体外培养期间维持在10-9-10-6mol/l(或10-9-10-6mol/l)浓度下。
本发明的一个相关方面是由这种方法获得的突变甜菜植物，(例如当该方法包括一种或多种除草剂(不是ALS抑制剂)的应用或一种或多种ALS抑制剂的应用，或包括一种ALS抑制剂的应用和一种非ALS抑制剂的除草剂的应用时)。
因此，本发明的一个方面是在ALS基因中在编码氨基酸的位置处具有一个或多个突变的甜菜(通过本发明的方法可获得)，该氨基酸选自由以下各项组成的组：甘氨酸112、丙氨酸113、甲硫氨酸115、精氨酸133、缬氨酸187，精氨酸190、丙氨酸196、苯丙氨酸197、赖氨酸247、甲硫氨酸346、组氨酸347、精氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸371、精氨酸372、甲硫氨酸565、缬氨酸566、苯丙氨酸573、丝氨酸648和甘氨酸649。
优选的甜菜(通过本发明的方法可获得)在ALS基因中在编码氨基酸的位置处具有一个或多个突变，该氨基酸选自由以下各项组成的组：丙氨酸113(例如突变为缬氨酸或苏氨酸)脯氨酸188突变为苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸、丙氨酸196(例如突变为缬氨酸)、天冬氨酸371(例如突变为谷氨酸)、精氨酸372(例如突变为组氨酸)、色氨酸569突变为甘氨酸、丝氨酸648(例如突变为苏氨酸)和甘氨酸649(例如突变为天冬氨酸)。
本发明的一个相关方面是突变甜菜植物(或突变甜菜植物细胞，如分离自甜菜的突变气孔保卫细胞)，其在ALS基因(在该基因中，在编码的ALS酶中的位置569(对应于在拟南芥ALS酶中的位置574)处的色氨酸由其它氨基酸(如亮氨酸)取代)中包括突变，以及可能地另一个(一种或多种)突变，优选地在ALS基因中的另一个(一种或多种)突变，如在ALS基因中引起进一步氨基酸取代的突变。
另一种优选的甜菜植物在位置569处具有色氨酸成为亮氨酸的突变并且在ALS基因中编码氨基酸的位置处(具有)一个或多个突变，该氨基酸选自由以下各项组成的组：甘氨酸112、丙氨酸113、甲硫氨酸115、精氨酸133、缬氨酸187，精氨酸190、丙氨酸196、苯丙氨酸197、赖氨酸247、甲硫氨酸346、组氨酸347、精氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸371、精氨酸372、甲硫氨酸565、缬氨酸566、苯丙氨酸573、丝氨酸648和甘氨酸649。
优选的甜菜(通过本发明的方法可获得)在位置569处具有色氨酸成为亮氨酸突变的一个突变并且在ALS基因中编码氨基酸的位置处(具有)一个或多个突变，该氨基酸选自由以下各项组成的组：丙氨酸113(例如突变为缬氨酸或苏氨酸)脯氨酸188突变为苏氨酸、精氨酸、亮氨酸、谷氨酰胺或丙氨酸、丙氨酸196(例如突变为缬氨酸)、天冬氨酸371(例如突变为谷氨酸)、精氨酸372(例如突变为组氨酸)、丝氨酸648(例如突变为苏氨酸)和甘氨酸649(例如突变为天冬氨酸)。
这种突变甜菜植物对使用的一种或多种ALS抑制剂(如磺酰脲(例如甲酰胺磺隆))有抗性，并且有利地对其它ALS抑制剂(优选地选自由以下各项组成的组：碘甲磺隆、酰嘧磺隆和噻酮磺隆)有抗性。
本发明的一个相关方面是突变甜菜植物(或突变甜菜植物细胞，如分离自甜菜的突变气孔保卫细胞)，其在ALS基因中包括突变，其中，在编码的ALS酶中的位置188(对应于在拟南芥ALS酶中的位置197)处的脯氨酸由其它氨基酸(如丝氨酸)取代。
可替代地，优选的甜菜植物(通过本发明的方法可获得)在位置188处具有脯氨酸成为丝氨酸的突变并且在ALS基因中编码氨基酸的位置处(具有)一个或多个突变，该氨基酸选自由以下各项组成的组：甘氨酸112、丙氨酸113、甲硫氨酸115、精氨酸133、缬氨酸187、精氨酸190、丙氨酸196、苯丙氨酸197、赖氨酸247、甲硫氨酸346、组氨酸347、精氨酸368、天冬氨酸370、天冬氨酸371、精氨酸372、甲硫氨酸565、缬氨酸566、苯丙氨酸573、丝氨酸648和甘氨酸649。
优选的甜菜(通过本发明的方法可获得)在ALS基因中在位置188处具有一个脯氨酸成为丝氨酸的突变和在编码丙氨酸113(例如突变为缬氨酸或苏氨酸)、天冬氨酸371(例如突变为谷氨酸)、精氨酸372(例如突变为组氨酸)、色氨酸569突变为甘氨酸、丝氨酸648(例如突变为苏氨酸)、甘氨酸649(例如突变为天冬氨酸)的位置处具有ALS基因的一个或多个突变。
本发明的另一相关方面是突变甜菜植物(或突变甜菜植物细胞，如分离自甜菜的气孔保卫细胞)，其在ALS酶中位置569处包括色氨酸的突变，并且在ALS酶中位置188处包括脯氨酸的突变，以及可能地另一个(一个或多个)突变，优选地在ALS基因中的另一个(一个或多个)突变。
优选地，这种突变甜菜植物的ALS基因(的一个等位基因)对应于SEQ.ID.NO:3或SEQ.ID.NO:5。
有利地，本发明的突变甜菜植物包括SEQ.ID.NO:3(在一个等位基因中)和SEQ.ID.NO:5(在第二等位基因中)。
可能地，本发明的突变甜菜植物包括SEQ.ID.NO:3(在一个等位基因中)和SEQ.ID.NO:1或SEQ.ID.NO:7(在第二等位基因中)。
本发明的另一相关方面是覆盖一个或多个突变的核苷酸片段(至少20或至少25个连续的核苷酸，但小于200个连续的核苷酸，优选地小于50个连续的核苷酸)；可能将此片段用作为引物或探针(包括例如通过非核苷酸部分或使用放射性进一步标记的核苷酸探针，或用甜菜ALS基因外源的核酸序列标记的探针)。
本发明又一相关方面是跨越突变的该核苷酸片段用于标记辅助筛选对毒性分子(除草剂)具有抗性的甜菜植物的应用。
实施例
对比实施例
由于在本领域(例如在WO98/02527)中，在添加ALS除草剂至愈伤组织(其是来自于野生型甜菜的外植体)后成功地产生了突变甜菜，所以本发明人首先选择来源于WO98/02527系的甜菜基因型(系)并且从它们的气孔保卫细胞中分离原生质体。
如在WO95/10178中，分离几百万的这些原生质体(平均约2百万至约5百万，并且通过实验最高达1100万；总共，将ALS除草剂施加至15000万原生质体中)，将它们放入包括藻酸盐的培养基中，并且用MS培养基(包括10-9至10-6mol/l甲酰胺磺隆)处理(它们)。
按照如在WO95/10178中描述的方案，本发明人已经随后再生了甜菜，并且仅观察到少数愈伤组织存活于抑制剂中。然而，一个例外是，这些再生愈伤组织都没未能发展成甜菜植物。唯一的再生甜菜植物在ALS基因(编码甲酰胺磺隆的靶标酶)中没有显示出突变。
因此当该方法涉及气孔保卫细胞原生质体时，这个甜菜系(在直接暴露愈伤组织(来自于外植体)于除草剂基础上示出了该甜菜系的亲本系获得对该除草剂的突变-诱导的抗性)不能用于同样的目的。
实施例1 筛选甜菜基因型(系)用于良好-再生原生质体
随后发明人已经比较了几种甜菜植物基因型从气孔保卫细胞原生质体再生的能力。
本发明人已经发现具有约0.01％(或甚至更少)的再生能力的基因型和具有(显著)大于0.1％的再生能力的几个基因型。
本发明人已经进一步确定了原生质体(它们在体外生长和分裂的能力)生长之间的区分，生长的愈伤组织形成芽的能力和生长的愈伤组织再生植物的比例。
基因型 原生质体/克 生长细胞百分比 芽形成百分比 获得的植物百分比
F06R38309 1500000 0,02 55,67 3,43
F06R38313 500000 0,04 0,14 0,00
F06R38323 1000000 0,19 0,49 10,81
F07R38836 500000 0,26 10,51 0,73
REL1 1000000 0,07 70,00 44,00
表1：一些甜菜基因型的比较
对于细胞系“Rel1”，虽然反映气孔保卫细胞原生质体再生为完整的甜菜植物的能力的值，作为整体时是更高的，但是该细胞系被认为对于运行本发明并非足够有用。
本发明人已经进一步得出结论，相比于其它参数，“生长细胞百分比”参数对于运行本发明显著地更加重要。
本发明人已经选择了具有大于0.25％的能够在体外生长的气孔保卫细胞原生质体的基因型。
实施例2 原生质体的除草剂处理
本发明人已经应用了与比较实施例相同的方法，但依赖于良好生长的气孔保卫细胞原生质体(例如，如在实施例1中确认的；还可以使用作为NCIMB42050或NCIMB42051保藏的植物，以及具有高比例的生长的气孔保卫细胞原生质体的其它甜菜植物)。
总共，大约6800万的良好-生长的气孔保卫细胞原生质体受到ALS除草剂组合物(包含高达10-6M的甲酰胺磺隆)处理。
本发明人获得46种愈伤组织。
几种再生植物示出在靶基因(ALS基因：在每种情况下，在位置569处色氨酸(W569L；对应于拟南芥中位置574处的色氨酸)的密码子的突变)中的突变。ALS基因的这个突变的两个等位基因是由SEQ.ID.NO:3和SEQ.ID.NO:7编码的。其它生长的愈伤组织被测序并且在ALS基因中具有突变，(包括在其它位置处的突变)但没有再生为植物。
本发明人因此推断，本发明的方法非常有利于发展具有进化的突变(引起对除草剂的抗性)的植物，特别是因为该方法不涉及使用外源DNA和/或引入编码遗传元件(对于赋予ALS抑制剂的抗性是已知的)的DNA载体，并且在仅仅几个月中产生阳性结果。
本发明人随后重复该方法并且进一步施加诱变剂(0.05％至0.2％的EMS)至原生质体，以提高突变数量。
实施例3 甜菜的ALS抑制剂处理
本发明人比较了具有突变SEQ.ID.NO:3的再生甜菜(该突变的杂合子)和野生型(天然)甜菜商业品种的行为(性能，behaviour)。
即使当除草剂已经与有机化合物(25g/ha菜籽油甲酯)组合以提高其效果时，该(杂合子)突变品种对甲酰胺磺隆(12.5g/ha；高达3次施加)也显示出良好的抗性。
如预期的，野生型(天然)植物对于甲酰胺磺隆是非常敏感的，即使在第一次施加后。
使用酰嘧磺隆(15g/ha)进行相同的试验，并且在突变植物中产生相同水平的抗性。
另一方面，野生型(天然)的植物对于酰嘧磺隆是非常敏感的，特别是当它与有机化合物组合时，和/或在几次施加酰嘧磺隆之后。
使用碘甲磺隆(3.5g/ha)进行了相同的实验，并且当添加碘甲磺隆时，该实验在突变植物中证明了良好水平的抗性，但是当碘甲磺隆与有机化合物一起施加时，该抗性下降。
如预期的，野生型(天然)植物对碘甲磺隆是非常敏感的，即使是在一次施加之后并且没有有机化合物。
使用7.5g/ha噻酮磺隆进行了相同的实验，并且在突变植物中产生了与碘甲磺隆大约相同水平的抗性。在所有测试的浓度处并且不管是否添加有机化合物，野生型(天然)植物对于噻酮磺隆是非常敏感的。
本发明人得出结论：通过与野生型的比较，包括SEQ.ID.NO:3的突变甜菜植物(根据布达佩斯条约以NCIMB42051保藏)针对甲酰胺磺隆提供了最好的抗性。
本发明人进一步得出结论，该(杂合子)突变植物对于其它ALS抑制剂(包括对于属于其它化学品类别的抑制剂)具有进一步获得的一些(尽管部分的)抗性。
实施例4 在ALS基因中具有进一步突变的甜菜的ALS抑制剂处理
本发明人随后发展了包含SEQ.ID.NO:3和SEQ.ID.NO:5(在两个不同的等位基因上)的突变甜菜植物。如此得到的双重突变体已经根据布达佩斯条约以NCIMB42050保藏。通过依赖多种技术(包括，例如，向单一突变体NCIMB42051施加的随后突变形成步骤)可以产生包含SEQ.ID.NO:3和SEQ.ID.NO:5二者的植物。
本发明人随后比较了这个双重突变体植物(在一个等位基因中在氨基酸569处的突变和在其它等位基因中在氨基酸188处的突变)的抗性与单一突变体(在位置569处的突变)甜菜(的抗性)。
该双重突变植物系至少保持了所有抗性特征(如在实施例3中)，并且对于噻酮磺隆和对于酰嘧磺隆处理也已经获得了良好的抗性(与田间施加相容)，即使当将其置于含有机化合物的组合物中时也是如此。
因此，通过与归因于单个突变体植物(在ALS基因中在位置569处)的抗性相比较，这个双重突变体植物对于几种ALS抑制剂显示出改进的增效的抗性。
实施例5 温室试验：直接比较中的不同甜菜的ALS抑制剂处理
根据本发明(如在上面的实施例4中描述的，“系A”)包含SEQ.ID.NO:3和SEQ.ID.NO:5(在两个不同的等位基因上)的突变甜菜植物由不同的ALS抑制剂处理，其与甜菜植物(在该植物中，编码的ALS酶的位置569处的色氨酸由亮氨酸取代)(“系B”)、在WO98/02527中描述的甜菜植物(在该植物中，编码的ALS酶的位置188处的脯氨酸由丝氨酸取代)(“系C”)、和在位置569和188不具有突变的传统品种(野生型)甜菜植物(“系WT”)直接比较。
几组四种不同的提及的甜菜植物的种子分别播种在温室中并生长至甜菜(Betavulgaris L.ssp)的BBCH 14阶段(即，4叶(第二对)展开的)(根据专题著作“Entwicklungsstadien mono-und dikotyler Pflanzen”,2nd edition,2001,ed.UweMeier,Biologische Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft)。随后，以在表2中指出的量(g/ha)的ALS抑制剂(ALS-in)各自单独地处理所得到的分开的组的甜菜植物。
在施加各自的ALS抑制剂后的第14天，每个甜菜植物的损害(即植物毒性)被评定等级，从0％(即没有损伤，没有植物毒性)至100％(即，植物被完全杀死)。每个组植物的平均等级也显示在表2中。
表2：
ALS-in ALS-in g/ha 系A 系B 系C 系WT
甲酰胺磺隆(Foramsulfuron) 13 26.9％ 45.6％ 77.5％ 80.0％
碘甲磺隆-Na(Iodosulfuron-methyl-Na) 3.5 22.5％ 38.8％ 80.0％ 82.5％
酰嘧磺隆(Amidosulfuron) 15 6.3％ 37.5％ 51.9％ 73.1％
噻酮磺隆(Thiencarbazone-methyl) 7.5 8.1％ 35.6％ 37.5％ 84.4％
双草醚-Na(Bisbyribac-Na) 50 17.5％ 38.1％ 71.7％ 80.0％
磺草唑胺(Metosulam) 15 13.1％ 40.6％ 69.4％ 79.4％
另外，在用包含噻酮磺隆和甲酰胺磺隆的混合物处理后，观察每个甜菜植物的典型早期表型。每个系的代表性早期表型在图1(Fig.1)中示出。
图1还证明了根据本发明的甜菜植物(“系A”)显示出改进的ALS抑制剂抗性，即在与其它早期表现型的比较中，观察到更好的生长和较少的植物毒性效应。
实施例6 田间试验：在直接比较中的不同甜菜的ALS抑制剂处理
表3：
表3：在甜菜植物上ALS抑制剂的效果。数值代表了测量的损伤的平均百分比。
本发明人在允许破坏杂草的剂量处已经测试了市售组合物。
敏感的对照(即，在ALS基因中没有突变的甜菜)是通过所有除草剂而不是一种(除草剂)杀死的。本发明人对于对照(未处理的)植物已经测量了小的损坏，达到有时35％或甚至40％。这些“损坏”反映了田间试验的农艺条件。
另一方面，在位置569(574)处是杂合子的甜菜植物对于几种除草剂组合物已经变得部分地抗性。在两个等位基因上具有整合的569突变(574)并且因此是(569/569)纯合子的植物具有进一步增加的抗性：只有7种除草剂组合物是中等毒性(从5％至35％)。
在ALS基因的一个等位基因中位置569(574)处已经引入突变并且在ALS基因的第二等位基因中位置188(197)位置处(已经引入)突变的甜菜植物也获得改善的抗性，因为9种除草剂组合物是中等毒性，并且只有3种是相当有毒性的。令人惊奇的是，这种植物(其中，提供强抗性的突变(569)已经丢失并且对于ALS抑制剂仅提供较弱的抗性的突变(188)已被添加)在这个田间测试的3种不同条件中相比于纯合子(569/569)提供了甚至更好的抗性。

Claims (14)

1.一种生产对乙酰羟酸合成酶(ALS)的一种或多种抑制剂有抗性的突变甜菜植物的方法，包括以下步骤：
-从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞中获得原生质体；
-向所述原生质体的体外培养物施加组合物，所述组合物包含一种或多种以下浓度的ALS抑制剂，所述浓度对于大于99％的体外培养细胞是致死的；以及
-从所述体外培养细胞中的存活细胞再生甜菜植物，
其中，所述气孔保卫细胞原生质体针对它们再生为甜菜植物的能力加以预先选择，并且其中，向大于20000000的所述原生质体施加所述ALS抑制剂，其中所述原生质体具有大于10％的概率分裂和再生成存活的甜菜愈伤组织，所述大于10％的概率是指生长的原生质体数：投入培养的总原生质体数之比大于10％，其中通过所述原生质体获得的愈伤组织具有大于10％的发芽的能力，所述大于10％的发芽的能力是指产生芽的愈伤组织数：总愈伤组织数之比大于10％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，选择能够再生为甜菜植物的气孔保卫细胞原生质体的步骤，包括以下子步骤：分离来自于不同基因型的甜菜植物的气孔保卫细胞原生质体，以及针对每种基因型测定当将所述原生质体投入体外培养时进行生长的所述原生质体的比例。
3.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括以下步骤：测序来自于存活的所述体外培养细胞的再生植物的基因组。
4.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括以下步骤：测序ALS基因用于识别所述ALS基因中的突变。
5.根据权利要求1或2所述的方法，进一步包括以下步骤：选择在ALS基因中具有突变的再生甜菜植物。
6.根据权利要求1或2所述的方法，包括推导浓度的预备步骤，在所述浓度下，包含所述一种或多种ALS抑制剂的所述组合物对于至少99％的所述体外培养细胞是致死的。
7.根据权利要求1或2所述的方法，其中，将所述一种或多种ALS抑制剂施加于大于50000000的气孔保卫细胞原生质体的体外培养物。
8.根据权利要求1或2所述的方法，其中，包含一种或多种ALS抑制剂的所述组合物包含甲酰胺磺隆。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，在10-9mol/L至10-6mol/L范围的浓度下施加所述甲酰胺磺隆。
10.根据权利要求1或2所述的方法，其中，包含一种或多种ALS抑制剂的所述组合物包含乙氧嘧磺隆。
11.一种生产对除草剂有抗性的突变甜菜植物的方法，包括以下步骤：
-从分离自甜菜植物的气孔保卫细胞中获得原生质体；
-向所述原生质体的体外培养物施加组合物，所述组合物包含以下浓度的所述除草剂，所述浓度对于大于99％的体外培养细胞是致死的；
-从所述体外培养细胞中的存活细胞再生甜菜植物；以及
-选择在编码所述除草剂靶向的肽的基因中具有突变的再生甜菜植物，
其中，所述气孔保卫细胞原生质体针对它们再生为甜菜植物的能力加以预先选择，并且其中，向大于20000000的所述原生质体施加所述除草剂，其中所述原生质体具有大于10％的概率分裂和再生成存活的甜菜愈伤组织，所述大于10％的概率是指生长的原生质体数：投入培养的总原生质体数之比大于10％，其中通过所述原生质体获得的愈伤组织具有大于10％的发芽的能力，所述大于10％的发芽的能力是指产生芽的愈伤组织数：总愈伤组织数之比大于10％。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，所述除草剂选自由以下各项组成的组：4-HPPD抑制剂、类胡萝卜素生物合成抑制剂、EPSP合酶抑制剂、光合体系II抑制剂、光合体系I抑制剂、细胞分裂抑制剂、微管组装抑制剂、原卟啉原氧化酶抑制剂、乙酰辅酶A羧化酶抑制剂、细胞壁合成抑制剂、谷氨酰胺合成酶抑制剂和合成生长素。
13.从突变甜菜植物分离的气孔保卫细胞原生质体用于引入一种或多种另外的遗传性状的应用，其中，所述突变甜菜植物包括在ALS基因的一个等位基因上的SEQ.ID.NO:3和在ALS基因的第二等位基因上的SEQ.ID.NO:5。
14.根据权利要求13所述的应用，其中，所述突变甜菜植物由以NCIMB42050保藏的种子可获得。
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