JPH06501615A - グリホセート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキメートシンターゼ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １２、トマト、タバコ、採油用ナタネ、アマ、ダイズ、ヒマワリ、テンサイ、ア ルファルファ、ワタ、コメ及びトウモロコシからなる群から選択される請求の範 囲第１■項に記載の形質転換された植物細胞。

１３、トマト由来の請求の範囲第１Ｉ項に記載の形質転換された細胞。

＋４．　タバコ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。

１５　採油用ナタネ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。

＋６．アマ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。

＋７　ダイズ由来の請求の範囲第１Ｉ項に記載の形質転換された細胞。

１８、ヒマワリ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。

１９、テンサイ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。

２０、アルファルファ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。

２１、トウモロコシ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。

２２、請求の範囲第１１項に記載の形質転換された植物細胞を含む植物。

２３、植物か、トマトである請求の範囲第２２項に記載の植物。

２４、　ｈｌ物か、タバコである請求の範囲第２２項に記載の植物。

２５、植物が、採油用ナタネである請求の範囲第２２項に記載の植物。

２Ｇ、植物が、アマである請求の［［第２２項に記載の植物。

２γ、植物が、ヒマワリである請求の範囲第２２項に記載の植物。

２８、植物か、テンサイである請求の範囲第２２項に記載の植物。

２９、植物が、アルファルファである請求の範囲第２２項に記載の植物。

３０、請求の範囲第２２項に記載の植物により生成される種子。

３１、植物か、トマトである請求の範囲第３０項に記載の種子。

３２、植物か、タバコである請求の範囲第３０項に記載の種子。

３３、植物か、採油用ナタネである請求の範囲第３０項に記載の種子。

３４、植物か、アマである請求の範囲第３０項に記載の種子。

３５、植物か、ヒマワリである請求の範囲ＩＥ３０項に記載の種子。

３６、植物か、テンサイである請求の範囲第３０項に記載の種子。

３７、植物か、アルファルファである請求の範囲第３０項に記載の種子。

３８、請求の範囲第４項に記載の植物遺伝子を含む植物を繁殖させることを含む グリホセート耐性植物の生産方法。

３９、植物か、トウモロコシ、トマト、タバコ、採油用ナタネ、アマ、ヒマワリ 、テンサイ、アルファルファ、ワタ及びコメからなる群から選択される請求の範 囲第３８項に記載の方法。

４０、交配の少なくとも一部の子孫がグリホセート耐性を示すように、第１植物 及び第２植物を交配することによって、第１植物か繁殖される請求の範囲第３８ 項に記載の方法。

４１、植物か、トウモロコシ、トマト、タバコ、採油用ナタネ、アマ、ヒマワリ 、テンサイ、アルファルファ、ワタ及びコメからなる群から選択される請求の範 囲第４０項に記載の方法。

４２、請求の範囲第４項に記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼをコード するＤＮＡ配列。

４３、長さか２０キロベ一ス未満である請求の［囲第４２項に記載のＤＮＡ配列 。

４４、請求の範囲第５項に記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼを特徴と する請求の範囲第４３項に記載のＤＮＡ配列。

４５、請求の範囲第６項に記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼを特徴と する請求の範囲第４２項に記載のＤＮＡ配列。

４６、下記工程： 成熟ＥＰＳＰシンターセ配列中の位置８０及び１２０の間にアミノ酸配列−Ｌ− Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−及び第２アミノ酸配列−Ａ　Ｌ　Ｌ　Ｍ　Ｘ、Ａ　Ｐ −Ｌ−Ｔ−（式中、Ｘｌはアラニン、セリンまたはスレオニンであり、前記第２ アミノ酸配列は、成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列中の位置１７０及び２ｉ０の間に 存在する）を含むグリホセート−耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵素をコートする遺伝 子を含む結果、グリホセート耐性を有する作物種子または植物を植え１次いでそ の畑中の前記作物及び雑草に、十分量のグリホセートを与えて、作物に著しい影 響を与えずに、雑草を制御すること を含む植えられた作物種子または植物を有する作物を含む圃場において、雑草を 選択的に制御する方法。

４７、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターセ酵素をコードする遺伝子か、植物起 源である請求の範囲第４６項に記載の方法。

明　細　書 グリホセート耐性５−エノールビルビル−３−ホスホシキメートシンターセ 本発明の背景 近年の遺伝子工学における進歩により、植物を形質転換して外来遺伝子を含有さ せるための必須の手段か提供されている。今や農地経営学上重要な特異の特徴を 存する植物を生産することか可能である。このような育利な特色は、除草剤耐性 であることは確かである。除草剤耐性の作物植物は、雑草の制御のだめの耕作作 業の必要を減じ、それにより農業従事者のコストを効率良く減じることかできる 。

この点について多くの研究の対象となっている１の除草剤は、Ｎ−ホスホノメチ ルグリシンである。

ＨＯ ＩＩ　Ｉ　ＩＩ ＨＯ−Ｃ−ＣＨ２−Ｎ−ＣＨ２−Ｐ−ＯＨＯＨ この除草剤は、５０より多い種類の作物での使用か登録された、非選択的で、広 いスペクトルを存する苗か成熟するまでの段階用の除草剤である。この分子は酸 であり、水性溶液中で解離して植物毒のアニオンを生成する。

いくつかのアニオン性の形懸が知られている。本明細書中で使用されているよう に、用語「グリホセート」は、酸及びそのアニオンを称する。

グリホセートは、芳香族アミノ酸の合成のためのプリカーサ−を与えるシキミ酸 経路を阻害する。特に、グリホセートは、酵素５−エノールビルビル−３−ホス ホシキメートシンターゼ（ＥＰＳＰＳまたはＥＰＳＰシンターゼ）を阻害するこ とによって、ホスホエノールピルベート及び３−ホスホシキミ酸から５−エノー ルビルビル−３−ホスホシキミ酸への転化を阻害する。

植物のゲノム中に、高レベルのＥＰＳＰシンターゼを生産する能力を挿入するこ とによって、グリホセート耐性植物を生産することかできることは知られている 。

本発明は、触媒活性を維持しながら、グリホセートに対する低い親和性を示す変 異体ＥＰＳＰシンターゼ酵素を生産することによって、グリホセート耐性植物の 有効性を高めるための方法を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、種々の植物及び細菌種由来のＥＰＳＰシンターゼ酵素のアミノ酸配列を 示す。

図２は、プラスミドＩ）ＭＯＮ８２０５の地図を示す。

図３は、プラスミドｐＭＯＮＩｏ０７９の地図を示す。

図４は、プラスミドｐＭＯＮ５０５の地図を示す。

図５は、ブラスミＦ’ｐＭＯＮ１００７４の地図を示す。

本発明の開示 本発明は、その他の変異体ＥＰＳＰシンターゼ酵素よりも低いホスホエノールピ ルベートのＫａｔ値ヲ示しなからグリホセート除草剤に対する増加された耐性を 示す新規ＥＰＳＰシンターゼ酵素を提供する。本発明の対象酵素は、下記するよ うに、グリシンの代りのアラニン置換及びアラニンの代りのスレオニン置換を有 している。

その他の観点において、本発明は、ホスホエノールピルベートのＫｍ値を低下さ せなから、高レベルのりＩＪ　ホセート耐性を維持するＥＰＳＰシンターゼ中の アミノ酸置換を単離する方法を提供する。

本明細書及び請求の範囲中に示される全てのペプチド構造は、Ｎ末端のアミノ基 が左にあり、Ｃ末端のカルボキシル基が右にある慣用の形式によって示される。

同様に、タンパク質中に見られる天然発生のアミノ酸のアミノ酸記号は、下記の 通りである：アラニン（Ａｌａ；Ａ）　、アスパラギン（Ａｓｎ；Ｎ）　、アス パラギン酸（Ａｓｐ；Ｄ）　、アルギニン（Ａｒｇ；Ｒ）　、システィン（Ｃｙ ｓ；Ｃ）　、グルタミン酸（Ｇｌｕ；Ｅ）　、グルタミン（Ｇｌｎ；Ｑ）　、グ リシン（Ｇｌｙ；Ｇ）　、ヒスチジン（Ｈｉｓ；Ｈ）　、イソロイシン（［１ｅ ：［）　、　ｏイシン（Ｌｅｕ；Ｌ）　、リジン（Ｌｙｓ；Ｋ）　、メチオニン （Ｍｅｔ；Ｍ）　、７　エニルアラニン（Ｐｈｅ；Ｆ）　、プロリン（Ｐｒｏ； Ｐ）　、セリン（Ｓｅｒ；Ｓ）　、スレオニン（Ｔｈｒ；Ｔ）　、トリプトファ ン（Ｔｒｐ：Ｗ）、チロシン（Ｔｙｒ；Ｙ）及びバリン（Ｖａｌ；Ｖ）　、本発 明の目的のために、用語「成熟ＥＰＳＰシンターゼ」とは、Ｎ末端クロロプラス トトランジットペプチドなしのポリペプチドを称する。植物中のＥＰＳＰシンタ ーセのプリカーサ−（トランジットペプチドを存する）か発現され、クロロプラ ストに移送され、トランジノトペプチミノ酸位置の全ての番号は、成熟ＥＰＳＰ シンターセに関して与えられる（クロロプラストトランジノトペブチトリーダー なし）。

図１は、種々の植物及び細菌種由来のＥＰＳＰシンターセのアミノ酸配列を示す 。図１において、配列中の「Ｘ」は、その位置のそのアミノ酸か不明であること を示す。”は、配列の整列の便宜のために挿入されたスペースを示す。配列の類 似性を最大にするための配列及び整列の検査は、グリシンの代りのアラニンの置 換及びアラニンの代りのスレオニンの置換か行なわれている領域中の保存された アミノ酸残基（配列の一致により示される）の領域を示す。事実、文献及び本明 細書中において報告される全ての単官能性のＥＰＳＰシンターセ酵素は、保存さ れた領域中の２の位置においてグリシン及びアラニンを表示している。文献に精 通した者は、酵母や糸状菌（アスペルギルス属）のようないくつかの宵機体か、 ＥＰＳＰシンターセ成分を含む多機能のｒａｒｏｍ複合体」を存することを理解 するであろう。注目されるアミノ酸は、保存され、多機能ｒ　ａｒｏｍ？３！合 体」のＥＰＳＰンンターゼ成分中の所望の置換の導入は、グリホセート耐性活性 をもたらすものでなければならない。

特に、本発明のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼの製造においてアラニン残 基により置換されるグリシン残基は、ペチュニアのＥＰＳＰシンターゼ中の位置 １０１．１−マドのＥＰＳＰシンターゼ中の位置１０１゜Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉ ｓ　ｔｈａｌｉａｎａのＥＰＳＰシンターゼ中の位置１０１　；　Ｂｒａｓｓｉ ｃａ　ｎａｐｕｓのＥＰＳＰシンターゼ中の位置１０１　：　Ｇｌｙｃｉｎｅ　 ｍａＸのＥＰＳＰシンターゼ中の位置１０４　；　Ｅ、ｃｏｌｉＫ　−１２（デ ュンカンら、１９８４）のＥＰＳＰシンターゼ中の位置９６及びＳａｌｍｏｎｅ ｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ　（スタルカーら、ｌ　９８５）のＥＰＳＰシン ターゼ中の位置９６で生じる。本発明のグリホエートＩｔ性ＥＰＳＰシンターゼ の製造においてスレオニン残基により置換されるアラニン残基は、ペチュニアの ＥＰＳＰ’ｙン９−セ中の位置１９２：）７ト（７）ＥＰＳＰシンターゼ中の位 置１９２　；　Ａｒａｂｉｄｏｐｓｒｓ　ｔｈａｌｉａｎａのＥＰＳＰシンター ゼ中の位置１９２　；　Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓのＥＰＳＰシンターゼ中 の位置１９２　：　Ｇｌｙｃｉｎｅ　［ｌ１ａＸのＥＰＳＰシンターゼ中の位置 １９５　；　Ｅ、ｃｏｌｉＫ　−１２のＥＰＳＰシンターゼ中の位置１８３及び Ｓａ１ｍｏｎｅｌｌａｔｙｐｈｉｍｕｒｉｕ＋ｎのＥＰＳＰシンターゼ中の位置 １８３において生じる。これらの例は、グリシンの代りのアラニン及びアラニン の代りのスレオニンの置換はこれらのその他の野性型Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐシンターゼ 酵素の保存された領域中に導入されて、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵 素を生成することか可能であることを示している。

従って、本発明の一側面は、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵素をコード する遺伝子及び成熟野性型ＥＰＳＰンンターゼアミノ酸配列における位置８０及 び１２０の間に存在する下記配列ニ ーＬ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ− を有する第１の保存された領域中で第２グリシン残基の代りにアラニン残基を置 換し、成熟野性型ＥＰＳＰシンターゼアミノ酸配列における位置１７０及び２１ ０の間に存在する下記配列： Ａ　Ｌ　Ｌ　Ｍ　ＸＩ　Ａ　Ｐ　Ｌ　Ａ−（式中、ｘｌは、Ａ（アラニン）、Ｓ （セリン）またはＴ（スレオニン）のいずれかを示す）を有する第２の保存され た領域中でアラニンの代りにスレオニンを置換することを含む、上記の遺伝子の 製造方法を提供ことにある。はとんどの場合において、第１の保存された領域は 、成熟ＥＰＳＰシンターゼの位置９０及び１１０の間に存在し、第２の保存され た領域は、位置１７５及び２００の間に存在する。

ｌの実施態様において、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼコード配列は、グ リホセート耐性トランジェニック植物の効力を高めるために有用である。植物を 形質転換してグリホセート耐性を示す方法は、欧州特許庁公開第０２１８５７１ 号及び１９９０年７月ＩＯ日に発行された「グリホセート耐性植物」という名称 の共通に壌渡された米国特許第４．９４０，８３５号に開示されており、それら は本明細書中に参考文献として採り入れられている。本発明は、このような方法 により植物またはその他のＥＰＳＰシンターゼコード配列を単離し、必要な変更 をＥＰＳＰシンターセをコードするＤＮＡ配列中に導入して、上記の置換を翻訳 されたＥＰＳＰシンターゼ酵素中にもたらす。

その他の観点において、本発明は、成熟ＥＰＳＰシンターゼアミノ酸配列におけ る位置８０及び１２０の間に存在する下記第１配列ニ ーＬ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ− 及び成熟ＥＰＳＰシンターゼアミノ酸配列における位置１７０及び２１０の間に 存在する下記第２配列ニーＡ−Ｌ−Ｌ−Ｍ−Ｘ、　−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｔ　−（式中 、ｘｌは、Ａ（アラニン）、Ｓ（セリン）またはＴ（スレオニン）のいずれかを 示す）を存するグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵素をコードする植物遺伝 子を含む形質転換された植物細胞及びそれから生産される植物を提供する。はと んどの場合において、第１の配列は、成熟ＥＰＳＰシンターゼの位置９０及び１ １０の間に存在し、第２の配列は位置１７５及び２００の間に存在する。この遺 伝子は、さらに、成熟ＥＰＳＰシンターゼコード配列のＮ末端に付加した葉緑体 トランジットペプチドをコードするＤＮＡ配列を含み、そのトランジットペプチ ドは、植物細胞の葉緑体中へのＥＰＳＰシンターセ酵素の移入を促進するために 適応される。

従って、その池の側面において、本発明は、成熟ＥＰＳＰンンターセアミノ酸配 列中の位置８０及び１２０の間に存在する第１配列・ −Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ− 及び位１ｔ１７０及び２１０の間に存在する第２配列・Ａ　Ｌ　Ｌ　Ｍ　ＸＩ　 Ａ　Ｐ　Ｌ　Ｔ（式中、ＸＩは、アラニン、セリンまたはスレオニンである） を有するグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターセ酵素をコードする植物遺伝子を含 む植物形質転換体または発現ベクターを提供するものである。

本発明のその他の側面は、そのような植物を栽培し、さらに、外植体、挿し木及 び種子のような栄養繁殖体を使用してそのような植物を繁殖し、または植物を互 いに交配して、グリホセート除草剤に耐性を示す子孫を生産することを含む方法 か提供される。

さらにその他の側面によれば、本発明は、成熟ＥＰＳＰＳ配列中の位ｆｔ８０及 び＋２０の間にアミノ酸配列−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−及び成熟ＥＰＳＰ Ｓアミノ酸配列中の位ｒ１１７０及び２１０の間の第２の保存された領域内にア ミノ酸配列−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｍ−ｘ’　−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｔ−（式中、ｘｌはアラニ ン、セリンまたはスレオニンである）を含むグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ酵素を コードする遺伝子を含むことによってグリホセート耐性を与えられた作物種子を 播種または植物を植え、次いで、十分量のグリホセートを作物及び雑草に処理し て作物に著しい影響を与えずに雑草を防除することによって、作物種子または植 物が生育している圃場での雑草を選択的に防除する方法を提供する。その結果、 グリホセート合作除草剤を、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を含む 植物が成長している圃場に施用して、その圃場中において成育しているかグリホ セート耐性でない雑草を選択的に死滅させるか防除することか可能となる。これ によって、所望のグリホセート耐性作物植物が、改良された作物品質及び収量を 得るために圃場中の利用可能な栄養分の全利益を得ることが可能になる。

図１中に示されるＥＰＳＰシンターゼ配列は、ＥＰＳＰシンターゼのための起源 物質の広い発展の範囲を示す。これらのデータは、細菌及び植物材料由来のＥＰ ＳＰシンターゼが上記の保存された領域を含むことを示している。しかしながら 、当業者は、保存された領域のまさにその配列を有していないその他の起源材料 から特定のＥＰＳＰシンターゼを生成し、単離することかできることを理解する であろう。事実、アラニンは、グリホセート感受性に変更をもたらさずにペチュ ニアＥＰＳＰシンターゼの保存された領域の第１グリシンの代りに挿入され得る ことか発見されている。

上記第２の保存された領域内のアラニン残基に対するスレオニンの置換は、グリ ホセート耐性ＥＰＳＰシンタ−ゼをもたらし、最も好ましい置換である。当業者 は、その他のアミノ酸残基の置換か、グリホセート耐性を有し触媒活性を維持す るために十分なＫｖａを有するＥＰＳＰシンターゼを生成し得ることを理解する であろう。しかしながら、この位置におけるその他の置換は、本発明の精神及び 範囲内のものであると考えられなければならない。事実、上記の第２の保存され た領域のアラニン残基に対するセリン、グリシン、プロリン、アス／（ラギン、 アスパラギン酸、リジンまたはフェニルアラニンの置換は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ａｒ ｏＡを補い、グリホセートを含有する最小培地上でのＥ、ｃｏｌｉ細胞の成長を 支持することができる機能的なグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼをもたらす 。セリン、グリシン、プロリン及びアスパラギン酸の置換は、Ｅ、ｃｏｌｉ　ａ ｒｏＡの相補のためのλＰＬのような非常に強力な細菌プロモーターから発現さ れなければならないＥＰＳＰシンターゼを生じさせる。これらの変異体は、ＥＰ ＳＰシンターゼ活性についてアッセイされている。プロリン及びアスパラギン酸 の両受異体は酵素活性か非常に小さいが、ウェスタンプロット分析により完全な ＥＰＳＰシンターセを生じさせる。アスパラギン、リジン及びフェニルアラニン 変異体は、Ｅ、ｃｏｌｉａｒｏ　Ａを補い、グリホセ−１・を含有する最小培地 上での細胞の成長を支持することかできた。

グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ植物ＥＰＳＰシンターセは、葉緑体トラン ジットペプチド（ＣＴＰ）を含みＥＰｓＰシンターゼポリペプチドを植物細胞内 の葉緑体中に搬送させることができるポリペプチドをコードする。ＥＰＳＰシン ターゼ遺伝子は、核内のｍＲＮＡ中に転写され、このｍ　ＲＮ　Ａは細胞質内の プリカーサ−ポリペプチド（ＣＴＰ／成熟ＥＰＳＰシンターゼ）中に翻訳される 。プリカーサ−ポリペプチドは、葉緑体中に運ばれ（移入され）、その時にＣＴ Ｐは分割されて成熟ＥＰＳＰシンターゼ酵素を生成する。本発明において使用さ れる適当なＣＴＰは、種々の起源から得ることができる。ＣＴＰは、形質転換さ れる目的植物の内生ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子から得ることが最も好ましい。代 替的には、その他の植物のＥＰＳＰシンターゼ遺伝子由来のＣＴＰを使用するこ ともできる。ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子及びｓ　５ＲＵＢ　ｌ５ＣＯ遺伝子（例 えば、プログリ−１１９８３参照）の間にはほとんど相同性がないが、非相同性 ＣＴＰは特定の具体例において機能することが理解され得る。本発明において使 用される適当なＣＴＰ配列は、下記の対象ＣＴＰを含むＥＰＳＰシンターゼポリ ペプチドの葉緑体取込みをアッセイすることによって容易に決定されることがで きる。ＥＰＳＰＳ遺伝子のＣＴＰ以外のＣＴＰが使用される場合に、ＣＴＰが得 られる起源タンパク質のＮ末端の小部分を含み、ＥＰＳＰシンターゼの葉緑体へ の効果的な移入を得ることか必要であることか判明している。はとんどの場合に おいて、形質転換される植物からＥＰＳＰＳ遺伝子を単離して、対象植物の内生 ＥＰＳＰＳｍＲＮＡから生成されるｃＤＮＡ構造中に、本発明の置換を導入する ことか好ましい。本発明の実施のための適当な植物は、これらに限定されないか 、ダイズ、ワタ、アルファルファ、採油用ナタネ、アマ、トマト、テンサイ、ヒ マワリ、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、コムギ１、コメ、レタス並びにポ プラ、ナシ及びリンゴのような樹木種、堅果植物及びブドウのようなつる植物を 包含する。

植物細胞中のＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の転写を生じさせることか知られたまた は判明したプロモーターは、本発明において使用することができる。このような プロモーターは、植物、植物病原性細菌または植物ウィルスから得ることかでき 、これらに限定されないか、カリフラワーモザイクウィルスの３５３及び１９ｓ プロモーター、ゴマノハグサモザイクウイルス由来の全長転写プロモーター、Ｅ ＰＳＰシンターゼ、ｓ　５ＲＵＢ　ｌ５ＣＯ遺伝子のような植物遺伝子から単離 されたプロモーター及びノーバリン及びマンノビンシンターセのようなＡｇｒｏ ｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ−ＤＮＡ遺伝子から得られた プロモーターを包含する。選択された特定のプロモーターは、十分な発現をもた らし、有効量のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターセポリペプチドを生成して、 植物細胞及びそれから再生される植物を実質的にグリホセート耐性とすることか できるものでなければならない。

当業者は、耐性を導入するために必要なグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼの 量は、植物の種類によって変化し得ることを理解するであろう。

本発明のＥＰＳＰシンターセ遺伝子を発現するために使用されるプロモーターは 、さらに必要に応じて修飾され、その発現特性を変更することかできる。例えば 、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターは、光の存在下てｓ　５ＲＵＢ　ｌ５ＣＯの発現 を抑えるｓ　５ＲＵＢ　ｌ５ＣＯの部分に連結されて、葉中て活性であるが機中 では活性でないｌのプロモーターを生成することができる。得られたキメラプロ モーターは、本発明において使用することができる。本発明において使用される ように、用語ｒｃａＭＶ３５ｓ」プロモーターは、オペレーター領域との連結反 応、ランダムな、または開園された突然変異生成、エンハンサ−配列の付加また は重複等により得られるプロモーターのようなＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの変 異体を包含する。特別に有効なプロモーターは、ゴマノハグサモザイクウィルス 由来の全長転写プロモーター（ＦＭＶ）　（ゴウダ、１９８９）である。

上記の位置１０１におけるグリシンからアラニンへの変更のみを含む変異体ＥＰ ＳＰシンターゼは、グリホセートに対する耐性か高い。しかしなから、この耐性 は、酵素の２つの天然基質の１つであるホスホエノールビルベ−１−（ＰＥＰ） の結合定数（Ｋｍ）の増加によって達成される。その池の基質、ツキメート−３ −ホスフェ−）（Ｓ−３Ｐ）の結合定数は影響を受けない。例えば、野性型ペチ ュニアＥＰＳＰシンターゼは、拮抗インヒビターグリホセートの結合定数（Ｋｉ ）０．４μＭ及びＰ　Ｅ　ｌ）のＫｍ５．２μＭを存し、ており、位１ｔｏｉに おけるグリシジに対するアラニン置換を有する変異体は、グリホセートのＫ１２ ０００μＭ及びＰＥＰのＫｍ１９８μＭを存している。ＰＥＰのＫｍの増加のた めに、通常の触媒活性は、変異体酵素のレベルの増加によりＰＥＰの生理学的濃 度においてのみ達成される。

ＥＰＳＰシンターゼの変異体かグリホセートの高Ｋｉ及びＰＥＰの低Ｋｍを有す ることによって同定することかできる場合には、そのような変異体は高レベルの 遺伝子発現を操作することか困難な植物種または植物組織におけるグリホセート 耐性をもたらす能力を増加する。

細菌中の新規なグリホセート耐性ＥＰＳＰＳ変異体を選択することは、非常に大 量の生物体が、より高等な生物により選択するために可能な時間よりもより短い 時間においてスクリーニングすることを可能にする。

ｃＤＮＡクローンかＥ、ｃｏｌｉ中の表現のために適当に仕立てられてる場合に 、ペチュニアＥＰＳＰシンターゼｃＤＮＡクローンは、Ｅ、ｃｏｌｉ中で表現さ れて、完全に機能するＥＰＳＰシンターゼ酵素を生成することかでき、変異体の 単離を促進するために、ペチュニアＥＰＳＰシンターゼの変異体の発現及び選択 のためのシステムか一般的な実験用の生物であるＥ、ｃｏｌｉにおいて開発され た。

ＰＥＰの低Ｋｍ値を存するグリホセート耐性変異体を同定するための選択方法の 一般的特徴 Ｅ、ｅｏｌｉ宿主　低濃度のグリホセートにより阻害された内生ＥＰＳＰＳ活性 を有するａｒｏ　Ａ−株または無機物から栄養を接種する株（各宿主に対して経 験的に決定された） 発現　低レベルで発現される場合にＥ、ｃｏｌｉａｒ。

プラスミド　Ａ突然変異体を補い最小培地上での細胞成長を支持することかでき ない、植物 ＥＰＳＰＳ遺伝子に融合された弱い細菌プロモーターを育する自己複製プラスミ ド。このプラスミドは、弱いので、野性型ＥＰＳＰＳ遺伝子との融合は内生的細 菌ＥＰＳＰＳの阻害に要求されるのと同様のグリホセートの濃度において阻害さ れる。

突然変異原　単一または多重の点転移、トランジションまたはトランスバージョ ンを起こすか、挿入、欠失またはフレームシフトは起こさない。自発的突然変異 体を選択することかでき、前動性が低いと思われる。

選択培地　芳香族アミノ酸を含まず必須の塩及び無機物及び糖を含む最小細菌成 長培地。発現プラスミド上の薬物耐性マーカー遺伝子に対応する抗生物質を添加 して発現プラスミドを含む細菌細胞のみを選択することかできる。ａｒｏ　Ａ宿 主について、グリホセートは、弱いレベルにおいて発現される場合にＥ、ｃｏｌ ｉａｒｏ　Ａ突然変異を補うことかできるＰＥＰの低Ｋｍ値を有する変異体を選 択することは要求されない。

無ｖｌ物から栄養をとるε、ｃｏｌｉ株については、グリホセートを添加して内 生的 ＥＰＳＰＳ活性を阻害する。

例示的異種構造細菌発現／選択システムＡ）　Ｅ、ｃｏｌｉ中の野性型及び変種 ペチュニアＥＰＳＰシンターゼのためのｐＭＯＮ３４２及びｐＭＯＮ９５６６発 現ベクターの構造 プラスミドｐＭＯＮ３４２は、バクテリオファージラムダｐＬプロモーターの縦 列複製（二重ｐＬ）から発現される「成熟」野性量ペチュニアＥＰＳＰシンター セコード配列（葉緑体トランジノトペブチトを含まない）を担持している。この プラスミドは、ｐＭＯＮ９５３１゜ｐＭＯＮ９５５６、下記のペチュニアＥＰＳ ＰｃＤＮＡクローンから得られた（ｐ〜１ＯＮ９５３１及びｐＭＯＮ９５５Ｇの 単＃Ｉ物については後記する）。

非反復Ｎｃｏ　１部位及びＡＴＧ翻訳開始シグナルか、成熟タンパク質の野性型 ペチュニアＥＰＳＰンンターゼｃＤＮＡコート配列のアミノ末端に導入された。

同時に、集録体トランジットベブチトコード配列は、Ｌｉ８０Ｌｉ３０１７（ｐ 　５３１の３００　ｂｐＥｃｏＲ［ｃ　ＤＮＡフラグメントの〜（Ｉ　３ｍｐ　 ９クローン）をシラー及びスミス（１９８３）の方法及び下記の突然変異生成プ ライマー＝５°−ＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧＧＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣ ＣＡ−３”を使用して部位特異的突然変異生成に付することによって除去された 。

Ｎｃｏ　Ｅ部位を含む変異体ファージクローンを単離した。

上記に記載の突然変異体の存在を、配列分析によって確認した。このＭ１３ｍｐ ９クローンを、Ｍ８０１９と命名した。

プラスミドｐＭＯＮ６００１は、合成バクテリオファージラムダｐＬプロモータ ーの２つの縦列複製がら発現される巳、ｃｏｌｉＫ１２ＥＰＳＰシンターゼコー ト配列を担持するｐＢＲ３２７（７ベａンら、１９８０）の誘導体である。プラ スミドｐＭＯＮ６００１を下記の方法により構成した。最初にｐＭＯＮ４　（ロ ジャーズ、１９８３）をＣ１ａ［により消化し、２．５ｋｂフラグメントをＣ１ ａ［により分割されたｐＢＲ３２７プラスミドベクター中に挿入した。得られた プラスミド、ｐＭＯＮＢは、ｐＢＲ３２７のβ−ラクタマーゼ遺伝子と同じ方向 のＥＰＳＰシンターゼコード配列読みを含む。

ｐＭＯＮ２５、Ｅ、ｃｏｌｉＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐシンターゼコート配列の隣に存在す る非反復限定エンドヌクレアーゼ部位を育するｐＭＯＮ８の誘導体を構成するた めに、下記の工程を採用した。ｐＭＯＮ４の欠失誘導体を、ＢｓｔＥ［Ｉによる 分割及び再連結により生成した。得られたプラスミドｐＭＯＮ７は、ｐＭＯＮ４ の２　ｋｂＢｓｔＥ［！フラグメントか欠けている。次に、ＥＰＳＰシンターゼ 読取り枠の５′末端をコードする１　５０　ｂｐＨｉｎｆｌからＮｄｅ　Ｉフラ グメントを、アクリルアミドゲル上での電気泳動による分離の後のＮｄｅ　［及 びＨｉｎｆｌによるｐＭＯＮ７の消化及び電気的溶離後に単離した。この断片を 、ＥＰＳＰシンターゼコード配列の３°部分及び下記配列： を有する合成リンカ−を含むｐＭＯＮ８の精製された４゜５　ｋｂＢａｍ）ｌｉ Ｎｄｅｌフラグメントに添加した。得られたプラスミドｐＭＯＮ２５は、Ｂａｍ Ｈ及びＢｇ１１１部位、合成リポソーム結合部位及び非反復Ｘｂａ　［及びＮｃ ｏ　［部位（後者は、コード配列のＡＴＧ翻訳開始シグナルを含む）によって先 行されるε、ｃｏＮＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐシンターゼコート配列を含む。

ｐＭＯＮ６００１を構成するために、ｐＭＯＮ２５をＢａｍｔ（Ｉにより消化し 、ＢａｍＨ［付着末Ｗｉ：を含む部分的ファージλｐＬ配列（アダムズ及びガル ッピ、１９８６）を含む合成りＮＡフラグメントと混合した。

得られたプラスミド６００１は、正しい方向の、ｐＭＯＮ２５のＢａｔｎＨ１部 位中の直接の繰り返しとして合成ファージλｐＬプロモーターフラグメントの２ つの複製を担持して、Ｅ、ｃｏｆｉＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐシンターゼコード配列の転写 を促進する。

プラスミド６００１は、Ｎｃｏ［及びＥｃｏＲＩにより分割され、３ｋｂフラグ メントはアガロースゲルから単離された。

このフラグメントは、Ｍ８０１９から精製された小１００　ｂｐＮｃｏ［−Ｅｃ ｏＲ［フラグメントと混合した。連結及び形質転換の後に、ペチュニアの「成熟 Ｊ　ＥＰＳＰシンターゼの５°末端に対応する小１００　ｂｐＮｃｏ［−Ｅｃｏ Ｒ［フラグメントを有するクローンを同定した。この構造物をＩ）ＭＯＮ９５４ ４と命名した。

プラスミドｐＭＯＮ９５４４をＥｃｏＲＩ　１ｍヨ’）消化Ｌ、アルカリホスフ ァターゼにより処理した。ｐＭＯＮ９５４４のＥｃｏＲ［フラグメントを予じめ ペチュニアＥＰＳＰシンターゼコード配列の３°部分をコードする１、４ｋｂフ ラグメントを放出させるためにＥｃｏＲ［により消化したｐＭＯＮ９５６６ＤＮ Ａと混合した。連結及び形質転換の後に、Ｅ、ｃｏｌｉ　ａｒｏＡ突然変異体を 補うことができ、ｐ〜（ＯＮ９５５６の１．４ｋｌ）フラグメントを担持するク ローンを同定して、ペチュニアＥＰＳＰシンターゼの完全成熟コート配列を与え た。このプラスミドをｐＭＯＮ３４２と命名した。

ｐＭＯＮ３４２中のＥＰＳＰシンターセの３′末端のＥｃｏＲ１部位をＣ１ａ［ 部位て置換し、構築を促進した。これは、ＥｃｏＲｌによる部分的消化及びヤエ ナリヌクレアーゼにより消化することによりプラント末端を生成することによっ て達成される。Ｃ１ａ［リンカ−（５′　−ＣＡＴＣＧＡＴＧ−３°、ニューイ ングランドバイオラブズ）を、Ｔ４ＤＮＡリガーゼとの連結によりプラント末端 に添加した。この混合物をＣ１ａｌにより消化して、付着末端を生成し、５　ｋ ｂＥｃｏＲ［部分消化物を、アガロースゲルから単離し、Ｔ４ＤＮＡリガーゼと 連結した。このプラスミドをｐＭＯＮ９５６３と命名した。

下記配列。

５’−ＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＩＴＣＣＡＡＧＧ−３’を 有するＡ２９−ヌクレオチド突然変異誘発性デオキシオリゴヌクレオチドを、自 動ＤＮＡ分析装置（了プライドハイオシステムズインコーポレイテッド）を使用 して、位ｆｉｔｌｏｌにおけるグリシンの代りにアラニン置換を導入するために 合成した。デオキソオリゴヌクレオチドを分離用ポリアクリルアミドゲル電気泳 動により精製した。

ｐＭＯＮ９５６３の６６０　ｂｐＥｃｏＲ［−ＨｌｎｄｌＩ［フラグメントをＥ ｃｏＲｌ−Ｈｉｎｄ［ＩＩ消化されたＭ１３ｍｐｌＯバクテリオファージベクタ ーにューイングラントバイオラブズ）中にサブクローンした。アマースハムイン コーポレイテッド（イリノイ州アーリントンハイツ）によるＭ１３クローニング 及び配列決定ハンドブックに記載のようにして、１本鎖鋳型ＤＮＡをサブクロー ンから生成し、オリゴヌクレオチド突然変異反応を上記のオリゴヌクレオチドを 使用するシーラー及びスミス（１９８３）により記載されたようにして実施した 。このプラスミドをＮ９５５１と命名した。ｐＭＯＮ９５５１の６６０ｂｐＥｃ ｏＲ［−Ｈｌｎｄ［ｒｌフラグメントを、ＥｃｏＲＩ及び旧ｎｄ［ｒ［部位の間 のｐＭＯＮ９５６３内に挿入し、対応する野性量フラグメントを置換した。この プラスミドをｐ　Ｍ　ＯＮ９５６６と命名した。

ｐＭＯＮ３４２及びｐＭＯＮ９５６６中のペチュニアＥＰＳＰシンターゼを発現 するために使用される二重ｐＬプロモーターは、酵素を非常に高いレベルで発現 する。

ｐＭＯＮ３４２により生成された酵素は野性型形態であるか、この酵素は、これ らのプロモーターの一方を宿す細菌か成長培地中で非常に高いレベルのグリホセ ート（＞５０ｍＭ）に対して耐性であるような高い濃度で存在する。酵素のグリ ホセート耐性形態を選択することを可能にするプロモーターを生成するために、 高発現λファージｐＬプロモーターをより弱いプロモーター配列により置換する ことか必要であった。このようなプロモーターを同定するプロモーターは下記の ようにして構築した：　ｐＭＯＮ　９５４４、ｐＭＯＮ３４２のプリカーサ−を 、ＢａｍＨｌにより消化してｐＬプロモーターを除去し、連結により再び円状に してｐＭＯＮ３６２を得た。次し１で、ペチュニアＥＰＳＰＳＣＤＮＡの３゛部 分を含むｐＭＯＮ９５５６のＥｃｏＲＩ　フラグメントを全コード配列を再構築 するこのプラスミドのＥｃｏＲ［部位中に挿入した。

得られたプラスミド、ｐＭＯＮ３６４は、ＥＰＳＰシンターゼコート配列のプロ モーター５′かないこと以外は、ｐＭＯＮ３４２と同じである。

先のクローニングを促進するために、そこからプロモーター要素か欠失されたｐ ＭＯＮ３６４のＥｃｏＲＩ　／Ｐｓｔ［フラグメントを、はとんとのＥＰＳＰソ ンターセｃＤＮＡを含むｐＭＯＮ９５６３のＥｃｏＲＩ　／Ｐｓｔ［７ラグメン トに連結させてｐＭＯＮ９５６４を生成する。このプラスミドは、ＥＰＳＰシン ターゼｃＤＮＡの３゛末端における非反復Ｃｌａ［部位及びＥＰＳＰンンターゼ コート配列内に非反復ＥｃｏＲＩ部位を有すること以外は、ｐＭＯＮ３６４と同 一である。５Ｒ４８１（〕く・ソノ１マンら、１９８０：バジエソトら、１９８ ７）のようなａｒｏ　ＡＥ、ｃｏｌｉの形質転換は、突然変異体を補うことかで きず、このことは、プロモーター領域のを効な欠失及びε、ｃｏｌｉ中てこのプ ラスミドかＥＰＳＰシンターゼを生成することかできないことを示している。経 験的スクリーニング方法を使用して、下記の方法により、Ｅ、ｃｏｌｉ中の適当 な低レベルの発現を存するプロモーターを単離した。

Ｂ）一連のプロモーター構造物の生成 Ｅ、ｃｏｌｉ株ＳＲ２０（０Ｍ４２ｈｆｒ　、　ｈｉｓ−１ｄａｍ３−　）から 単離された染色体ＤＮＡを、Ｍｂｏ［により完全に消化した。このＭｂｏ［フラ グメントをプラスミドｐＭＯＮ９５６４のＢｇｌ［１部位中にクローニングした 。Ｂｇｌ［［部位は、Ｅ、ｃｏｌｉの発現のために仕立てられたプロモーターな しのペチュニアＥＰＳＰＳコード配列の上流に存在する多重リンカ−中にある。

連結反応混合物を使用して、Ｅ、ｃｏｌｉ株５Ｒ４８１、内生的ＥＰＳＰＳ活性 がないａｒｏ　Ａ変異体を形質転換した。５Ｒ４８１のａｒｏ　Ａ欠陥を補い最 小培地上での細胞の成長を支持する、ペチュニアＥＰＳＰＳｅＤＮＡを発現する に十分なプロモーター活性を有するＭｂｏｌフラグメントを含む４１のコロニー を得た。この４１のコロニーを、１，５．１０，１５及び２０ｍＭの濃度のグリ ホセートを含むＭＯＰＳ最小培地上に個々に縞状に塗布した。増加する濃度のグ リホセート上での細胞の成長の量を、ペチュニアＥＰＳＰＳコード配列を発現す る各Ｍｂｏ［フラグメントの比較プロモーター強度の基準として使用した。Ｍｂ ｏ［プロモーターフラグメントの各々をさらに特性化するために、プラスミドミ ニブレツブＤＮＡを、４１コロニーの各々からアルカリリーシス方法により生成 し、ＥｃｏＲＩ　、　ＢａｍＨ［、Ｈｉｎｄ［［Ｉ、Ｃ１ａ［及び　Ｎｃｏｌに よりそれぞれ消化した。これらの制限酵素は、ペチュニアＥＰＳＰＳコード配列 中で切断しまたはその側面に位置し、突然変異生成されたフラグメントを可動化 させるために使用できるので、選択された。

従って、理想的なプロモーターフラグメントは、これらの酵素のいずれに対して も限定部位を有しない。上記の酵素の制限部位を欠く変化する程度のプロモータ ー活性を有する８Ｍｂｏｌのフラグメントか存在した。そのうちの２つ、ｐＭＯ Ｎ８１０５及び１）ＭＯＮ８１４３をさらに特性化するために選択した。両プラ スミドは、ａｒｏ　Ａ欠陥を補い、１ｍＭ（ｐＭＯＮ８１０５）及び２０ｍＭ（ ｐＭＯＮ８１４３）まてのグリホセートを含む最小培地上の５Ｒ４８１の成長を 支持した。

Ｃ）発現ベクターの試験 異種構造の発現システムを、知られた変異体を使用して試験し、ペチコニアＥＰ ＳＰＳのグリホセート耐性変異体か選択されたか否かを調へた。グリホセート耐 性突然変異、グリシン（１０１）からアラニンを、ｐＭＯＮ８１０５及びｐＭＯ Ｎ８１４３発現ベクターのペチュニアＥＰＳＰＳコード配列中に導入して、ｐＭ ＯＮ８１３５及びｐＭＯＮ８１５２のそれぞれを生成した。これは、両ベクター 由来の６６０　ｂｐＥｃｏＲ［−）１ｉｎｄＩＩ！領域を、グリシン（＋０１） からアラニンの突然変異を含むｐ　Ｍ　ＯＮ９５６６由来の６６０　ｂｐＥｃｏ Ｒ［−Ｈｌｎｄ［ｔ［領域により置換することによって達成された。両ｐＭＯＮ ８１３５及びｐＭＯＮ８１５２を使用して５Ｒ４８１を形質転換した。

ｐＭＯＮ８１５２構造物は、５Ｒ４８１中のａｒｏ　Ａ欠陥を補い、５０ｍＭま でグリホセートを含む最小培地上ての細胞の成長を支持することかできた。

知られた変異体酵素配列を含む弱発現ｐＭＯＮ８１３５（図２）は、５Ｒ４８１ 中のａｒｏ　Ａ欠陥を補うことかできず、最小培地上で細胞生成を支持しない。

ｐＭＯＮ８１３５プラスミドを担持する５Ｒ４８１細胞の培養物をアッセイして 、ペチュニアＥＰＳＰシンターゼ酵素か発現されたことか示された。プラスミド ｐＭＯＮ８１３５は、４１　ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質の特異的活性を有し 、ｐＭＯＮ８１０５は、２８　ｎｍｏｌ／分／ｍｇタンパク質の特異的活性を育 している。従って、親の構造物ｐＭＯＮ８１０５と類似の特異的活性を有するｐ ＭＯＮ８１３５はＥ、ｃｏｌｉ中に発現された。次いで、変異体酵素のＰＥＰの Ｋｍの増加（野性型の５．２μＭに対して１９８μＭ）により、酵素か低いレベ ルで生成された場合にａｒｏ　Ａ突然変異体の成長を支持することかてきない比 較的無能なＥＰＳＰシンターゼ酵素か得られることが仮定された。

この結果、ＰＥＰのＫｍの重要性及び変異体ペチュニアＥＰＳＰＳ酵素かＥ、ｃ ｏｌｉ中で弱く表現されたときにａｒｏ　Ａを補う能力か示された。変異体酵素 がＰＥＰの高Ｋｍを有していれば、より高いレベルの発現かａｒｏ　Ａを補うた めに要求される。従って、弱い発現ベクター、ｐＭＯＮ８１０５は、ＰＥＰの比 較的低いＫｍ値を存するペチュニアＥＰＳＰＳ変異体を同定するための新規で強 力な選択器具を提供する。グリホセート選択と合わせて、著しいグリホセート耐 性とＰＥＰの低いＫｍ値を合わせた変異体を得ることかできる。このことは、野 性型酵素の新規な変異体をこのシステムから得ることかできることのみならず、 それを使用して、グリホセート耐性を維持しなからＰＥＰのＫｍを低下させるグ リシン（１０］）からアラニン変異体コード配列中の第２部位突然変異変異を選 択することができることを意味している。

この予期されなかった強力な選択システムは、本発明の１部を構成する。当業者 は、本発明の精神及び範囲から逸脱せずに、ａｒｏＡｍ菌のその池の株、その他 の挿入方法、ランダムＤＮＡフラグメントのその他の起源及びペチュニア以外の 生物由来のコード配列を利用できることを理解するであろう。

Ｄ）ｐＭＯＮ８２０５ベクターの構築 プラスミドｐＭＯＮ８２０５は、ｐＭＯＮ８１３５ベクター中のＥＰＳＰＳコー ト配列の９９４ｂｐ３’半及びＨｉｎｄ［［Ｉ及びＣ１ａ［部位の間の３′非翻 訳化領域を、ｐＭＯＮ９５３由来の同じ領域で置換することによって構築された 。このことによって、内部Ｎｃｏ［部位か欠失し、ペチュニアＥＰＳＰＳグリシ ン１０１からアラニンコート配列を含む発現ベクターを与え、遺伝子の開始にお けるＮｅｏ　［を非反復にして、つぎのサブクローニング工程を支持する。また 、非反復Ｘｂａ［部位は、翻訳停止部位の後の遺伝子の３′末端において与えら れ、つぎのサブクローニング工程を支持した。

内部Ｎｃｏ　［部位を削除して、Ｘｂａ１部位を、２の部位特異的突然変異生成 によりＥＰＳＰＳコード配列中に生成し、ｐＭＯＮ９５３を下記のようにして生 成した。ペチュニアＥＰＳＰＳコード配列の３′末端及びｐＭＯＮ９５６６由来 の３′非翻訳領域を含む９９４ｂｐ旧ｎｄ４１１−Ｃ１ａ［フラグメントを、ブ ルースクリプトｐＢＳＫＳ＋ベクター中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ９７６ ３を生成した。

−重鎖ＤＮＡ鋳型を生成し、Ｘｂａ１部位を、クンクルの方法及び下記の合成り ＮＡオリゴヌクレオチドプライマを使用する部位特異的突然変異生成によって導 入した。

得られたプライマーはｐＭＯＮ９７６６であった。ペチュニアＥＰＳＰＳ中のＮ ｅｏ　［部位を除去するために、−重鎖鋳型を部位特異的突然変異生成のために ｐＭＯＮ９７６６から生成した。突然変異生成において使用される合成オリゴヌ クレオチドは、下記配列：５°−ＧＡＴＣＡＣＡＧＧＡＴＧＧＣＡＡＴＧＧＣＴ ＩＴｒＴＣＴＣＴｒ−３゜を育していた。

Ｎｃｏ　［欠失を含む得られたプラスミドはｐＭＯＮ９５０である。ｐＭＯＮ９ ５０由来のｌ　、ＯＯｋｂＨｉｎｄ［［ｌ−Ｃ１ａｌペチユニアＥＰＳＰＳフラ グメントを、野性型ペチュニアＥＰＳＰＳ遺伝子の残部を含むｐＭＯＮ９７３１ の４゜０８　ｋｂＨｉｎｄ［［１−Ｃ１ａ［フラグメントに融合した。得られた プラスミド、ｐＭＯＮ９５３は、内部Ｎｃｏ１部位か欠失され再構築された野性 型ペチュニアＥＰＳＰＳ遺伝子、葉緑体トランンソトペブチト、ＧＩＯリーダー 及びＥ、ｃｏｌｉ発現のためのＰｒｅｃＡプロモーターを含む。

Ｅ）ｐ〜ｆＯＮ８２０５のＮ−メチル−Ｎ′−ニトロ−Ｎ−ニトロソグアニジン （ＮＧ）によるインビボの突然変異生成 下記の突然変異生成手順は、ペチュニアＥＰＳＰＳ酵素のグリシン（１０１）か らアラニン変異体のこのような第２の部位変異体を得るためのこの選択システム の応用例として作用する。Ｎ−メチル−Ｎ゛−二トローＮ−ニトロソグアニジン （ＮＧ）は、通常突然変異原として細菌遺伝学において使用される強力なメチル 化化合物である。これは主にＧＣ・・・＞ＡＴ塩基トランジションを誘発するか 、ＡＴ・・・＞ＣＣ）ランジション、トランスバージョン及びフレームソフト変 異もまた誘発することかできる。プラスミドｐＭＯＮ８２０５はＥ、ｃｏｌｉＪ 〜Ｎ　０１中に形質転換された。培養物４ｍｌは、５０μｇ／ｍｌのカルベニシ リンを含む２ＸＹＴ培地中で一晩成長させて飽和状態とした。この培養物を１１ １１１づつに４分割した。次いて各分割を、２ＸＹＴ培地４０ｍ１により４０倍 に希釈し、２５０ｍ１のクレット側腕フラスコ中に入れた。４連のクレットフラ スコを３７°Ｃて水浴中で連続的に振盪し、培養物か約１００クレツト単位のク レット値まで成長するまで、クレットーサマージン光電比色計により成長を監視 した。次いて、この細胞を７．０００ｒｐｍで５°Ｃにおいて５分間回転するこ とにより、遠心分離により細胞をオークリッジのねじ蓋管中でペレット化するこ とにより採取した。各細胞ベレット（全部て４）を、０．１Ｍクエン酸ナトリウ ム４０＋ｎｌ、　ｐＨ５，５により２度洗浄し、各洗浄の後で上記のようにして ペレット化した。各細胞ペレットを０．１Ｍクエン酸ナトリウム３２ｍ１、ｐＨ ５゜５中に再懸濁し、０．１Ｍクエン酸ナトリウムｐＨ５，５緩衝液中で生成さ れたｌ　ｍｇ／　ｍｌＮ　Ｇ　（ミズーリ州セントルイスシグマケミカルカンパ ニー）ストック１．６ｍｌを前記４連の試料の各々に添加した。

４連制試料の各々におけるＮＧの最終濃度は５０μｇ／ｍｌであった。次いでこ の試料を３７°Ｃにおいて、５．１Ｏ１２０または３０分間インキュベートした 。この細胞を上記のようにして各試料からペレット化した。この細胞ペレットを 、その後各々０．１Ｍリン酸塩緩衝液３０ｍ１ｐＨ７，０により２度洗浄し、各 洗浄の後にペレット化した。次いてこのベレットを再懸濁し、最終容量か２５０ ｍ１２ＸＹＴとなるように一緒にプールした。次いで培養物を３７°Ｃの水浴中 で全部で２．５時間連続的に振動した。次いて、遠心分離瓶５００１１１１中で ペレット化し、ヘックマンＪＡ回転装置中て７，０００ｒｐｉｌにおいて５℃で １０分間それを回転することによって、細胞を採取した。この細胞ベレットを次 いで一２０℃に凍結した。

このペレットを解凍し、突然変異生成されたｐ　Ｎｉ　ＯＮ　８２０５プラスミ ドＤＮＡを下記の標準アリ力すリーシス手順に従って抽出した。

Ｆ）グリホセート耐性コード配列変異体のスクリーニング 多重工程スクリーニング方法を使用して、ペチュニアＥＰＳＰＳのグリホセート 耐性変異体を同定した。第１のスクリーニング工程は、Ｅ、ｃｏｌｉのＮＧ突然 変異生成されたｐＭＯＮ８２０５プラスミドＤＮＡによる形質転換及びグリホセ ートを含存する最小培地上でのグリホセート耐性コロニーの選択を含む。ＳＲ４ ８１ａｒｏ　Ａ　−Ｅ、ｃｏｌｉ株は、形質転換頻度か非常に低く、最大でプラ スミドＤＮＡ　１μｇ当り１０’形質転換体を生成する。この問題を克服するた めに、プラスミドＤＮＡ　１μｇ当り１０”までの形質転換体の形質転換有効率 か日常的に得られるので、Ｅ、ｃｏｌｉ株ＪＭＩＯＩを使用した。しかしなから 、ＪＭＩＯＩは、全機能ａｒｏ　Ａ遺伝子を含み、ＭＯＰＳ最小培最小−地上す ることかできた。ＪＭＩＯｌを種々の濃度のグリホセートを含む最小培地で平板 培養することによって、２ｍＭのグリホセートか、内生的ＥＰＳＰシンターセ酵 素活性及び最小培地上でのＪＭＩＯｌの成長を阻害することか測定された。弱表 現野性型ペチュニアＥＰＳＰシンターセｃＤＮＡ構造物（ｐＭＯＮ８１０５）は 、１ｍＭグリホセート上てのａｒｏ　Ａ−Ｅ、ｃｏｌｉ株、５Ｒ４８１の成長を 支持することかできず、対応するグリシン１０１からアラニン構造（ｐＭＯＮ８ １３５）は細菌ａｒｏ　Ａを補うことかできないので、グリホセート濃度か２ｍ Ｍよりも高い場合は、Ｅ、ｃｏｌｉの無機物栄養接種株を選択のために使用する ことかできる。ＮＧ突然変異生成されたｐＭＯＮ８２０５プラスミドＤＮＡは、 ＪＭＩＯｌ中に形質転換され、グリホセート耐性変異体は、１０ｍＭグリホセー トを含むＭＯＰＳ最小培最小−地上された。

グリホセート耐性コロニーは、ペチュニアＥＰＳＰシンターゼコード配列中のプ ロモーター突然変異体、復製数突然変異体及びグリホセート耐性突然変異体を包 含する種々の突然変異体とともにｐＭＯＮ８２０５プロモーターを含んでいた。

プラスミド複製数を増加させ、またはＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を作動するため に使用されるプロモーターの強度を増加させる突然変異体は、細菌中のＥＰＳＰ シンターゼ酵素の量を増加させ、細胞に、ａｒｏ　Ａのプラスのグリホセート耐 性発現量を与えるであろう。ＮＧ突然変異生成されたｐＭＯＮ８２０５プラスミ ドの非コート領域中の突然変異を削除するために、グリホセート耐性コロニーを 、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む２ＸＹＴ液体培地中に一緒にため、撹拌 により細胞に通気しなから３７°Ｃにおいて一晩成長させた。次いて、この細胞 を、遠心分離により飽和した培養物からペレット化し、プラスミドＤＮＡをアル カリリーシス方法を使用して抽出した。次いて、ブラスミ１〜ＤＮＡをＮｃｏｌ 及びＣ１ａ［酵素により完全に消化し、１，７３ｋｂのペチュニアＥＰＳＰＳコ ード配列領域を０．８０６シーブラク（Ｆ〜ＩＣコーポレーソヨン）低ゲル化温 度アガロースゲルから精製した。１　、　７３　ｋｂＮｃｏ［−Ｃ１ａ［フラグ メントを使用して、上記のようにして単離されたこのプラスミドの３．　６２ｋ ｂＮｃｏｌ−Ｃ１ａｌベクターフラグメニノト（ここれを連結することにより、 非突然変異生成されたｐ〜ｆＯＮ８１０５発現ベクター中の野性型コード配列を 含む類似のフラグメントを置換した。次いて、この連結反応混合物を使用して、 ＪＭＩＯＩ細胞を形質転換し、ｌ０ｍＭグリホセートを含むＭＯＰＳ最小培最小 −地上、ペチュニアＥＰＳＰシンターセコード配列領域中のグリホセート耐性突 然変異体を選択した。

サブクローニングされたコード領域の形質転換から得られるグリホセート耐性コ ロニーを、種々の濃度のグリホセート中ての液体培養物中の各変異体の成長の速 度を測定することによって、さらに特定化した。この生長曲線分性は、第３のス クリーンとして機能し、下記の方法により実施された。

グリホセート耐性コロニーを、選択プレートから採り出し、ＭＯＰＳ培地１ｍｌ 及び５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む前培養物中に別個に接菌した。前培養 物を３７°Ｃにおいて一晩振盪することによって、飽和状態まで成長させた。翌 朝、各培養物の密度は、それぞれから１００μＩづつ採取し、それを追加の９０ ０μｍのＭＯＰＳ培地により１０倍に希釈し、次いて分光光度計によって６６０ ｎｍの波長において光学濃度を読むことによって決定した。次いて、飽和された 各前培養物５０μｌを、０．５または１０ｍＭグリホセートを含むＭＯＰＳ培地 ５＋ｎｌに添加することによって、この飽和された前培養物を１％に希釈した。

希釈された前培養物を、ステンレス鋼のクロージヤーを取り付けられたガラス培 養管内において、３７°Ｃにおけるホイール上で回転させて成長させた。このガ ラス培養管は、クレットーサマーラン光電比色計中て直接読むように設計されて おり、それを使用して、約３時間の間隔て細菌培養物の生長をモニターした。

＃７４２と命名されたｌの培養物か、！Ｏｎ＋Ｍグリホセートを含むＭＯＰＳ培 地中で非常に速く生長することか同定された。培養物＃７４２は、培地のための ペチュニアＥＰＳＰＳＧＡ　ｌ　０１　ＧＤ　１４４の陽性対照培養物と同様に 、また試験されたその他のグリホセート耐性培養物より著しく良く、６４％生長 した。ペチュニアＥＰＳＰＳＧＡ１０１Ｃ；Ｄ１４４対照培養物は、位置１０１ においてグリシンからアラニン置換及び、位置１４４においてグリシンからアス パラギン酸置換を存するＥＰＳＰＳ遺伝子の変異体の代表である。この変異体は 、本明細書中に参考文献として採り入れられている「グリホセート−耐性５−エ ノールビルビル−３−ホスホシキメートシンターゼ」という名称の現在継続中の 同一出願人に係る米国特許出願第０７／３８０，９６３号中に記載されている。

Ｇ）グリホモ−１−耐性コード配列変異体の特性化＃７４２前培養物（〜７５０ μｌ）の残りを使用して、５０μｌ／ｍｌカルベニシリンを含む２ＸＹＴ培地２ ｍｌに接種し、３７°Ｃにおいて一晩振盪し、飽和に達しさせた。

プラスミドＤＮＡを、アルカリリーシス方法を使用して、飽和された培養物のア リコートから単離した。このプラスミドをｐＭＯＮ８２５２と命名した。ｐＭＯ Ｎ８２５２プラスミドを少量使用してＥ、ｃｏｌｉ宿主５Ｒ４８１（上記記載） を形質転換し、１０ｍＭグリホセート及び５０Ｍｇ／ｍｌカルベニシリンを含む ＭＯＰＳ培地上で再選択した。ｐＭＯＮ８２５２の単一のグリホセート耐性コロ ニーを選択プレートから採り出し、使用して５０Ｍｇ／ｌｎＩカルベニシリンを 含む２ＸＹＴ細菌培地３ｍｌに接種した。飽和に達するまで、この培養物を３７ °Ｃにおける回転ホイール上で通気し、次いで大きい２５０ｍ１の培養物に接種 した。この大培養物は、それを３７°Ｃにおける水浴中において一晩連続的に振 盪することによって、飽和となるまで成育させた。細菌細胞を溶解し、抽出物を ＥＰＳＰＳ活性についてアッセイした。

特に、細菌細胞ペーストを、０．９％食塩水により２度洗浄し、緩衝液（１００ ｍｌトリスＨＣＩ、５ｍＭベンズアミジンＨＣＩ）中に懸濁し、フレンチプレッ シャーセルを１０００ｐｓｉにおいて２度通過させた。１５．００ＱＸｇで５℃ において１０分間遠心分離して、細胞抽出物を細胞から分離した。これを、セフ ァデックスＧ−５０にュージャージー州ビスケートウェイのファルマシア）を使 用して脱塩した。脱塩された抽出物を下記のようにして、ＥＰＳＰシンターゼ活 性についてアッセイした。

５０ｍＭＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ，ｐＨ７中のレキメート−３−ホスフェート（２１ Ｍ）、１４０−ホスホエノールピルベート（１ｍＭ、１．　２ｍＣｉ／ｍｍｏｌ ）　、モリブデン酸アンモニウム（０，１ｍＭ）、フッ化カリウム（５ｍＭ）を 含む混合物（４０μＩ）に、前記抽出物ｌＯμＩを添加し、２５°Ｃにおいて２ 分間インキュベートした。この反応物を９０％エタノール１０．１Ｍ酢酸５０μ １ＳｐＨ４，５を添加することにより急冷した。反応混合物７０μＩをシンクロ パックＡＸ１００ＨＰＬＣカラム（０，４Ｘ２５　ｃｍ）上に充填し、カラムを ０．５Ｍリン酸カリウム、ｐＨ５，５により、１ｍｌ／分溶離した。溶離剤の放 射能をラジオマチイックＦｌｏ−Ｏｎｅβインストゥルメント（フロリダ州うジ オマティックス）を使用してモニターした。

ＥＰＳＰシンターゼ活性を、”Ｃ−Ｐ　Ｅ　ＰからＩ４Ｃ−ＥＰＳＰシンターゼ （両者は、上記のクロマトグラフィー条件下で分離した）への添加の測定により 決定した。

抽出物のタンパク質含量は、バイオラッド（カリフォルニア州バイオラッドラブ ズ）の方法により測定した。抽出物の比活性は、生成されたＥＰＳＰシンターゼ ｎｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇとして表示する。

反応速度定数（みかけのＫ　ｍ　Ｐ　Ｅ　Ｐ及びみかけのＫｉグリホセート）を 、下記のようにしてＥＰＳＰシンターゼについて測定した。基質反応速度パラメ ーターを、２ｍＭ３３　Ｐ及び変化する量の”Ｃ−ＰＥＰ　（Ｉ　ＯｕＭ　〜４ ００μＭ）の存在下で、２．０分間２５°Ｃにおいて、５０ｍＭＨＥＰＥＳ　（ Ｎ−［２−ヒドロキシエチルコピペラジン−Ｎ’−［２−エタンスルホン酸］緩 衝液中でｐＨ７，９で測定した。反応物質をエタノール中の１００ｍＭ酢酸ナト リウム、ｐＨ４，５により急冷し、遠・し・分離し、流出物の放射能検出による ＨＰＬＣにより生成物ＥＰＳＰの生成をアッセイした。ＨＰＬＣ条件は、１．０ ｍｌ／分におけるシンクロバックＡＸ１００カラム上での０．３５ＭＫＰ　ｉ、 Ｉ）Ｈ６，５であった。得られた速度を、双曲線プロット、ラインウイーバーー バークブロノト及びイーディーーホフスティープロットによりブロユートシ、Ｐ ＥＰの平均Ｋｍ値を得た。グリホセート対ＰＥＰの見かけのに１は、変化する濃 度のグリホセート（０，１００，２００，４００μＭ）の存在下であること以外 は、基質速度反応定数について記載された方法により決定した。初期速度データ は、！／　［ＰＥＰ］対Ｉ／Ｖとしてプロットし、得られた線のスロープを［グ リホセート］に対して再プロットした。

アッセイの結果、ｐ〜１ＯＮ８２５２プラスミドを含む細菌細胞は、得られたＥ ＰＳＰＳ　３３ｎｍｏｌ／分／タンパク質ｍｇのＥＰＳＰシンターセ活性を存し ていることが示された。この酵素は、６８３μＭのグリホセートに対するＫｉて 示されるようにグリホセートに対する高い耐性を存していた。ＰＥＰのＫｍは、 ５４μＭであると測定された。ペチュニアＥＰＳＰＳグリシン（１０１）からア ラニン変異体は、２０００μＭのグリホセートのＫｉ及び２００μＭのＰＥＰに 対するＫｍを有している。

ｐＭＯＮ８２５２コードされたグリホセート耐性変異体酵素のＫｉ／Ｋｍ比は、 １２．６であり、これは、その比かｌ０００である原種グリシン（１０１）から アラニン変異体のそれと似ている。しかしなから、ｐＭＯＮ８２５２酵素は、グ リシン（１０１）からアラニンの変異体よりも４倍低いＰＥＰのＫｍを存してい る。高濃度のグリホセートを含むＭＯＰＳ培地でのベクターの弱プロモーターを 用いて発現させた場合ても、Ｅ、ｃｏｌｉの成育を支持てきる能力によって示さ れるように、ＰＥＰのＫｍを低下させることによって、ｐＭＯＮ８２５２変異体 酵素を反応速度的に有効にてきる。このことは、選択システムが、最初の変異体 のグリホセート耐性を維持しているかＰＥＰのＫｍを低下させるペチュニアＥＰ ＳＰＳグリシン（１０１）からアラニン変異体酵素の突然変異を誘発し同定する ことを可能にすることを示している。

ｐＭＯＮ８２５２の結果は、ＰＥＰのＫｍにおける改良か上記の異種構造の細菌 表現システム中で選択され得ることを示唆している。

Ｉ−ｆ）　ｐＭＯＮ　８２５２突然変異体の同定ｐＭＯＮ８２５２変異体ＥＰＳ Ｐソンターセ酵素の改良されたグリホセ−１・耐性のためにＮＧ誘導されたアミ ノ酸変化を同定するために、全コート配列領域のＤＮＡ配列を決定した。ｐＭＯ Ｎ８２５２ブラスミｌ”　Ｄ　Ｎ　Ａを、鋳型として二本鎖プラスミドＤＮＡを 使用するサンガーのジデオキシＤＮＡ配列決定方法により直接配列決定した。ペ チュニアＥＰＳＰＳ配列に相同の５の合成りＮＡオリゴヌクレオチドを使用して 、ｌの隣接する配列中の全コード配列領域を配列決定した。合成りＮＡオリゴヌ クレオチドブライマーは、１７ヌクレオチの長さてあり、互いに約３００ｂｐ離 隔していた。二本鎖ｐＭＯＮ８２５２プラスミドＤＮＡ約３００ｎｇを各配列決 定反応のために使用した。２０μｌ容量内の二本鎖プラスミドＤＮＡを、２ＭＮ ａＯＨ／２ｍＭＥＤＴＡ溶液２μｍを添加し、室温において５分間インキュベー トし、次いて３Ｍ酢酸ナトリウム３μｌ、ｐＨ４，８の添加による中和によって 変性した。この容量を水７μｌを添加することによって３２μｌに希釈した。変 性されたプラスミドＤＮＡをエタノール７５μｌの添加、乾燥氷上での５分間の 凍結、次いて微遠心分離中ての５℃における１０分間の遠心分離により沈殿させ た。ＤＮＡペレット・を水７μｌ中に溶解した。合成オリゴヌクレオチドブライ マーＤＮＡ（５０ｇ）を変性されたプラスミドＤＮＡにアニーリングし、ユナイ テッドステーツバイオケミカルコーポレーションから商業的に入手てきるＤＮＡ 配列決定ギ・ソト由来の試薬及び方法を使用して配列決定した。グリシン（１０ １）からのアラニンへの置換の存在をＤＮＡ配列中て確認した。さらに、成熟ペ チュニアＥＰＳＰシンターセ中のアラニン１９２に対するＧＣＴコドンの第１ヌ クレオチド位置に単一のグアニンからアデニンのトランジションかあり、位置１ ９２におけるアラニンからスレオニンアミノ酸置換をもたらした。グアニンから アデニンのトランジションは、ＮＧによって誘導される知られた突然変異の型と 一致する。追加の点変異か認められたが、アミノ酸は保存された。点変異は、ア ミノ酸位置４におけるグルタミン酸のＧＡＧコドンの第３の位置におけるグアニ ンからアデニントランジションであった。得られたコドン、ＧＡＡは、グルタミ ン酸をコードする。従って、ｐＭＯＮ８２５２コードされたグリホセート耐性ペ チュニアＥＰＳＰＳ変異体酵素の反応速度特性は、下記の２つの置換の組合せに よるものである：１はグリシン（１０１）からアラニンの変化、もう一方は、ア ラニン（１９２）からスレオニンのアミノ酸変化である。

グリシン（１０１）からアラニン及びアラニン（１９２）からスレオニンの置換 を含むペチュニアＥＰＳＰシンターゼコード配列は、植物細胞中ての適当な発現 のために操作された。植物細胞の中間体植物形質転換ベクター及びＡｇｒＯｂａ Ｃｔｅｒｉｕｌｌｌ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓベースの形質転換の構造を以下に 記載する。

ｐＭＯＮ　ｌ　Ｏｏ　７９の構築 ｐＭＯＮ１００７９（そのマツプは図３に示す）は下記のＤＮＡセグメントを含 む。細菌スベクチノマイノン／ストレプトマイシン耐性（Ｓｐａ／５ｔｒ）をコ ートしＥ、ｃｏｌｉ及びＡｂｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ 　（フリングら、＋　９８５）中ての選択のための決定基である１−ランスボゾ ンＴｎ７から単離された０、９３ｋｂフラグメント。これは、形質転換された組 織の選択を可能にするために植物での発現に対して操作されたキメラカナマイシ ン耐性遺伝子に接合される。このキメラ遺伝子は、０．５３ｋｂカリフラワーモ ザイクウイルス３５Ｓプロモーター（Ｐ−３５３）（オーデルら、１９８５）、 ０．８３ｋｂネオマイシンホスホトランスフエラーセタイブＩＩ遺伝子（Ｋ　Ａ 　Ｎ　）及びノーバリンシンターゼ遺伝子の０．２６ｋｂ３’　非翻訳化領域（ ＮＯＳ−３”）（フレイリーら、１９８３）からなる。次のセグメントは、ＲＫ ２プラスミド由来の複製の０．７５ｋｂ起点（ｏｒｉ−Ｖ　）　（スタルカーら 、１９８１）である。これは、Ｅ、ｃｏｌｉ中での維持のための複製の起点（ｏ ｒｉ−３２２）及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ＋ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞 中への接合転移のためのｂｏｍ部位を与えるｐＢＲ３２２の３　、］　ｋｂｓａ ｌ［からＰｖｕ［セグメ：／　ｌ−１：接合される。次は、ノーバリン型Ｔ−Ｄ ＮＡ右端領域（フレイリーら、１９８５）を含むｐＴｉＴ３７ブラスミト由来の ０　、　３６　ｋｂＰｖｕｌからＢｃｌｌフラグメントである。

最後のセグメントは、植物中に５−エノールビルビルツキメート−３−ホスフエ ートシンターセ酵素（ＥＰＳＰＳ）を過剰生産するように操作されたキメラ遺伝 子である（シャーら、１９８６）。このキメラ遺伝子は、ゴマノハグサモザイク ウィルスの０．６ｋｂ３５Ｓプロモーター（Ｐ−Ｆ〜Ｉ■）（ゴウダら、１９８ ９）、２つのアミノ酸変化（ｇｌｙ−ａｌａ　、　ａｌａ−ｔｈｒ　）を有する １　、６１ｋｂ　Ｐｅｔｕ旧ａ　ｈｙｂｒｉｄａ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ及びマメ ｒｂｃＳ−Ｅ９遺伝子の０．７ＫＢ３’非翻訳化領域（Ｅ９３’）（コルッジら 、１９８４及びモレリら、１９８５）からなる。

ｐＭＯＮ１００７９ベクターを、脱武装したＴｉプラスミドｐＴｉＣ５８（コン クズ及びシェル、１９８６）を担持するＡ　Ｂ　Ｉ　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕ ｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ株２０８中で可動化した。このＴｉプラスミドは、 Ｔ−ＤＮＡ植物ホルモン遺伝子を担持せず、従ってこの株は、クラウンゴール病 を引起こすことかできない。ｐＭＯＮｌ　００７９（７）ＡＢ　Ｉ中への交配は 、ヘルパープラスミドｐＲＫ２０１３（ディツタら、１９８０）を使用する三親 接合システムにより行われる。植物組織をＡＢＩ：：ｐＭ。

Ｎ１００７９接合物とともにインキュベートしたときに、このベクターは、脱武 装したｐＴｉ５８プラスミドによりコートされたｖｉｒ機能によって植物細胞に 転移される。

このベクターは、Ｔ−ＤＮＡ右端領域において開環し、全ｐＭＯＮ　Ｉ　００７ ９ベクタ一配列を、宿主植物染色体中に挿入する。ｐＴｉｃ５８Ｔｉプラスミド は、植物細胞へ転移せず、ＡｇｒＯｂａＣｅｒｉｔ１ｍ中に残存する。

ｐＭＯＮ１００７９ベクターにより形質転換されたタバコ植物はグリホセートに 対して耐性を示す。１１本の植物か形質転換され、その植物のＥＰＳＰＳの粗抽 出物を１．０１１１＋１１グリホセートの存在下でアッセイしたときに１１本全 てがグリホセート耐性を示した。従って、位置１０１におけるグリシンからアラ ニン置換及び位１１９２におけるアラニンからスレオニン置換を育するペチュニ アＥＰＳＰＳ変異体は、形質転換された植物にグリホセート耐性を与える。

変異体ＥＰＳＰシンターゼポリペプチド及び本発明のＥＰＳＰＳ遺伝子は、ポリ ペプチドの合成またはＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の単離若しくは突然変異生成に より生成されて、上記のグリホセート耐性分子を生成することかできる。本発明 の最大の存用性は、グリホセート耐性植物の生成にあることが予測されるので、 グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターセをコードするヌクレオチド配列（ｃＤＮＡ またはゲノムのいずれか）は、下記の方法により容易に製造することかできる。

ｃＤＮＡコート配列 全ＲＮＡは、必ずしもこれらに限定されないか、真菌及び植物組織を包含する起 源物質から単離される。ポリ−Ａ　ｍＲＮＡは、オリゴｄＴセルロースクロマト グラフィーによって選択される。次いで、ｃＤＮＡライブラリーは、ポリ−Ａ　 ｍＲＮＡを使用して生成される。次いてこのｃＤＮＡライブラリーは、予めクロ ーン化されたＥＰＳＰシンターゼ配列または適当なオリゴヌクレオチドプローブ を使用してスクリーニングされる。適当なオリゴヌクレオチドプローブは、アミ ノ酸配列（Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ）を有する保存された領域に基づくプロ ーブまたはＥＰＳＰシンターゼ分子のその他の部分のアミノ酸配列に基づくプロ ーブを包含する。次いで、ハイブリッド生成により選択されたｃＤＮＡフラグメ ントは配列決定されて、そのフラグメントかＥＰＳＰシンターゼをコードするこ とを確認し、上記の保存されたアミノ酸配列をコードし隣接するＤＮＡ配列を決 定する。

次いでＥＰＳＰシンターゼクローンは、上記のようにして第１の保育されたアミ ノ酸配列中のグリシンに対するアラニン置換及び第２の保育されたアミノ酸配列 中のアラニンに対するスレオニン置換をもたらすために必要なりＮＡ置換を挿入 するオリゴヌクレオチド突然変異生成により変化される。上記の手順により、選 択された起源物質の野性ａＥｐｓｐシンターゼに基づく本発明のグリホセート耐 性ＥＰＳＰシンターゼをコードするｃＤＮＡ配列を生じさせる。この構造コード 配列は、機能性キメラ遺伝子構造物中に挿入され、形質転換された植物細胞及び 再生された植物を本明細書中に記載の方法を使用して生成することにおいて使用 される適当な植物一般的には、形質転換される植物種由来の植物組織か、本発明 のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼのためのＤＮＡコート配列のための起源 物質として使用されることか好ましい。この方法によれば、形質転換される植物 種から葉緑体トランジットペプチドコード配列を容易に得ることかできるであろ う。場合によっては、内生的ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子遺伝連中見られるイント ロンを含む植物種からゲノムクローンを利用することか育苗である。プローブを 使用して選択された植物組織から構成されるゲノムＤＮＡライブラリーをスクリ ーニングすること以外は、上記に記載の一般的方法を適用することかできる。本 発明のｃＤＮＡ及びゲノムＤＮＡグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターセ構造の製 造を明らかにする詳細な実施例を以下に示す。

上記の突然変異生成方法において使用されたペチュニアＥＰＳＰシンターゼのｃ ＤＮＡクローンを製造するために使用される方法を以下に説明する。その他の植 物起源に由来の野性型ＥＰＳＰシンターセのクローンヲ類似の方法により得るこ とかでき、上記の突然変異体は部位特異的突然変異生成により誘導された。

Ａ、ＭＰ４−Ｇセルラインの製作 ＭＰＪ系と命名された設計された出発セルラインは、ミッチェルディブロイトペ チュニア（例えば、オースベル、１９８０参照）に由来した。このＭＰ４細胞を ムラシゲ及びスクーグ（ＭＳ）培地にューヨーク州グランドアイランド、ギブコ ）中に懸濁した。全ての転移は、懸濁培養物１０ｍ１を新鮮な培地５０ｍ１中に 分配することを含んでいた。次の転移までの培養期間は、１０−１４日間であり 、培養物か飽和に近付いていることの可視的な徴候を基準とした。

飽和懸濁培養物（約５Ｘ１０’細胞を含有）約１０ｍ１を、０．５ｍＭグリホセ ートを含むＭＳ培地５０ｍ１中に転移した。グリホセートのナトリウム塩を、本 明細書中に記載の実験全部において使用した。細胞の大部分がグリホセートの存 在下で再生することかできなかった。生延びた細胞（出発母集団の１９６未満と 見積もられる）をグリホセート０．５ｍＭ中で培養し、グリホセートを含む新鮮 な培地に１０−１４日間毎に移入した。

２回移し換えた後、生延びた細胞を１．０ｍＭグリホセートを含む新鮮な培地中 に移した。１．０ｍＭにおいて２回転移した後、生延びた細胞を２．５＋ｎＭグ リホセート、５．０ｍＭグリホセート及び１０ｍ！１［グリホセート中に連続的 に移入した。

上記のようにして製造されたＭＰ４Ｇ細胞は、その後ササンブロット分析（ササ ン、１９７５）により、「遺伝子増幅」と呼ばれる遺伝子操作（例えばシムケ、 １９８２参照）のためにＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の約１５〜２０の複製を存す ることか示された。自発的突然変異は、いずれかの細胞の復製中に起こり得るか 、遺伝子増幅工程中にＥＰＳＰシンターゼ遺伝子のいずれかの突然変異またはそ の他の修正が生じたことを示す徴候はない、ＭＰ４及びＭＰ４−Ｇ細胞のただ１ つの知られた相違点は、ＭＰ　４−Ｇ細胞か、ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子及び細 胞の染色体上のその近くに存在する可能なその他の遺伝子の多数の復製を含有す ることである。

Ｂ、ＥＰＳＰシンターゼ酵素の精製及び配列決定ＭＰ　４−Ｇセルラインに由来 のペチュニア細胞を真空濾過により採取し、液体Ｎ２下で凍結し、ウェアリング ブレンダーにより粉砕して粉末とした。この粉末を、１ｍＭＥＤＴＡ及び７．５ ％ｗ／ｖポリビニルーポリピロリドンを含む０．２ＭトリスＨＣＬ　ｐＨ７，８ 中に懸濁した。この懸濁液を約２０．０ＯＯＸ重力において１０分間遠心分離し て、細胞破片を除去した。０．１容量の１．４％硫酸プロタミンを添加すること により、核酸を上清から沈殿させ、廃棄した。粗タンパク質懸濁液を、（１）硫 酸アンモニウム沈殿：　（２）ジエチルアミノエチルセルロースイオン交換クロ マトグラフィー：（３）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィｍ：（４）フェ ニルアガロースゲル上の疎水性クロマトグラフィー：及び（５）セファクリルＳ −２００ゲル上のサイジングを含む５の連続工程（ムースゾール及びコギング、 １９８４及びスタインラッケン及びアムルハイン、１９８５参照）により精製し た。

バンカピラー、１９８３ａに記載の方法を使用して、モデル４７０タンパク質配 列決定装置（カリフォルニア州フォスターソティー、アブライトバイオシステム ズインコーボレイテット）によるエドマン分解によって、精製されたＥＰＳＰシ ンターゼポリペプチドを、一連の個々のアミノ酸に分解した。２２，０００を越 える理論プレート（コネティカット州つオリングフォード、ＩＢＭインストゥル メンツ）を有するシアノプロピルカラムを使用して、バンカピラー１９８３ｂに より記載された方法と同様にして逆相高速液体クロマトグラフィーにより、各ア ミノ酸誘導体を分析した。ペチュニアＥＰＳＰシンターゼの部分的アミノ酸配列 を表１に示す。

！−１ ベデ壜士ｆＥＬ？！、５ｊＰ−−ンンタ−ザ配列虐１１０ｍ１１２Ｘ３ アミノ酸、　Ｇｌｉ＋　Ｐｒｏ　！ｉｓ　Ｌｙｓ　Ｇｌｕ　１１６ｍＲＮＡ　馴 ：　Ｓ’ＣＡＪＦ　ＣＣＮ　ＡυＵ　ＧＡＰ　口＃　、ＡＷ合成りＮＡプローブ ： ＩＰＳＰＩ：　コ’−ＧＴＱ　ＧＩＸＰ　ＴＭ　ｍ　Ｃ７０？Ａ１：ＰｓＰ２： 　３’−ＧＴＯＧＧＧ　丁＾ｔ　τ丁ｇｃテＱ　丁＾ＥＰ５ｔ３：　３ｌ−ＧＴ ＯＧＧＮ　ＴＡＴ　ｉ？Ｑ　ＧＴＯ？Ａ正確なｍＲＮＡ　配列： ｓ’−ｃ＾＾ｃｃｃ　ＪｕＪｔＪ　ＡＡ＆　ＧＡＧ　ＡＩＪＩ７Ｃ，プローブの 合成 この遺伝子コードを使用して、表１に示されるアミノ酸配列を、それぞれの示さ れたアミノ酸をコードすることかできる可能なりＮＡコドンを決定するために使 用した。この情報を用いて、３つの異なるプローブ混合物を製作し、表１に示さ れるようにＥＰＳＰＳ−１、ＥＰＳＰＳ−２及びＥＰＳＰＳ−３と命名した。こ の表において、Ａ、Ｔ、Ｕ、Ｃ及びＧはヌクレオチド塩基：アデニン、チミン、 ウラシル、ントシン及びグアニンを示す。文字Ｐ、Ｑ及びＮは変異記号、Ｎはい ずれかの塩基を示す二Ｐはプリン（ＡまたはＧ）：Ｑはピリミジン（ＵＳＴまた はＣ）を示す。すへてのオリゴヌクレオチドはアダムズ（１９８３）の方法によ り合成された。インタミディエートヌクレオチド位置（Ｐ、ＱまたはＮ）に到達 するときにはいつも、適当なヌクレオチドの混合物かこの反応混合物に添加され た。プローブは、使用の直前に、５０ｄトリスＨＣＬ　ｐＨ７，５；　１０ｍＭ ＭｇＣ１ｚ、５ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡ及び０．１ｍＭスペルミジン中 の＋００μＣｉγ−［３２ＰコーＡＴＰ　（アマースハム）及びＩＯユニットポ リヌクレオチドキナーゼにより２０　ｐｍｏｌ標識された。３７°Ｃにおいて１ 時間インキュベーションした後、このプローブを２０％アクリルアミド、８Ｍ尿 素ゲル上で、または０．ＬＭＮａＣ］、１０ｍＭ）リスＨＣＬ　ｐＨ７，５，１ ｍＭＥＤＴＡ中のセファデックスＧ２５の５ｍｌカラム上を通過させることによ り再精製した。

Ｄ、ｍＲＮＡの製造及びプローブの予備試験（ａ）ポリ−Ａ　ｍＲＮＡ 全ＲＮＡをゴールドバーブ（１９８１）の方法により〜ＩＰ４（グリホセート感 受性）及びＬ１４−Ｇ（グリホセ−１・耐性）セルラインから単離した。全ＲＮ Ａをさらにデピッカ−（＋９８２）の方法によりＣｓＣｌクッションを介して沈 降させた。ポリ−Ａ　ｍＲＮＡをオリゴ−ｄＴセルロースクロマトグラフィーに より選択した。

ポリ＝Ａ　ＲＮＡの収率は、ＭＰ４細胞１ｇ当り１．　１マイクログラム（μｇ ）及びＭＰ４−Ｇ細胞の２．５μｇ／ｇｍであった０ （ｂ）ＲＮＡのゲルプロセッシング ＭＰ４またはＭＰ４−Ｇセルラインに由来のポリ−ＡｍＲＮＡ１０μｇをエタノ ールにより沈殿させ、５０％ホルムアミド及び２．２Ｍホルムアルデヒドを含む ＩＸＭＯＰＳ緩衝液（２００１ＭＭ０ＰＳ、ｐＨ７，５，５ｍＭ酢酸ナトリウム 及び１ｍＭＥＤＴＡ、ｐＨ８，０）中に再懸濁した。ＲＮＡは、６５°Ｃにおい て１０分間加熱することにより変性した。次いで、５０％グリセロール、１ｍＭ ＥＤＴＡ、０．４％ブロモフェノールブルー及び０．４％キシレンシアツールを 含む充填緩衝液１１５容量を添加した。ブロモフェノールブルーか底に近付くま で、１．１Ｍホルムアルデヒドを含む１．３％アガロースゲル上で、ＲＮＡを分 画した。ｓｔｐにより標識されたＨａｅ　［［Ｉ−消化のφＸ１７４ＤＮＡをサ イズの標準として作用させた。ＤＮＡマーカーはＲＮＡバンドの近似の寸法を示 した。

（Ｃ）ＲＮＡのニトロセルロースへの転移転移緩衝液として２０ＸＳＳＣ（ＩＸ ＳＳＣは０．１５ＭＮａＣ２，０，０１５Ｍクエン酸ナトリウム、ｐＨ７，０で ある）を使用してゲルを一晩プロットすることにより、ＲＮＡをニトロセルロー ス（＃ＢＡ８５、シュライヒャー及びシュエル、キーン、ＮＨ）へ転移した。

転移の後、濾紙を空気乾燥し、真空炉中て８０°Ｃにおいて２〜３時間焼いた。

（ｄ）放射性プローブによる予備ハイブリッド形成６ＸＳＳＣ１ＩＯＸデンハル トの溶液（ＬＸＸシンルトの溶液は、０，０２％フィコール、０．０２％ポリビ ニルピロリドン、ｏ、ｏ２９６ウシ血清アルブミン）、０．５％ＮＰ−４０及び ２００　ｕ　ｇ　／　ｍｌＥ、ｃｏｌｉ転移ＲＮＡ中で、濾紙を５０°Ｃで４時 間予備ハイブリッド形成した。ハイブリッド形成は、ＥＰＳＰ−１またはＥＰＳ Ｐ−２プローブのいずれかを２　Ｘ　ｌ　Ｏ’ｃｐｍ／ｍｌを含む類似の新鮮な 溶液中で、３２°Ｃて４８時間行った。

ＥＰＳＰ−３プローブはペチュニアゲノム中ではめったに見られないコドン（Ａ ＴＡ）を含んでいるので、試験しなかった。それぞれの場合において使用したハ イブリッド形成温度（３２°Ｃ）は、混合物中で最も低いＧＣ含量を有するオリ ゴヌクレオチドに関して算出された解離温度（Ｔｄ）よりもｌＯｏＣ低かった。

プローブのＴｄは、式２°ＣＸ　（Ａ＋Ｔ）＋４℃Ｘ　（Ｇ＋（：）によって概 算された。

（ｅ）濾紙洗浄 前記濾紙を５ｘｓｓｃ中において、室温で１５〜２０分間、次いて３７°Ｃで５ 分間おだやかに振盪しなから２回洗浄した。次いで濾紙をプラスチックフィルム で包み、２つの増強スクリーンを使用して一７０″Ｃで１２〜１４Ｎ？間放射能 写真撮影した。次いてこのフィルターを、４２°Ｃの温度でやさしく振盪しなが ら５分間再び洗浄した。

このフィルターを再び１２〜１４時間放射能写真撮影した。この放射能写真は、 プローブＥＰＳＰ−１か、ＭＰ４−Ｇセルライン由来のポリ−ＡＲＮＡを含むレ ーンにおいて約１．９ｋｌ）のＲＮＡとハイブリッド形成したことを示した。Ｍ Ｐ４セルライン由来のポリ−ＡＲＮＡを含むレーンにはこのＲＮＡとのハイブリ ッド形成か検出されなかった。この結果は、ＭＰ４−ＧセルラインによるＥＰＳ ＰシンターゼｍＲＮＡの過剰生産によるものである。単一のヌクレオチドによっ てＥＰＳＰ−１と相違するプローブＥＰＳＰ−２は、ＭＰ４−Ｇセルラインの１ ．９ｋｂｍＲＮＡとのハイブリッド形成かほとんと検出されなかったか、両セル ライン由来の１．ＯｋｂｍＲＮＡと強力にハイブリッド形成した。しかしながら 、】、０ｋｂＤＮＡは、ｓｏ、ｏｏｏダルトンのポリペプチドをコードするには 不十分であり、ＥＰＳＰ−２プローブ中の１の配列か、ライブラリー中の全く異 なる配列とハイブリッド形成すると考えられる。これらの結果は、変性したプロ ーブ混合物ＥＰＳＰ−１かＥＰＳＰシンターゼの正確な配列を含んでいることを 示唆していた。この混合物を、以下の変性プローブハイブリッド形成実験の全て において使用した。

Ｅ、λｇｔｌＯｃＤＮＡライブラリーの製造（ａ＞使用した材料 ＡＭＶ逆転写酵素は、フロリダ州セントビーターズブルグのセイカガクアメリカ インコーポレイテッドから：ＤＮＡポリメラーゼＩの大フラグメント（タレノウ ボリメラーセ）は、マサチューセッツ州ボストンのニューイングランドニューク リアから、ｓ■ヌクレアーゼ及びｔＲＮＡはシグマ社から：ＡｃＡ３４カラム床 樹脂は、メリーランド州ゲイサーズブルグのＬ　Ｋ　Ｂから；ＥｃｏＲ■、Ｅｃ ｏＲＩメチラーセ及びＥｃｏＲＩリンカ−は、マサチューセッツ州ビバリーのニ ューイングランドバイオラブズから；ＲＮＡ５ｉｎ　（リホヌクレアーゼインヒ ビター）はライスコンシン州マディソンのプロメガバイオチックから及び全ての 放射性化合物はイリノイ州アーリントンハイツのアマースハムから購入した。

λｇｔｌＯヘクター（ＡＴＣＣ第４０１７９号）及び関連のＥ、ｃｏｌｊセルラ インは、スタッフォード大学メディカルスクールのタンバイン及びロナルドデー ビスから提供された（バイン、１９８５参照）。このベクターは３つの重要な特 徴を有している：　（１）新規ＤＮＡを挿入する前にファージＤＮＡからＤＮＡ の中心部分を除去する必要性を回避する非反復ＥｃｏＲＩ挿入部位を存している ：　（２）Ｏから約８，０００塩基のサイズの範囲のＤＮＡをこのベクターを使 用してクローニングすることかできる：そして（３）１のライブラリーをＥ、ｃ ｏ１ｉＭＡ１５０細胞（ＡＴＣＣ第５３１０４号）を使用して操作し、ＤＮＡ挿 入を存していないクローンを除去することかできる。

（ｂ）ｃＤＮＡ第１鎖合成 ポリ−ＡｍＲＮＡをセクションＤ、（ａ）に記載の方法により製造し、５０ＩＩ ＩＭトリス（ｐＨ８，５）　、ｌ　ＯｄＭｇＣＬ、４ｍＭＤＴＴ、４０ｍＭＫＣ Ｉ、５００　μＭｄ（ＡＧＣＴ）ＴＰ、Ｉ　Ｏμｇ　／Ｉ＠ｌｄＴ＋ｚ−＋ｉプ ライマー及び２７．５ユニツト／　０ＩＩＲＮ　Ａ　ｓｉｎ中に再懸濁した。

反応体容量１２０μｌにおいて、ポリ−ＡＲＮＡ５μｇ当り７０ユニツト逆転写 酵素を添加した。１の反応管はγ−”Ｐ−ｄＣＴＰ　（５μＣｉ　／　１２０μ ｌ反応体）を含有して、ｃＤＮＡのサイズ及び収量を監視することを可能にし、 及び第１ｊｊｉ標識を与えて、その後の反応を監視した。ｍＲＮＡ第２構造を崩 壊するために、Ｈ，０中のｍＲＮＡを７０″Ｃで３分間インキュベートし、管を 氷上で冷やした。逆転写酵素を添加し、ｃＤＮＡ合成を４２°Ｃで６０分間実施 した。この反応をＥＤＴＡを５０［１１Ｍまで添加することにより終結した。ｃ ＤＮＡの収量を反応の開始時及び６０分後に除去された試料のＴＣＡ沈殿により 監視した。ｃＤＮＡ合成の後に、ｃＤＮＡはｃＤＮＡ−ＲＮＡのハイブリッドと して存在した。

１．５分間沸騰水浴中で混合物を加熱し、次いで氷上で冷却することにより、こ のｃＤＮＡ−ＲＮＡ）１イブリ・ソドは変性した。

（ｃ）第２鎖ＤＮＡ合成 １本鎖のｃＤＮＡを第２鎖合成のために自己開始させた。フレノウポリメラーゼ 及び逆転写酵素の両酵素を使用して５ＳＣＤＮＡをｄ　Ｓ　ＣＤＮＡに転化した 。その３′−５°工キソヌクレアーゼ修復機能は自己開始により生成される非プ ラントＤＮＡ末端を消化することができると考えられ、そのポリメラーゼ活性に よりこれらのプラント末端を延長することができるので、フレノウポリメラーゼ は最初に採用される。逆転写酵素は一旦鋳型鎖に結合したら時期尚早に停止する 傾向は少ないと考えられるので、逆転写酵素は、フレノウポリメラーゼに加えて 使用される。このフレノウポリメラーゼ反応は酵素を除いて最終容量が１００μ ｌであった。この反応混合物は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ６，９、ｌ　０ｍＭ ＭｇＣ１１、５０ｍＭＫＣｌ、ｄＮＴＰ及びｃＤＮＡ各５００μＭを含んでいた 。反応を開始するために、２０〜４ｏユニツトのフレノウポリメラーゼ（通常５ μｍ未満）を添加し、この管を１５℃において５時間インキュベートした。この 反応をＥＤＴＡを５００１Ｍまで添加することにより終結した。この混合物をフ ェノールにより抽出し、核酸を沈殿させ、遠心分離し次いで乾燥させた。

抗相補ＤＮＡ鎖をさらに延長するための逆転写酵素反応を、ｄ　Ｔ　ｒ。−１Ｉ プライマー及びＲＮＡ５ｉｎが存在せず、１２０μｌ反応体中に逆転写酵素３２ ユニツトを使用したこと以外は、最初にｃＤＮＡを合成する反応について記載し たようにして実施した。この反応をＥＤＴＡを５０ｍＭまで添加することにより 終結させた。この混合物を等容量のフェノールにより抽出し、核酸を沈殿させ、 遠心分離し次いで乾燥させた。

（ｄ）ＳＩヌクレアーゼ処理 ２ＸＳ　Ｉ緩衝液（ＩＸＳＴ緩衝液は、３０ｍＭ酢酸ナトリウム、ｐＨ４，４， ２５０ｍＭＮａＣ１、ＩｍＭＺｎＣＩｚ）、２００μｌ＝Ｈｚ０１７５μｍ及び Ｓｌヌクレアーゼ５２５ユニツトを、第２鎖合成反応生成物１２５μｍを含む管 に添加した。この管を３７℃において３０分間インキュベートし、この反応をＥ ＤＴＡを５０ｍＭまで添加することにより終結した。この混合物を等容量のフェ ノール／クロロホルム（１：１）により抽出した。水性相をエチルエーテルによ り抽出し、残りのフェノールを除去した。ＤＮＡをエタノールにより沈殿させ、 空気乾燥させた。

（ｅ　）　ＥｃｏＲ［メチル化反応 ｄｓｃＤＮＡが多種類のｍＲＮＡから複製されたので、このｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡ の多くは、内部ＥｃｏＲＩ制限部位を含んでいたてあろう。その後にＥｃｏＲ［ により分割されて末端において付着突出を作るプラント末端ＥｃｏＲ１リンカ− を使用することを可能にするために、ＥｃｏＲ［分割からこのような分割部位を 保護することか望まれる。

内部ＥｃｏＲ［部位の不要な分割を防止する試みにおいて、ｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡ をＥｃｏＲ［メチラーゼを使用してメチル化した。ＤＮＡベレットを、５０ｆｆ １Ｍトリス４０μｌ、ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ、５［＋１ＭＤＴＴ中に溶解 した。１００μＭＳ−アデノシル−し−メチオニン４μｌ及びＥｃｏＲＩ　メチ ラーゼｌμｌ　（８０ユニツト）を添加した。

管を３７゛Ｃにおいて１５分間、次いて、７０°Ｃにおいて１０分間インキュベ ートし、メチラーゼを不活性化した。

次いで、上記のメチラーゼ反応は、明らかに不活性メチラーゼ試薬により、ＥＰ ＳＰシンターゼコート領域内の内部部位におけるＥｃｏＲＩ分割を防止すること に成功しなかったことが発見された。内部ＥｃｏＲ１部位の分割は、以下に記載 するように、全長ｃＤＮＡを単離するための追加工程が必要となる。これらの追 加工程を避けるために、メチル化試薬及び反応条件は、ｃＤＮＡ及びＤＮＡの対 照フラグメント上で同時に使用されなければならず、対照フラグメントの保護は 、消化がｃＤＮＡ上で実施される前にＥｃｏＲ［消化により確認されなければな らない。

（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼ■フィルイン反応ｃＤＮＡ（上記のようにして製造し た）４５μＩを含む管に、０．１ＭＭｇｃＬ　５μｌ　、０．　２［ｌｌＭｄ　 （ＡＣＧＴ）ＴＰ５μｌ及びＤＮＡポリメラーゼＩＩＯユニットを添加した。こ の管を室温においてｌＯ分間インキユベートシた。この反応をＥＤＴＡを２５ｍ Ｍまで添加することにより終結した。未切断λｇｔｌＯＤＮＡ１μｇを担体とし て添加し、この混合物をフェノール／クロロホルム（１：１）により抽出した。

混合物中の核酸をエタノールにより沈殿させ、遠心分離し乾燥させた。

（ｇ　）　ＥｃｏＲ［リンカ−のメチル化ｄＳＣＤＮＡへの連結反応 ＥｃｏＲ［リンカ−（５’　−ＣＧＧＡＡＴＴＣＣＧ−３°）約４００　ｐｏｏ ｌを、２０ｍＭトリス９μｌ、ｐＨ８，０，１０ｍ＆１Ｍｇｃｌｔ　、７−）２ Ｐ−ＡＴ　Ｐ　（５００ＱＣｉ／ａｕｏｏｌ）　５０μＣ１を含む１０ｍＭＤＴ Ｔ及びＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ２ユニット中に溶解した。オリゴヌクレオ チドを、３７℃において３０分間インキュベートし、互にアニールさせて、二本 鎖プラント末端リンカ−を生成した。

Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ２ユニット及び１０ｍＭＡＴＰＩμＩを添加して 、３７℃においてさらに３０分間インキュベートした。このリンカ−を−２０℃ において保存した。メチル化されたＤＮＡペレットをキナーゼ処理されたリンカ −４００ｐｍｏｌを含む管中に再懸濁した。

ＥｃｏＲｌ　リンカ−のメチル化されたＤＮＡへの連結反応をＴ４’Ｊガーゼ１ μｍを添加し、この反応混合物を１２〜１４°Ｃ（こおいて２日間インキュベー トすること（こよって実施した。

（ｈ　）　ＥＣｏＲＩを使用する消化による付着末端の生成上記セクション１． Ｅ、（ｇ）から得られた反応生成物１１μｍに対して、５０ｍＭ）リス、ｐＨ７ ，５、ｌＯｄＭｇＳＯ＋　、２００　ｍＭＮ　ａ　Ｃ１を含む溶液１０μｍを添 加した。Ｔ４ＤＮＡリガーゼを、７０°Ｃにおいて１０分間インキュベートする ことにより熱不活性化した。ＥｃｏＲ［４０ユニツトを添加し、３７′Ｃにおい て３時間インキユベートシた。この反応を５０ｍＭまで添加することにより終結 した。この試料を遠心分離により清澄化し、ＡｃＡ３４カラムに適用した。

（ｉ）ＡｃＡ３４カラムクロマトグラフイー遊離リンカ−（連結されていない） を、付着されたリンカ−とともにｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡから除去し、それが所望の ｄｓｅＤＮＡのクローニングベクター中への挿入に支障をきたすのを防止した。

２ｍＭクエン酸塩緩衝液及び水中０．０４％アジ化ナトリウム中の予備膨張され たＡｃＡ３４樹脂（通常サイジングに使用されるアクリルアミド及びアガロース ビーズの混合物）を、ガラスウールを詰めた１ｍｌのプラスチックシリンジの１ ｍｌのマークのところまで添加した。このカラムを１０１１１Ｍトリス−ＨＣ１ ｐＨ７，５，１ｍＭＥＤＴＡ、４００ｍＭＮａＣ１により平衡化した。連結され たリンカ−及び遊離リンカ−（〜４５μりを育するｄｓｃＤＮＡ混合物を４００ ｍＭＮａＣ１に入れた。０．５％ブロモフェノールブルー染料（ＢＰＢ）ｌμｌ を添加し、この試料をカラムに充填し、室温において平衡緩衝液内で操作した。

１０個の２００μ１画分を採取した。ＢＰＢ染料は通常６番目の管またはその後 の管から溶離された。管１及び２を合わせ、クローニングのためのｄ　ｓ　ｃ　 ＤＮＡの起源として使用した。

（ｊ）λｇｔｌＯクローニングのアセンブリｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡをεｃｏＲＩ− 切断λｇｔｌ　ＯＤＮＡ　Ｉ　ｕｇと混合し、エタノールにより沈殿させ、遠心 分離した。７０％エタノールによりペレットを一度洗浄した後、このＤＮＡペレ ットを空気乾燥し、１１０１１Ｉトリス−ＨＣｌ２．５μｌ、ｐＨ７，５，１０ ｍＭＭｇｃ１２．５０ｍＭＮａＣ［中に再懸濁した。ｃＤＮＡ挿入をλｇｔｌＯ ＤＮＡの左右のアームとアニーリングし、連結するために、この混合物を７０゛ Ｃで３分間、次いで５０℃で１５分間加熱した。この混合物を氷上で冷却し、ｌ ＯｍＭＡＴＰ、０．１ＭＤＴＴ及び少なくとも９０％完了するために十分なＴ４ ＤＮＡリガーゼを、それぞれ０．５μｍ添加した。この反応物質を１４℃におい て一晩インキユベートし、ｄ　ｓ　ｃ　ＤＮＡをλｇｔｌＯＤＮＡのＥｃｏＲ［ 部位中に挿入させた。得られたＤＮＡを、シエーラーの１９８１に記載の方法を 使用して、ファージ粒子中にインビトロで充填した。

（ｋ）挿入なしのファージの除去 ｅＤＮＡをλｇｔｌｏのＥｃｏＲ１部位に挿入することによって、Ｃ１遺伝子を 不活性した。不活性化されたＣＩ遺伝子を育するλｇｔｌｏファージ（即ち挿入 を有する）は通常Ｅ、ｃｏｌｉＭＡ　１５０細胞中で複製する。対照的に、挿入 を含まないλｇｔ１０ファージは、ｆ：、ｃｏｌｉのＭＡ１５０株中で復製化す ることができない。これは挿入を含まないλｇｔｔｏクローンの除去方法を提供 する。

ライブラリー中のファージを、λｇｔｌＯＤＮＡを修飾してそれをＥ、ｃｏｌｉ ＭＡ　１５０制隈システムから保護するＥ、ｅｏｌｉＣ６００（Ｍ＋Ｒ＋）細胞 中で最初に複製化した。

比較的少数のＥ、ｃｏｌｊＣ６００細胞か感染し、次いで２０倍過剰のＭＡ　１ ５０　（Ｍ＋Ｒ＋）細胞とともに平板培養した。このような主な感染は、全ての ファージか生長するＭ＋Ｒ−細胞中で起こるか、挿入なしのファージの復製を防 止するＭＡ　Ｉ　５０細胞中で連続的ラウンドの複製か起こる。増幅されたファ ージライブラリーをプレートから採取し、寒天及びその他の不純物を遠心分離に より除去した後、組換えファージはスクリーニング実験に使用することかできる 。

Ｆ、ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング：　ｐＭＯＮ９５３Ｉの選択 約６００フアージ（各プレート）を、０．７％アガロースを育する固形ＮＺＹ寒 天（マニアチス、１９８２）のｌ　ＯｃｍＸ　Ｉ　０ｃｍ四方のプレート上に塗 布した。Ｅ、ｃｏｌｉＭＡ１５０細胞の透明なローンかプレート上で生長した。

ファージかε、ｃｏｌｉ細胞を感染し殺滅した領域は、「プラク」と称される清 澄な領域によって示され、それはプレートを３７℃において一晩インキユベート した後に細菌のローンに対して見ることができた。６つのプレートをこの方法に より謂製した。プラクを、予備カットしたニトロセルロースフィルターに対して 、約３０分間通過させた。これは、プラクの対称の複製を生成した。このファー ジＤＮＡを付加するために、フィルターを、０．５ＭＮａＯＨ及び２．５　ＭＮ ａＣｌて５分間処理した。次いでフィルターを、１．０Ｍトリス）ＩＣＩ　、ｐ Ｈ７，５及びＮａＯＨを中和するための２．５ＭＮａＣ１を含有する０、５Ｍト リスＨＣＩ　、　ｐＨ７，５により連続的に処理した。次いて、これらをクロロ ホルム中に浸漬し、細菌の破片を除去した。

次いで、これらを空気乾燥し、８０℃において２時間真空下で焼き、室温まで冷 却した。次いでフィルターを、上記セクション１．Ｄ　（ｅ）のようにして、５ ｔｐ−標識したＥＰＳＰ−１プローブ（２Ｘ１０“Ｃ１）０１／　７４ルター） とハイブリッド形成した。４８時間のハイブリッド形成後、このフィルターを室 温において２０分間ＢＸＳＳＣ中で２度、次いで３７℃において５分間洗浄した 。これらの洗浄により、非特異的に結合したプローブ分子か除去され、一方、正 確に相当する配列（その時まで知られていなかった）を育するプローブ分子は、 フィルター上のファージＤＮＡに結合したままであった。

このフィルターを、最終洗浄の後、放射能写真撮影により分析した。最初のスク リーニング工程の後、７つのプラスのハイブリッド形成のシグナルが、放射能写 真上の黒色スポットとして表われた。これらのプラクをプレートから除去し、１ ００〜２００プラク／プレートの密度で新しく平板培養した。これらのプレート を上記の方法を使用してスクリーニングした。４つのプラスのハイブリッド形成 ファージを選択した。ＤＮＡをこれらの４つのクローンの各々から単離し、Ｅｃ ｏＲ［により消化し、ｃＤＮＡ挿入のサイズを決定した。最大のｃＤＮＡ挿入を 含むクローン、約３００ｂｐを選択し、λＥ３と命名した。λＥ３由来のｃＤＮ Ａ挿入をプラスミドｐＵＣ９（ビエイラ、１９８１）中に挿入し、得られたプラ スミドをｐＭＯＮ９５３１と命名した。

ｐＭＯＮ９５３１クローンか所望のＥＰＳＰソンタ−ゼ配列を含んでいることを 確認するために、挿入を、ＥｃｏＲ［による消化により、ｐＭＯＮ９５３１クロ ーンから除去した。次いでこのＤＮＡ断片をマキサム（１９７７）の化学減成方 法により配列決定した。ヌクレオチド配列から推定されるアミノ酸配列は、表１ に示されるＥＰＳＰシンターゼ部分アミノ酸配列に対応していた。

Ｇ、λＦ７ゲノムＤＮＡクローンの生成全ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を得るため に、ＭＰ４−Ｇセルライン由来の染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩにより消化し、ファ ージベクター中にクローニングしてライブラリーを生成し、それをプローブとし てのｐＭＯＮ９５３１由来の部分ＥＰＳＰシンターゼ配列を使用してスクリーニ ングした。

（ａ）ＭＰ４−Ｇ染色体ＤＮＡフラグメント断片の調製ＭＰ　４−Ｇ細胞を凍結 し、液体窒素の存在下で乳鉢中においてクラッシュガラスを使用して微粉砕した 。この粉砕された細胞を８．０Ｍ尿素、０　、３５　ＭＮａＣｌ、０．０５Ｍト リスＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、０．　０２ＭＥＤＴＡ、２％サルコシル及び５ ％フェノールを含む冷す−シス緩衝液８ｍｌ／ｇと混合した。この混合物をガラ ス棒を使用して撹拌し、大きな塊を解体した。等容量の、５％イソアミルアルコ ールを含むフェノール及びクロロホルムの３：１混合物を添加した。硫酸ドデシ ルナトリウム（ＳＤＳ）を最終濃度か０．５％になるまで添加した。この混合物 を室温において１０−１５分間回転台上て渦巻き回転させた。相を６，０００Ｘ ｇにおいて１５分間遠心分離することにより分離した。フェノール／クロロホル ム抽出を繰り返した。酢酸ナトリウムを最終濃度か０．１５〜１になるように、 水性相に添加し、ＤＮＡをエタノールにより沈殿させた。ＤＮＡを遠心分離によ り採集し、Ｉ　ＸＴＥ　（Ｉ　ＯｍＭ）リスＭＣＩ、１）Ｈ８，ＯｌｌｍＭＥＤ ＴＡ）中に溶解し、ＣｓＣ１−エチジウムプロミド勾配中でバンドを生成した。

１６ゲージの針を使用して管の側部に穿孔することにより、ＤＮＡを採取した。

エチジウムプロミドをＣｓＣ１飽和イソプロパツールにより抽出して、ＤＮＡを ＩＸＴＥに対して大量に透析した。ＤＮＡ約４００μｇを細胞１２ｇから単離し た。

ＭＰ　４−Ｇ染色体ＤＮＡ　（１０μｇ　）を、１０ｍＭ）リス、ｐＨ７，８， １ｍＭＤＴＴ、Ｉ　Ｏ［Ｉ＋ＭＭｇＣ１，，５０ｍＭＮａＣ１を含む緩衝液中で 、ＢａｍＨＩ　３０ユニツトにより、３７°Ｃて２時間完全に消化した。このＤ ＮＡをフェノールにより抽出し、次いて、クロロホルムにより抽出し、エタノー ルにより沈殿させた。このＤＮＡフラグメントを０．５μｇ／μｌの濃度におい てＩＸＴＥ中に懸濁させた。

（ｂ）λＭＧＩ４中のＭＰ４−Ｇ染色体ＤＮＡフラグメントのクローニング ファージλＭＧ＋４（ミズーリ州セントルイスワシントン大学メディソンスクー ルのメイナードオルソン博士から得た）由来のＤＮＡを、マニアチス１９８２に 記載の方法により製造した。ＤＮＡ　１５０μｇを、ｌｏＩＭトリスＨＣＩ　、 １）Ｈ７，８，１ｍ１ＪＤ　Ｔ　Ｔ　、ｌ　ＯｍＭ！ｉ１ｇｃｌｚ　、５０ｍＭ Ｎａｃｌを含む緩衝液中で、ＢａｍＨＩにより完全に消化した。

消化の完了を、０．５％アガロースゲルを介する電気泳動によりチェックした。

ファージＤＮＡをフェノール−クロロホルム−イソアミルアルコール（２５：２ ４＋１）により２度抽出し、エタノールにより沈殿させた。

ＤＮＡをｌ　５０　ｔｔｇ　／＋ｎｌの濃度でＩＸＴＥ中に再懸濁した。ＭｇＣ ｌ　２を１０［１１Ｍに添加し、４２°Ｃにおいて１時間インキュベートし、λ ＤＮＡの付着末端を再アニーリングした。アニーリングをアガロースゲル電気泳 動によりチェックした。

アニーリングの後に、ＤＮＡをベックマンＳＷ２７超遠心分離管中の３８ｍｌ　 （１０〜４０％、ｗ　／　ｖ　）シュクロース勾配上で層状にした。この勾配用 溶液は、ＩＭＮａＣｌ、２０　ｍｌ　トリス）（ＣＩ　（ｐＨ８，０）　、５ｍ ＭＥＤＴＡを含む緩衝液中で製造した。ＤＮＡ７５μｇを各勾配上に充填した。

試料をベックマンＳＷ２７回転装置中で２６゜０００　ｒｐｍにおいて１５°Ｃ で２４時間遠心分離した。両分（０、５ｍｌ）を遠心分離管の上部から採取し、 ゲル電気泳動によりＤＮＡの存在を分析した。λＤＮＡのアニーリングされた左 右のアームを含む両分を、−緒にプールし、ＴＥに対して透析し、エタノールに より沈殿させた。この沈殿を７０９６エタノールにより洗浄し乾燥した。

ＤＮＡを５００μｇ／ｉｆの濃度でＴＥ中に溶解した。

ベクターＤＮＡの精製さｔｌｔニアーム及びＭＰ４−ＧＤＮＡのＢａｍＨＩフラ グメントをモル比４：１及び２゜１で混合し、６６ａ＋ＡｎリスＪ（ＣＩ　、　 ｐＨ７，５，５ｍＭＭｇｃｌ＊、５ｍＭＤＴＴ及びＩ　ｍＡＪＡ　Ｔ　Ｐを含む リガーゼ緩衝液中てＴ４ＤＮＡリガーゼを使用して連結した。連結反応を１５° Ｃにおいて一晩実施した。連結反応をアガロースゲル電気泳動によりチェックし た。ＭＰ４−ＧＤＮＡの挿入を担持する連結されたファージＤＮＡを、商業的に 入手可能なパッケージ抽出物（ライスコンシン州マディソンのプロメガバイオチ ック）を使用してインビトロでファージキャブジッド中に包んだ。包まれたファ ージを、Ｅ、ｃｏｌｉＣ６００細胞を使用するプレート当り約６０００のプラク の濃度て０．７％アガロース中のＮＺＹ寒天の１０ｃｍＸ　Ｉ　０ｃｍ四方のプ レート上に置いた。３７℃において一晩インキュベートシた後、このプラクか生 成され、プレートをインキュベーターから除去し、４°Ｃにおいて少なくとも１ 時間冷蔵した。″Ｎ天プレートを、ニトロセルロースフィルターに対して３０分 間押しつけ、ファージをフィルターに移し、ファージＤＮＡを上記のようにして フィルターに付着させた。各フィルターを、ニック翻訳されたｐＭＯＮ９５３１ クローンから単離された３３０ｂｐｃＤＮＡ挿入約１．Ｏｘｌ　Ｏ’ｃｐｍ／フ ィルターと、マニアチス（１９８２）の方法を使用して、４２°Ｃにおいて４０ 時間ハイブリッド形成した。このプローブの特異活性は、ＤＮＡ　２〜３　ｘ　 ｌ　Ｏ’ｅｐｍ／μｇであった。ハイブリッド形成は、５０％ホルムアミド、５ 　Ｘ　Ｓ　Ｓ　Ｃ１５Ｘデンハルトの溶液、２００　ＩＪ、ｇ　／ｍｉｔ　ＲＮ Ａ及び０．１％ＳＤＳを含む溶液中で行われた。フィルターを１Ｘｓｓｃ、０． ２％ＳＤＳ中で５０’Ｃ１：ｌ−おいて洗浄し、放射線写真撮影した。いくつか のプラスのシグナルが観察され、対応するプレート上のプラクと一致した。選択 されたプラクをプレートがら単離し、８Ｍ緩衝液中に懸濁し、ＮＺＹ寒天ととも にプレート上に置いた。プレート上の全てのプラクかプラスのシグナルを示すま で、このレプリカプレートスクリーニング方法をより低い密度で繰り返した。ｌ の単離物を次の分析のために選択し、λＦ７フアージクローンと命名した。

Ｈ，ｐＭＯＮ９５４３及びｐＭＯＮ９５５６（７）調製λＦ７由来のＤＮＡをＢ ａａ＋Ｈ［、Ｂｇｌｒｌ　、、ＥｃｏＲＩ及びｆ（ｉｎｄ［［により（別々に） 消化した。ＤＮＡを、サザンブロット法でｐＭＯＮ９５３１由来のニック翻訳さ れたＥＰＳＰシンターゼ配列とハイブリッド形成した。この実験から得られた結 果は、λＦ７由来の相補配列か、４、　８ｋｂＢｇｌＩＩ　フラグメント上にあ ることを示した。このフラグメントを、プラスミドｐＵＣ９（ビエイラ１９８２ ）中に挿入し、複製し、ニック翻訳し、セクション１、（Ｇ）に記載のハイブリ ッド形成条件及びフィルター毎にｌ　Ｏ’ｃｐｍを使用して、ペチュニアｃＤＮ Ａライブラリーをプローブするために使用した。λＦ７配列とハイブリッド形成 した配列を存するｃＤＮＡクローンを同定した。このクローンの挿入をｐＵＣ９ のＥｃｏＲ［部位中にサブクローニングし、ｐＭＯＮ９５４３を得た。

ＤＮＡ配列分析（マキサム１９７７）は、ｐＭＯＮ９５４３かＥＰＳＰシンター セ遺伝子の終結コドンまたは３゛非翻訳化領域を含まないことを示した。従って 、ＥＰＳＰシンターセ配列を、ｐＭＯＮ９５４３から除去し、ニック翻訳し、ｃ ＤＮＡライブラリーを再びスクリーニングするためのプローブとして使用した。

ＥＰＳＰシンターゼ配列とハイブリッド形成したクローンを同定し、ｐＭＯＮ９ ５５６と命名した。ＤＮＡ配列分析は、このクローン中の挿入か、ポリアデニル 化されたテールを含むＥＰＳＰシンターセ遺伝子の全３′領域を含んでいること を示した。この挿入の５’ＥｃｏＲＩ末端はｐＭＯＮ５３１中のＥＰＳＰシンタ ーゼ挿入の３’ＥｃｏＲ１末端と合致した。全ＥＰＳＰシンターセコード配列を 、ｐＭＯＮ９５３１及びｐＭＯＮ９５５６由来のＥＰＳＰシンターゼ挿入を連結 することにより生成した。

１、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰシンター七遺伝子を有するｐＭＯＮ５４６ベクタ ーの生成 トランジットベプチｌ’を含み内部ＥｃｏＲＩ　ｆｆｆＥ位を介するコード配列 を含むｃＤＮＡの５゛Ｍ分を含むｐＭＯＮ９５３１中のペチュニアＥＰＳＰシン ターゼ挿入を、Ｍ１３ベクター（メリック１９８１及びｌ　９８２）を使用する 部位特異的突然変異生成（シーラーら、＋　９８３）により修飾し、ＥＰＳＰシ ンターセ遺伝子の５゛非翻訳化領域中にＢｇ１１１部位を生成した。修飾された ＥＰＳＰシンターゼ配列を、ＥｃｏＲＩ及びＢｇｌｌ＋消化により単離し、ベク ター、ｐＭＯＮ５３０、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍベースノ植物形質転換体の ための二元ベクター中に挿入してｐＭＯＮ５３６を得た。次いで、ｐＭＯＮ９５ ５６由来の３′非翻訳化された領域を介して内部εｃｏＲ１部位由来のｃＤＮＡ の３′部分を含む１．　６２ｋｂＥｃｏＲｒ−ＥｃｏＲｆフラグメントを、ｐＭ ＯＮ５３８中に挿入してｐＭＯＮ５４６を得た。ｐＭＯＮ５３０は既にＢｇｌｌ ［部位の隣にカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）由来の３５３プロモー ターを含んでいたので、それはｐＭＯＮ５４６中に野性型コード配列を含むキメ ラＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を生成した。

ｐＭＯＮ５３０．３５Ｓ−ＮＯＳカセットを有するｐＭＯＮ５０５の誘導体を下 記の方法により調製した：ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを、Ａｌｕｌ（ｎ７１４ ３）　−ＥｃｏＲＩ＊　（ｎ　７５１７）フラグメントとしてＣＭ４−１８４の ｐｏｓ−１クローンから単離し、それを最初にＢａｍＨＥにより開裂されたｐＢ Ｒ３２２中に挿入し、ＤＮＡポリメラーゼＩのフレノウフラグメントにより処理 し、次いでＥｃｏＲＩにより開裂した。次いでプロモーターフラグメントをＢａ ｍＨＩ及びＥｃｏＲＩによっでｐＢＲ３２２から摘出し、クレノウボリメラーゼ により処理し、ｍｐ８多重リンカ−のεｃｏＲ１部位かプロモーターフラグメン トの５′末端に存在するように、Ｍ１３ｍｐ８の５ＩＩｌａ　［部位中に挿入し た。ヌクレオチドの番号は：、ｃＭｔ８４１　（ガードナーら、１９８１）の配 列を引用する。

次いで部位特異的突然変異生成を使用して、ヌクレオチド７４６４にＧを導入し てＢｇｌ［１部位を生成した。

ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、転写及び５′非翻訳化リーダーの３０ヌクレオチ ドを含むが、いずれかのＣａＭＶ翻訳イニシエーターや転写の開始から１８０ヌ クレオチド下流に存在するＣａＭＶ３５Ｓ転写ポリアデニル化シグナルも含まな い３３０　ｂｐＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌ［フラグメントとして、ＣａＭＶ３５Ｓプ ロモーターをＭ１３から摘出した（コベイら、１９８１；ギレイら、１９８２） 。ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターフラグメントを、合成多重リンカ−及びＮＯ３３ ’非翻訳化領域へ接続し、ｐＭＯＮ２００　（７Ｌｚ”）−ら、１９８５；ロジ ｔ−：Ｘら、１９８６）中に挿入し、ｐＭＯＮ３１６　Ｃロジャーズら、１９８ ７参照）を得た。

プラスミドｐＭＯＮ３１６は、５゛　リーダーとＮＯＳポリアデニル化シグナル との間に存在するＢｇｌｌ［、Ｃ１ａｎ。

Ｋｐｎ　Ｉ、Ｘｈｏ　Ｉ及びＥｃｏＲ［の非反復分割位置を含む。プラスミドｐ ＭＯＮ３１６は、ｐＭＯＮ２００ｃＤ全テノ特性を保有している。ＣａＭＶ３５ Ｓプロモーター、多重リンカ−及びＮＯ３３’　セグメントの完全な配列は、ロ ジャーズら、１９８７に示されている。この配列は、クレノウボリメラーゼ処理 により生成されるＸｍｎ［部位により開始し、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターセグ メントの５′末端に存在するεｃｏＲ１部位を除去する。

プラスミドｐＭＯＮ５３０　（ロジャーズら、１９８７）は、ｐＭＯＮ３１６の ２　、　３　ｋｂｓｔｕ［−）１ｉｎｄ［ＩＩフラグメントをｐＭＯＮ５２６中 に移入することにより生成されるｐＭＯＮ５０５の誘導体である。プラスミドｐ ＭＯＮ５２６は、その中のＳｍａｒ部位かＸｒｎａ　Ｅによる消化、クレノウボ リメラーゼにより処理及び連結反応により除去されるｐＭＯＮ５０５の単純な誘 導体である。プラスミドｐＭＯＮ５３０は、ｐＭＯＮ５０５及びＣａＭＶ３５Ｓ −ＮＯ３表現カセットの全ての特性を保有し、プロモーター及びポリアデニル化 シグナルの間のＳｍａ　［の非反復分割部位を含む。

一二元ベクターｐＭＯＮ５０５は、その中のＴｉブラスミドホ％Ｏジー領域、Ｌ ＩＨが３．８　ｋｂＨｉｎｄｌｌｌから微小ＲＫ２プラスミド、ｐＴＪＳ７５の ＳｍａＩセグメントへ（シュミトハウザー及びヘリンスキ、１９８５）により置 換されたｐＭＯＮ２００の誘導体である。このセグメントは、３親交配方法（ホ ーシュ及びり−、１９８６）を使用するＡｇｒＯｂａＣｔｅｒｉｌＪＩＩＩ中へ の接合のための複製のＲＫ２起点、ｏｒｉ　Ｖ及び転移の起点、ｏＢ　Ｔを含む 。

図４を参照すると、プラスミドｐＭＯＮ５０５は、所望のＤＮＡフラグメントの 挿入のための合成多重リンカ−、トランスジェニック植物中における選択のため のキメラＮ０３−ＮＰＴＩ　Ｉ’　−ＮＯＳカナマイシン耐性決定基及びＥ、ｃ ｏｌｉ及びＡ、　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ中の選択のためノストレプトマイシン ／スペクチノマイシン遺伝子、形質転換体及び子孫中の遺伝形質の容易な計測の ための不完全ノーバリンシンターゼ遺伝子及びＥ、ｃｏｌｉ中の大量のベクター の生成を容易にする複製のｐＢＲ３２２起点を含む１）ＭＯＮ２００の重要な特 徴を全て保有している。プラスミドｐＭＯＮ５０５は、ｐＴｉＴ３７ノーパリン 型Ｔ−ＤＮＡの右末端に由来の１重鎖Ｔ−ＤＮＡ縁を含む。

サザン分析によると、プラスミドｐＭＯＮ５０５及びそれか担持するいずれかの ＤＮＡか植物ゲノム中に組込まれ、即ち、全プラスミドか植物ゲノム中に挿入さ れたＴ−ＤＮＡであることか示される。組込みＤＮＡの１端は、右端配列及びノ ーバリンシンターゼ遺伝子の間に存在し、他端は、端部配列及びｐＢＲ３２２配 列の間にある。

プラスミドｐＭＯＮ５４６は、　（１）ＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰシンターセ遺 伝子：　（２）カナマイシン耐性の選択可能なマーカー遺伝子（Ｋａｎ）：　（ ３）計測可能なマーカーとしてのノーパリンシンターセ（ＮＯ３）遺伝子：及び （４）右Ｔ−ＤＮＡ縁部を含んており、Ａ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞により「転移ＤＮＡＪ　（Ｔ−ＤＮＡ）領域として 処理されるべき全プラスミドを可動に生じさせる。

このプラスミドを、ヘルパープラスミド、ｐＧＶ３１１Ｉ−３Ｅを含むＡ、　ｔ ｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中に挿入した。ヘ細胞−プラスミドは、植物細胞染色 体中に挿入される一＼きｐＭＯＮ５４６からＤＮＡを生じさせるのに必要な特定 の酵素をコードした。それはまた、細菌中に抗生物質カナマイシン耐性を与える 遺伝子を含む。

ｐＭＯＮ５４６及びｐＧＶ３１１１−３Ｅを含むＡ。

ｔｕ［ｌ１ｅｆａｃｉｅｎｓの培養物をアメリカンタイプカルチャーコレクショ ン（ＡＴＣＣ）へ寄託し、ＡＴＣＣ受託番号５３２１３を与えられた。所望によ り、これらのプラスミドのいずれか１つを、標準方法を使用して細胞のこの培養 物から単離することができる。例えば、これらの細胞をｐＲＫ２０１３　（ディ ツタ、１９８０）のような起動プラスミドを含むＥ、ｃｏｌｉ細胞とともに培養 することかできる。Ｓｐｃ　／Ｓｔｒ　”　Ｋａｎ　’になる細胞はｐＭＯＮ５ ４６を含み、一方Ｋａｎ　”　Ｓｐｃ　／Ｓｔｒ　”になる細胞はｐＧＢ　３Ｉ ｌｌ−ＳＥを含む。

ＥＰＳＰＳｃＤＮＡを含む植物形質転換ベクターを得るための上記の記載は、そ の他の植物種に適用することかでき、ペチュニアへの応用の説明は、はんの１例 である。当業者は、同じ操作及び目的の特定植物種に適合するためにその操作に 必要な変更を行うことかできるであろう。このような方法及び変更は当業者には 知られている。また、このように単離されたｃＤＮＡクローンは、本発明におい て記載した変異体を、知られた方法によってＥＰＳＰＳ遺伝子中遺伝人中るため に適していると考えられる。

グリホセート耐性ペチュニア植物 ６ｎ＋ｎ（１／４□イシチ）径の集ディスクを表面滅菌されたペチュニアの葉か ら採取した。これをＭＳ　１０４寒天培地上で２日間培養し、損傷した表面にお ける部分細胞壁生成を促進させた。次いでシリアブロス中で２８℃において一晩 生長したＩ）ＭＯＮ５４６及びＧＶ３１１１−ＳＥを含むＡ、　！ｕＩＩｌｅｆ ａｃｉｅｎｓ細胞の培養物中に沈めた。葉ディスクを細菌懸濁液から除去し、吸 収により乾燥させ、ホーシュ（１９８０）により記載されたようにして、タバコ 細胞の「ナース」培養物上に置いた濾紙上に裏返しくこして置いた。２〜３日後 （こ、このディスクをナース培養物を含まず５００μｇ／ａ＋ｌカルベニシリン 及び０．０．１１０．２５または０．５ｍ１Ｊのグリホセ−１・（ナトリウム塩 ）を含むＭＳ培地を存するペトリ皿に移した。

対照細胞は、ヘルパープラスミドｐＧＶ３１１１−ＳＥ並びにＮＯ３／ＮＰＴ　 Ｉ　Ｉ／ＮＯＳカナマイシン耐性遺伝子及びｐＭＯＮ５４６と同じＮＯ３選択可 能なマーカーを含み、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を含まないＴ −ＤＮＡ領域を含む異なる植物形質転換ベクター、ｐＭＯＮ５０５を含むＡ、　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ　１ｉＢＦを使用して生成した。

グリホセートを含む培地へ移した後１０日以内に、活発に生長したカルス組織か 、グリホセートを含まない対照プレート上の全てのディスクの縁に表われた。０ ．　１１１ＩＭグリホセートを含む培地上では、対照ディスク及び形質転換され たディスクの間に検出される相違はあまりなかった。０．２５ｄグリホセートで は、形質転換された組織の実質的な成長かあったか、対照ディスクからのカルス の成長はほとんどなかった。０．５１ｔ１Ｍグリホセートでは、形質転換された ディスクからは非常に多数のカルスか成長したが、対照ディスクからはカルスは 成長しなかった。これは、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子か、形質 転換された細胞にグリホセート耐性を与えたことを確認するものである。

形質転換されたペチュニア植物は、ホーシュら（１９８５）により記載された方 法により、上記の形質転換された葉ディスクから再生することにより生産された 。得られた形質転換された植物は、野性型ペチュニアＥＰＳＰシンターゼ遺伝子 に融合されたＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む上記のｐＭＯＮ５４６ベクター を含んでいた。

４つの別個の代表的トランスジェニック種苗を選択し、成長させ、４つの別個の 非形質転換された（野性型）ペチュニア種苗とともに、下記の試験方法により試 験した。

植物を１２時間光７日で２６°Ｃにおいて成長室内の成長培地中で成長させた。

この植物に可溶性肥料を１週間毎に与え、必要に応じて水を与えた。自動トラッ ク噴霧装置を使用して、均一で再現可能な薬量の除草剤を噴霧した。使用したグ リホセート溶液を、グリホセート酸当量ボンド／ニーカーで測定し、グリホセー トイソプロピルアミン塩として、イオン性表面活性剤と、混合した。

４つの個々の野性型（非形質転換された）ペチュニア植物を選択して対照植物と して使用した。ｐＭＯＮ５４６ベクターを含む４つの個々の形質転換された植物 を、ホーシュら（１９８５）に記載の方法によりカナマイシン耐性により選択し た。

対照植物及び形質転換された植物に、下記表２に記載の噴霧濃度でグリホセート のイソプロピルアミン塩を噴霧した：得られた実験結果もまた表２にまとめて示 す。

表２ グリホセート噴霧に対する植物の応答 植物型　グリホセート用量０　可視的様相対照’　０．８１／ニーカー　完全に 死滅、植物は非常に迅速なりロロ シス及び漂白を示し、 しおれ、死滅した。

キメラＥＰＳＰＳ　Ｏ，８＃　／ニーカー　よく成長し、通常のの形態で成長し た新 葉にわずかなりロロ シスが表われたが、 植物は健全で開花を 始めた 本酸当量（０，ｓｓ／ニーカー＝０．　８９７ｋｇ／へ’）９−ル） ｌ野性型植物または対照ベクター（ｐＭＯＮ５０５）により形質転換された植物 表２に示されるように、対照植物は、０．８ボンド／ニーカーのグリホセートを 噴霧したときに死滅した。反対に、形質転換されたペチュニア植物は、健全で、 ０．８ポンド／ニーカーを噴霧した後でも生存可能であった。形質転換された植 物は、非形質転換の対照植物よりもグリホセートに対してより高い耐性を有する 。グリホセート耐性は、高レベル表現ＣａＭＶ３５Ｓブロモーターから野性型ペ チュニアＥＰＳＰシンターゼｃ　ＤＮＡを過剰発現することにより、これらのト ランスジェニックタバコ植物において得られる。より高いレベルの耐性を得て、 トランスジェニック植物が典型的使用率においてグリホセートに対して耐性とな るように、グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ変異体を利用した。以下は、グ リシン１０１からアラニンの置換を含むグリホセート耐性ＥＰＳＰ並びにグリシ ン１０１からアラニン及びアラニン１９２からスレオニンの置換を含むＥＰＳＰ 変異体が植物形質転換ベクターに導入され、使用されてグリホセート耐性トラン スジェニック物を生成する例である。

グリホセート耐性ペチュニアＥＰＳＰシンターゼグリシン（１０１）からアラニ ンのペチュニアＥＰＳＰシンターゼ変異を担持する植物形質転換ベクターを、下 記の方法により製造した。

プラスミドｐＭＯＮ５３０ＤＮＡを、Ｂｇｌ［Ｉ及びＣ１ａ［により消化し、そ れにｐＭＯＮ５３６由来の３３０　ｂｐＢｇｌ［１−ＥｃｏＲＩシンターゼ５′ フラグメント及びｐＭＯＮ９５６６由来の１　、　４　ｋｂＥｃｏＲＩ−Ｃ１ａ ［Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐシンターゼ３′　フラグメントを添加し、次いでＴ４ＤＮＡリ ガーセにより処理した。形質転換の後、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターに隣接する ペチュニアの完全なグリシン（１０１）からアラニン変異体ＥＰＳＰシンターセ コード配列（葉緑体トランジットペプチドのコード配列を存する）を有するプラ スミドを単離した。このプラスミドをｐ　ＭＯＮ５６７と命名した。プラスミド ｐＭＯＮ５６７を、ヘルパープラスミドｐＧＢ３１１１−ＳＥを含むＡ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞中に挿入した。

ｐＭＯＮ５６７／ｐＧＶ３１１１−ＳＥを含むＡ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ細胞の培養物を、ホーン！（１９８５）により記載され た方法で、タバコ植物（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ　ｔａｂａｃａｍＣＶＨ４２５）か ら採取した葉ディスクと共培養した。

このＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ細胞は、変異体ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を植 物細胞の染色体中に挿入した。カナマイシンに耐性を育する植物細胞を選択し、 ホーシュ（１９８５）の方法により分化された植物中に再生させた。

これらの植物の子孫を繁殖させ、約４週の植物幹に対応する約１０ｃｍ径のロゼ ツトに成長させた。この植物に、０．４．２．０及び３．６ボンド酸当量／ニー カーに対応する濃度のグリホセートを噴霧した。形質転換された植物に与えるグ リホセートの影響を７．１４及び２８日目に計測した。この影響を数値による点 数０〜ＩＯに換算し、０は、全ての死滅を示し、ＩＯは通常の未噴霧の植物であ る。下記のデータは、ペチュニアのグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子 により形質転換されたタバコ植物が、これらの高濃度のグリホセートに対しても 実質的な耐性を示すことを示唆している。この値は、野性型ＥＰＳＰシンターゼ 及びグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子の両方に対する最良の形質転換 体を示す。

表　３ ＧＴ”　ＷＴ３ＧＴ　ＷＴ　ＧＴ　ＷＴ７　８．０　６．０　８．０５．０　５ ．０５．０１４　８．０　７．０　８．３１．８　７．４１．７２８　９．０　 ９．０　７．００．８　７．００．８Ｉ　Ｏは全ての死滅を示し、ｌＯは影響が ないことを示す。

２　グリホセート耐性ペチュニアＥＰＳＰシンターゼ３　野性型ＥＰＳＰシンタ ーゼ Ｉ　１．ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＥＰＳＰシンターゼゲノムクローンＡｒａｂ ｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａゲノムバンクを、サイズ分画された（１５〜 ２０　ｋｂ）　Ｍｂｏ［部分的に消化されたＤＮＡを、ＢａｍＨ［及びＥｃｏＲ ［消化されたλＥＭＢＬ３（カリフォルニア州すンディエゴ、ストラータージー ンクローニングシステムズ）中にクローニングすることにより調製した。

このライブラリー由来のファージの約１０，０００プラクを、３２ｐ標識された ペチュニアＥＰＳＰシンターゼプローブ（上記記載のｐＭＯＮ９５６６）により スクリーニングした。Ｅｌと命名された強カッ１イブリ・ソド形成プラクを精製 した。ＥＰＳＰシンターゼプローブを有するファージＤＮＡのササンプロットは 、非常に強力に／）イブ・ノット形成した２つのフラグメントを同定した。第１ フラグメントは、１　、ＯｋｂＨｉ口ｄ［Ｉ［フラグメントてあり、他方は、７ ００　ｂｐＢａｍＨ［フラグメントてあった。これらのフラグメントをプラスミ ドｐＵＣ１１９中にクローニングし、ｐＭＯＮ５７４及びｐＭＯＮ５７８と命名 した。

次いてこの２つの挿入のＤＮＡ配列をサンが−の方法（１９７７）により決定し た。配列のデータは、ファージか、ペチュニアＥＰＳＰシンターゼ配列に対する その強い相同性により、ＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓのＥＰＳＰシンターゼ遺伝子を 含むことを示した。７００　ｂｐＢａｍＨ［フラグメントをファージ及びＡｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓゲノムＤＮＡに対するハイブリッド形成プローブとして使用し て、全ＥＰＳＰシンターゼ遺伝子のクローニングに適した制限フラグメントを同 定した。６．Ｏｋｂ及び３．１ｋｂの２つのハイブリッド形成りｇｌ［［フラグ メントを、Ｅｌファージクローン中で同定した。これらのフラグメントを別個に ｐＭＯＮ５５０中にサブクローニングし、次の実験のためのＤＮＡを生成して、 別個！：ｐＭＯＮ５８２及びＰＭＯＮ５８３と命名した。プラスミドｐＭＯＮ５ ５０は、合成りＮＡフラグメント を旧ｎｄｌｌ［及びＫｐｎ　［により消化されたｐＵＣ１９中に挿入することに より生成されたＩ）ＵＣｌ３（ヤニシューぺロンら、１９８５）の誘導体である 。２つの追加のサブクローンは、クローンｐＭＯＮ５８２及びｐＭＯＮ５８３か ら生成された。プラスミドｐＭＯＮ５８４は、上記のｐＵＣ１９由来のｐＵＣ１ １９の製造と類似の方法によりｐＵＣ１８から製造されるｐＵＣ１１８中のＡｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐシンターゼ遺伝子の５′末端を含む１．８ 　ｋｂＥｃｏＲ［からＢａｍＨＩフラグメントである。プラスミドｐＭＯＮ５８ ９は、ｐｔｒｃ　ｌ　１９中のＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＥＰＳＰシンターゼ遺伝 子の３′末端を含む２．８ｋｂＢａｍＨ［からＢｇｌ［［フラグメントである。

ｐＭＯＮ５８４のＢａｍＨ１部位から、及びｐＭＯＮ５８９のＢａｍＨ［部位か らの配列決定は、遺伝子のコード領域の配列を完成した。

Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐシンターゼか成熟酵素の位１ｌｌＯ１ においてグリシンに対するアラニンの置換を含むように、コード配列か変更され た。プラスミドｐＭＯＮ５７８は、クンケル（１９８５）の方法により、オリゴ ヌクレオチド： ５°−ＣＴＩ’ｒＡＣＣＴＣＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＧ −３゜により突然変異生成された。得られたプラスミド、ｐＭＯＮ５９４の一部 を配列決定し、突然変異を証明した。アラニン１９２からスレオニンのアミノ酸 変更を、クンケルの方法及びプラスミドｐＭＯＮＩ　００１１を使用して部位特 異的突然変異生成によりＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓＥＰＳＰＳ遺伝子中に導入した 。プラスミドｐＭＯＮ１００１１は、ｐＵＣベースのファージミドベクター中の ＮｏＬＩＩＩＪ限フラグメント上の高められた３５Ｓプロモーター及びノーバリ ンシンターゼ３′に融合されたｇｌＹ＋０ｌ−ａｌａの変更を有するキメラＡｒ ａｂｉｄｏｐｓｉｓ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子を含む。このベクターはまた、 Ｅ、ｃｏｌｉにおける選択のためのアンピシリン耐性マーカーとともに、複製の 両ｐＵＣ及びＭＩ３ファージ起点を含む。１本鎖ＤＮＡ鋳型は、ｐＭＯＮｔｏｏ ｌｌから製造され、下記オリゴヌクレ才チドプライマー二 ５”−ＡＴＧＴＣＴＧＣＴＣＣＣＴＩ’ＡＡＣＣＣＴｒＧＧＡｆｌＡＣＧＴＣ− ３゜により突然変異生成された。

得られたプラスミド、ｐＭＯＮ８３２４を部分的に配列決定し、突然変異生成を 確認した。グリシン１０１がらアラニン及びアラニン１９２からスレオニンの両 アミノ酸変更を含むＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ遺伝子を、植物形質転換実験のため にｐＭＯＮ２００７４中にアセンブリし、グリホセート耐性植物を生成した。ｐ ＭＯＮＩ００７４プラスミドは、下記のＤＮＡセグメントを含む（図５、時計回 り）。第一に、細菌スペクチノマイシン／ストレプトマイシン抵抗（Ｓｐｃ／５ ｔｒ）をコードしＥ、ｃｏｌｉ及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓ　（フリンゾら、１９８５）中の選択のための決定基であるトランス ポゾンＴｎ７から単離された０、９３ｋｂフラグメント。これは、植物での発現 のために操作されて形質転換された組織の選択を可能にするキメラカナマイシン 耐性遺伝子に接続される。

このキメラ遺伝子は、０．３５ｋｂカリフラワーモザイクウイルス３５Ｓプロモ ーター（Ｐ−３５３）（オーデルら、１９８５）　、０．８３ｋｌ＋ネオマイシ ンホスホトランスフエラーゼタイプＩＩ遺伝子（ＫＡＮ）及びノーバリンシンタ ーセ遺伝子の０．２６ｋｂ３’　−非翻訳化領域（ＮＯＳ３”）（フレイリーら 、＋　９８３）からなる。

隣のセグメントは、ＲＫ２プラスミド由来の複製の０．７５ｋｂ起点（ｏｒｉ− Ｖ）（スタルカーら、１９８１）である。これは、Ｅ、ｃｏｌｉ中の保持のため の複製の起点（ｏｒｉ−３２２）及びＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｎ　ｔｕｍｅｆ ａｅｉｅｎｓ細胞内への接合転移のためのｂｏｍ部位を与えるｐＢＲ３２２の３ ．１　ｋｂｓａｌＩからＰｂｕ　Ｉセグメントへ結合される。隣は、ノーバリン 型Ｔ−ＤＮＡ右端領域（フレイリーら、１９８５）を含むｐＴｉＴ３７ブラスミ ド由来の０．３６ｋｂＰｖｕ［からＢｅｌ［フラグメントである。最後のセグメ ントは、植物中に５−エノールビルビルツキメート−３−ホスフェートシンター ゼ酵素（ＥＰＳＰＳ）を過剰生産するように操作されたキメラ遺伝子である（シ ャーら、１９８Ｇ及びり−ら、＋９８７）。キメラ遺伝子は、ゴマノハグサモザ イクウィルス由来の０．６ｋｂ３５Ｓプロモーター　（Ｐ−ＦＭＶ）（ゴウダら 、＋９８９）、２つのアミノ酸変更（ｇｌｙ−ａｌａ　（１０１）　、ａｌａ− ｔｈｒ　（１９２））を存する３　、９　ｋｂＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａ ｌ　１ａｎａＥＰＳＰＳ及びマメｒｂｃＳ−Ｅ９遺伝子の０．７ｋｂ３’非翻訳 化領域（Ｅ９３°）（コルッジら、１９８４及びモレリら、１９８５）からなる 。

りＭＯＮ１００７４ベクターを、Ａ　Ｂ　ＩＡｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ株中に 可動化した。このＡＢＩ株は、脱武装されたＴｉプラスミドｐＴｉＣ５８（コン クズ及びシェル、１９８６）を有するＡ　２０８　Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ 　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓである。Ｔｉプラスミドは、Ｔ−ＤＮＡ植物ホルモン 遺伝子を担持せず、従ってこの株は、クラウンゴール病を生じさせることかでき ない。ｐＭＯＮ１００７４のＡＢＩ中への交配は、ヘルパープラスミドｐＲＫ２ ０１３を使用する三親接合システムを使用して行った（ディツタら、１９８０） 。植物組織をＡＢＩ：　：Ｉ）ＭＯＮ１０Ｃ１７４接合体とともにインキュベー トし、ベクターを脱武装されたｐＴｉｃ５８プラスミドによりコートされるｖｉ ｒ機能により植物細胞へ転移し７た。ベクターは、Ｔ−ＤＮＡの右端領域で開環 し、全１）ＭＯＮ１００７４ベクター配列を宿主植物染色体中へ挿入する。ｐＴ ｉｃ５８Ｔｉプラスミドは植物細胞へ転移せず、Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ中 に残る。

ｐＭＯＮｌｏ０７４構造物を含む全部で１５のトランスジェニックキｔノーラ植 物及び２つの非形質転換対照に、グリホセートを商業的速度０　、　５６　ｋｇ ／ｈａで噴霧した。噴霧された植物の成長及び繁殖の両性能に与えるグリホセー トの影響について、噴霧後７．１４及び２８日目にスコアを付けた。グリホセー トの影響を数値による点数θ〜１０に翻訳したか、０は全部の死滅を示し、ｌＯ は通常の未噴霧の植物を示す。非形質転換対照は、１４日後に成長スコアが２で あり、２８日後に繁殖スコアが０であった。ｐＭＯＮ　１００７４キヤノーラ植 物は、対照よりも優れており、１５の植物のうち６つの成長スコアが８よりも高 く、１つが１０であり、１５の植物のうち７つの繁殖スコアが８よりも高く、そ の３つがｌＯであった。データにより、グリホセート耐性のグリシン１０１から アラニン、アラニン１９２からスレオニンの二重の変異ＥＰＳＰＳシンターゼを 含む形質転換されたキャノーラ植物は、グリホセートの商業的適用に対して非常 に高い耐性を育し、通常の受精能力のある植物を生トウモロコシ種子を水中に１ ２時間浸し、胚盤を含む胚を種子から切開し、ＲＮＡをロチニスターらの方法（ １９８６）により、この材料から精製した。ポリＡ−ｍＲＮＡを、オリゴｄＴセ ルロース上のクロマトグラフィーによりＲＮＡから単離し、使用して上記の方法 （ガッサーら、１９８９）によりｃＤＮＡライブラリーを構成した。このライブ ラリーを、Ｈｉｎｄ［［［により線状化されたｐＭＯＮ９７１７　（ガッサーら 、１９８８）からインビトロで合成されたｓｔｐ標識のＲＮＡプローブによりス クリーニングした。このプローブを、製造者の指示に従って、Ｔ７ＲＮＡポリメ ラーゼ（ウィスコンシン州マディソンプロメガ社）により合成した。ハイブリッ ド形成プラクを単離し、再びプレート上に置き、プレートから採り出したニトロ セルロースを同じプローブでスクリーニングした。トマトプローブと強力にハイ ブリッド形成した単一のクローンを示すプラクを単離し、繁殖させ、ＤＮＡを生 成するために使用した。λ−ｚｌｄと命名されたクローンが１　、　８　ｋｂＥ ｃｏＲ１挿入を含むことが判明した。

このファージの挿入をブルースクリプトＫＳ＋　（カリフォルニア州すンディエ ゴ、ストラータジーン）のＥｃｏＲ［部位中にサブクローニングされ、ＰＭＯＮ ９９３５を生成した。このｃＤＮＡクローンの完全な配列を決定し、図１に示さ れるアミノ酸配列を推定するために使用した。

先の構造を促進するために、プラスミドｐＭＯＮ９９５０を生成するオリゴヌク レオチド： ５’−ＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＧＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣ −３゜を使用するクンケルの方法によるオリゴヌクレオチド介在突然変異生成に よってこのクローンの第１　ＡＴＧ開始コドンのすぐ上流で、Ｘｂａ　Ｉ部位を 操作した。ｐＭＯＮ９９５０をＸｂａ、Ｉにより消化し、再連結してｐＭＯＮ９ ９５１を生成するｃＤＮＡの５′末端における１　２６　ｂｐＸｂａ［フラグメ ントを除去した。トウモロコシＥＰＳＰシンターゼのグリホセート耐性体をコー ドするコード配列を生成するために、ｐＭＯＮ９９５１をオリゴヌクレオチド。

５’−ＣＴｒＣＴｒＧＧＧＧＡＡＴＧＣＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴＧＣＧＧＣ− ３゜を使用するクンケルの方法により突然変異させ、ｐＭＯＮ９９６０を得た。

この突然変異生成は、ＧＧＡコドンをＧＣＴコドンに変化させ、保有された配列 −Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−中の第２グリシン残基を得られたタンパク質中 のアラニンに変更した。グリシン残基は予測されたトウモロコシｐｒｅＥＰＳＰ シンターゼのアミノ酸１６３である。これは、決定されている正確なトランジッ トペプチダーゼ開裂部位に応じて、成熟タンパク質のアミノ酸９５〜１０５の間 の位置に対応する。次いて、ｐＭＯＮ９９６０をオリゴヌクレオチド：５°−Ｇ ＡＴＧＧＣＴＧＣＴＣＣＴＴＴＧＡＣＴＣＴｒＧＧＧＧＡＴＧ−３を使用する同 じ方法により突然変異生成して、トウモロコシＥＰＳＰシンターゼプリカーサ− の位１ｔ２５４にスレオニンの代りのアラニン置換を含むであろうトウモロコシ ＥＰＳＰシンターゼを生成する。これは、成熟タンパク質のアミノ酸残基１８７ 及び１９７の間の位置に対応する。

トウモロコシ細胞中の表現のために、トウモロコシｐｒｅＥＰＳＰシンターゼの グリホセート耐性変異体のコード配列を、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターのような トウモロコシ細胞中で作用する知られたプロモーター及びノーバリンシンターゼ 遺伝子またはその他の適用可能な遺伝子のポリＡ添加部位の間に挿入される。さ らに、トウモロコシＡＤＨＩ遺伝子の第１イントロンのようなイントロンは、キ メラ遺伝子（カリスら、１９８７）の発現を高め得る発現ユニットの５゛非翻訳 化領域中に含まれ得る。

トランスジェニックトウモロコシ細胞は、クラインら（１９８８）の方法または フロムら（１９９０）の方法により、プラスミドＤＮＡにより被覆された粒子を 使用する、懸濁系ＢＭＳ　Ｉ　（ＡＴＣＣ５４０２２）のようなトウモロコシ細 胞の衝撃により製造することができる。

次いてこの細胞を５ｍＭグリホセートを含む培地中で１〜３週間選択し、次いで ５ｍＭグリホセートを含む固形培地上で選択する。導入されキメラ変異体ＥＰＳ Ｐシンターゼ遺伝子を発現するカルスは、固形培地上の迅速な成長により同定さ れることかできる。

代替的に、ＥＰＳＰシンターゼ発現ユニットは、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの 制御下でネオマイシンホスホトランスフェラーゼ遺伝子を含むベクター、または 形質転換されたトウモロコシ細胞の選択を可能にする異なるマーカー遺伝子を存 する類似のベクター中に挿入される。

次いで、このベクターまたは特許請求の範囲及び本出願の実施例中に記載された ようにして構成されるその他のグリホセート耐性コード配列を使用する類似のベ クターを、下記実施例のようにして、トウモロコシ細胞中に導入する。

トウモロコシプロトプラストの製造 フロムらにより記載された方法（１９８５及び１９８６）により、プロトプラス トをブラックメキシカンスウィート（ＢＭＳ））ウモロコシ懸濁系、ＢＭＳ　Ｉ （ＡＴＣＣ５４０２２）から製造する。ＭＳ塩、２０ｇ／ｌシュクロース、２ｍ ｇ／ｌ　２．４ジクロロフエノキシ酢酸、２００ｍｇ／ｌイノシトール、１３０ ｍｇ／ｌアスパラギン、１．３ｍｇ／ｌナイアシン、０．２５ｍｇ／ｌチアミン 、０．２５＋ｎｇ／Ｉ　ピリドキシン、０．２５ｍｇ／ｌパントテン酸カルシウ ム、ｐＨ５，８を含むＥＭＳ培地中で、ＢＭＳ　Ｉ！［１！濁細胞が成長する。

１２５エルレンマイヤーフラスコ中の４０ｍ１培養物をＩ　５０　ｒｐｒｎて２ ６℃において振動させる。この培養物を等容量の新鮮な培地で３日毎に希釈する 。新鮮な培地を添加した後１〜２日目に、プロトプラストを活発に成長している 細胞から単離する。

プロトプラスト単離のために、揺動パケットテーブルトップ遠心分離装置を使用 して、２００Ｘｇで細胞をベレット化する。この上清を、プロトプラストの培養 のために調整した培地として保存する。バックされた細胞ａｍｌをｌ゛９６９６ セルロース５％へミセルラーゼ及び０．０２％ペクチナーゼを含む０．２Ｍマン ニトール１５０　ｍ１ｃａｃＬ　／　１０　ｍｌ酢酸ナトリウム４０ｍ１中に再 懸濁する。２６℃において２時間インキュベートした後、プロトプラストをナイ ロンメツシュスクリーン６０μｍを介して濾過することにより分離し、２００Ｘ ｇて遠心分離し、酵素を含まない同じ溶液中で１度洗浄する。

電気泳動技術を使用するトウモロコシプロトプラストの形質転換 ２ｍＭリン酸カリウム、ｐＨ７，１，４ｍＭ塩化カルシウム、１４０ｍＭ塩化ナ トリウム及び０．２〜１マンニトールを含む溶液中で洗浄することにより、電気 泳動のためのプロトプラストを調製する。洗浄後に、このプロトプラストを４Ｘ １０’プロトプラスト／ｍｌの濃度の同じ溶液中に再懸濁する。溶液を含むプロ トプラスト０．５ｍｌをスーパーコイル化されたプラスミドベクターＤＮＡ５０ μｇを含む同じ溶液０．５ｍｌと混合し、電気泳動キュベツト１ｍｌ中に入れる 。電気泳動は、フロムら（１９８６）の方法により行う。上記記載のように、電 気パルスは、２００Ｖに充電された１２２または２４５マイクロフアラドのコン デンサーから供給される。４℃での１０分間及び室温での１０分間の後、ＭＳ塩 、０．３Ｍマンニトール、２％シュクロース、２ｍｇ／［２，４−Ｄ、２０９６ １１整された８ＭＳ培地（上記参照）及び０．１％低融点アガロースを含む培地 ８＋ｎｌにより、プロトプラストを希釈する。２６°Ｃの暗所において２週間径 た後、マンニトールを含まずカナマイシンを含む培地を添加して、１００ｍｇ／ ｌカナマイシンの最終濃度を得る。さらに２週間径た後、微小カルスを前記液体 から除去し、１００ｍｇ／ｌカナマイシンを含むアガロース固化された培地上の 膜フイルタ−ディスク上に置く。形質転換されたトウモロコシ細胞からなるカナ マイシン耐性カルスは、１〜２週間に出現する。

グリホセート耐性トウモロコシ細胞 フロムら（１９８８）により記載されたように、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、 ＮＰＴＩＩ：＋−ド領域及びＮ０Ｓ３’　末端からなるキメラカナマイシン耐性 遺伝子を含むＤＮＡベクターによる電気泳動の後に、形質転換されたトウモロコ シ細胞は、カナマイシン含有培地中の成長により選択することかできる。これら の細胞は、ＥＰＳＰシンターゼのグリホセート耐性体を生成することかでき、高 められた濃度のグリホセートに対し耐性を示すであろう。

電気泳動処理された細胞はまた、上記のように、グリホセートを含有する固形培 地上での選択の後にグリホセート含有液体培地中に直接移することによって選択 することかてきる。

プラスミドをトウモロコンまたはその他の単子葉植物細胞中に導入するための代 替的方法としては、これらに限定されないか、ニューハウスらの注入方法（１９ ８７）、トラペナら（１９８７）の注入方法またはクラインら（１９８７）及び マクケープら（１９８８）の微投影方法が挙げられる。

ＩＶ、グリホセート耐性ＥＰＳＰＳをコードする遺伝子のその他の植物種への導 入 成熟ＥＰＳＰＳ酵素の位置１０１におけるグリシンからアラニンの置換及び位！ ：１９２におけるアラニンからスレオニンの置換を存する本発明の変異体ＥＰＳ ＰＳ酵素をコードする遺伝子は、タバコ、テンサイ、トマト、ダイス及びワタの ようなその他の植物種に導入されている。本発明のＥＰＳＰＳ酵素をコードする 変異体ＤＮＡを含むベクターにより形質転換された植物はまた、グリホセート耐 性を示した。特に、本発明のグリシンがらアラニン及びアラニンからスレオニン の置換は、Ａｒａｆ＋１ｄｏｐｓｉｓ　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　Ｓ遺伝子のゲノムクロ ーン中に導入されており、この遺伝子は、適当な植物形質転換ベクターを使用し てキャノーラ及びタバコ植物中へ導入されている。得られた形質転換植物は、グ リホセートに対する耐性を示した。

以上の開示より、本発明か、本発明に特有で明白な利点を伴って、上記に記載の 全ての目的を達成するために非常に適したものであることか明らかになったてあ ろう。

上記の具体例は、本発明の実施をより明確にするためのものである。本発明の範 囲から離脱せずに、本発明の多くの可能な具体例を設けることか可能であるので 、これらの具体例は、例示のみを目的とするものであって、本発明の範囲を限定 することを意図するものではないことを理解するべきである。

特定の特徴及びサブコンビネーションは有効であって、その他の特徴及びサブコ ンビネーションを参照せずに採用することかできると理解される。これは本発明 の範囲により企図され、本発明の範囲内のものである。

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（１９８６）ｒＮａｔｕｒｅＪ　３１９　ニア９１−７９３゜フロム、　Ｍ、　 Ｅ、、　Ｆ、モリシュ、Ｃ，アームストロング、Ｒ，ウィリアムス、Ｊ、トーマ ス、Ｔ、クライン（１９９０）　ｒＢｉｏ／ＴｅｃｈｎｏｌｏｇＹＪ　８　：　 ８３３−８３９゜ガードナー、Ｒ９，ホワース、Ａ１．バーン、Ｒ９，ブラウン ールエディ、Ｍ、、シェフアート、Ｒｏ及びメリック、Ｊ、。

（１９８１）　ｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、」９　：２８７１ガソサー ら、　（１９８８）　ｒＪ、Ｒｉａｌ、　Ｃｈｅｍ、Ｊ９：４２８０−４２８７ ゜ ガッサーら、　（１９８９）　ｒＰｌａｎｔ　Ｃｅ１ｌＪ　１　：　１５−２４ ゜ ゴールドバーブ、Ｒ，Ｂ、ら、（１９８１）　ｒＤｅｖｅｌ、Ｂｉｏ、Ｊ８３： ２０＋−２１７゜ ゴウダ、Ｓ９．ウー、Ｆ、　Ｃ，、及びシェパード、Ｒ，Ｊ、（１９８９）　、 ｒＪｏｕｒｎａｌ　ｏｆ　Ｃｅ１ｌｕｌａｒ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙｓｕｐ ｐｌｅｍｅｎｔ　１３Ｄ　Ｊ　、３０１．　（Ａｂｓｔｒａｃｔ）グリッツ及び ディビス、江朋　２５：１７９−１８８゜グブラー、Ｕ、、及びホフマン、Ｂ、 Ｈ，（１９８３）「江匣Ｊ　２５　：２６３−２６９゜ ギレイ、Ｈｏ、ダブリ−１Ｒ９，シタナルト、Ｇ１．バラツクＮａｔ１．　Ａｃ ａｄ、　Ｓｃｉ、　ＬＩＳＡＪ　ｖｏｌ、８３．　４４２８−４４３２゜バイン 、Ｔ、　Ｂ、、ヤング、Ｒ，Ａ、、及びディヒス、Ｒ，Ｗ。

（１９８５）　ｒＤＮＡ　Ｃｌｏｎｉｎｇ　Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ　：　Ａ　Ｐ ｒａｃｔｉｃａｌＡｐｐｒｏａｃｈ、　Ｊ　Ｄ、グローバー、編集、ＩＲＬブレ ス、オツクスフオート。

ケイ、Ｒ１，キャン、Ａ、、プーリー、Ｍ、、及びマクファーリー、Ｈ，Ｊ、、 ムスコフ、Ｙ、Ｍ、、及びゲイサー、Ｃ，Ｓ。

（１９８７）、ｒＭｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔＪ２１０，４３７−４４２゜ クライン、Ｔ、Ｍ、、つオルト、Ｅ、Ｄ、、ウー、Ｒｏ及びサンホード、Ｊ、Ｃ ，（１９８７）　ｒＮａｔｕｒｅＪ　３２７　ニア０−７３゜ コンクズ、Ｃ９，及びシェル、Ｊ、　（１９８６）　、ｒＭｏｌＧｅｎ　Ｇｅｎ ｅｔ　Ｊ　２　０　４．　３　８　３−３　９　６゜クリーブ、Ｐ、　Ａ、及び メルトン、Ｄ、Ａ、（１９８４）ｒＮｕｃｌｅｉｃＡｃｉｄｓＲｅｓ、Ｊ　１２ 　：　７０５７−７０７０゜クンケル（１９８５）　ｒＰ、　Ｎ、　Ａ、　Ｓ、 　ＵＳＡＪ　８２：４８８−４９２゜ レムケ、Ｇ、及びアクセル、Ｒ，（１９８５）　ｒｃｅｌｌＪ　４０　：　５０ １−５０８゜ マンアチス、Ｔ、、ら、（１９８２）　ｒＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ　 ：　Ａ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ　Ｍａｎｕａｌ、　Ｊ　：］−ルドスプリンクハ ーハーラプズ、ニューヨーク州 マーマー、Ｊ、（１９６１）　ｒＪ、　１ｌｌｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　３：２ ０マスケル、Ｄ、　Ｊ、　ら、（１９８８）　ｒＪ、　Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇ ｙＪ　１７０．６：２４６７−２４７１゜マキサム、Ａ、　Ｍ、及びギルバート 、Ｗ、、（１９７７）ｒＰ、　Ｎ、Ａ、　Ｓ、　［ｌ５ＡＪ　７４：５６０−５ ６４゜マクケープ、Ｄ、Ｃ２，ら、（１９８８）　ｒＢｒｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏ ｇＹＪ６：９２３゜ メソング、Ｊ、ら、（１９８１）　ｒＮｕｃｌｅｉｃ　Ｒｅｓ、」９　：３０９ −３２１゜ モレリ、Ｇ、、ネイギー、Ｆ、、フレイリー、Ｒ，Ｔ、、ロジャーズ、Ｓ、　Ｇ 、、及びチュア、Ｎ、Ｈ，（１９８５）。

ｒＮａｔｕｒｅＪ　３１５．　２００−２０４゜ムースゾール、Ｄ、　Ｍ、及び コギングス、Ｊ、Ｒ，（１９８４）　ｒＰＩａｎｔａｊ　Ｉ　６　４　：　７８ −８　３　。

オーデル、Ｊ、　Ｔ、、ネイギー、Ｆ、、及びチュア、Ｎ、　Ｈｏう才、Ｒ，Ｎ 、及びロシャーズ、Ｓ、Ｇ、（１９７９）「蝕胚Ｊ　ｐｐ、７　：　７９−８２ ゜ロチニスター、Ｄ、ε、、ウィンター、Ｊ、　Ａ−及びシャー、Ｄ、　Ｍ、（ １９８６）　ｒＥＭＢＯＪ、　Ｊ　５　：　４５２−４５８゜ロジャーズ、Ｓ、 、ホーシュ、Ｒ３及びフレイリー、Ｒｏ（１９８６）　ｒＭｅｔ　ｏｄｓ　ｉｎ 　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　Ｊ　Ｖｏｌ、　ｌ　ｌ　８（Ｈ，バイスバッハ及びＡ 、　ｔ＜イスバッハ、編集’）　Ｉ）、　６２７、アカデミツクプレス、ニュー ヨークロジャーズ、Ｓ、、リー、：Ｈｌ、ホーシュ、Ｒｏ及びフレイリー、Ｒ， （１９８７）　ｒＭｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ　ＪＶｏｌ、　 ＋　５３　（Ｒ，ウー及びり、グロスマン、編集）ｌ）、２５３、アカデミツク プレス、ニューヨークサンカー、Ａ１．ら、（１９８０）　ｒＰ、　Ｎ、　Ａ、 　Ｓ、　ＬＩＳＡＪ７７：２６１１゜ サンガー、ら、（１９７７）　ｒＰｒｏｃ、　Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　５ｃｉ ＵＳＡ　Ｊ　７４　：　５４６３゜ シェラ−１ら、（１９８１）　ｒＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏ　Ｊ　８ ６：４３８−４４７゜ シムケ、Ｒ，Ｔ、　Ｗ集、（１９８２）　ｒＧｅｎｅ　Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉ ｏｎ。

」コールドスプリングハーバーラブズ シュミットハウザー、Ｔ、及びバリンスキ、Ｄ、　（１９８５）　ｒＪ、　Ｂａ ｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ　Ｊ　１６４　：　４４６゜シュラ−１Ｍ、Ａ、、シュミ ット、Ｅ、　Ｓ、及びビーチ−１Ｒ８Ｎ、（１９８２）　ｒＮｕｃｌ　Ａｃ１ｄ ｓＲｅｓ、Ｊ　、１　０　：　８２２５−８２４４゜ シャー、Ｄ５．ホーツユ、Ｒ３，リー、Ｈｌ、キショア、Ｇ、。

ウィンター、ｊ、、チュマー、Ｎ、、ヒロナヵ、ｃｌ、サンダーズ、Ｐ、、ガサ −１Ｃ１，アイケント、Ｓ、、シーゲル、Ｎ、。

ロジャーズ、Ｓ、、及びフレイリー、Ｒｏ（１９８６）。

ｒＳｃ４ｅｎｃｅ　ノ　、２３３．　４７８−４８１゜ソバーソン、ら、　（１ ９８０）、ｒＧｅｎｅＪ　９：２８７−３０５゜ サザン、Ｅ、Ｍ、　（１９７５）　ｒＪ、　Ｍｏ１．　Ｂｉｏｌ、　Ｊ　、９８ 　：５０３−５１７゜ スタルカー、Ｄ、　Ｍ、　、）−マス、Ｃ，Ｍ、、及びヘリンスキ、Ｄ、　Ｒ， （１９８１）、ＩＩＪｏｌＧｅｎＧｅｎｅｔＪ　１８１．　８−１２、 スタルカー、Ｄ、　Ｍ、　、ハイアット、Ｗ、　Ｒ，及びコマイ、Ｌ、　（１９ ８５）　ｒＪ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍｌ　２６０　：４７２４−４７２８゜ スタインルッヶン、Ｈｏ及びアムルハイン、Ｎ、（１９８ヤニツシユーペロン、 ｃｏ、ビエイラ、　Ｊ、及びメリック、１００：４６Ｂ。

ト７トＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬ　ＴＡＡＶＴＶＡＧＧＨ５ＲＹＶＬＤＧＶＰＲＭＲ ＥＲＰＩＧＤＬＶ　ＤＧＬＫＱＬＩａＡＥＶ）ウモａコシＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬ 　ＴＡＡＶＴＡＡＧＧＮ　ＡＴＹＶＬＤＧＶＰＲＭＲＥＲＰＴＧＤＬＶ　ＶＧＬ ＫＱＬＧＡＤＶＢ、ｎａｐｕｓ　ＧＮＡＧＴＡＭＲＰＬ　ＴＭＶＴＡＡＧＧＮ　 ＡＲＹＶＬＤＧＶＰＲＭＲＥＲＰＩＧＤＬＶ　ＶＧＬＫＱＬＧＡＤＶＬｃｏｌｉ 　ＧＮＡＧＴＡｔ４ＲＰＬ　ＡＡＡＬＣＬＧＳＮＤ　ＩＶ、　、ＬＴＧＥＰＲＨ ＫＥＲ円Ｇ）ＬＶ　Ｉ）ＡＬＲＬＧＧＡＫＩＳａｌａｎｅｌｌａ　ＣＮＡＧＴＡ ＭＲＰＬ　ＡＡＡＬＣＬＧＯＮＥ　ＴＶ、、ＬＴＧＥＰＡ　ＭＬＥＲ円Ｇ）ＬＶ 　ＤＳＬＲＱ［１ｌＧＡmＩ −４ＧＮＡＧＴＡ−ＲＰＬ　−Ｍ−−−−−−−−−−−Ｌ−Ｇ−Ｐ−Ｍ（ＲＰ Ｉ−ＬＶ−Ｌ−−−ＧＡ−−ペチユニアＤＣＦＬＧＴＫＣＰＰ　ＶＲＩＶＳＫＧ Ｃ（Ｐ　ＧＩｌ＆ＶＫＬＳＧＸＩ　ＳＳＯＹＬＴＡＬＬＭ　ＡＡＰＬ、、、、Ａ Ｌトマト　ＤＣＳ；ＬＧＴＮＣＰＰＶＲＩＶＳＫＧＧＬＰＧＧＫＶＫＬＳＧＳＩ ＳＳＱＹＬＴＡＬＬＭＡＡＰＬ、、、、ＡＬＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ＥＣＴＬ ＧＴＮＣＰＰ　ＶＲ’／ＮＡＮＧＧＬＰ　Ｃ１［！ＫＶにＬＳ（＋！；Ｉ　ＳＳ ＱＹＬＴＡＬＬＭ　５ＡoＬ、、、、ＡＬ ダダイ　［ｌＣＦ’ＬＧＴＮＣＰＰ■ＶＮＧＫ［１ＧＬＰ　Ｇ［１ｌＫＶＫＬＳ ＧＳＶ　５ＳＱＹＬＴ糺ＬＭＡρＬ、、、、糺トウモロコンＩＩＣＦＬＧ丁ＤＣ ＰＰ　ＶＲＶＮＧＩＧＧＬＰ　Ｃ１ＧＫＶＫＬＳＧＳＩ　ＳＳＱＹＬＳＡＬＬＭ 　ＡＡＰＬ５．、、／ＩＩk トウモロコシ　ＶＫＮ　。

５ａｌｎｎｎｅｌｌａ　５ＴＰＡ 一致　−−一− 国際調査報告 、　Ｎｏ　ＰＣＴ／ｕｓ　９１１０７０６８フロントページの続き （５１）　Ｉｎｔ、　Ｃ１，５識別記号　庁内整理番号Ｃｌ２Ｎ　１５／８２ ／／　Ｃ１２Ｎ　９／１０　９３５９−４Ｂ（７２）発明者　キショアー、ガネ シュ、マーシイアメリカ合衆国６３０１７　ミズーリ州チェスターフイールド、 グラントリイ　ドライブＩ

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列中の位置８０及び１２０の間に存在する第１ア ミノ酸配列：−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ− 中の第２グリシン残基をアラニン残基で置換すること、及びさらに、第２アミノ 酸配列： −Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｍ−Ｘ１−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ａ−（式中、Ｘ１はアラニン、セリンま たはスレオニンであり、前記第２アミノ酸配列は成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列中 の位置１７０及び２１０の間に存在する）中の末端アラニン残基をスレオニン残 基で置換することを含む、グリホセート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホ シキメート（ＥＰＳＰ）シンターゼ酵素をコードする遺伝子の製造方法。
2. ２．グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼが、植物ＥＰＳＰシンターゼから生成 される請求の範囲第１項に記載の方法。
3. ３．グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼが、細菌ＥＰＳＰシンターゼから生成 される請求の範囲第１項に記載の方法。
4. ４．成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列中の位置８０及び１２０の間に第１アミノ酸配 列： −Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−、 及び第２アミノ酸配列： −Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｍ−Ｘ１−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｔ−（式中、Ｘ１は、アラニン、セリン またはスレオニンであり、前記第２アミノ酸配列は成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列 中の位置１７０及び２１０の間に存在する）を含む、グリホセート耐性５−エノ ールピルビル−３−ホスホシキメート（ＥＰＳＰ）シンターゼ酵素をコードする 遺伝子。
5. ５．図１中に示される請求の範囲第４項に記載の遺伝子。
6. ６．ＥＰＳＰシンターゼコード配列が、ペチュニア、トマト、トウモロコシ、Ａ ｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ、ダイズ、Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａＰ ｕｓ、Ｅ．ｃｏｌｉＫ−１２及び図１中に示されるＳａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙ ＰｈｉｍｕｒｉｕｍからなるＥＰＳＰシンターゼの群から選択される請求の範囲 第２項に記載の方法によって生成されるグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼを コードする遺伝子。
7. ７．請求の範囲第４項に記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵素をコー ドする植物遺伝子。
8. ８．成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列の８０及び１２０の間に存在する第１アミノ酸 配列： −Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ− 及び第２アミノ酸配列： −Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｍ−Ｘ１−Ａ−Ｐ−Ｌ−Ｔ−（式中、Ｘ１はアラニン、セリンま たはスレオニンであり、前記第２アミノ酸配列は成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列中 の位置１７０及び２１０の間に存在する）を有するグリホセート耐性５−エノー ルピルビル−３−ホスホシキメート（ＥＰＳＰ）シンターゼをコードする遺伝子 を含む植物形質転換ベクター。
9. ９．グリホセートー耐性植物ＥＰＳＰシンターゼを含む請求の範囲第８項に記載 のベクター。
10. １０．グリホセートー耐性細菌ＥＰＳＰシンターゼを含む請求の範囲第８項に記 載のベクター。
11. １１．請求の範囲第７項に記載の遺伝子を含む形質転換された植物細胞。
12. １２．トマト、タバコ、採油用ナタネ、アマ、ダイズ、ヒマワリ、テンサイ、ア ルファルファ、ワタ、コメ及びトウモロコシからなる群から選択される請求の範 囲第１１項に記載の形質転換された植物細胞。
13. １３．トマト由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
14. １４．タバコ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
15. １５．採油用ナタネ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
16. １６．アマ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
17. １７．ダイズ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
18. １８．ヒマワリ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
19. １９．テンサイ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
20. ２０．アルファルファ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
21. ２１．トウモロコシ由来の請求の範囲第１１項に記載の形質転換された細胞。
22. ２２．請求の範囲第１１項に記載の形質転換された植物細胞を含む植物。
23. ２３．植物が、トマトである請求の範囲第２２項に記載の植物。
24. ２４．植物が、タバコである請求の範囲第２２項に記載の植物。
25. ２５．植物が、採油用ナタネである請求の範囲第２２項に記載の植物。
26. ２６．植物が、アマである請求の範囲第２２項に記載の植物。
27. ２７．植物が、ヒマワリである請求の範囲第２２項に記載の植物。
28. ２８．植物が、テンサイである請求の範囲第２２項に記載の植物。
29. ２９．植物が、アルファルファである請求の範囲第２２項に記載の植物。
30. ３０．請求の範囲第２２項に記載の植物により生成される種子。
31. ３１．植物が、トマトである請求の範囲第３０項に記載の種子。
32. ３２．植物が、タバコである請求の範囲第３０項に記載の種子。
33. ３３．植物が、採油用ナタネである請求の範囲第３０項に記載の種子。
34. ３４．植物が、アマである請求の範囲第３０項に記載の種子。
35. ３５．植物が、ヒマワリである請求の範囲第３０項に記載の種子。
36. ３６．植物が、テンサイである請求の範囲第３０項に記載の種子。
37. ３７．植物が、アルファルファである請求の範囲第３０項に記載の種子。
38. ３８．請求の範囲第４項に記載の植物遺伝子を含む植物を繁殖させることを含む グリホセート耐性植物の生産方法。
39. ３９．植物が、トウモロコシ、トマト、タバコ、採油用ナタネ、アマ、ヒマワリ 、テンサイ、アルファルファ、ワタ及びコメからなる群から選択される請求の範 囲第３８項に記載の方法。
40. ４０．交配の少なくとも−部の子孫がグリホセート耐性を示すように、第１植物 及び第２植物を交配することによって、第１植物が繁殖される請求の範囲第３８ 項に記載の方法。
41. ４１．植物が、トウモロコシ、トマト、タバコ、採油用ナタネ、アマ、ヒマワリ 、テンサイ、アルファルファ、ワタ及びコメからなる群から選択される請求の範 囲第４０項に記載の方法。
42. ４２．請求の範囲第４項に記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼをコード するＤＮＡ配列。
43. ４３．長さが２０キロベース未満である請求の範囲第４２項に記載のＤＮＡ配列 。
44. ４４．請求の範囲第５項に記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼをコード する請求の範囲第４３項に記載のＤＮＡ配列。
45. ４５．請求の範囲第６項に記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼをコード する請求の範囲第４２項に記載のＤＮＡ配列。
46. ４６．下記工程： 成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列中の位置８０及び１２０の間にアミノ酸配列−Ｌ− Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−及び第２アミノ酸配列−Ａ−Ｌ−Ｌ−Ｍ−Ｘ１−Ａ− Ｐ−Ｌ−Ｔ−（式中、Ｘ１はアラニン、セリンまたはスレオニンであり、前記第 ２アミノ酸配列は、成熟ＥＰＳＰシンターゼ配列中の位置１７０及び２１０の間 に存在する）を含むグリホセートー耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵素をコードする遺 伝子を含む結果、グリホセート耐性を有する作物種子または植物を植え；次いで その畑中の前記作物及び雑草に、十分量のグリホセートを与えて、作物に著しい 影響を与えずに、雑草を制御すること を含む植えられた作物種子または植物を有する作物を含む圃場において、雑草を 選択的に制御する方法。
47. ４７．グリホセート耐性ＥＰＳＰシンターゼ酵素をコードする遺伝子が、植物起 源である請求の範囲第４６項に記載の方法。