CN101124324B - 赋予除草剂抗性的基因 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了组合物和方法，用于向细菌、植物、植物细胞、组织和种子赋予除草剂抗性。本发明提供了包含下述多肽的编码序列的组合物，所述多肽赋予对草甘膦除草剂的抗性或耐受性。编码序列可用于DNA构建体或表达盒，用于在植物中转化和表达。组合物还包含经转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。特别地，提供了对应于草甘膦抗性核酸序列的经分离的核酸分子。此外，本发明包括对应于所述多核苷酸的氨基酸序列。特别地，本发明提供了经分离的核酸分子，其包含编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列或SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列。

Description

赋予除草剂抗性的基因
发明领域
本发明提供了编码5-烯醇丙酮酰莽草酸盐-3-磷酸盐(5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate，EPSP)合酶的新颖基因及其变体。该基因及其变体可用于植物生物学、作物育种和植物细胞培养。
发明背景
通常被称为草甘膦的N-膦酰甲基甘氨酸是重要的农业化学品。草甘膦抑制将磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和3-磷酰莽草酸(3-phosphoshikimic acid)转化为5-烯醇丙酮酰-3-磷酰莽草酸的酶。对该酶(5-烯醇丙酮酰莽草酸盐-3-磷酸盐合酶，在本文中被称为“EPSP合酶”)的抑制通过阻断莽草酸盐途径杀死植物细胞，由此抑制芳香族氨基酸的生物合成。
因为草甘膦类除草剂能抑制芳香族氨基酸生物合成，所以它们不仅杀死植物细胞，还对细菌细胞有毒性。草甘膦抑制很多细菌EPSP合酶，由此对这些细菌有毒性。但是，某些细菌EPSP合酶具有对草甘膦的高度耐受性。
可通过对植物细胞进行转化，以表达抗草甘膦的细菌EPSP合酶，来生产对草甘膦毒性有抗性的植物细胞。尤其地，来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株CP4的细菌基因已用于在植物中表达之后对植物细胞赋予除草剂抗性。来自鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)菌株CT7的经突变EPSP合酶在细菌细胞中赋予草甘膦抗性，并且在植物细胞上赋予草甘膦抗性(美国专利号4,535,060、4,769,061和5,094,945)。但是，仍然需要其它的除草剂抗性基因。
发明简述
本发明提供了用于对细菌、植物、植物细胞、组织和种子赋予除草剂抗性的组合物和方法。组合物包括编码除草剂抗性多肽的序列的核酸分子，包含这些核酸分子的载体，以及包含所述载体的宿主细胞。本发明提供了包含下述多肽的编码序列的组合物，所述多肽赋予对草甘膦除草剂的抗性或耐受性，还提供了针对这些多肽的抗体。本发明的组合物包括编码除草剂抗性多肽的合成核酸分子。编码序列可用于DNA构建体或表达盒，用于在生物体(包括微生物和植物)中转化和表达。组合物还包含经转化的细菌、植物、植物细胞、组织和种子。此外，提供了生产下述多肽的方法，所述多肽由本发明的合成核苷酸所编码。
特别地，提供了对应于赋予除草剂抗性的核酸序列的经分离核酸分子。此外，本发明包括对应于所述多核苷酸的氨基酸序列。特别地，本发明提供了经分离的核酸分子，其包含SEQ ID NO：1或2所示的核苷酸序列、编码SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列的核苷酸序列、以编号No.B-30804在细菌宿主中保藏的草甘膦抗性核苷酸序列，以及它们的变体和片段。与本发明的核苷酸序列互补的核苷酸序列或与本发明的序列杂交的核苷酸序列也包括在本发明中。
附图简述
图1显示了grg8的核苷酸序列(SEQ ID NO：1)。开放读码框从第296位核苷酸开始，在第1555位核苷酸结束(SEQ ID NO：2)。
图2显示了GRG8蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)。
图3显示了对GRG8(SEQ ID NO：3)、GRG8ml_(C22)(SEQ ID NO：5)、GRG8m3_(N24)(SEQ ID NO：9)、GRG8m2_(N15)(SEQ ID NO：7)、GRG8m4_(A1)(SEQ ID NO：11)、GRG8m5_(B2)(SEQ ID NO：13)、GRG8m6_(B7)(SEQ ID NO：15)、GRG8m7_(B11)(SEQ ID NO：17)、GRG8m8_(C11)(SEQ ID NO：19)、GRG8m9_(E3)(SEQ ID NO：21)和GRG8m10_(E4)(SEQ ID NO：23)的氨基酸序列的比对。
发明详述
现在将参考附图，在下文中对本发明进行更完全的描述，附图中显示了一些但并非全部的发明实施方式。事实上，这些发明可以以很多不同的形式实施，其不应当被限制为本文示出的实施方式；其实，提供这些实施方式是为了使本公开文本满足适用的法律要求。上下文中，相似的编号指相似的元件。
对于上述发明所涉及的领域的技术人员(从前述说明书和相关附图的教导受益的)而言，能想到本文示出的本发明的很多改变和其它实施方式。因此，应当理解，本发明不仅限于公开的特定实施方式，改变和其它实施方式也将被包括在所附权利要求的范围内。虽然本文使用了特定的术语，但是它们仅用作普通描述，并非用于限制目的。
本发明涉及在生物(特别是植物或植物细胞)中调控除草剂抗性的组合物和方法。所述方法包括用编码本发明草甘膦抗性基因的核苷酸序列对生物加以转化。本发明的核苷酸序列可用于制备展示出对除草剂草甘膦具有提高的耐受性的植物。因此，本发明提供了经转化的细菌、植物、植物细胞、植物组织和种子。组合物包括与微生物和植物中除草剂耐受性相关的核酸和蛋白质，以及经转化的细菌、植物、植物组织和种子。本文公开了草甘膦抗性基因(grg8)的核苷酸序列以及由此编码的蛋白质的氨基酸序列。所述序列可用于构建表达载体，以随后转化进感兴趣的植物，或者可用作为探针，用于分离其它草甘膦抗性基因，或者可用作为选择标记等。
含有本发明的除草剂抗性核苷酸序列的质粒于2004年12月21日被保藏于Agricultural Research Service Culture Collection，Northern Regional Research Laboratory(NRRL)，编号为No.NRRLB-30804，永久保藏。该保藏物将按照布达佩斯条约关于国际承认的用于专利程序目的的微生物保藏的规定被保持。该保藏物仅作为本领域技术人员提供便利之用，并非对按照35U.S.C.§112要求保藏物的认可。
“草甘膦”意指N-膦酰甲基甘氨酸(包括其任何盐)的任何除草剂形式，以及其它能导致在植物中(in planta)产生草甘膦阴离子的形式。“除草剂抗性蛋白”或从“编码除草剂抗性的核酸分子”产生的蛋白包括向细胞赋予下述能力的蛋白，所述能力是：较之不表达该蛋白的细胞而言，能耐受更高浓度的除草剂，或者较之不表达该蛋白的细胞而言，在更长的时间耐受某浓度的除草剂。“草甘膦抗性蛋白”包括向细胞赋予下述能力的蛋白，所述能力是：较之不表达该蛋白的细胞而言，能耐受更高浓度的草甘膦，或者较之不表达该蛋白的细胞而言，在更长的时间耐受某浓度的草甘膦。“耐受”或“耐受性”意指：存活，或以不易与未经处理细胞分辨的方式进行重要的细胞功能，例如蛋白合成和呼吸。
经分离的核酸分子及其变体和片段
本发明的一个方面涉及经分离的核酸分子，其包含编码除草剂抗性蛋白和多肽或其生物活性部分的核苷酸序列，以及涉及足以作为杂交探针以鉴定编码除草剂抗性的核酸的核酸分子。本文中使用的术语“核酸分子”意在包括DNA分子(例如cDNA或基因组DNA)和RNA分子(例如mRNA)以及使用核苷酸类似物产生的DNA或RNA的类似物。核酸分子可以是单链的或双链的。
编码本发明的蛋白质的核苷酸序列包括SEQ ID NOs：1和2所示的序列，以编号No.NRRL B-30804在细菌宿主中保藏的除草剂抗性核苷酸序列以及它们的变体、片段和互补序列。“互补序列”意指下述核苷酸序列，其与给定的核苷酸序列足够互补，使得其可与给定的核苷酸序列杂交，由此形成稳定双链体。这些核苷酸序列编码的除草剂抗性蛋白的相应氨基酸序列示于SEQ ID NO：3中。本发明还包括包含下述核苷酸序列及其互补序列的核酸分子，所述核苷酸序列编码部分长度的除草剂抗性蛋白。
“经分离的”或“经纯化的”核酸分子或蛋白质或其生物活性部分，基本(substantially)不含其它细胞物质或培养基(当通过重组技术生产时)，或基本不含化学品前体或其它化学品(当化学合成时)。优选地，“经分离的”核酸不含在获得所述核酸的生物基因组DNA中天然连接于所述核酸侧翼的序列(优选地，蛋白质编码序列)(即，位于所述核酸5’和3’末端的序列)。就本发明的目的而言，当用于指代核酸分子时，“经分离的”排除了经分离的染色体。例如，在多种实施方式中，经分离的编码草甘膦抗性的核酸分子可含有少于大约5kb、4kb、3kb、2kb、1kb、0.5kb或0.1kb的下述核苷酸序列，所述核苷酸序列在获得所述核酸的细胞的基因组DNA中天然连接于所述核酸侧翼。基本不含细胞物质的除草剂抗性蛋白质包括下述蛋白质制剂，所述制剂具有少于大约30％、20％、10％或5％(以干重计)的非除草剂抗性蛋白(也被称为“污染性蛋白”)。
是上述编码除草剂抗性的核苷酸序列的片段的核酸分子也包括在本发明内。“片段”指编码除草剂抗性蛋白的核苷酸片段。核苷酸序列的片段可编码除草剂抗性蛋白的生物活性部分，或者其可以是使用下文公开的方法可用作杂交探针或PCR引物的片段。是除草剂抗性核苷酸序列的片段的核酸分子包含至少大约15、20、50、75、100、200、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800、850、900、950、1000、1050、1100、1150、1200、1250、1300、1350、1400、1450、1500、1550、1600、1650、1700、1750、1800、1850、1900、1950个连续的核苷酸，或者多达本文公开的编码除草剂抗性的全长核苷酸序列中存在的核苷酸数量(例如，对SEQ ID NO：1而言，2000个核苷酸，对SEQ ID NO：2而言，1257个核苷酸)。“连续的”核苷酸意指互相紧邻的的核苷酸残基。
本发明的核苷酸序列的片段通常将编码保留了全长草甘膦抗性蛋白的生物活性(即，除草剂抗性活性)的蛋白片段。“保留了除草剂抗性活性”意指：该片段将具有本文中作为SEQ ID NO：3公开的全长草甘膦抗性蛋白的除草剂抗性活性的至少大约30％，至少大约50％，至少大约70％或者至少大约80％。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利Nos.4,535,060和5,188,642，它们每份都通过引用整体并入本文。
编码本发明蛋白的生物活性部分的、除草剂抗性编码核苷酸序列的片段将编码至少大约15、25、30、50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400个连续的氨基酸，或者多达本发明的全长除草剂抗性蛋白中存在的氨基酸的总数(例如对于本发明的蛋白质而言，419个氨基酸)。
本发明的除草剂抗性蛋白由与SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列足够相同的核苷酸序列编码。术语“足够相同”意指：采用标准参数，使用本文所述的比对程序之一，较之参照序列具有至少大约60％或65％序列相同性，大约70％或75％序列相同性，大约80％或85％序列相同性，大约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列相同性的氨基酸或核苷酸序列。本领域技术人员将理解，可以考虑到密码子简并性、氨基酸相似性、读码框位置等，对这些值适当地调节，以确定两条核苷酸序列编码的蛋白质的对应相同性。
为确定两条氨基酸序列或两条核酸序列的百分比相同性，针对最优比较的目的，对序列加以比对。两条序列间的百分比相同性是序列共有的相同位置数的函数(即，百分比相同性＝相同的位置数/总位置数(例如重叠的位置)x100)。在一种实施方式中，两条序列长度相同。可使用与下文所述类似的技术，允许或不允许存在缺口，来测定两条序列间的百分比相同性。在对百分比相同性的计算中，典型地，计算完全的匹配。
对两条序列间百分比相同性的测定可使用数学算法来完成。用于比较两条序列的数学算法的非限制性例子是按照Karlin andAltschul(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877改良的Karlin and Altschul(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：2264-2268算法。此算法被并入Altschul et al.(1990)J MoI.Biol.215：403-410的BLASTN和BLASTX程序。可用BLASTN程序，分数＝100，字长＝12，进行BLAST核苷酸搜索，以获得与本发明的GDC样核酸分子同源的核苷酸序列。可以用BLASTX程序，分数＝50，字长＝3，来进行BLAST蛋白质搜索，以获得与本发明的除草剂抗性蛋白分子同源的氨基酸序列。为获得有缺口的比对用于比较目的，可使用有缺口BLAST，如Altschul et al.(1997)Nucleic Acids Res.25：3389-3402所述。或者，可以用PSI-Blast进行迭代搜索，以探测分子之间较远的关系。见上文所述的Altschul et al.(1997)。当利用BLAST、有缺口BLAST和PSI-Blast程序时，可使用各程序(例如BLASTX和BLASTN)的缺省参数。见www.ncbi.nlm.nih.gov。用于比较序列的数学算法的另一非限制性例子是ClustalW算法(Higginset αl.(1994)Nucleic Acids Res.22：4673-4680)。Clustal W对序列加以比较，对氨基酸或DNA序列的整体加以比对，因此能提供关于整个氨基酸序列的序列保守性的数据。ClustalW算法用于多种可商业获得的DNA/氨基酸分析软件包，例如Vector NTI程序套装(Invitrogen Corporation，Carlsbad，CA)的ALIGNX模块。用ClustalW对氨基酸序列进行比对之后，可以估计出氨基酸百分比相同性。可用于ClustalW比对分析的软件程序的一个非限制性例子是GeneDocTM。GeneDocTM(Karl Nicholas)允许对多个蛋白质之间的氨基酸(或DNA)相似性或相同性加以评估。用于比较序列的数学算法的另一非限制性例子是Myers and Miller(1988)CABIOS4：11-17的算法。此算法被并入ALIGN程序(版本2.0)，该程序是GCG序列比对软件包(可从Accelrys，Inc.，San Diego，CA获得)的一部分。当利用ALIGN程序用于比较氨基酸序列时，可以使用PAM120权重残基表(weight residue table)、12的缺口长度惩罚以及4的缺口惩罚。
除非另有指明，使用Needleman and Wunsch(1970)J Mol.Biol.48(3)：443-453算法的GAP版本10将用于确定序列相同性或相似性，其中使用下述参数：对于核苷酸序列的％相同性和％相似性，使用50的GAP权重，3的长度权重，以及nwsgapdna.cmp计分矩阵；对于氨基酸序列的％相同性或％相似性，使用8的GAP权重，2的长度权重以及BLOSUM62计分程序。还可使用等同程序。“等同程序”意指下述任何序列比较程序，对于用于比对的任何两条序列而言，较之GAP版本10产生的对应比对，其能产生出具有相同核苷酸残基匹配的比对以及相同的百分比序列相同性。
本发明还包括变体核酸分子。编码除草剂抗性的核苷酸序列的“变体”包括下述这些序列，它们编码本文公开的除草剂抗性蛋白，但是由于遗传密码简并性它们有一定程度的不同，“变体”还包括上文所述足够相同的那些。可以用公知的分子生物学技术来鉴定天然存在的等位变体，例如用聚合酶链式反应(PCR)和杂交技术，如下文所概述的。变体核苷酸序列还包括通过合成获得的核苷酸序列，它们是例如用定点诱变产生的，但是将仍然编码本发明公开的除草剂抗性蛋白，如下文所讨论。本发明包括的变体蛋白是具有生物活性的，即，它们保留有人们想要的天然蛋白的生物活性，即保留了除草剂抗性活性。“保留了除草剂抗性活性”意指变体将具有天然蛋白除草剂抗性活性的至少大约30％，至少大约50％，至少大约70％，或者至少大约80％。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利Nos.4,535,060和5,188,642，它们每份都通过引用整体并入本文。
本领域技术人员还将知道，可通过突变向本发明的核苷酸序列引入变化，由此导致被编码的除草剂抗性蛋白的氨基酸序列中的改变，而不改变蛋白的生物活性。因此，可以这样制造经分离的核苷酸分子的变体：向本文公开的对应的核苷酸序列引入一个或多个核苷酸取代、添加或缺失，使得向被编码的蛋白中引入一个或多个氨基酸取代、添加或缺失。可以通过标准技术，例如定点诱变和PCR介导的诱变来引入突变。此类变体核苷酸序列也被本发明所包括。
例如，可在一个或多个预定的、非关键的氨基酸残基制造保守氨基酸取代。“非关键的”氨基酸残基是下述残基，其可从除草剂抗性蛋白的野生型序列改变，但不改变生物活性，而“关键”氨基酸残基是生物活性所需要的。“保守氨基酸取代”是这样的：其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基代替。具有相似侧链的氨基酸家族在本领域中已被定义。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、带β-支链的侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。氨基酸取代可在保留功能的非保守区域发生。通常，此类取代将不对保守氨基酸残基，或处于保守基元(motif)(在该处的此类残基对于蛋白质活性来说是很重要的)中的氨基酸残基进行。但是，本领域技术人员将理解，功能性变体可能在保守残基处具有较少保守性的或非保守性的改变。
或者，可通过在编码序列的全部或部分上随机引入突变来产生变体核苷酸序列，例如，通过饱和诱变来产生，可针对赋予除草剂抗性活性的能力对得到的突变体加以筛选，以鉴定出保留有活性的突变体。诱变之后，被编码的蛋白质可在细胞中表达，可使用标准试验技术来测定蛋白活性。
使用PCR、杂交等方法，可鉴定出对应的除草剂抗性序列，此类序列具有与本发明序列的基本相同性。见，例如Sambrook and Russell(2001)Molecular Cling：ALaboratory Manual(Cold SpringHarbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)和Innis，et al.(1990)PCR Protocols：A Guide to Methods and Applications(Academic Press，St.Louis，MO)。
在杂交方法中，除草剂抗性核苷酸序列的全部或部分可用于筛选cDNA或基因组文库。用于构建此类cDNA和基因组文库的方法通常是本领域已知的，并在上文所述的Sambrook and Russell(2001)中有所描述。所谓的杂交探针可以是基因组DNA片段、cDNA片段、RNA片段或其它寡核苷酸，可用可探测基团，例如32P或任何其它可探测标志(marker)，例如其它放射同位素、荧光化合物、酶或酶辅助因子对其进行标记。可基于本文公开的编码除草剂抗性的已知核苷酸序列，对合成的寡核苷酸加以标记，来制造用于杂交的探针。可额外使用基于核苷酸序列或被编码的氨基酸序列中的保守核苷酸或氨基酸残基设计的简并引物。探针典型地包含下述核苷酸序列区域，所述区域在严谨条件下能与本发明的除草剂抗性编码核苷酸序列或其片段或变体的至少大约12，至少大约25，至少大约50、75、100、125、150、175、200、250、300、350、400、500、600、700、800、900、1000、1200、1400、1600或1800个连续核苷酸杂交。用于制备杂交用探针的方法通常是本领域已知的，其公开于上文的Sambrook and Russel1(2001)和Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：ALabora tory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)中，这两者都通过引用并入本文。
例如，本文公开的整个除草剂抗性序列或其一个或多个部分可用作探针，所述探针能与相应的除草剂抗性序列和信使RNA特异性杂交。为在多种条件下获得特异性杂交，此类探针包括：独特的(unique)以及至少大约10个核苷酸长的序列，以及至少大约20个核苷酸长的序列。此类探针可用于通过PCR从选定的生物扩增相应的除草剂抗性序列。该技术可用于从想要的生物中分离额外的编码序列，或者作为诊断试验，用于探测生物体中编码序列的存在。杂交技术包括对铺板的(plated)DNA文库进行杂交筛选(噬菌斑或菌落，见，例如Sambrooket al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY))。
此类序列的杂交可在严谨条件下进行。“严谨条件”或“严谨杂交条件”意指下述条件，在所述条件下，探针将与其靶序列杂交至较之其它序列而言探测到的更高的程度(例如背景的至少2倍)。严谨条件是序列依赖性的，在不同环境下将有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严谨度，可以鉴定出与探针100％互补的靶序列(同源探查)。或者，可将严谨度条件调节为允许序列中有一些错配，从而探测到更低的相似性程度(异源探查)。通常，探针长度小于大约1000个核苷酸，或者长度小于大约500个核苷酸。
典型地，严谨条件将是下述这些，其中，在pH7.0至8.3下，盐浓度小于大约1.5M Na离子，典型地，大约0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)，对短的探针(例如10至50个核苷酸)而言温度为至少大约30℃，对长的探针(例如超过50个核苷酸)而言温度为至少大约60℃。严谨条件还可以通过加入去稳定剂(例如甲酰胺)来获得。示例性低严谨度条件包括用30至35％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS(十二烷基硫酸钠)的缓冲溶液在37℃进行杂交，在1X至2X SSC(20X SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸三钠)中于50至55℃进行洗涤。示例性中等严谨度条件包括在40至45％甲酰胺、1.0M NaCl、1％SDS中在37℃进行杂交，在0.5X至1X SSC中于55-60℃进行洗涤。示例性高严谨度条件包括在50％甲酰胺、1M NaCl、1％SDS中在37℃进行杂交，在0.1X SSC中于60至65℃进行洗涤。可选地，洗涤缓冲液可以含有大约0.1％至大约1％的SDS。杂交持续通常短于大约24小时，通常为大约4至大约12小时。
典型地，特异性是杂交后洗涤的函数，关键因子是最后的洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体而言，Tm可以从Meinkothand Wahl(1984)Anal.Biochem.138：267-284的等式估算：Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％甲酰胺)-500/L；其中，M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶的百分比，％甲酰胺是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是以碱基对表示的杂交体长度。Tm是(在给定的离子强度和pH下)互补靶序列的50％与完全匹配的探针杂交的温度。对于每1％的错配，Tm减少大约1℃；因此，可对Tm、杂交和/或洗涤条件加以调节，以与具有想要的相同性的序列杂交。例如，如果想要≥90％相同性的序列，Tm可降低10℃。通常，对严谨条件加以选择，使得比给定的离子强度和pH下特定序列及其互补序列的热解链温度(Tm)低大约5℃。但是，严格的严谨度条件可利用比热解链温度(Tm)低1、2、3或4℃的杂交和/或洗涤；中等严谨度条件可利用比热解链温度(Tm)低6、7、8、9或10℃C的杂交和/或洗涤；低严谨度条件可利用比热解链温度(Tm)低11、12、13、14、15或20℃的杂交和/或洗涤条件。使用该等式、杂交和洗涤组合物以及想要的Tm，本领域技术人员将能理解，杂交和/或洗涤溶液的严谨度可以固有地变化。如果想要的错配程度导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度，以便可以使用更高的温度。对于核酸分子杂交的详细指导可在Tijssen(1993)Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology—Hybridization with Nucleic Acid Probes，Part I，Chapter2(Elsevier，New York)；和Ausubel et al，eds.(1995)CurrentProtocols in Molecular Biology，Chapter2(Greene Publishingand Wiley-Interscience，New York)中找到。见Sambrook et al.(1989)Molecular Cloning：A Laboratory Manual(2d ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY)。
经分离的蛋白质及其变体和片段
除草剂抗性蛋白也包括在本发明中。“除草剂抗性蛋白”意指具有SEQ ID NO：3所示氨基酸序列的蛋白。还提供了其片段、生物活性部分和变体，它们也可用于实施本发明的方法。
“片段”或“生物活性部分”包括下述多肽片段，所述多肽片段包含编码SEQ ID NO：3所示的除草剂抗性蛋白的氨基酸序列的部分，并且保留有除草剂抗性活性。除草剂抗性蛋白的生物活性部分可以是长度为例如10、25、50、100或更多个氨基酸的多肽。此类生物活性部分可通过重组技术来制备，并针对除草剂抗性活性加以评估。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利号4,535,060和5,188,642，每一专利都通过引用整体并入本文。如在本文中所用的，片段包含SEQ ID NO：3的至少8个连续氨基酸。但是，本发明也包括其它片段，例如，蛋白质中超过大约10、20、30、50、100、150、200、250、300、350或400个氨基酸的任何片段。
“变体”意指下述蛋白质或多肽，它们具有与SEQ ID NO：3的氨基酸序列至少大约60％、65％，至少大约70％、75％，至少大约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列。变体还包括下述核酸分子编码的多肽，所述核酸分子能在严谨条件下与SEQ ID NOS：1或2或其互补序列杂交。变体包括由于诱变导致氨基酸序列有所不同的多肽。本发明包括的变体蛋白具有生物活性，即，它们继续拥有天然蛋白的想要的生物活性，即，保留有除草剂抗性活性。用于测量除草剂抗性活性的方法是本领域公知的。见，例如，美国专利Nos.4,535,060和5,188,642，它们每份都通过引用整体并入本文。
本发明的细菌基因，例如grg8基因，相当通常地，拥有与开放读码框的起点邻近的多个甲硫氨酸起始密码子。通常，在这些起始密码子的一个或多个起始翻译将导致功能性蛋白的产生。这些起始密码子可以包括ATG密码子。但是，细菌，例如芽孢杆菌属物种还能将密码子GTG识别为起始密码子，在GTG密码子起始翻译的蛋白在第一个氨基酸含有甲硫氨酸。此外，通常不能预先确定这些密码子中的哪些天然在细菌中使用。因此，应当理解，使用备选的甲硫氨酸密码子之一可能导致产生赋予除草剂抗性的grg8变体。这些除草剂抗性蛋白也包括在本发明中，并且可用于本发明的方法。
本发明的多肽、其变体或片段的抗体也包括在本发明内。用于生产抗体的方法是本领域公知的(见，例如，Harlow and Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)；美国专利No.4,196,265)。
改变的或改进的变体
应当认识到，grg8的DNA序列可被多种方法改变，这些改变可能导致产生编码具有与grg8所编码的不同的氨基酸序列的蛋白的DNA序列。可以以多种途径对该蛋白加以改变，包括氨基酸取代、缺失、截短和插入。用于此类操作的方法通常是本领域已知的。例如，GRG8蛋白的氨基酸序列变体可通过DNA中的突变来制备。这可通过若干形式的诱变之一和/或通过定点进化(directed evolution)来完成。在一些方面，氨基酸序列中编码的变化将不会对蛋白质功能造成实质性影响。此类变体将具有想要的除草剂抗性活性。但是，应当理解，可通过在本发明的组合物上使用此类技术来改进GRG8赋予除草剂抗性的能力。例如，GRG8可在下述宿主细胞中表达，所述细胞在DNA复制期间展示出高比例的碱基错误加入(misincorporation)，例如XL-1Red(Stratagene，La Jolla，CA)。在此类菌株中扩增之后，可以对grg8DNA加以分离(例如通过制备质粒DNA，或者通过PCR进行扩增以及将得到的PCR片段克隆进载体)，并在非诱变菌株中培养。可通过测量对于除草剂(例如草甘膦)的提高的抗性，例如通过在增加的浓度的草甘膦中培养细胞，以及对赋予对增加的浓度的草甘膦的耐受性的克隆加以测试，来鉴定出含有grg8中的突变的克隆。
或者，可以在氨基或羧基末端对很多蛋白的蛋白序列加以改变，而不实质性影响活性。这些改变可包括通过现代分子方法引入的插入、缺失或改变，所述方法例如PCR，包括改变或延伸蛋白质编码序列的PCR扩增，这利用了将氨基酸编码序列包括进PCR扩增中利用的寡核苷酸的过程。或者，加入的蛋白序列可包括整个蛋白质编码序列，例如通常用于本领域中产生蛋白质融合物的那些。此类融合蛋白通常用于(1)增加感兴趣蛋白的表达；(2)引入结合结构域，酶活性，或表位，以协助蛋白质纯化、蛋白质检测或者本领域已知的其它实验用途；或(3)将蛋白质靶向分泌或翻译进亚细胞细胞器，例如，革兰氏阴性细菌的周质空间，或真核细胞的内质网，后者通常导致蛋白质糖基化。
本发明的变体核苷酸和氨基酸序列还包括从诱变和重组程序(例如DNA改组(shuffling))获得的序列。采用此类程序，一种或多种不同的除草剂抗性蛋白编码区域可用于制造拥有想要的性质的新的除草剂抗性蛋白。以这种方式，从一群相关序列多核苷酸(包含具有高度序列相同性，并可被体外或体内同源重组的序列区域)产生重组多核苷酸的文库。例如，使用该手段，可在本发明的除草剂抗性基因和其它已知除草剂抗性基因之间对编码感兴趣结构域的序列基元进行改组，以获得编码具有改进的感兴趣的性质(例如增加的草甘膦抗性活性)的蛋白的新基因。用于此类DNA改组的策略是本领域已知的。见，例如Stemmer(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：10747-10751；Stemmer(1994)Nature370：389-391；Crameri et al.(1997)NatureBiotech.15：436-438；Moore et al.(1997)JMol.Biol.272：336-347；Zhang et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.USA94：4504-4509；Crameri et al.(1998)Nature391：288-291和美国专利Nos.5,605,793和5,837,458。
转化细菌或植物细胞
本发明提供了新颖的经分离基因，其赋予对除草剂的抗性。本发明还提供了GRG8蛋白的氨基酸序列。从翻译该基因得到的该蛋白允许细胞在存在对细胞(包括植物细胞和细菌细胞)有害的浓度的除草剂的情况下发挥功能。在本发明的一方面，grg8基因可用作标志，以评估细菌或植物细胞的转化。
通过对grg8进行下述工程改造——(1)从已知能在待测试生物中刺激转录的细菌启动子表达，(2)正确翻译，以产生完整GRG8肽，和(3)将细胞放置于除草剂毒性浓度下，利用它们对除草剂的抗性可以鉴定出已被DNA转化的细胞。“启动子”意指功能是指导下游编码序列的转录的核酸序列。启动子以及其它转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)对于表达感兴趣的DNA序列来说是必要的。
对细菌细胞的转化通过本领域已知的若干技术之一来完成，所述技术包括但不限于电穿孔或化学转化(见，例如，Ausubel(ed.)(1994)Current Protocols in Molecular Biology(John Wiley and Sons，Inc.，Indianapolis，IN))。赋予对毒性物质的抗性的标志可用于从未经转化的细胞(不含或不表达测试DNA的那些)鉴定经转化的细胞(已具有并表达测试DNA)。在本发明的一个方面，grg8基因可用作标志，以评估对细菌或植物细胞的转化。
对植物细胞的转化可以以相似的方式来进行。“植物”意指整株植物、植物器官(例如，叶、茎、根等)、种子、植物细胞、繁殖体、胚及它们的后代。植物细胞可以是分化的或未分化的(例如，愈伤组织、悬浮培养细胞、原生质体、叶细胞、根细胞、韧皮部细胞、花粉)。“转基因植物”或“经转化的植物”或“稳定转化的”植物、细胞或组织表示：已将外源核酸序列或DNA片段包括或整合进植物细胞的植物。“稳定转化”意指引入植物的核苷酸构建体整合进植物基因组，并且能被其后代所遗传。
可对本发明的grg8基因加以修饰，以获得或增强在植物细胞中的表达。本发明的除草剂抗性序列可被提供于表达盒中，用于在感兴趣的植物中的表达。“植物表达盒”包括能导致蛋白质在植物细胞中从开放读码框表达的DNA构建体。表达盒将包括：以5’-3’转录的方向而言，在植物中具有功能的、与本发明的DNA序列可操作地相连的转录起始区域(即，启动子)以及翻译和转录终止区域(即，终止区域)。表达盒可额外含有至少一种额外的基因，其将被共转化进生物，所述额外的基因例如选择标志基因。或者，额外的基因可以在多个表达盒上提供。此类表达盒提供有多个限制性位点，用于插入将处于调控区域的转录调控下的除草剂抗性序列。
启动子相对植物宿主和/或本发明的DNA序列来说可以是天然的或类似的，或者外源的或异源的。此外，启动子可以是天然序列，或者备选地，合成序列。启动子对于植物宿主来说是“天然的”或“同源的”的情况下，这表示，在将引入该启动子的天然植物中能找到该启动子。启动子对于本发明的DNA序列来说是“外源的”或“异源的”的情况下，这表示，启动子不是天然的，或者不是用于本发明的可操作地相连的DNA序列的天然存在的启动子。“异源的”通常指下述核酸序列，它们并非其存在的天然基因组的一部分或是细胞内源的，其通过感染、转染、微注射、电穿孔、显微操作等加入进细胞。“可操作地相连”意指启动子和第二序列间的功能性连接，其中，启动子序列起始和介导对应于第二序列的DNA序列的转录。通常，可操作地相连表示，相连的核酸序列是连续的，并且，需要将两个蛋白编码区域连接时，其是连续的、按读码框连接的。
通常，此类构建体还将含有5’和3’非翻译区域。此类构建体可含有“信号序列”或“前导序列”，以协助感兴趣的肽向某些细胞内结构(例如，叶绿体(或其它质体)、内质网或高尔基体(Golgiapparatus))的共翻译或翻译后转运，或被分泌。例如，可对基因进行工程改造，以含有信号肽，以协助将肽转移进内质网。“信号序列”意指下述序列，该序列已知或被怀疑能导致共翻译或翻译后的、经过细胞膜的肽转运。在真核细胞中，该转运典型地涉及向高尔基体中的分泌，其中某些导致糖基化。“前导序列”意指下述任何序列：当其翻译时，产生足以触发肽链向亚细胞细胞器的共翻译转运的氨基酸序列。因此，这包括引导转运和/或糖基化的前导序列，这通过进入内质网，进入液泡，质体(包括原生质体、线粒体等)来实现。还可对植物表达盒进行工程改造，使其含有内含子，从而对内含子的mRNA加工是表达所需要的。
“3’非翻译区域”意指定位于编码序列下游的核苷酸序列。聚腺苷酸化信号序列和编码调控信号(能影响聚腺苷酸片断向mRNA前体的3’末端的加入)的其它序列是3’非翻译区域。“5’非翻译区域”意指定位于编码序列上游的核苷酸序列。
其它上游或下游非翻译元件包括增强子。增强子是发挥作用以增强启动子区域的表达的核苷酸序列。增强子是本领域已知的，其包括但不限于，SV40增强子区域和35S增强子元件。
终止区域可以是相对转录起始区域天然的，可以是相对本发明的除草剂抗性序列天然的，或者可以从另外的来源获得。可以从根癌农杆菌的Ti质粒获得方便的终止区域，例如章鱼碱合酶以及胭脂碱合酶终止区域。还见Guerineau et al.(1991)Mol.Gen.Genet.262：141-144；Proudfoot(1991)Cell64：671-674；Sanfacon et al.(1991)GenesDev.5：141-149；Mogen et al.(1990)Plant Cell2：1261-1272；Munroe et al.(1990)Gene91：151-158；Ballas etal.(1989)Nucleic Acids Res.17：7891-7903和Joshi et al.(1987)Nucleic Acid Res.15：9627-9639。
合适的情况下，可对基因加以优化，以提高在经转化宿主细胞中的表达。即，可使用宿主细胞偏爱的密码子来合成基因，用于提高的表达，或者可以使用宿主偏爱的密码子使用频率来合成基因。通常，基因的GC含量将增加。关于对宿主偏爱的密码子使用的讨论，见，例如，Campbell and Gowri(1990)Plant Physiol.92：1-11。用于合成宿主偏爱的基因的方法是本领域已知的。见，例如，美国专利Nos.6,320,100、6,075,185、5,380,831和5,436,391，美国公开的申请Nos.20040005600和20010003849，以及Murray et al.(1989)Nucleic Acids Res.17：477-498，它们通过引用并入本文。
在一种实施方式中，感兴趣的核酸靶向叶绿体，用于表达。以这种方式，当感兴趣的核酸不直接插入叶绿体时，表达盒将额外含有编码转移肽(transit peptide)的核酸，以将感兴趣的基因产物指导向叶绿体。此类转移肽是本领域已知的。见，例如，Von Hei jne et al.(1991)Plan tMol.Biol.Rep.9：104-126；Clark et al.(1989)J.Biol.Chem.264：17544-17550；Della-Cioppa et al.(1987)PlantPhysiol.84：965-968；Romer et al.(1993)Biochem.Biophys.Res.Commun.196：1414-1421和Shah et al.(1986)Science233：478-481。
可对将靶向叶绿体的感兴趣的核酸加以优化，以在叶绿体中表达，以解决植物的核与该细胞器之间密码子使用不同的问题。以这种方式，可使用叶绿体偏爱的密码子来合成感兴趣的核酸。见，例如，美国专利No.5,380,831，其通过引用并入本文。
典型地，该“植物表达盒”将被插入“植物转化载体”。“转化载体”意指对于细胞的有效转化来说必要的DNA分子。此类分子可由一个或多个表达盒构成，其可被组织为多于一个“载体”DNA分子。例如，二元载体是下述植物转化载体，它们利用两个非邻接的DNA载体，编码转化植物细胞必需的所有顺式和反式作用功能(Hellens andMullineaux(2000)Trendsin Plant Science 5：446-451)。“载体”指设计来在不同宿主细胞之间转移的核酸构建体。“表达载体”指下述载体，其具有在外源细胞中并入、整合和表达异源DNA序列或片段的能力。
该植物转化载体可包含实现植物转化所需的一种或多种DNA载体。例如，利用包含超过一条的邻接的DNA片断的植物转化载体在本领域中是常见的操作。这些载体在本领域中通常被称为“二元载体”。二元载体以及具有辅助质粒(helper plasmid)的载体最常用于农杆菌介导的转化，这种转化中，实现有效转化需要的DNA片断的大小和复杂度相当大，并且将不同功能分开到不同DNA分子上是有利的。典型地，二元载体含有下述质粒载体，所述质粒载体含有T-DNA转移所需要的顺式作用序列(例如左边界和右边界)、选择标志(被工程改造为能在植物细胞中表达)以及“感兴趣的基因”(被工程改造为能在下述植物细胞中表达的基因，对所述植物细胞来说，转基因植物的产生是想要的)。在该质粒载体上还存在细菌复制所需要的序列。顺式作用序列以允许有效转移进植物细胞并且在其中表达的方式排列。例如，选择标志基因和感兴趣的基因定位于左右边界之间。通常，第二质粒载体含有反式作用因子，其介导从农杆菌向植物细胞的T-DNA转移。该质粒通常含有毒力(virulence)功能(Vir基因)，这允许通过农杆菌感染植物细胞，以及允许通过在边界序列进行的切割来转移DNA，以及Vir介导的DNA转移，如本领域所理解的那样(Hellensand Mullineaux(2000)Trends in Plant Science，5：446-451)。若干种类型的农杆菌菌株(例如LBA4404、GV3101、EHA101、EHA105等)可以用于植物转化。第二质粒载体对于通过其它方法(例如显微操作、微注射、电穿孔、聚乙二醇等)转化植物来说并非必需的。
植物转化
本发明的方法涉及将核苷酸构建体引入植物。“引入”意指将核苷酸构建体以下述方式植入，所述方式使得该构建体能够进入植物细胞的内部。本发明的方法不需要使用将核苷酸构建体引入植物的特定方法，仅需要核苷酸构建体能进入植物的至少一个细胞的内部。用于将核苷酸构建体引入植物的方法是本领域已知的，其包括但不限于：稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
通常，植物转化方法涉及将异源DNA转移进靶植物细胞(例如，未成熟或成熟的胚、悬浮培养物、未分化的愈伤组织、原生质体等)，接着通过应用最大阈值水平的合适选择物(取决于选择标志基因，在本情况下是“草甘膦”)，从一组未转化的细胞物质回收经转化的植物细胞。典型地，外植体被转移进新鲜提供的同样的培养基，进行常规培养。随后，在放置到补充有最大阈值水平的选择试剂(例如“草甘膦”)的再生培养基上之后，经转化的细胞分化为芽。然后将芽转移至选择性生根培养基，用于得到生根的芽或小植株(plantlet)。然后转基因小植株生长为成熟植物，产生能繁殖的种子(例如，Hiei etal.(1994)The Plant Journal 6：271-282；Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology14：745-750)。典型地，将外植体转移至新鲜提供的同样的培养基，进行常规培养。关于用于产生转基因植物的技术和方法的一般性描述见Ayres and Park(1994)Critical Reviewsin Plant Science13：219-239和Bommineni and Jauhar(1997)Maydica42：107-120。因为经转化的材料含有很多细胞；在经处理的任何靶愈伤组织或组织或细胞群中，经转化的和未经转化的细胞两者都存在。杀死未经转化的细胞以及允许细胞增殖的能力产生了经转化的植物培养物。通常，去除未经转化的细胞的能力是迅速回收经转化的植物细胞以及成功生产转基因植物的限制。可以使用分子及生物化学方法，以验证转基因植物基因组中整合进来的异源感兴趣的基因的存在。
可以通过下述若干方法之一来进行对转基因植物的生产，所述方法包括但不限于：通过农杆菌将异源DNA引入植物细胞(农杆菌介导的转化)、用附着到微粒上的异源外来DNA轰击植物细胞，以及若干其它非颗粒式的直接介导方法(例如，Hiei et al.(1994)The PlantJournal6：271-282；Ishida et al.(1996)Nature Biotechnology14：745-750；Ayres and Park(1994)Critical Reviews in PlantScience13：219-239；Bommineni and Jauhar(1997)Maydica42：107-120)来转移DNA。
用于转化叶绿体的方法是本领域已知的。见，例如，Svab et al.(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA87：8526-8530；Svab and Maliga(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：913-917；Svab and Maliga(1993)EMBO J.12：601-606。该方法依赖于对于含有选择性标志的DNA的微粒枪递送，以及通过同源重组将DNA靶向到质体基因组。此外，质体转化可以通过对沉默的质体携带的转基因进行反式激活来完成，这通过核编码的、质体介导的RNA聚合酶的组织偏爱性表达来进行。此类体系报道于McBride et al.(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA91：7301-7305中。
可用传统方法将已被转化的细胞培养成植物。见，例如，McCormicket al.(1986)Plant Cell Reports5：81-84。然后可对这些植物加以培养，以及用同样的经过转化的株系或不同株系对其进行授粉，鉴定出具有组成性表达的想要的表型特征的、得到的杂交体。可培养两代或更多代，以确保想要的表型特征的表达稳定保持并遗传，然后收获种子，以确保获得了想要的表型特征表达。以这种方式，本发明提供了下述经转化的种子(也被称为“转基因种子”)，其具有稳定并入其基因组的本发明核苷酸构建体(例如，本发明的表达盒)。
植物
本发明可用于转化任何植物物种，其包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。感兴趣的植物的例子包括但不限于，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦和油菜籽(oilseed rape)、Brassica sp.、紫花苜蓿、黑麦、粟、红花、花生、甘薯、木薯、咖啡、椰子、菠萝、柑橘树、可可、茶、香蕉、鳄梨、无花果、番石榴、芒果、橄榄、番木瓜、腰果、澳大利亚坚果(macadamia)、杏仁、燕麦、蔬菜、装饰用植物和针叶树。
蔬菜包括但不限于番茄、莴苣、青豆(green bean)、利马豆、豌豆和Curcumis属的成员，例如黄瓜、甜瓜(cantaloupe)和香瓜(muskmelon)。装饰用植物包括但不限于，杜鹃、八仙花(hydrangea)、芙蓉、玫瑰、郁金香、水仙、矮牵牛、康乃馨、猩猩木和菊花。优选地，本发明的植物是作物植物(例如，玉米、高粱、小麦、向日葵、番茄、十字花科植物、胡椒、土豆、棉花、水稻、大豆、甜菜、甘蔗、烟草、大麦、油菜籽等)。
本发明特别适合用于单子叶植物家族的任何成员，其包括但不限于：玉米、水稻、大麦、燕麦、小麦、高粱、黑麦、蔗糖、菠萝、山药(yam)、洋葱、香蕉、椰子和枣。
对植物转化的评估
将异源外来DNA引入植物细胞之后，通过多种方法，例如，对与整合的基因相关的核酸、蛋白质和代谢产物的分析，来验证植物基因组中异源基因的转化或整合。
PCR分析是针对在种植进土壤之前的早期阶段并入的基因的存在，筛选经转化细胞、组织或芽的快速方法(Sambrook and Russell(2001)Molecular Cloninng：A Laboratory Manual(Cold Spring HarborLaboratory Press，Cold Spring Harbor，NY))。使用特异于感兴趣的基因或农杆菌载体背景等的寡核苷酸引物来进行PCR。
可以通过对基因组DNA进行Southern印迹分析来验证植物转化(上文所述的Sambrook and Russell(2001))。通常，从转化子提取总DNA，用合适的限制性酶消化，在琼脂糖凝胶中分级分离，并转移至硝酸纤维素膜或尼龙膜。然后可以按照标准方法(上文所述的Sambrook and Russell，2001)，用，例如，经放射性标记的32P靶DNA片段对膜或“印迹”加以探测，以验证引入的基因在植物基因组中的整合。
在Northern分析中，按照本领域中常规使用的标准程序(如上文所述的Sambrook and Russell(2001))，从转化子的特定组织分离RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上进行分级分离，然后印到尼龙滤膜上。然后按照本领域已知的方法(如上文所述的Sambrook and Russell(2001))，通过用滤膜与从GDC获得的放射性探针杂交，对grg8编码的RNA的表达加以检测。
Western印迹和生物化学试验等可通过标准方法(如上文所述的Sambrook and Russell(2001))在转基因植物上进行，以确定除草剂抗性基因编码的蛋白质的存在，其中使用与除草剂抗性蛋白上存在的一种或多种表位结合的抗体。
下述实施例以阐述方式提供，而不作限制之用。
实验
实施例1：分离ATX4145
通过将土壤样品分散到含有草甘膦作为唯一磷源的EnrichedMinimal Media(EMM)上来分离ATX4145。因为EMM不含芳香族氨基酸，菌株为了在该培养基上生长必须对草甘膦有抗性。
将两克土壤悬浮于大约30ml水中，在超声波水浴中超声波处理30秒。旋转震荡(vortex)样品5秒，令其静置60秒。该过程重复3次。取100μl该悬浮液，加入到含有4mM草甘膦的3mlEMM(pH6.0)中。EMM含有(每900ml)：10g蔗糖、2g NaNO3、1.0ml0.8M MgSO4、1.0ml0.1M CaC l2、1.0ml痕量元素溶液(在100ml1000x溶液中：0.1g FeSO4·7H2O、0.5mg CuSO4·5H2O、1.0mgH3BO3、1.0mgMnSO4·5H2O、7.0mg ZnSO4·7H2O、1.0mg MoO3、4.0g KCl)。于21℃在组织培养辊筒(roller drum)上对培养物振荡16天，然后用100μl接种3ml新鲜的EMM，其中含有作为唯一磷源的4mM草甘膦。5天后，用100μl接种另外的新鲜的3ml培养物。足够的培养之后，通过用1μl的环划线到琼脂平板(含有EMM琼脂，其中含有5mM草甘膦作为唯一的磷源)表面上，来将培养物涂布到固体培养基上，贮藏于-21℃。然后对培养物重复涂板，以进行分离。由于其在存在高浓度草甘膦的情况下生长的能力，选出被称为ATX4145的一种特定菌株。在Luria Bertani(LB)琼脂上，菌落是白色的、圆形的，大小(pinsize)为1mm，革兰氏染色阴性。
实施例2.制备及筛选粘粒文库
使用本领域公知的方法，从ATX4145的培养物提取总DNA。按照厂商说明书，用限制性酶Sau3Al对DNA进行部分消化，与SuperCos(Stratagene)载体片段连接。使用GigaPack IIIXL包装提取物(Stratagene)将连接产物包装进噬菌体颗粒，转染进大肠杆菌细胞，涂布到含有50μg/ml卡那霉素的LB琼脂上，筛选含有粘粒的菌落。捡出大约1100个菌落用于筛选。
在含有50μg/ml卡那霉素的丰富液体培养基上培养菌落，然后用针挑到M63琼脂培养基上，该培养基含有50μg/ml卡那霉素和7mM草甘膦。M63琼脂培养基含有100mM KH2PO4、15mM(NH4)2SO4、50μMCaCl2、1μMFeSO4、50μMMgCl2、55mM葡萄糖、25mg/升的L-脯氨酸、10mg/升的盐酸硫胺素、足够的NaOH以将pH调节为7.0，以及15g/升的琼脂。鉴定出在存在7mM草甘膦时生长的若干个菌落。从这些菌落中的每个制备粘粒，再次转化进大肠杆菌XL1Blue MRF细胞。在每种情况下，经过粘粒DNA再转化的细胞在存在5mM草甘膦时能在M63培养基上生长，而含有空的SuperCos载体的细胞则不长。被称为3-M5的一个粘粒被选用来进行进一步分析。该粘粒后来被重新命名为pAX298。
实施例3.在粘粒pAX298中鉴定grg8
为鉴定出负责粘粒pAX298所显示出来的草甘膦抗性的基因，用可转座元件对来自该克隆的DNA进行诱变。用这种方法，鉴定出已经历转座子插入并且丢失了赋予草甘膦抗性的能力的克隆。转座子插入的定位鉴定出负责草甘膦抗性表型的开放读码框。
使用EZ::TN插入试剂盒(Epicentre，Madison，WI)和厂商的方案，对粘粒pAX298进行体外转座子诱变。该方法向粘粒DNA中随机插入转座子片段，由此随机破坏粘粒中基因的功能。这种特别的转座子含有编码对三甲氧苄二氨嘧啶抗性的基因，因此可以通过在存在该抗生素时生长的能力来选出转座子插入克隆。可以通过绘制限制性片段图谱或者通过用在转座子中退火的引物进行测序，来测定转座子插入的定位。将pAX298的转座子插入克隆涂布到含有草甘膦的M63培养基上。发现有三个克隆丢失了在存在草甘膦时生长的能力，这表明转座子已破坏了负责抗性的基因。
使用本领域公知的测序方法，对含有转座子插入的pAX298区域测定DNA序列，其如下文所示。鉴定出了开放读码框(ORF，SEQ ID NO：1的从第296至第1555碱基)。对来自丢失了对草甘膦的抗性的四个转座子插入检出菌落的序列信息的分析揭示：所有四个插入都在ORF中。这表明ORF编码了粘粒赋予的抗性。
实施例4.GRG8与其它蛋白的同源性
该ORF的推断氨基酸序列与EPSP合酶具有同源性，这表明该ORF编码EPSP合酶。将粘粒pAX298转化进大肠杆菌aroA-，这是其中天然aroA基因(编码EPSP合酶)已缺失的菌株。该菌株不能在M63培养基上生长，因为其需要外源提供的芳香族氨基酸。粘粒pAX298的存在补全aroA-表型，即，其允许该菌株在M63培养基上生长，而无须外源提供的芳香族氨基酸。这是粘粒含有EPSP合酶基因的进一步证据。该基因被称为grg8。
对推断出的氨基酸序列(SEQ ID NO：3)的检查揭示：其不含II类EPSP合酶所典型的四个结构域。因此，这是新颖的、非II类、草甘膦抗性EPSP合酶。
实施例5.对grg8进行工程改造，用于在大肠杆菌中表达GRG8 蛋白
通过PCR扩增grg8开放读码框(ORF)，将其克隆进质粒载体pCR-Blunt-II(来自Invitrogen)，转化进大肠杆菌菌株DH5α。制备质粒DNA，通过限制性消化来测定插入物的存在和定向。一个克隆含有相对于载体中的1ac启动子而言正向的ORF。该质粒被称为pAX299。对该插入物进行测序，针对赋予对草甘膦的抗性的能力对该质粒加以测试。
于2004年12月21日将含有grg8ORF的质粒pAX299保藏于Agricultural Research Service Culture Collection(NRRL)，分配的编号为No.NRRLB-30804。
实施例6.grg8赋予对高水平草甘膦的抗性
使用含有空载体的细胞作为对照，针对在存在草甘膦时在M63培养基上生长的能力，对pAX299加以测试。将宿主菌株DH5中的质粒pAX296用作阴性对照。该质粒含有克隆进载体pCR-Blunt-II的烟草基因组DNA的片段。结果概括于表1中。两种菌株的起始培养物生长于含有50μg/ml卡那霉素的M63培养液中，以维持质粒。将起始培养物稀释至大约相等的细胞密度(通过测量OD600测定的)，然后按照1至200稀释进3mlM63培养液(含有0至200mM草甘膦)。每种浓度的每种菌株取重复的三份3ml培养物进行培养。在恒定振荡下于37℃对培养物加以培养。大约46小时后，回收0.3ml的小份，测量OD600。结果示于表1中。数值代表平均值+标准偏差。这些结果显示，GRG8赋予对高水平的草甘膦的抗性。
表1.含有grg8的pAX299的草甘膦抗性
 
草甘膦浓度(mM) grg8 阴性对照
0 1.18±0.029 1.09±0.024
10 1.15±0.018 0.04±0.0008
20 1.10±0.043 0.04±0.0004
50 1.20±0.037 0.04±0.0004
100 1.31±0.024 0.04±0.0005
200 0.05±0.004 0.04±0.0004
实施例7.纯化在大肠杆菌中作为6xHis标签化蛋白质表达的 GRG8
使用PfuUltraTMDNA polymerase(Stratagene)，通过PCR扩增grg8编码区域。设计用于引导PCR的寡核苷酸，以在得到的PCR产物的5’和3’末端附近引入限制性酶识别位点。用SalI消化得到的PCR产物。将经消化的产物克隆进通过用SalI消化制备的6xHis标签表达载体pRSF1b(Novagen)。得到的克隆含有处于与6xHis标签同一翻译读码框中的GRG8，并且在该标签的恰好C-末端。用于产生此类克隆，以及用于表达含有6xHis标签的蛋白的一般性策略是本领域已知的。
通过将细胞涂布到含有5mM草甘膦的M63培养基上来验证该克隆赋予草甘膦抗性的能力。确定含有grg8的克隆在该浓度的草甘膦上生长的能力。可在SDS-PAGE蛋白质凝胶上测定GRG8蛋白的表达水平。可以按照厂商说明书，通过色谱(例如，在Ni-NTA Superflow Resin(Qiagen)上进行的)，对诱导的GRG8蛋白进行纯化，来分离GRG8蛋白。
实施例8.对grg8的诱变以及对功能性变体的分离
使用本领域已知的基于PCR的诱变，对grg8开放读码框进行诱变。使用变化的量的输入DNA，使用诱变试剂盒(Stratagene)，对含有grg8的质粒pAX700进行扩增。纯化得到的PCR产物，用BamHI和HindIII进行消化，重新纯化，并连接进经修饰pRSF1b载体(Novagen)。将得到的文库转化进大肠杆菌，挑进384孔板，在37℃培养至饱和。将得到的384贮板(stockplate)印到最小培养基(M63p lus)上，该培养基补充有卡那霉素并且具有不同浓度的草甘膦。选出赋予对50mM草甘膦的抗性的经诱变克隆(如表2所示)。对于这些克隆的亚组，制备DNA，测定grg8变体的DNA序列。
表2.表达grg8变体的大肠杆菌在存在草甘膦时的生长
 
突变 原来的名称 在50mM草甘膦上的生长
载体对照 - -
grg8 grg8 +++
grg8ml C22 +++
grg8m2 N15 +
grg8m3 N24 +++
grg8m4 A1 +++
grg8m5 B2 +++
grg8m6 B7 +++
grg8m7 B11 +++
grg8m8 C11 +++
grg8m9 E3 +++
grg8m10 F4 +++
实施例9.对grg8进行功能改造，用于植物转化
通过聚合酶链式反应，从全长cDNA模板扩增grg8开放读码框(ORF)。PCR期间向ORF的每个末端都加上HindIII限制性位点。此外，在基因的起始密码子的恰好5’处加入核苷酸序列ACC，以增加翻译效率(Kozak(1987)15：8125-8148；Joshi(1987)NucleicAcidsResearch15：6643-6653)。使用本领域公知的技术，对PCR产物克隆并测序，以确保PCR期间没有引入突变。
用例如HindIII消化含有grg8PCR产物的质粒，分离含有完整ORF的片段。在该实施例中，将片段克隆进质粒(例如pAX200，这是含有水稻肌动蛋白启动子(McElroy et al.(1991)Molec.Gen.Genet.231：150-160)和PinII终止子(An et al(1989)The Plant Cell1：115-122)的植物表达载体)的HindIII位点。然后将来自该中间质粒的启动子-基因-终止子片段亚克隆进质粒，例如pSB11(JapanTobacco，Inc.)，以形成最终的质粒，其在本文中被称为pSB11GRG8。对pSB11GRG8加以组织，使得含有启动子-grg8-终止子构建体的DNA片段可通过合适的限制性酶进行的双消化被切割，并还用于通过例如气溶胶胶束注射转化进植物。通过限制性消化和凝胶电泳，以及通过跨越多个克隆连接处的测序，来验证pSB11GRG8的结构。
使用本领域公知的三亲株交配方案，并涂布到含有壮观霉素的培养基上，将质粒移入根癌农杆菌菌株LBA4404，其还含有质粒pSB1(Japan Tobacco，Inc.)。质粒pSB11GRG8携带有抗生素抗性，但是其是窄宿主范围的质粒，并且不能在农杆菌中复制。当pSB11GRG8通过同源重组整合进广宿主范围的质粒，例如pSB1中时，产生抗生素抗性菌落。通过Southern杂交验证得到的共整合产物。携带有共整合物的农杆菌菌株然后可用于转化玉米，例如，通过PureIntro方法(Japan Tobacco)进行。
实施例10.将grg8转化进植物细胞
在授粉后8-12天的最好时机收集玉米穗。从穗上分离胚，大小为0.8-1.5mm的胚优选用于转化。以盾片侧朝上的方式将胚分布到合适的孵育培养基上，例如DN62A5S培养基(3.98g/L N6盐；1mL/L(的1000x贮液)N6维生素；800mg/L L-天冬酰胺；100mg/L Myo-肌醇；1.4g/L L-脯氨酸；100mg/L酪蛋白氨基酸；50g/L蔗糖；1mL/L(的1mg/mL贮液)2，4-D)。但是，非DN62A5S的培养基和盐也是合适的，并且是本领域已知的。在黑暗中于25℃对胚进行过夜培养。但是，对胚进行过夜培养本身并非必须。
将得到的外植体转入方形筛网(每板30-40)，转到渗透培养基上，大约30-45分钟，然后转入胶束处理(beaming)板(见，例如PCT公开号No.WO/0138514和美国专利号No.5,240,842)。
使用气溶胶胶束推进器，用基本如PCT公开文本No.WO/0138514中描述的条件，将设计来在植物细胞中表达GRG8的DNA构建体推进到植物组织中。胶束处理之后，将胚在渗透培养基上温育大约30分钟，放置到孵育培养基上，25℃黑暗中过夜。为避免对经过胶束处理的外植体造成不适当的损害，在转移进复苏(recovery)培养基之前，它们要被温育至少24小时。然后将胚分布到复苏期培养基上，25℃在黑暗放置大约5天，然后转移至选择培养基。在选择培养基中对外植体进行至多8周的温育，这取决于所用的特殊选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移进胚成熟培养基，直到观察到形成成熟的成体胚。然后将得到的成熟的成体胚放置到低光照下，通过本领域已知的方法起始再生。令得到的芽在生根培养基上生根，将得到的植物转移到育苗罐(nursery pot)中，作为转基因植物繁殖。
材料
DN62A5S培养基
 
组分 每升 来源
Chu’s N6基础盐混合物(Prod.No.C416) 3.98g/L Phytotechnology Labs
Chu’s N6维生素溶液(Prod.No.C149) 1mL/L(的1000x原液) Phytotechnology Labs
L-天冬酰胺 800mg/L Phytotechnology Labs
Myo-肌醇 100mg/L Sigma
L-脯氨酸 1.4g/L Phytotechnology Labs
酪蛋白氨基酸 100mg/L Fisher Scientific
蔗糖 50g/L Phytotechnology Labs
2，4-D(Prod.No.D-7299) 1mL/L(的1mg/mL原液) Sigma
用1N KOH/1N KCl将溶液pH调节至pH5.8，加入Gelrite(Sigma)至3g/L，并高压灭菌。冷却至50℃后，加入2ml/L的Silver Nitrate原液(Phytotechnology Labs)(5mg/ml)。该配方产生大约20块板。
实施例11.通过农杆菌介导的转化将grg8转化进玉米植物细胞
在授粉后8-12天的最好时机收集穗。从穗上分离胚，大小为0.8-1.5mm的胚优选用于转化。以盾片朝上的方式将胚分布到合适的孵育培养基上，在黑暗中于25℃对胚进行过夜培养。但是，对胚进行过夜培养本身并非必须。将胚与含有合适载体的农杆菌菌株接触大约5-10分钟，该载体是用于Ti质粒介导的转移的，然后将胚分布到共培养培养基上，放置大约3天(黑暗中，25℃)。共培养后，将外植体转入复苏期培养基上，放置大约5天(黑暗中，25℃)。在选择培养基中对外植体进行至多8周的温育，这取决于所用的特殊选择的性质和特征。在选择期之后，将得到的愈伤组织转移进胚成熟培养基，直到观察到形成成熟的成体胚。然后将得到的成熟的成体胚放置到低光照下，通过本领域已知的方法起始再生。令得到的芽在生根培养基上生根，将得到的植物转移到育苗罐中，作为转基因植物繁殖。
在本说明书中提及的所有出版物和专利申请指示本发明所属领域的技术人员的水平。所有出版物和专利申请都在本文中通过引用并入本文，其程度与将每篇单独的出版物或专利申请特别地和单独地通过引用并入本文相同。
尽管为清楚理解的目的已经通过解释和实施例的方式较详细地描述了前面的发明，但是显然可以在所附权利要求书的范围内进行某些改变和改进。

Claims (15)

1.经分离的核酸分子，其选自下组：
(a)核酸分子，由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列或其互补序列组成；以及
(b)核酸分子，其编码由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽。
2.权利要求1的经分离的核酸分子，其中，所述核苷酸序列是合成序列，已针对在植物中的表达对所述合成序列进行了设计。
3.包含权利要求1的核酸分子的载体。
4.权利要求3的载体，其还包含编码异源多肽的核酸分子。
5.含有权利要求3的载体的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌宿主细胞。
6.经分离的多肽，其选自下组：
(a)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽；以及
(b)由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列编码的多肽。
7.权利要求6的多肽，还包含异源氨基酸序列。
8.经分离的的多肽，其中，所述多肽由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成，并且，其中：
(a)在SEQ ID NO：3的第81位氨基酸上的甘氨酸残基被半胱氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第205位氨基酸上的天冬氨酸残基被酪氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第267位氨基酸上的丙氨酸残基被缬氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第292位氨基酸上的天冬氨酸残基被酪氨酸取代；
(b)在SEQ ID NO：3的第23位氨基酸上的脯氨酸残基被丝氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第265位氨基酸上的苏氨酸残基被甲硫氨酸取代；
(c)在SEQ ID NO：3的第47位氨基酸上的苏氨酸残基被丙氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第76位氨基酸上的苏氨酸残基被甲硫氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第195位氨基酸上的甘氨酸残基被丝氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第293位氨基酸上的甘氨酸残基被丝氨酸取代；
(d)在SEQ ID NO：3的第73位氨基酸上的天冬氨酸残基被酪氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第209位氨基酸上的丙氨酸残基被缬氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第235位氨基酸上的丙氨酸残基被缬氨酸取代；
(e)在SEQ ID NO：3的第133位氨基酸上的天冬氨酸残基被谷氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第139位氨基酸上的甘氨酸残基被天冬氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第225位氨基酸上的丙氨酸残基被苏氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第355位氨基酸上的丙氨酸残基被丝氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第364位氨基酸上的异亮氨酸残基被天冬酰胺取代；
(f)在SEQ ID NO：3的第4位氨基酸上的甘氨酸残基被天冬氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第87位氨基酸上的脯氨酸残基被亮氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第89位氨基酸上的丙氨酸残基被缬氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第188位氨基酸上的丙氨酸残基被苏氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第239位氨基酸上的缬氨酸残基被丙氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第382位氨基酸上的丙氨酸残基被缬氨酸取代；
(g)在SEQ ID NO：3的第127位氨基酸上的脯氨酸残基被亮氨酸取代；
(h)在SEQ ID NO：3的第66位氨基酸上的甘氨酸残基被天冬氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第68位氨基酸上的苏氨酸残基被甲硫氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第169位氨基酸上的甘氨酸残基被丝氨酸取代，
在SEQ ID NO：3的第317位氨基酸上的缬氨酸残基被丙氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第335位氨基酸上的丝氨酸残基被天冬酰胺取代；
(i)在SEQ ID NO：3的第194位氨基酸上的亮氨酸残基被苯丙氨酸取代；或者
(j)在SEQ ID NO：3的第157位氨基酸上的甘氨酸残基被半胱氨酸取代，以及
在SEQ ID NO：3的第260位氨基酸上的赖氨酸残基被苏氨酸取代。
9.经分离的核酸分子，其编码权利要求8的经分离的多肽。
10.一种用于生产具有草甘膦抗性活性的多肽的方法，
所述方法包括：在编码所述多肽的核酸分子能表达的条件下，培养权利要求5的宿主细胞，
所述多肽选自下组：
(a)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽；以及
(b)由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列编码的多肽。
11.一种用于在植物中赋予对草甘膦的抗性的方法，所述方法包括：
(i)用DNA构建体转化所述植物，所述构建体包含在植物细胞中驱动表达的启动子，所述启动子与权利要求1的核酸分子的核苷酸序列可操作地相连，其中所述核苷酸序列编码具有草甘膦抗性活性的氨基酸序列，以及
(ii)再生经转化的植物。
12.权利要求1的经分离的核酸分子，其选自下组：
(i)核酸分子，其由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列或其互补序列组成；和
(ii)核酸分子，其由核苷酸序列组成，所述核苷酸序列编码由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽。
13.权利要求6的多肽，其选自下组：
(i)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽；以及，
(ii)核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列组成。
14.权利要求10的方法，其中所述多肽选自下组：
(i)由SEQ ID NO：3的氨基酸序列组成的多肽；以及，
(ii)核苷酸序列编码的多肽，所述核苷酸序列由SEQ ID NO：1或2的核苷酸序列组成。
15.以保藏号NRRL B-30804保藏的质粒。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
NZ571115A (en) * 2006-03-02 2011-11-25 Athenix Corp Method and compositions for improved enzyme activity in transgenic plant
CA2651428A1 (en) * 2006-05-12 2007-11-22 Commonwealth Scientific And Industrial Research Organisation Enzymes for degrading herbicides
NZ573150A (en) * 2006-06-27 2011-09-30 Athenix Corp Grg33, grg35, grg36, grg37, grg38, grg39, and grg50: novel epsp synthase genes conferring herbicide resistance
CN101932701A (zh) * 2008-02-01 2010-12-29 阿森尼克斯公司 Grg31和grg36 epsp合酶的定向进化
RS55986B1 (sr) 2010-01-22 2017-09-29 Bayer Ip Gmbh Akaricidne i/ili insekticidne kombinacije aktivnih supstanci
WO2011154159A1 (en) 2010-06-09 2011-12-15 Bayer Bioscience N.V. Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
US9593317B2 (en) 2010-06-09 2017-03-14 Bayer Cropscience Nv Methods and means to modify a plant genome at a nucleotide sequence commonly used in plant genome engineering
BR112013012080A2 (pt) 2010-11-15 2016-07-19 Bayer Ip Gmbh n-aril pirazol (tio) carboxamidas
CN103717076B (zh) 2011-08-10 2016-04-13 拜耳知识产权股份有限公司 含有特定特特拉姆酸衍生物的活性化合物组合物
AU2012299691B2 (en) 2011-08-22 2015-01-29 BASF Agricultural Solutions Seed US LLC Methods and means to modify a plant genome
CA2871008C (en) 2012-04-23 2022-11-22 Bayer Cropscience Nv Targeted genome engineering in plants
US9428459B2 (en) 2012-12-19 2016-08-30 Bayer Cropscience Ag Difluoromethyl-nicotinic- tetrahydronaphtyl carboxamides
AU2013361220A1 (en) 2012-12-21 2015-04-02 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions and methods for auxin-analog conjugation
US20140289906A1 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Pioneer Hi-Bred International, Inc. Compositions Having Dicamba Decarboxylase Activity and Methods of Use
BR112015023286A2 (pt) 2013-03-14 2018-03-06 Arzeda Corp polipeptídeo recombinante com atividade da dicamba descarboxilase, construto de polinucleotídeo, célula, método de produção de uma célula hospedeira compreendendo um polinucleotídeo heterólogo que codifica um polipeptídeo tendo atividade da dicamba descarboxilase, método para descarboxilar dicamba, um derivado de dicamba ou um metabolito de dicamba, método para a detecção de um polipeptideo e método para a detecção da presença de um polinucleotideo que codifica um polipeptideo tendo atividade da dicamba descarboxilase
US10214510B2 (en) 2015-04-13 2019-02-26 Bayer Cropscience Aktiengesellschaft N-cycloalkyl-N-(biheterocyclylethylene)-(thio)carboxamide derivatives

Family Cites Families (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4535060A (en) * 1983-01-05 1985-08-13 Calgene, Inc. Inhibition resistant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthetase, production and use
US4940835A (en) * 1985-10-29 1990-07-10 Monsanto Company Glyphosate-resistant plants
US5312901A (en) * 1986-02-14 1994-05-17 Pharmacia Lkb Biotechnology Ab Cloned streptococcal genes encoding protein G and their use to construct recombinant microorganisms to produce protein G
US5145783A (en) * 1987-05-26 1992-09-08 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-endolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US4971908A (en) * 1987-05-26 1990-11-20 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase
US20020007053A1 (en) * 1989-02-06 2002-01-17 Barry Gerard Francis Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5310667A (en) * 1989-07-17 1994-05-10 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
CA2083948C (en) * 1990-06-25 2001-05-15 Ganesh M. Kishore Glyphosate tolerant plants
US5633435A (en) * 1990-08-31 1997-05-27 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthases
US5866775A (en) * 1990-09-28 1999-02-02 Monsanto Company Glyphosate-tolerant 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthases
US5118908A (en) * 1990-11-06 1992-06-02 Trw Technar Inc. Gas damped deceleration switch
US5118642A (en) * 1991-01-24 1992-06-02 Daidousanso Co., Ltd. Method for producing semiconductors
GB9423212D0 (en) * 1994-11-17 1995-01-04 Glaxo Group Ltd Industrial enzymes
US5886775A (en) * 1997-03-12 1999-03-23 M+Ind Noncontact digitizing imaging system
US6492578B1 (en) * 1998-07-10 2002-12-10 Calgene Llc Expression of herbicide tolerance genes in plant plastids
US7314974B2 (en) * 2002-02-21 2008-01-01 Monsanto Technology, Llc Expression of microbial proteins in plants for production of plants with improved properties
AU2003255106A1 (en) * 2003-08-08 2005-02-25 Biotechnology Research Institute, Chinese Academy of Agricultural Science 5-enolpyruvyl-3-phosphoshikimate synthase of high glyphosate-bioresistance and coding sequence

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JOSEPH E. FITZGIBBON AND H. D. BRAYMER.Cloning of a Gene from Pseudomonas sp. StrainPG2982Conferring Increased Glyphosate Resistance.applied and environmental microbiology56 11.1990,56(11),3382-3388. *

Also Published As

Publication number Publication date
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CA2592563C (en) 2016-01-19
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US20060150270A1 (en) 2006-07-06
WO2006110188A2 (en) 2006-10-19
AR051877A1 (es) 2007-02-14
CA2592563A1 (en) 2006-10-19
CN101124324A (zh) 2008-02-13
EP1838858A2 (en) 2007-10-03
WO2006110188A3 (en) 2007-03-01
DE602005027253D1 (de) 2011-05-12
EP1838858B1 (en) 2011-03-30

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