JPH05508071A - グリホセート耐性５―エノールピルビル―３―ホスホシキメートの合成酵素 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 １８、アマから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。

１９、ダイズから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。

２０、ヒマワリから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。

２１、テンサイから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。

２２、アルファルファから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。

２３、トウモロコシから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。

２４、請求項１３記載の形質転換細胞からなる植物。

２５、上記植物がトマトである請求項２４記載の植物。

２６、上記植物がタバコである請求ｑＬ２４記載の植物。

２７、上記植物がセイヨウアブラナである請求項２４記載の植物。

２８、上記植物がアマである請求項２４記載の植物。

２９、上記植物がヒマワリである請求項２４記載の植物。

３０、上記植物がテンサイである請求項２４記載の植物。

３１、上記植物がアルファルファである請求項２４記載の植物。

３２、ｆｆ請求項２４記載植物によってつくられた種子。

３３、上記植物がトマトである請求項３２記載の種子。

３５、上記植物がセイヨウアブラナである請求項３２記載の種子。

３７、上記植物がヒマワリである請求項３２記載の種子。

３９、上記植物がアルファルファである請求項３２記載の種子。

４０、請求項５記載の植物遺伝子を含む植物を繁殖させることからなる、グリホ セート耐性植物の作成方法。

４１、上記植物が、トウモロコシ、トマト、タノ（コ、セイヨウアブラナ、アマ 、ヒマワリ、テンサイ、アルファルファ、ワタおよびイネからなる群より選ばれ た、請求項４０記載の方法。

４２、第１の植物が、上記第１の植物と第２の植物との間の交配によって繁殖さ れ、その結果、該交配植物の少なくとも何種類かの子孫がグリホセート耐性を示 す、請求項４０記載の方法。

４３、上記植物が、トウモロコシ、トマト、りｌ（コ、セイヨウアブラナ、アマ 、ヒマワリ、テンサイ、アルファルファ、ワタおよびイネからなる群より選ばれ た、請求項４２記載の方法。

４４、請求項５記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をコードするＤＮＡ配 列。

４５、長さが２０キロ塩基対未満である、請求項４４記載のＤＮＡ配列。

４６、請求項６記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素を特徴とする請求項４ ５記載のＤＮＡ配列。

４７、請求項７記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素を特徴とする請求項４ ４記載のＤＮＡ配列。

明細書 グリホセート耐性５−エノールビルビル−３−ポスホシ遺伝子工学における最近 の進歩は、外米遺伝子を取り込ませて植物を形質転換させるに不可欠な道具を提 供してきた。今や、耕種掌上重要であって特異な性質をもつ植物を成育させるこ とも可能である。こういった有利な特徴の一つが除草剤耐性であることは言うま でもない。

除草剤耐性の作物の出現によって、除草作業の必要性を低下させることができ、 農家にかかるコストの低減が効果的に行われる。

この観点から重要な研究テーマとなる除草剤は、Ｎ−ホスホノメチルグリシンで ある。

ＨＯ−ＣＣＨｚ　Ｎ　ＣＨ２Ｐ　ＯＨ ＯＨ この除草剤は、非選択性で広範囲スペクトルをもつ種子への使用に関して登録さ れている。この分子は一種の酸であって、水溶液に溶解して、植物毒性のアニオ ンを形グリホセートは、芳香族アミノ酸合成の前駆体を生じるシキミ酸経路を阻 害する。特に、グリホセートは、酵素である５−エノールビルビル−３−ボスボ シキメート合成酵素を阻害することによって、３−ホスホシキミ酸の５−エノー ルビルビル−３−ホスホシキミ酸への転換を阻害する。

グリホセート耐性植物は、その植物のゲノムに高レベルのＥＰＳＰ合成酵素を産 生ずる能力を付与することによって作成され得る。

この発明は、触媒活性を保持しながらグリホセートに対して低い親和性を示すＥ ＰＳＰ合成酵素の変異型を産生ずることによって、グリホセート耐性植物の有用 性を高める手段を提供する。

図面の簡単な説明 図１は、さまざまな植物および細菌から得られるＥＰＳＰ合成酵素のアミノ酸配 列を示す。

図２は、プラスミドｐＭＯＮ８１３５の遺伝子地図を示す。

図３は、プラスミドｐＭＯＮ８９５の遺伝子地図を示す。

図４は、プラスミドｐＭＯＮ９１５の遺伝子地図を示切断地図を示す。

図６は、中間体植物の形質転換ベクターｐＭＯＮ９８７の遺伝子地図を示す。

図７は、プラスミドｐＭＯＮ８６３１の遺伝子地図を示す。

発明の開示 ホスホエノールピルベートに対して低いに、値を保持しつつも、グリホセート除 草剤への高い耐性を示す新規なＥＰＳＰ合成酵素を提供する。この発明の主題の 酵素は、後述するように、アラニンへのグリシン置換およびアスパラギン酸への グリシン置換を有する。

もう一つの態様で、この発明は、ホスホエノールピルベートに対して低いに、値 を保持しつつも、グリホセート除草剤への高い耐性を維持しているようなアミノ 酸置換体の分離方法を提供する。

この明細書および請求の範囲で示されるペプチド構造のすべては、Ｎ末端のアミ ノ基が左側に、Ｃ末端のカルボキシル基が右側に現れる従来の形式で示される。

また。

タンパク質中にあって天然に存在するアミノ酸の命名は、以下の通りである。ア ラニン（Ａｌ＆、Ａ）、アスパラギン（Ａ　３　ｎｓ　Ｎ）　、アスパラギン酸 （Ａｓｐ、Ｄ）、アルギニン（Ａ　ｒ　ｇＳＲ）　、システィン（Ｃｙｓ、Ｃ） 、グルタミンｆｉ（Ｇｌｕ、Ｅ）、グルタミン（Ｇｉｎ、Ｑ）、グリシン（Ｇｌ ｙ、Ｇ）、ヒスチジン（ＨｉｓＳＨ）、イソロイシン（Ｉｌｅｓｌ）、ロイシン （ＬｅｕｌＬ）、リシン（Ｌｙ　ｓ、Ｋ）　、メチオニン（Ｍ　ｅ　ｔ　ＳＭ） 　、７　ｘニルアラニン（ＰｈｅｓＦ）、プロリン（Ｐ　ｒ　ｏ　ｓ　Ｐ　）、 セリン（Ｓｅ　ｒｌＳ）　、スレオニン（Ｔｈｒ、Ｔ）、トリプトファン（Ｔ　 ｒ　Ｉ）　％　Ｗ）　、チロシン（ＴｙｒＳＹ）、およびバリン（ｖ　ａ　ｒ　 ｓ　”）　＊この発明の目的として、「成熟ＥＰＳＰ合成酵素」とは、Ｎ末端の クロロプラストシグナルペプチドを含まないポリペプチドを指す、Ｅルペプチド は開裂されて成熟ＥＰＳＰ合成酵素を生じる。

アミノ酸の位置番号は、すべて成熟ＥＰＳＰ合成酵素（クロロプラストのシグナ ルペプチドリーダーを含まない）に対して付される。

図１は、さまざまな植物および細菌種から得られるＥＰＳＰ合成酵素のアミノ酸 配列を示す、配列の類似性を最もよく表す配列順を検索すると、アラニンへのグ リシ置換およびアスパラギン酸またはアスパラギンへのグリシン置換が生じる領 域に保存アミノ酸残基（共通配列によって示される）の領域が見い出される。実 除、文献および本明細書で報告されに一官能性のあらゆるＥＰＳＰペルギルス属 ）といった微生物の中には、ＥＰＳＰ合成酵素成分を含む多官能性「アロム（ａ ｒｏｍ）錯体」を有するものもあることが知られている。注目すべきアミノ酸も 保存され、多官能性「アロム錯体」のＥＰＳＰ合成酵素成分での、記載された置 換体も当然グリホセート耐性活性を生じる。

特に、この発明のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素を調製するとき、アラニン 残基によって置換されたグリシン残基は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐ ｅｒｔｕｓｓｉｓ）のＥＰＳＰ合成酵素では９６位に（マスケルら、１９８８年 ）、ツクバネアサガオ（ｐａｔｕｎｉａ）のＥＰＳＰ合成酵素では１０１位に、 トマトのＥＰＳＰ合成酵素では１０１位に、アラビドプシス・サリアナ（Ａｒａ ｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＰＳＰ合成酵素では１０１位に、ブ ラシカ・ナブス（Ｂｒａｓｓｉｃａ　ｎａｐｕｓ）では１０１位に、ダイズ（Ｇ ｌｙｃｉｎｅ　ｍａｘ）のＥＰＳＰ合成酵素では１０４位に、大腸菌に−１２の 年）、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　Ｌｙｐｈｉｍｕｒｉｕｍ ）のＥＰＳＰ合成酵素では９６位に（スタルカーら、１９８５年）存在している 。この発明のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素を調製するとき、アスパラギン 酸ｓヨｖアスパラギンからなる群より選ばれたアミノ酸残基によって置換された グリシン残基は、百日咳菌（Ｂｏｒｄｅｔｅｌｌａ　ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）のＥ ＰＳＰ合成酵素では１３７位に、ツクバネアサガオ（ｐｅｔｕｎｉａ）のＥＰＳ Ｐ合成酵素では１４４位に、トマトのＥＰＳＰ合成酵素では１４４位に、アラビ ドプシス・サリアナ（Ａｒａｂｉｄｏｐｓｉｓ　ｔｈａｌｉａｎａ）のＥＰＳＰ 合成酵素では１４４位に、ブラシカ・ナプス（ＢｒａｓＥＰＳＰ合成酵素では１ ３７位に、およびネズミチフス菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ　ｔｙｐｈｉｍｕｒｉ ｕＩｌｌ）のＥＰＳＰ合成酵素では１３７位に存在している。これらの例は、ア ラニンへのグリシン置換およびアスパラギン酸へのグリシン置換が、こされ、グ リホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素を生じ得ることを示す。

したがって、この発明は一態様で、グリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素、および 以下の工程を含むＥＰＳＰ合成酵素を調製する方法を提供する。すなわち、成熟 野生型ＥＰＳＰ合成酵素のアミノ酸配列中の８０から１２０位の間に位置するア ミノ酸配列（−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−）を有する第１の保存領域中でア ラニン残基を２番目のグリシン残基と置換する工程、ならびにアミノ酸配列（Ｅ −Ｒ−Ｐ−１−Ｘ、−Ｘｔ−Ｌ−Ｖ−Ｘ、−Ｘａ−Ｌ−Ｘｓ　Ｘ、Ｘｒ−Ｇ　Ａ ）を有する第２の領域中［ただし、Ｘ　ｌ、　Ｘ　！、Ｘ３、ｘいｘ、およびＸ ｒはいずれかのアミノ酸であり、Ｘｓはアルギニン（Ｒ）またはりシン（Ｋ）で あって、第２の領域は成熟野生型ＥＰＳＰ合成酵素のアミノ酸配列中の１２０か ら１６０位の間に位置する］でアスパラギン酸およびアスパラギンからなる群よ り選ばれたアミノ酸残基を末端グリシン残基と置換する工程を含む調製方法であ る。多くの場合、成熟するであろう。

一実施態様では、グリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をフードする配列は、グリ ホセート耐性形質転換植物の効率をさらに高める上で有用である。植物を形質転 換してグリホセート耐性を発現させる方法は、欧州特許広報第０２１８５７１号 、および１９８６年７月７日に提出された通常譲渡の米国特許出願第８７９，８ １４号（発明の名称［グリホセート耐性植物］）に記載されている。

これらの開示は、参考までにここに引用するものとする。

コードするＤＮＡ配列中に必要な変化をもたらすことにン゛）成酵素のアミノ酸 配列中の８０から１２０位の間に位置する第１のアミノ酸配列（−Ｌ−Ｇ−Ｎ− Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−）、ならびに第２のアミノ酸配列［Ｅ−Ｒ−Ｐ−１−Ｘｌ−Ｘ 、−Ｌ−Ｖ−Ｘ、−Ｘ、−Ｌ−ＸＳ−Ｘｌ−Ｘｒ−Ｎ　（Ｄ）−Ａｌ　ｌだし、 Ｘ３、Ｘｌ、ｘ３、Ｘ６、Ｘ、およびＸ、はいずれかのアミノ酸であり、Ｘｓは アルギニンまたはりシンであって、第２の配列は成熟野生型ＥＰＳＰ合成酵素の アミノ酸配列中の１２０から１６０位の間に位置する）を有するグリホセート耐 性ＥＰＳＰ合成酵素をコードする植物遺伝子を含む形質転換細胞およびそれから 再生した植物を提供する。多くの場合、成熟ＥＰＳＰ合成酵素中で、第１の配列 は９０ないし１１０位に、第２の配列１３５ないし１５０位に位置することであ ろう。さらにこの遺伝子は、成熟ＥＰＳＰ合成酵素をコードする配列のＮ末端に 付着したクロロプラストのシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列を含む。こ のシグナルペプチドは調節されて、植物細胞のクロロプラスト中へのＥＰＳＰ合 成酵素の取り込みを容易にする。

したがって、さらに別の寅施態様で、この発明は、成熟野生型ＥＰＳＰ合成酵素 のアミノ酸配列中の８０から１２０位の間に位置する第１のアミノ酸配列（−Ｌ −Ｇ−Ｎ−Ａ−Ａ−Ｔ−Ａ−）　、ならびに第２のアミノ酸配列［Ｅ　ＲＰ　Ｉ −Ｘａ　Ｘｌ　Ｌ　Ｖ　Ｘｓ　Ｘ４−Ｌ−Ｘ、−Ｘ、−Ｘ、−Ｎ　（Ｄ）−Ａｌ 　（ただし、Ｘ５、Ｘよ、ｘｌ、ｘいｘ、８よびＸ、はいずれかのアミノ酸であ り、Ｘ、はアルギニンまたはりシンであって、第２の配列は成熟野生型ＥＰＳＰ 合成酵素のアミノ酸配列中の１２０から１６０位の間に位置する）を有するグリ ホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をコードする植物遺伝子を含む植物の形質転換細 胞および発現ベクターを提供する。

この発明のさらに他の態様に基づくと、上記の植物を栽培すること、次いで、移 植片、功徳および種子などの胎芽を用いて植物を繁殖させること、または上記植 物を他の植物と交配させてグリホセート除草剤に耐性を発揮図１に示されたＥＰ ＳＰ合成酵素の配列は、ＥＰＳＰ合成酵素材料がもつ広範囲な進化を表す。これ らのデータは、細菌および植物材料が上記の保存領域を含むことを示す。しかし 、当該分野の技術者には、特定のＥＰＳＰ合成酵素が保存領域の正確な配列をも たない可能性のある別の材料から産生され、その材料から分離され得ることがよ く知られている。実際、アラニンは、グリホセート感受性に変化を起こさずに、 ツクバ不アサガオＥＰＳＰ合成酵素の保存領域の最初のグリシンに代わっテ挿入 されることが分かっている。

前記の第２の保存領域中でアスパラギン酸またはアスパラギンをグリシン残基で 置換することによってグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素が生じるが、アスパラ ギン酸置換が最も好ましい。当該分野の技術者には、その他のアミノ酸置換によ っても、グリホセート耐性であって触媒活性を維持するに十分なに、を有するＥ ＰＳＰ合成酵素が産生される可能性のあることがよく知られている。

したがって、この位置での他の置換も当然この発明の精神および範囲中に入るも のと考えられる。

グリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素の植物遺伝子は、クロロプラストのシグナル ペプチド（ＣＴＰ）を含むポリペプチドをコードしているが、ＣＴＰによって、 ＥＰＳＰ合成酵素ポリペプチドが植物細胞内側のクロロプラスト中へ輸送される ことが可能となる。ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子は、核中のｍ　ＲＮ　Ａに転写され 、このｍＲＮＡは細胞質中で前駆体のポリペプチド（ＣＴＰ／成熟ＥＰＳＰ合成 酵素）に翻訳される。この前駆体ポリペプチドはクロロプラスト中に輸送（輸入 ）され、その時点で、ＣＴＰが切断されて成熟ＥＰＳＰ合成酵素が生じる。この 発明で使用されるに適したＣＴＰは、さまざまな材料から得られる。このＣＰＴ は、形質転換される目的植物の内在性ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子から得られること が最も好ましい、また、他の植物のＥＰＳＰ合成酵素遺伝子から得られるＣＰＴ を使用することも可能である。ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子（７）ＣＰＴ配列とｓ　 ５ＲＵＢ　Ｉ　ＳＣＯ遺伝子（例えば、プログリ−１１９８３年参照）のそれと ではあまり相同性はないが、非相同性ＣＰＴが特定の実施態様で機能し得ること も理解できよう。この発明での使用に適した（、ＰＴ配列は、後述のように、目 的とするＣＰＴを含むＥＰＳＰ合成酵合成酵素ポリペグノドロゲラストによる取 込みを測定することによって容易に決定可能である。あるＣＰＴがＥＰＳＰ合成 酵素遺伝子のＣＰＴ以外に使用される場合、ＥＰＳＰ８成酵素をクロロプラスト 中に効果的に輸送させるために、ＣＰＴが由来するタンパク質源のＮ末端の小部 分を含む必要があろう。多くの場合、形質転換される植物からのＥＰＳＰ合成酵 素遺伝子を分離し、対象植物の内在性ＥＰＳＰ合成酵素ｍＲＮＡから生じたｃＤ ＮＡ構造体中にこの発明の置換体を導入することが好ましい。この発明の実施に 適した植物として、ダイス、ワタ、アルファルファ、セイヨウアブラナ、アマ、 トマト、テンサイ、ヒマワリ、ジャガイモ、タバコ、トウモロコシ、コムギ、イ ネ、およびレタスが挙げられるが、これらに限定されるものではない。

植物細胞中でＥＰＳＰ合成酵素遺伝子の転写を引き起こすことが知られているプ ロモーターを、この発明で使用することができる。こういったプロモーターは、 植物、植物病原菌または植物ウィルスから得られ、その例として、カリフラワー のモザイクウィルスの３５Ｓおよび１９Ｓプロモーター、ＥＰＳＰ合成酵素、５ ｓＲＵＢＩＳＣＯ遺伝子などの植物遺伝子から分離されたプロモーター、ならび にツバリンおよびマンノビン合成酵素などのアクロバクテリウム・ツメファシェ ンス（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴ−ＤＮＡから 得られるプロモーターが挙げられるが、必ずしもこれらに限定されない。選定さ れた特定のプロモーターは、当然十分な発現を引き起こし、有効量のグリホセー ト耐性ＥＰＳＰ合成酵素ポリペプチドを産生じ、植物細胞およびそれから再生し た植物にグリホセートに対する実質的な耐性を付与することができる。当該分野 の技術者には、耐性を誘導するに必この発明のＥＰＳＰ合成酵素遺伝子の発現に 使用されるプロモーターを、必要に応じてさらに修飾し、それらの発現特性を変 化させることができる。。例えば、光の下で５ｓＲＵＢＩｓｃｏ遺伝子の発現を 抑制する５ｓＲＵＢ　Ｉ　ＳＣＯ遺伝子の部分にＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを 連結させ、根ではなく集で活性を示すプロモーターを作成することができる。得 られたキメラプロモーターを、ここに記載された通りに使用することもできる。

ここで使用する場合、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの例として、ＣａＭＶ３５Ｓ プロモーターの変位型（例えば、オペレーター領域との連結によって生じたプロ モーター）、ランダム突然変異誘発または調節突然変異誘発、エンハンサ−配列 の付加または重複などが挙げられる。

上記のように、１０１位でのグリシンからアラニンへの変化だけを含む変位型の ＥＰＳＰ合成酵素は、グリホセートに対して大きな耐性を示す、しかし、この耐 性には、ＥＰＳＰ合成酵素のための２つの天然基質の一方であるホスホエノール ピルベー）（ＰＥＰ）に対する結合定数（Ｋ、）の増大を伴う、他方の基質、レ キメート−３−ホスフェート（５３Ｐ）に対する結合定数は影響を受けない。例 えば、野生型ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素は、０．４μＭのグリホセート （拮抗阻害剤）に対する結合定数（Ｋ、）および５．２μＭのＰＥＰに対するに 、をもつ一方、１０１位でアラニンへのグリシン置換を有する変異型は、２００ ０μＭのグリホセートに対するに、および１９８μＭのＰＥＰに対するに、をも つ。

ＰＥＰに対する高いに、のため、ＰＥＰの生理学的濃度では高レベルの変異型酵 素によっａ常な触媒活性が得られるであろう。現在得られている変位型より、グ リホセートに対して高いに、値およびＰＥＰに対して低いに、値をもつＥＰＳＰ 合成酵素の変異型が同定され得るならば、その変異型は、高レベルの遺伝子発現 の操作が困難な場合でも植物種または種類組織におけるグリホセート耐性を獲得 する能力を高めることとなろう。細菌での新しいグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成 酵素変異型のスなる以上に、非常に多くの微生物を短時間でスクリーニングする ことが可能となろう。ツクパネアサガオのＥＰＳＰ合成酵素のｃＤＮＡクローン が大腸菌中での発現に適するように加工される場合、この酵素のｃＤＮＡクロー ンは大腸菌中で発現されて、完全な機能をもつＥＰＳＰ合成酵素を産生じ得る。

したがって、変異型の分離を促進させるために、ツクバ不アサガオＥＰＳＰ合成 酵素の変異型を発現および選択するための系が、一般の実験室用微生物である大 腸菌で開発された。

ＰＥＰに対して低いに１を有するグリホセート耐性変異型同定用の選択手法の一 般的性質 成分　性質 大腸菌宿主　低レベルのグリホセートで阻害された内在性ＥＰＳＰ合成酵素活性 を有する アロへ株または原栄養株（各宿主に対 して実験上で決定された）。

発現プラスミド　植物のＥＰＳＰ合成酵素遺伝子に融合した弱い細菌プロモータ ーを有する自 己複製プラスミドであって、これは、 大腸菌アロＡ突然変異体に対して相補 性を示さず、低レベルで発現したとき 最小培地上での細胞増殖を維持する。

このプロモーターは、野生型ＥＰＳＰ 合成酵素遺伝子との融合体が、内在性 の細菌ＥＰＳＰ合成酵素を阻害する所 要濃度と類似したグリホセート濃度で 突然変異体　点突然変異体、単一または複数の塩基の転位体または転換体を当然 創製する が、挿入体、欠失体またはフレームシ フト体を創製することはない。自然突 然変異体も選択可能であるが、恐らく あまり有効ではないであろう。

選択培地　芳香族アミノ酸は含まず、必須塩類および鉱物ならびに糖類を含む細 菌の最 小培地。発現プラスミド上に薬剤耐性 のマーカー遺伝子に相当する抗生物質 を添加して、発現プラスミドを含む細 菌細胞だけを選択する。アロＡ宿主用 として、ＰＥＰに対して低いに、、、値を有する変異をを選択するためにグリホ セートを必要としない。これは、低レ ベルで発現したとき大腸菌のアロＡ突 Ａ）大腸菌において、野生型および変異型［アラニンへのグリシン（１０１）置 換］のツク／（ネアサガオＥＰＳ現した「成熟」野生型ツクバネアサガオＥＰＳ Ｐ合ＪＬ［素コード配列（クロロプラストのシグナルペプチドを含まず）を運搬 する。このグラスミドは、下記のように、ｐＭＯＮ９５３１およびｐＭＯＮ９５ ５６　Ｃツクｔ＜ネ７サガオのＥＰＳＰｃＤＮＡクローン）に由来するものであ る（ｐＭＯＮ９５３１およびｐＭＯＮ９５５６の分離は後述する）。

非反復Ｎｃｏ１部位およびＡＴＧ翻訳開始シグナルを、成熟タンパク質に対する 、野生型ツクバ不アサガオＥＰＳＰ合成酵素ｃＤＮＡコード配列のＮ末端に導入 した。

ｃｏＲＩのｃＤＮＡ断片のＭ１３ｍｐ９クローン）を、シラーとスミスの方法（ １９８３年）および突然変異誘発プライマー（５’　−ＡＴＣＴＣＡＧＡＡＧ（ ：、ＣＴＣＣＡＴＧＧＴＧＣＴＧＴＡＧＣＣＡ−３’　）を用いて部位特異的突 然変異を誘発することによって除かれた。

た。上記の突然変異の有無は、配列分析によって確認されｔ；。このＭｌ　３ｍ ｐ　９クローンをＭ８０１９と命名した。

プラスミドｐＭＯＮ６００１は、合成バクテリオ７ア−ジλｐＬプロモーターの ２つのタンデムコピーから発現した、大腸菌Ｋ　１２　Ｅ　Ｐ　Ｓ：Ｐ合成酵素 コード配列を運搬するｐＢＲ３２７（ソベｏンら、１９８０年）の誘導体である 。プラスミドｐＭＯＮ６００１を以下の方法で構成した。最初に、ｐＭＯＮ４　 （ロジャーズら、１９８３年）をＣ１ａｌで消化し、２．５ｋｂの断片を、同様 にＣ１ａＩで切断しておいたｐＢＲ３２７プラスミドベクター中に挿入した。得 られたプラスミド　ｐ　Ｍ　ＯＮ　８には、ｐＢＲ３２７のβ−ラクタマーゼ遺 伝子と同一方向で読み取るＥＰＳＰ合成酵素コード配列が含まれている。

ｐ　Ｍ　ＯＮ　２５、すなわち、大腸菌ＥＰＳＰ合成酵合成酵素コムプラスミド ｐＭｏＮ７は、ｐ　Ｍ　ＯＮ　４　ノ２　ｋ　ｂのＢｓｔＥＩＩ断片を欠いてい る。次いで、ＥＰＳＰ合成酵素のオープンリーディングフレームの５′末端をコ ードする、１５０ｋｂのＨｉｎｆ　ＩがらＮｄｅＩの断片部された４、５ｋｂの ＢａｍＨＩ−Ｎｄｅｌ断片に添加した。なお、このｐＭＯＮ８は、ＥＰＳＰ合成 酵素フード配列の３′末端部分および ３’　−ＧＴＣＴＡＧＡＣＡＡＣＡＴＴＣＧＡＧＴＣＴＡＧＡＣＣＡＴＧＧ−３ ’ＣＴＣＡＧＡＴＣＴＧＧＴＡＣＣＴＴＡ−５’　）を有する合成リンカ−を含 んでいる。

得られたプラスミドｐＭＯＮ２５は大腸菌ＥＰＳＰ合成酵素フード配列を含むが 、その前方に非反復配列のＢａｍＨＩおよびＢｇｌｌＩ部位、合成リポソーム結 合部位、ならびに非反復配列のＸｂａＩおよびＮｃｏ１部位が先行する。なお、 Ｎｃｏｌは、コード配列のＡＴＧ翻訳開始シグナルを含む。

ｐＭＯＮ６００１を構成するために、ｐ　Ｍ　Ｏ−Ｎ　２５をＢａｍＨ１で消化 して、Ｂａａ＋ＨＩ粘着末端（５’　−ＧＡＴＣＣＴＡＴＣＴＣＴＧＧＣＧにＴ ＧＴＴＧＡＣＡＴＡＡＡＴＡＣＣＡＣＴＧＣ，ＣＧＧＴに３’　−ＧＡＴＡＧＡ ＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＡＣＴＧＴＡＴＴＴＡＴＧＧＴＧＡＣＣＧＣＣＡＣＡＴＡ ＣＴＧＡＧＣＡＣＡＴＣＧ−３’ＴＡＴＧＡＣＴＣにＴＧＴＡにＣＣＴＡＧ−５ ”）を含むλファージの部分的ｐＬ配列（アダムズおよびガルピ、１９８６年） を含む合成りＮＡ断片と混合した。

得られたプラスミドｐＭＯＮ６００１は、正しい方向でｐＭＯＮ２５のＢａｍＨ １部位中に直列反復配列として合成λ７アージｐＬプロモーター断片の２つのコ ピーをもっており、大腸１１ＥＰＳＰ合成酵素コード配列の転写を促進する。

プラスミドｐＭＯＮ６００１をＮｃｏｌおよびＥｃｏＲＩで切断すると、３ｋｂ の断片がアガロースゲルがら単離された。この断片を、Ｍ８０１９から精製され た１００ｂｐのＮｃｏｌ−ＥｃｏＲＩ小断片と小金片た。連結および形質転換に 続いて、ツクバネアサガオの「成熟」ＥＰＳＰ合成酵素の５′末端に相当する１ ００ｂｐのＮ。

バネアサガオＥＰＳＰ合成酵素コード配列の３′末端をコードする１、４ｋｂの 断片を放出させた。連結および形質転換に続いて、大腸菌アロＡ突然変異体に相 補性があって、１．４ｋｂのｐＭＯＮ９５５６断片を有する１つのクローンを同 定し、ツクバネアサガオＥ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　’！ｉ”　ａ酵素のための完全な成熟 フード配列を得た。このプラスミドをｐＭＯＮ３４２と命名した。

ａ１部位と置換した。これは、ＥｃｏＲＩによる部分消化、その後のヤエナリヌ クレアーゼによる消化によって行われ、平滑末端を作成した。Ｃ１ａｌリンカ− （５’　−ＣＡＴＣＧＡＴＧ−３″　；ニューイングランドバイオラブズ社）を 、Ｔ４ＤＮＡリガーゼでの連結反応によってその平滑末端に連結した。この混合 物をＣ１ａＩで消化して、粘着末端を作成したところ、５ｋｂのＥｃｏＲＩ部分 消化産物がアガロースゲルから分離され、これをＴ４ＤＮＡリガーゼによって連 結させた。このプラスミドをｐＭＯＮ９５６３と命名した。

配列（５’　−ＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧ’　ＣＡＴＴＴＣＣＡＡ ＧＧ−３’）を有する２９個の突然変異デオキシリボヌクレオチドを、１０１位 でグリシンによるアラニンの置換を行うために自動ＤＮＡ合成装置（アプライド ・バイオシステムズ社）を用いて合成した。

このデオキシリボヌクレオチドを調製用ポリアクリルアミドゲル電気泳動によっ て精製した。

ｐＭＯＮ９５６３の６６０ｂｐのＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋断片を、Ｅ　 ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌ［Ｉ消化Ｍ１３ｍｐｌＯバクテリオファージベクターに ューイングランド・バイオラブズ社）中にサブクローニングした。アマージャム 社（イリノイ州アーリントン）より出版されているＭ１３クローニングおよび配 列決定のハンドブックの記載に従って、１本鎖鋳型ＤＮＡを調製し、上記のオリ ゴヌクレオチドを用いてオリゴヌクレオチド突然変異誘発反応をシラーとスミス による記載（１９８３年）通りに実施した。このグラスミドをＭ９５５１と命名 しｒ：、ＥｃｏＲＩとＨｉｎｄ１１１部位との間（７）ｐＭＯＮ９５６３１：Ｍ ９５５１（７）６６０ｂｐのＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋断片を挿入し、対 応する野生聖断片に置き換えた。このグラスミドをｐＭＯＮ９５６６と命名した 。

ｐＭＯＮ３４２およびｐＭＯＮ９５６６中のツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素 を発現させるために用いられる２重のｐＬプロモーターから、高レベルの酵素の 発現がもたらされる。この酵素は高レベルで存在するので、これらプラスミドの どちらかを有する細菌は、ｐＭＯＮ３４２によって産生される酵素が野生型であ っても、増殖培地中で非常に高レベルのグリホセート（＞５０１）に対して耐性 を示す。この酵素のグリホセート耐性型の選択を可能とするようなプラスミドを 産生ずるために、高レベル発現のλファージｐＬプロモーターを非常に弱い発現 のプロモーター配列で置き換える必要がある。こういったプロモーターを同定す るためのプラスミドを以下の通りに構成した。ｐＭＯＮ３４２の前駆体であるｐ ＭＯＮ９５４４をＢａｍＨＩで消化してＩ）Ｌプロモーターを除去し、連結によ って再環化させると、ｐＭＯＮ３６２が得られた。次いで、ツクバネアサガオＥ ＰＳＰ合成酵素の３′末端を含む、Ｉ）ＭＯＮ９５５６のＥｃｏＲＩ断ＭＯＮ３ ６４は、ＥＰＳＰ合成酵素コード配列の５′末端プロモーターが存在しない点を 除いて、ｐＭＯＮ３６２と同一である。

後のクローニング工程を容易にするために、プロモーターニレメトの欠失が生じ るｐＭＯＮ３６４のＥｃｏＲＩ／Ｐｓｔｌ断片を、ＥＰＳＰ合成酵素のｃＤＮＡ のほとんどを含むｐＭＯＮ９５６３のＥｃｏＲＩ／Ｐ　ｓ　ｔ　Ｉ断片に連結す ると、ＥｃｏＲＩ９５６４が生じる。このプラスミドは、これが、ＥＰＳＰ合成 酵素ｃＤＮＡの３′末端で非反復Ｃ１ａ１部位およびＥＰＳＰ合成酵素コード配 列中に非反復ＥｃｏＲＩ部位を有する点を除いて、ｐＭ。

Ｎ３６５と同一である。Ｒ３４８１（バッチマンら、１９８０年；パジェッテら 、１９８７年）のようなアロＡ大腸菌の形質転換は突然変異に対して相補的では ないことから、このプロモーター領域で有効な欠失が生じていること、およびこ のプラスミドが大腸菌中でＥＰＳＰ合成酵素の産生能を欠くことが示された。あ る実験的なスクリーニング法を使用して、以下のように大腸菌中で適当な低レベ ル発現を示すプロモーターを分離した。

大腸菌株５Ｒ２０（０Ｍ４２、ｈｆｒ、ｈｉｓ−１ｄａｍ３）から分離したクロ モシームＤＮＡを、Ｍｂ。

Ｉで完全に消化した。これらＭ　ｂ　ｏ　Ｉ断片を、プラスミドｐＭＯＮ９５６ ４のＢｇｌ１１部位にクローニングした。このＢｇｌＩＩ部位は、大腸菌中で発 現させるために剪断されたプロモーターを欠くツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵 素コード配列の上流に位置するマルチリンカ−中に存在する。この連結混合物を 用いて、大腸菌株５Ｒ４８１（内在性のＥＰＳＰ合成酵素活性のないアロＡ変異 株）を形質転換した。ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素ｃＤＮＡを発現するに 十分なプロモーター活性を有するＭ　ｂ　ｏ　Ｉ断片を含む４１個のコロニーを 得たが、これらは、５Ｒ４８１申のアロＡ欠失に相補的であって、最小培地上で の細胞増殖を促した。濃度１，５．１０、た。グリホセート濃度の増加にともな う細胞の増殖量を、ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素コード配列を発現する各 Ｍ　ｂ　ｏ　Ｉ断片の相対的プロモーター性能の尺度として使用した。ＭｂｏＩ プロモーター断片をさらに特徴付けるために、プラスミドＤＮＡミニ調製物を４ １個のコロニーのそれぞれからアルカリ溶解法によって調製し、それぞれ別個に 、ＥｃｏＲＩ、ＢａｍＨＩ、Ｈｉｎｄｌｌｌ、Ｃ１ａｌおよびＮｃｏｌによって 消化した。これらの制限酵で選ばれ、変異断片を移動させるために使用されよう 。

したがって、理想的なプロモーター断片は、これら制限酵素のいずれに対する制 限酵素切断部位をも含まないで′あろう。上記の制限酵素に対する制限酵素切断 部位を欠０Ｎ８１０５およびｐＭＯＮ８１４３）を、さらに特徴を調べるために 選択した。両プラスミドは７０Ａ欠損を相補し、グリホセート濃度１＋ｏＭ　（ ｐＭＯＮ８１０５）および２０ｍＭ　（ｐＭＯＮ８１４３）以下を含む最小培地 上で５Ｒ４８１の増殖を促した。

Ｃ）発現ベクターの試験 ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素のグリホセート耐性変異型を選択し得るか否 かを調べるために既知の変異型を用いて、異種の発現系を試験した。グリホセー ト耐性の突然変異Ｃアラニンへのグリシン（１０１）ｌｔ−１重ＭＯＮ８１０５ とｐＭＯＮ８１４３の両方の発現ベクターのツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素 コード配列に導入シ、それぞれｐＭＯＮ８１３５およびｐＭＯＮ８１５２を作成 した。これは、両ベクターからの６６０ｂｐのＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋ 領域を、アラニンへのグリシン（１０１）突然変異型を含むｐＭＯＮ９５６６か らのＥｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋領域で置換することによって行われた。ｐＭ ＯＮ８１３５とｐＭＯＮ８１５２の双方を使用して、５Ｒ４８１を形質転換した 。ｐＭＯＮ８１５２構成体は５Ｒ４８１中のアロＡ欠損に相補し得るので、５０ ＩＤＭ以下のグリホセートを含む最小培地上で細胞の増殖を促しｌ；。

し得ないので、最小培地上での細胞増殖を起こさなかった。ｐＭＯＮ８１３５ブ ーｙスミドを有ｔ６ｓＲ４８１ｍ３５の比活性は、４１　ｎｗｏｌ／＋ｉ＋ｉ／ Ｂタンパク質であって、プラスミドｐＭＯＮ８１０５の比活性は、２８　ｎｍｏ ｌ／ａｉｍ性で大腸菌中に発現させた。そこで、変異型酵素のＰＥＰに対するに 、が高い（野生型と比較して１９８μＭ：５゜２μＭ）ためＣ１ＥＰＳＦ’合成 酵素がこのような低レベルで産生された場合、アロＡ突然変異型に相補し得ない 比較的非効率的なＥＰＳＰ合成酵素が生じるという仮説が提出された。この結果 は、ＰＥＰに対するに、の重要性、および変異型ＥＰＳＰ合成酵素を大腸菌中で 弱く発現されたとき、この酵素のアロＡ相補力を示すものであった。変異型酵素 がＰＥＰに対して高いに、をもつならば、アロＡを相補するために高レベルの発 現が要求される。

したがって、発現の弱いベクターｐＭＯＮ８１０５は、ＰＥＰに対する比較的低 いに、を有するツクバ不アサガオＥＰＳＰ合成酵素の変異型を同定するために、 新規で強力な選択手段となる。グリホセート選択に関連して、ＰＥＰに対する低 いに、とともに有意なグリホセート耐性を併有する変異をを得ることができる。

これは、この系から野生型酵素の新変異をが得られるだけでなく、これヲ用いて 、アラニンへのグリシン（１０１）変異型中の第２の部位突然変異型を選択こと かできる事実を意味゛している。なお、後者の変異型は、グリホセート耐性を維 持しつつＰＥＰに対するに、を低く下げる配列をコードするものである。この予 期に反した強力な選択系は、この発明の一部分を構成するものである。当該分野 の技術者には、この発明の精神と範囲に逸脱することなく、他のアロＡ菌株、他 の挿入方法、他のランダムＤＮＡ断Ｄ）エチルメタンスルホン酸を用いたｐＭＯ Ｎ８１３５のインビボでの突然変異誘発 ツクバネアサガオ酵素のアラニンへのグリシン（１０１）変異型の第２の部位変 異型を得るために上記の選択系の一応用例として、以下の突然変異誘発法が役立 つ。

エチルメタンスルホン酸（ＥＭＳ）は、細菌遺伝学の領域で通常使用される突然 変異誘発物質であるが、これには、最小培地中での細菌培養物の増殖が必要であ る。ｐＭＯＮ８１３５は５Ｒ４８１中のアロＡに相補しないので、大腸菌の原栄 養株を使用しなければならない。

ｐＭＯＮ８１３５を大腸菌株３Ｍ１０９中で形質転換した。３＋ｎｌの培養物を 、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含む２ＸＹＴ培地中で３７°Ｃで飽和する まで一晩増殖させた。飽和培養物のアリコート０．５ｍｌを、取っ手つき７ラス フ中の２ＸＹＴ培地２０１に入れて４０倍に希釈した。この希釈培養物を３７° Ｃで水浴中にて連続的に製置し、その増殖を、クレット／サムエルラン（Ｋｉｅ ｔｔ−５μｍｍｅｒｓｏｎ）の光電比色計を用いて１４５のクレット値に達する までモニターした。次いで、この培養物をＥＭ液２０ｍ１（等量）に混合した。

４０ｍ１の培養物を、３７℃で２時間製置した後、ＩＸＭＯＰＳ培地で１０倍に 希釈し、最終容量を４００ｍ１とした。次いで、この希釈培養物を３゛７℃で３ 時間製置した。５００１のプラスチック遠心ボトルに入れた細胞を、ベックマン ＪＡＩＯローターを使って７０００　ｒｐｍで１０分間（５℃）遠心してペレッ ト化した。続いて、この細胞をｌｏｏ＋ａｌのｌ　ＸＭＯＰ　Ｓ培地に再懸濁さ せ洗浄してから、上記と同様にペレット化した。このｍＭ細胞のペレット全２ｘ ＹＴ増殖培地２００ｍ１に再懸濁させ、ｌリッターのフラスコ中で９０分間３７ ℃で製置した。次いで、これらの細胞を上記のように再びペレット化し、−２０ ℃で凍結した。このペレットを解凍して、標準的なアルカリ溶解法にかけた後、 突然変異したｐＭＯＮ８１３５プラスミドＤＮＡが抽出された。

Ｅ）グリホセート耐性コード配列変異型のスクリーニング 多工程スクリーニング法を使用して、ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素のグリ ホセート耐性変異型を同定した。最初のスクリーニング工程は、ＥＭＳ突然変異 誘発ｐＭＯＮ８１３５のプラスミドＤＮＡを用いた大腸菌の形質転換、およびグ リホセートを含む最小培地上でのグリホセート耐性コロニーの選択であった。５ Ｒ４８１７０八大腸菌株の形質転換頻度は非常に低く、プラスミドＤＮＡ　１μ ｇあたりせいぜい１０’（ｉの形質転換体を生じるだけであった。この問題を克 服するために、大腸菌株ＪＭＩ　０１を使用した。プラスミドＤＮＡ１μｇあた り形質転換体１０’個までの形質転換効率が日常的に得られたからである。しか し、ＪＭＩＯＩは、完全に機能性のアロＡ遺伝子を含み、ＭＯＰＳ最小培地上で の増殖かのグリホセートが、内在性ＥＦ’ＳＰ合成酵素活性および最小培地上で のＪＭＩ　Ｏ１の増殖を阻害することが明らかにされた。発現性の弱い野生型ツ クバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素ｃＤＮＡ構成体（ｐＭＯＮ８１０５）は１ｍＭ グリホセート上でアロ八大腸菌株５Ｒ４８１の増殖得ないので、グリホセート濃 度が２１を超える場合、大腸菌の一厚栄養株を選択のために使用することができ る。

ＥＭＳ突然変異誘発ｐＭＯＮ８１３５プラスミドＤＮＡをＪＭＩ　Ｏｌ中に形質 転換し、グリ士セード耐性変異をを５ｍＭのグリホセートを含むＭ　ＯＰ　Ｓ　 Ｐ！小培地上で選択した。

グリホセート耐性コロニーは、ツクバ不アサガオＥＰＳＰ合成酵素コード配列中 にプロモーター突然変異、コピー数突然変異およびグリホセート耐性突然変異な どのさまざまな突然変異が生じたｐＭＯＮ８１３５プラスミドを含んでいた。Ｅ ＰＳＰ合成酵素遺伝子を発現するために使用されるプラスミドコピー数を増加さ せた突然変異、またはプロモーターの能力を増大させた突然変異は、細菌中でＥ ＰＳＰ合成酵素の量を増加させ、細胞をアロＡ陽性グリホセート耐性の表現型と することになろう。

ＥＭＳ突然変異誘発ｐＭＯＮ８１３５プラスミドの非コード領域中の突然変異を 排除するために、グリホセート耐性コロニーを、５０μｇ／ｍｌカルベニシリン を含む２ＸＹＴ液体培地中にプールして、雲量しながら３７℃で一晩増殖させ、 細胞に通気した。次いで、細胞を遠心によって飽和培養物からペレット化し、プ ラスミドＤＮＡをアルカリ溶解法によって抽出した。続いて、このプラスミドＤ ＮＡをＥｃｏＲＩおよびＣ１ａｌ制限酵素で完全に消化してから、１．６ｋｂの ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素フード配列領域を、０．８％ジ−プラーク（ ５ｅａＰｌａｑｕｅ、　Ｆ　Ｍ　Ｃ社）の低ゲル化温度アガロースゲルから野生 型コード配列を含む類似の断片を置換した。これは、上記のように分離したプラ スミドの３．８３ｋｂのＥｃ。

ＲＩ−Ｃ１ａｌベクタ一断片にその類似断片を連結することによって行った。次 いで、この連結混合物を使ってツクパネアサガオＥＰＳＰ合成酵素コード配列領 域中でグリホセート耐性突然変異が生じたものを選択した。

サブクローン化コード配列の形質転換から得られたグリホセート耐性コロニーの 特徴を、グリホセート濃度の異なる液体培地中で各変異体の増殖速度を測定する ことによって、さらに調べた。この増殖曲線解析は第３のスクリーニング法とし ての役割を果し、以下の手法で実施した。

グリホセート耐性コロニーを選択プレートから拾い上げ、ＭＯＰＳ培地１培地１ 友ｌ５０μｇ／１１のカルベニシリンを含む前培養物中に個別に接・種した。次 いで、この前培養物を、３７℃で一晩装置することによって飽和に達するまで増 殖させた。翌朝、各培養物の密度を測定したが、これは、各培養物からｌＯＯμ ｌ七ジセー＝才を取り出し、これをＭＯＰＳ培地９００μｌの添加によって１０ 倍に希釈して、分光光度計を使って６６０ｎｍの波長での光学密度を読み取るこ とによって行った。飽和した各前培養物５０μｍを、０．５または１０μＭのグ リホセートを含むＭＯＰＳ培地５培地５添ｌすることによって、この飽和前培養 物を１％に希釈した。希釈前培養物を、ステンレス製の蓋がついたガラス培養管 中で増殖させたが、これは、３７℃にてホイール上にこれらを乗せて回転させな がら行った。このガラス培養管をクレット／サムエルノン（Ｋｌｅｔｔ−５ｕｍ ｍｅｒｓｏｎ）の光電比色計中で直接読み取れるように設計した。そして、この 比色計を用いて、約３時間の間隔を置いて細菌培養物の増殖をモニターした。

一つの培養物（＃２１５）を同定したが、これは、１０ｍＭグリホセートを含む ＭＯＰＳ培地中で、他のグリホセート耐性培養物および対照培養物のすべてより も早く増殖するものであった。これは、この濃度のグリホセートで１１時間以内 の増殖で飽和に達した唯一の培養物であった。このときの対照培養物は、ＪＭＩ ＯＩ大腸菌の宿主中のｐＭＯＮ８１４３およびｐＭＯＮ８１５２（両方とも上掲 ）であった。

Ｆ）グリホセート耐性コード配列変位型の特徴決定５０μｇ／ｍｌのカルベニシ リンを含むＭＯＰＳ培地２培地２接ｌするＩ；めに、＃２１５前培養物の残り（ 〜７５０和培養物←−物囁シーから分離した。このグラスミドル掲）を形質転換 し、１０ｍＭグリホセートおよび５０μｇ／＋ａｌカルベニシリンを含むＭＯＰ Ｓ培地上で再選択した。

ｐＭＯＮ８１８６の単一のグリホセート耐性コロニーを、選択プレートから拾い 上げ、５０μｇ／ｍｌカルベニシリンを含む２ＸＹＴ細菌培地３ｏ１に接種する ために用いた。

次いで、飽和に達するまで３７℃の回転ホイール上でこの培養物に通気し、これ をｓｏｏｍｉの大容量培養物に接種した。大容量の培養物を、水浴中で３７℃に て一晩装置することによって、飽和に達するまで増殖させた。この細菌細胞を溶 解し、その抽出物のＥＰＳＰ合成酵素活性を測定した。

とりわけ、細菌細胞のペーストを、０．９％生理食塩水で２回洗浄し、緩衝液（ ｌ　ＯＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、５ｍＭ塩酸ベンズアミジン）に懸濁して、７ ０　、３ｋｇ／ａｍ”　（１０００ｐｓｉ）でフレンチ・プレッシャー・セル（ ＦｒｅｎｃｈＰｒｅｓｓｕｒｅ　Ｃｅ１ｌ）に２回通過させた。この細胞抽出物 を、１５、ＯＯＯＸｇで５℃にて１０分間遠心することによつて細胞から分離し た。セファデックスＧ　５０（７フルマシア社、ニューシャーシー州ビス力タウ ェイ）を用いて脱塩した。この脱塩されｌ２抽出物のＥＰＳＰ合成酵素活性を以 下のように測定した。

５０ｍＭのＨＥＰＥＳ−ＫＯＨ（ｐＨ７）中にシキミ１ｉ！−３−ホスフェート （２ｍＭ　）　、”Ｃ−ホＸ　ｆ、　工／　−ルビルベート（ｌ　ｍＭ　、１　 、２　ｍｃｉ／ｍｍｏｌ）　、モリブデン酸アンモニウム（０，１ｍＭ）、フッ 化カリウム（５ｍＭ）を含むアッセイ混合物（４０μｌ）を、上記の抽出物１０ μｌに添加し、２５℃で２分間インキュベージＢンした。

この反応を、９０％エタノール５０μＩ１０．１Ｍ酢酸（ｐＨ４，５）の添加に よって浮止させた。この反応混合物７０μｌ　を、シンクロバク（Ｓｙｎｃｈｒ ｏＰａｋ）　Ａ　Ｘ　１００ＨＰＬＣカラムにかけ、ｌ　ｍｌ／ｗｉｎの流速で ０．５Ｍリン酸カリウム（ｐＨ５，５）に上りカラムから溶出させた。溶離液の 放射活性をラジオマチック・フローワン・ベータ装置（ラジオマチック社、フロ リダ州）を用いてモニターした。ＥＰＳＰ合成酵素活性は、”Ｃ−Ｐ　Ｅ　Ｐか ら”Ｃ−Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐへの転換を測定することによって判明しＩ；。その両者 は、上記のクロマトグラフィー条件下で分かれる。抽出物のタンパク質含有量は 、ブラッド７オードの方法（バイオラプス社、カリフォルニア州）によって測定 された。抽出物の比活性を、タンパク質１ｍｇ／１分間あたりで形成されるＥＰ ＳＰ合成酵素をナノモル単位で表わす。

ＥＰＳＰ合成酵素の動力学定数（ＰＥＰに対する概略のに、およびグリホセート に対する概略のにυを下記のとおりに測定した。基質に対する動力学パラメータ を、ｕＭ　−４００ＰＭ　）　、２＋ｏＭ　５３Ｐ（７）存在下（７）５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（Ｎ−［２−ヒドロキシエチル１ピペラジン−Ｎ′−［２−エタンス ルホン酸］）緩衝液（ｐ　Ｈ７、０）中で測定した。反応は、１００１１１Ｍ酢 酸ナトリウムのエタＣによって解析した。ＨＰＬＣの条件は、流速１．０ｍｌ／ ｍｉｎでシンクロバクＡＸ１００カラム上での０．３５ＭＫＰ　ｉ　（ｐＨ６， ５）であった。得られた流出速度を、双曲線プロット、ラインニーバー・パーク プロットおよびイーディー・ホ７ステープロットによってプロットし、ＰＥＰに 対する平均に、値を得た。ＰＥＰに対するグリホセートの概略のに、値を、グリ ホセート濃度変化（０゜１００．２００および４００ＰＭ）が異なる以外、基質 に対する動力学定数の場合と同様に測定した。初速度のデータを１／　［ＰＥＰ ］　：　ｌ／Ｖとしてプロットし、得られた線分の勾配を［グリホセート］に対 して再プロットした。

検定結果によって、ｐＭＯＮ８１８６プラスミドを含む細菌細胞は、タンパク質 １＋ｏｇ／１分間あたりで形成されるＥＰＳＰが２８ｎｍｏｌのＥＰＳＰ合成酵 素活性を有していることが示された。グリホセートに対する３４８μＭのに１に よって示されるように、この酵素はグリホセートに対する高度に耐性を示すもの であった。ＰＥＰに対するに、値は、４０ＰＭと測定された。ツクバネアサガオ ＥＰＳＰ合成酵素のアラニンへのグリシン（１０１）変異型は、グリホセートに 対するに＋が２０００ｕＭであって、ＰＥＰに対するに、が２００ＰＭである。

ｐ　Ｍ　ＯＮ　８１８６をコードするグリホセート耐性酵素変異型のＫ。

／に、比は７．７であり、これは、その比が１０−０であるアラニンへのグリシ ン（ｌ　Ｏｌ）変異型前駆体の値に類似している。しかし、このｐＭＯＮ８１８ ６酵素のＰＥＰに対するに、は、アラニンへのグリシン（１０１）変異型より４ 倍以上低い。高濃度のグリホセートを含むＭＯＰＳ培地中での大腸菌の増殖を促 進する能力によって示されるように、ＰＥＰに対するに、が低下するとｐＭＯＮ ８１８６酵素変異型が動力学的に一層有効に作用するようになる。これによって 、この選択系は、ツクバ不アサガオＥＰＳＰ合成酵素のアラニンへのグリシン（ １０１）変異型の突然変異誘導および同定を可能とすることが示された。なお、 この酵素は、もとの変異型のグリホセート耐性を維持するが、ＰＥＰに対するに 、を低下させることになる。ｐＭＯＮ８１８５に関する結果も、ＰＥＰに対する Ｋ。の改良は、上記の異質細菌発現系中で選択され得ることを示す。アラニンへ のグリシン（１０ｆ）置換およびアスパラギンに対するグリシン（１４４）置換 を含むツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素変異型は、ＰＥＰに対するに、が９１ ｔＩＭであって、グリホセートに対するに、が９６０ＰＭ　（Ｋ、／に、−１０ ，５）であった。

Ｇ）ｐＭＯＮ８１８６突然変異の同定 ｐＭＯＮ８１８６酵素変異型のグリホセート耐性の改細菌の発現ベクターに５′ 末端側および３″末端側の半分づつを別個にサブクローニングすること、および 各サブクローンの動力学的特性を以下のように測定することによって行われた。

ｐＭＯＮ９７６７中のツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素コード配列から得られ た６６０ｂｐのＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片を、ｐＭＯＮ８１８６から 得られた類似のＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片で置き換えた。

プラスミドｐＭＯＮ９７６７は、ＸｂａＩ部位が、ｓ位特異的突然変異によって ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素でのアラニンへのグリシン（１０１）変異型 コード配列の３′末端に創製されたｐＭＯＮ９５６６（１掲）の誘導体である。

同様に、Ｉ）ＭＯＮ９７６７中のツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素コード配列 から得られた６６０ｂｐのＨ１ｎｄｌｌｌ　−Ｃ１ａ　Ｉ断片を、ｐＭＯＮ８１ ８種した。各サブクローンの大量培養物（５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含 む２ＸＹＴ５０＋ｍｌ）は、選択プレートから拾い上げた単一コロニーより調製 された。この培養物を、３７℃の水浴中で一晩装置することによって飽和状態ま で増殖させた。ｍ胞をペレット化して溶解させた・この細菌抽出物を上記のよう に測定し、各ｐＭＯＮた。Ｅ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋領域サブクローンの コレラ動力学値は、完全なｐＭＯＮ８１８６の値に類似している一方、Ｈ１ｎｄ ｌ（１−Ｃｊａｒサブクローンノ値は、ｐＭＯＮ８１３５の値と類似していた。

したがって、ＥＭＳで誘導され、ｐＭＯＮ８１８６の優れた動力学特性の原因と なる第２の突然変異部位は、６６０ｂｐのＥｃｏＲＩ−旧ｎｄｌｌ＋断片上に位 置していた。このＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌ１１領域のサブクローンをｐＭＯ Ｎ８１９１と命名した。

ｐＭＯＮ８１８６のＥ　ｃｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌ＋の６６０ｂｐ断片の配列決 定をして、正確なヌクレオチド変化、およびｐＭＯＮ８１８６コード酵素変異型 の新しい動力学特性の原因となる対応のアミノ酸変化を決定いこ。ｐＭ。

Ｎ８１８６からの６６０　ｂ　ｐ　ＥｃｏＲｌ−Ｈ１ｎｄｌｌ＋断片を、Ｅ　ｃ ｏＲＩ　−Ｈ１ｎｄｌｌｌで切断したＭ１３ｍｐ１８およびＭ１３ｍｐ１９バク テリオ７アージのベクターＤＮＡに挿入し、これらをそれぞれＭ８０５９および Ｍ８０５８と命名した。ＪＭＩＯＩに形質転換した後、単一のプラークを拾い上 げて、１本鎖鋳型ＤＮＡをそれぞれから調製シタ（アマジャム社のプロトコル、 「Ｍ１３クローニングおよび配列決定ハンドブック」）。この鋳型ＤＮＡの配列 を、米国バイオケミカル社から市販されているＤＮＡ配列決定キットを用いて、 サンガーの方法によって決定した。アラニンへのグリシン（１０１）　１１換の 存在は、ＤＮＡ配列中で確認された。さらに、成熟ツクバネアサガオＥＰＳＰ合 成酵素中のグリシン（１４４）に対するＧＧＴコドンの２番目のヌクレオチド位 置におけるアデニンへの単一グアニン転位が生じており、その結果、１４４位で アスパラギン酸へのグリシン置換が起きていた。

アデニンへのグアニン転位は、ＥＭＳによって誘発されることが知られている突 然変異型と一致する。したがって、ｐＭＯＮ８１８６コードのグリホセート耐性 ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素変異をの改良された動力学的特性は、以下の ２つの置換の組合わせによるものである。１つの置換によってアラニンへのグリ シン（ｌ　Ｏｌ）変異が生じ、もう一つの置換によってアスパラギン酸へのグリ シン（１４４）置換が生じる。

植物細胞中で適当な発現を起こさせるために、アラニンへのグリシン（ｌ　Ｏｌ ）置換およびアスパラギン酸へのグリシン（１４４）置換を含むツクパネアサガ オＥＰ７アシエンス（ＡｇｒｏｂａｃＬｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ） での植物。

細胞の形質転換を以下に記載する。

ｐＭＯＮ９１５の構成 植物の形質転換ベクターｐＭＯＮ９１５は、ｐＭＯＮ８９５ベクター由来のもの であった。このｐ　Ｍ　ＯＮ　８９５プラスミド（図３）は、以下のＤＮＡセグ メントから構成されている。第１のセグメントは、細菌のスペクチノマイシン／ ストレプトマイシン耐性（Ｓ　ｐ　ｃ／Ｓ　ｔ　ｒ）をコードするトランスポゾ ンＴ、７から分離された処理ＥｃｏＲＶに対する０、９３ｋｂのＡｖａＩ断片で ある。

なお、これは、大腸菌およびアグロバクテリウム・ツメファシェンス中での選択 のための決定因子である。これを、形質転換された植物細胞の選択を可能とする キメラカナマイシン耐性遺伝子をコードするＤＮＡの１．６１゜ｋｂ上セグメン ト連結する。このキメラ遺伝子（Ｐ−３５／ＫＡＮ／ＮＯ３３”）は、カリフラ ワーのモザイクウィルス（ＣａＭＶ）３５Ｓプロモーター、ネオマイシンホスホ トランスフェラーゼＩＩ型（ＫＡＮ）遺伝子、ならびにツバリン合成酵素の３゛ −非翻訳および隣接領域（ＮＯ３３’　）からなる。次のセグメントは、ＲＫ２ プラスミドから得られる複製の開始点を含む０．７５ｋｂのｏｒｉ−Ｖである。

これを、ｐＢＲ３２２（ｏ　ｒ　ｉ　−３２２）の３−１　ｋｂｓａ　ｌ　Ｉ− Ｐｖｕ　ｒセグメントへ連結する。なお、これによって、大腸菌中での維持のた めの複製開始点およびアグロバクテリウム・ツメファシェンス細胞への共役転移 のｔ；めのｂｏｍ部位が提供される。ｏｒｉ−Ｖセグメントおよびｏｒｉ　３２ ２セグメントによっても、非連結ｐＴｉＴ３７−Ｃｏプラスミド中へのベクター の組換えに対する相同性がもたらされ、下記のようなバイブリドＴ−ＤＮＡの形 成に至る。次のセグメントは、ツバリン型Ｔ−ＤＮＡの右端を有する。

次いで、ｐＭＯＮ８９５プラスミドは、ンクバ不アサガオの５−エノールビルビ ルシキミ酸−３−ホスフェート合成酵素の発現用キメラ遺伝子をフードする３、 １４ｋｂのＤＮＡセグメントを含む。このキメラ遺伝子は、ケイら（１９８７年 ）によって記載されたように高性能の０．８５ｋｂのＣａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓプ ロモーター、それに続いて、アラニンへのグリシン（１０１）置換を有する。

ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素（プレＰＥＰＳＰ合成酵素：２）のための２ ｋｂのコード配列、およびβ−コングリシニン遺伝子のダイズα′サブユニー／ 　）　（７）　３　’非翻訳領域（７Ｓ　３’末端）からなる（シュラ−ら、１ ９８２年）。

プラスミドｐＭＯＮ９１５　（図４）を、３つのＤＮＡ断片から構成した。

１、Ｐ−ｅ３５Ｓプロモーター、ＳｐＣ／Ｓｔｒ遺伝子、？−３５／ＫＡＮ／Ｎ Ｏ３３’末端、ｏｒｉ−Ｖ、ｏ　ｒ　１−ＰＢＲ，および右端を含むｐＭＯＮ８ ９５から得られる７、９１ｋｂのＢｇｌＩＩ−Ｘｂａｌ断片。

２．７ラニンへのグリシン（ｌ　Ｏｌ）置換およびアスパラギン酸へのグリシン （１４４）を換を有するツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素遺伝子を含むｐＭＯ Ｎ８１９１から得られる１、２７ｋｂのＸｂａＬ−ＥｃｏＲＩ断片。

３、ツクバ不アサガオＥＰＳＰ合成酵素のクロロプラストのシグナル−ペプチド を含むｐＭＯＮ８９５から得られる０、３１ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＢｇｌＩＩ断片 。

ｐＭＯＮ９１５プラスミドをＡＣＯアグロバクテリウム株に導入した。この株は 、組込みのないｐ　Ｔ　ｉ　Ｔ　３７−ＣＯツバリン型のプラスミドを運搬する 。図５を参照にすると、Ａ２０８アグロバクテリウム・ツメファシェンス株のｐ ＴｉＴ３７プラスミドのＴ　−Ｄ　Ｎ　Ａｉｍの制限酵素切断地図が提供される 。この株は、組込みを除かれて、ＡＣＯ株を創製する。斜線の囲いは、Ｔ−ＤＮ Ａの組換えおよびｆｉｔ換に関する相同性を提示するために使われたＴ！フ゛ラ スミドＤＮＡのセグメントを示す。

このＴ−ＤＮＡセグメントを、Ｔｎ６０１細菌のカナマイシン耐性遺伝子（Ｋｎ Ｒ）セグメントで置換しｔ；。

このセグメントは、上記のベクターに相同性を示す０１ｉＶおよびｐＢＲ３２２ セグメントに連結したものである。組込みを除かれたｐＴｉＴ３７−Ｃｏとｐ　 Ｍ　ＯＮ　９１５プラスミドとの間での組換えは、ＰＢＲ３２２ｏｒＩＶの相同 領域を介して起こり、その結果、全体ｐ、、ＭＯＮ９１５ＤＮＡを含むバイブリ ドＴ−ＤＮＡが生じる。

植物細胞とともにアグロバクテリウムを培養すると、左右両端の間のバイブリド Ｔ−ＤＮＡセグメントが細胞に移入され、ゲノムＤＮＡ中に組み込まれる。

この発明の変異ｆｆ１Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ合成酵素のポリペプチドは、ＥＰＳＰ合成 酵素遺伝子のポリペプチド合成か分離および突然変異誘発のいずれかによって調 製され得る。そしが予想されるので、グリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をコー ドするヌクレオチド配列（ｃＤＮＡまたはゲノム）を、容易に以下の方法で合成 することができる。

ｃＤＮＡのフード配列 必ずしも限定はされないが、カビおよび植物組織を含む材料から全ＲＮＡを分離 する。ポリＡ　−ｍ　ＲＮ　ＡをオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーによ って選別する０次いで、ｃＤＮＡライブラリーをポリＡ−ｍＲＮＡを使って作成 する。続いて、ｃＤＮＡライブラリーを、前もってクローニングしたＥＰＳＰ合 成酵素配列または適切なオリゴヌクレオチドプローブを用いてスクリーニングす る。適切なオリゴヌクレオチドプローブには、アミノ酸配列（Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ− Ｇ−Ｔ−Ａ）を有する保存領域を基盤としたプローブ、またはＥＰＳＰ合成酵素 含まれる９次いで、バイブリド形成によって選択されるｃＤＮＡ断片の配列を決 定したところ、この断片がＥＰＳＰ合成酵素をコードすることが確認され、上記 の保存アミノ酸配列をコードし、かつこれに隣接するＤＮＡ配列を決定した。

それから、オリゴヌクレオチド突然変異誘発によってＥＰＳＰ合成酵素クローン を変化させて、上記のように第１の保存アミノ酸配列中におけるアラニンへのグ リシン置換および第２の保存アミノ酸配列中におけるアスパラギン酸へのグリシ ン置換を生じるに必要なりＮＡ置換を挿入した。上記の手法によって、選択され た材料の野生型ＥＰＳＰ合成酵素に基づくこの発明のグリホセート耐性ＥＰＳＰ 合成酵素をコードするｃＤＮＡが得られる。

この明細書に記載した方法を用いて、この構造的コード配列を機能性のキメラ遺 伝子構成体に挿入することができ、形質転換植物細胞および再生植物を作成する 上で使用の対象となる適切な植物形質転換ベクター中に挿入することができる。

ゲノムＥＰＳＰ合成酵素のクローン 一般に、形質転換の対象となる植物種の植物組織も、この発明のグリホセート耐 性ＥＰＳＰ合成酵素のＤＮＡコード配列の材料として役立つことが好ましい。こ の方法では、形質転換の対象となる植物種から得られる、クロロプラストのシグ ナルペプチドコード配列が容易に得られよう。場合によっては、内在性ＥＰＳＰ 合成酵素遺伝子に通常見られるイントロンを含む植物種からゲノム−をスクリー ニングするためにグローブを使用する以外、上記の一般的な方法も応用される。

このｃＤＮＡの作成、およびこの発明のゲノムＤＮＡグリホセート耐性ＥＰＳＰ 合成酵素構成体を説明する詳細な実施例を、以下に提示する。

ＥＰＳＰ合成酵素植物形質転換ベクターの作成■、ツクバ不アサガオＥＰＳＰ合 成酵素をコードするＣＮＡ 上記の突然変異誘発法で使用したツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素のｃＤＮＡ クローンを作成するために使用した方法を以下に記載する。他の植物材−料から 得られる野生型ＥＰＳＰ合成酵素のクローンを同様の方法で得ることができ、上 記の突然変異を部位特異的突然変異誘発によって導入することができる。

Ａ、ＭＰ４−Ｇ細胞系の創製 ＭＰ４細胞系と命名された、最初の細胞系は、ミッチェルの二倍体ツクバネアサ ガオに由来するものであった（例えば、アウスベル、１９８０年参照）。このＭ Ｐ４細胞を、ムラシゲ・スクーグ（ＭＳ）培地（ギフフ社、ニュこの期間の決定 は、培養物が飽和に達することを肉眼的見分けて行った。

約１０＋＋＋ｌの飽和懸濁培養液（約５ＸｌＯ’細胞を含む）を、０．５ｍＭの グリホセートを含むＭＳ培地５０ｍ１に移し入れた。ここでの実験ではすべて、 グリホセートの群の１％未満と推定された）を、０．５ｍＭグリホセーだ。１． ｏ＋＋＋Ｍで２回移し入れた後、生存細胞を順次、（サザン、１９７５年）によ って、約１５〜２０コピーを有することが逐−示された。これは、「遺伝子増幅 」（例えば、シムケ、１９８２年参照）と呼ばれる遺伝学的方法によるものであ る。自然突然変異はいかなる細胞の複製中にも生じるが、遺伝子増幅過程の間に ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子のいかなる突然変異または他の修飾が起きている徴候は みられない。ＭＰ４とＭＰ４−Ｇ細胞の間で唯−認められた差異は、ＭＰ４−Ｇ 細胞がＥＰＳＰ合成酵素遺伝子の複数コピーを含み、おそらく他の遺伝子は細胞 の染色体上でその遺伝子に近い位置にあるということである。

Ｂ、ＥＰＳＰ合成酵素の精製および配列決定ＭＰ　４−Ｇ細胞系から得られたツ クバネアサガオの細胞を、真空濾過によって収穫し、液体窒素下で凍結して、ワ ーリングブレングー中で粉末に砕いた。この粉末を、１ｍＭＥＤＴＡおよび７． ５％（Ｗ／ｖ）のポリビニルポリピロリドンを含む０　、　２Ｍ　Ｔｒｉｓ−Ｈ ＣＩ　（ｐ　Ｈ７。

８）中に懸濁させた。懸濁物を約２０．ＯＯＯＸｇで１０分間遠心し、細胞残渣 を障いた。核酸を０．４％の硫酸プロタミン０−１容を添加することによって上 清から沈澱させて、捨てＩ；。

この粗タンパク質懸濁物を５段階の工程で精製した［マウスダーレ（１９８０年 ）およびシュタインルツケン（１９８５年）参照１゜これらの工程には、（１） 硫酸アンモニウム沈１　（２）ジエチルアミノエチルセルロースイオン交換クロ マトグラフィー、（３）ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー、（４）フェ ニルアガロースゲル上での疎水性クロマトグラフィー、および（５）セファクリ ルＳ−２００ゲル上での分子ふるい法が含まれる。

精製されたＥＰＳＰ合成酵素ポリペプチドを、フン力ビラ−（Ｈｕｎｋａｐｉｌ ｌｅｒ、１９８３年ａ）に記載された方法を用い、モデル４７０Ａタンパク質シ ークエンサー（アプライド・バイオシステムズ社、カリフォルニア州７オスター シテイー）によるエドマン分解によって、一連の儀々のアミノ酸に分解した。各 アミノ酸誘導体を、７ンカピラー（１９８３年ｂ）に記載されたように、逆相高 速液体クロマトグラフィーによって分析した。この際、２２．０００以上の理論 段数を有するシアノプロピルカラム（ＩＢＭインスツルメンツ社、コネチカット 州ワーリングフォード）を使用した。ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素の部分 的アミノ酸配列を表１に示す。

表１ ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素の配列アミノ酸　Ｇｌｎ　Ｐｒｏ　ｌｉｅ　 Ｌｙｓ　（：ｌｕ　ｌｉｅｍＲＮＡ鎖　５’−ＣＡＰ　ＣＣＮ　ＡＵｔｌ　ＧＡ Ｐ　ＣＡＰ　ＡＵＵ相補性 ＤＮＡ１ｌＮ　３’−ＧＴＱ　ＧＧＮ　ＴＡＡ　ＴＴＱ　ＣＴＱ　ＴＡＡ合成り ＮＡ グローブ ＥＰＳＰＩ　３’−ＧＴＱ　にＧＰ　ＴＡＰ　ＴＴＱ　ＣＴＱ　ＴＡＥＰＳＰ２ 　３°−ＧＴＱ　ＧＧＱ　ＴＡＰ　ＴＴＱ　ＣＴＱ　ＴＡＥＰＳＰ３　３’−Ｇ ＴＱ　ＧＧＮ　ＴＡＴ　ＴＴＱ　ＣＴＱ　ＴＡＣ，プローブの合成 特定アミノ酸をコードし得るＤＮＡコドンを決定した。

この情報を使って、３つの異なったプローブ混合物を作成し、表１に示すように 、ＥＰＳＰ−１，ＥＰＳＰ−２およびＥＰＳＰ−３と命名した。この表で、Ａ、 Ｔ、Ｕ。

ＣおよびＧは、ヌクレオチド塩基（すなわち、アデニン、チミジン、ウラシル、 シトシンおよびグアニン）を示す。

ＰＳＱおよびＮの文字は、置き換え可能なものを示す。

Ｎは、塩基のいずれをも示し、Ｐはプリン（ＡまたはＧ）を示し、そして、Ｑは 、ピリミジン（Ｕ、ＴまたはＣ）を示す。あらゆるオリゴヌクレオチドをアダム ズの方法（１９８３年）によって合成した。ヌクレオチド位置が不確定（Ｐ、Ｑ またはＮ）となった場合は常に、適当なヌクレオチドの混合物を反応混合物に添 加した。１００５０Ｄ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７−５）に溶けたポリヌクレオ チドキナーゼｌＯ単位、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、５ｍＭ　ＤＴＴ、Ｏ，１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡｊ；よびＯ，１ｍ＆ｌスペルミジンを用いて、グローブ２０　ｐｗ ｏｌを使用直前に標識した。１時間３７℃でインキュベージコンした後、ブロー フヲ２０％アクリルアミド（８Ｍ尿素ゲル）上、またはセファＤ、ｍＲＮＡの網 製およびグローブの予備試験（ａ）ポリＡｍＲＮＡ 全ＲＮＡを、ゴールドバーブ（１９８１年）にょる記びＭＰ４−Ｇ細胞系（グリ ホセート耐性）から分離した。

さらに全ＲＮＡを、デピッヵ−（１９８２年）の記載に従って塩化セシウム法に より沈降させた。ポリＡ　ｍ　ＲＮＡを、オリゴ−ｄＴナセルースクロマトグラ フィーによって選択した。ポリＡＲＮＡの収率は、ＭＰ４細胞では細胞１ｇあた り１．１μｇであって、ＭＰ４−Ｇ細胞では細胞１ｇあたり２．５μｇであった 。

（ｂ）ＲＮＡのゲルプロセッシング アミドおよび２．２Ｍホルムアルデヒドを含むｌ　ＸＭＯＰＳ緩衝液［２０ｗＭ 　ＭＯＰＳ　（ｐＨ７−０）　、５ａｒＭ酢酸ナトリウム、オヨび１ｍＭ　ＥＤ ＴＡ　（ｐＨ８，０）］に再懸濁させた。ＲＮＡを６５℃で１Ｄ分間加熱するこ とによって変性させた。次いで、５０％グリセロール、１ｍＭ　ＥＤＴＡ、０． ４％ブロモフェノールブルーおよび０．４％キシレンシアツールを含む充填緩衝 液１１５容を添加した。ブロモフェノールブルーが底に近付くマで、１．１Ｍホ ルムアルデヒドを含む０．３％アガロースゲル上で、ＲＮＡを分画した。Ｈａｅ ｌｌｌ消化−Ｘｉ７４ＤＮＡは３２ｐで標識され、これをサイズの標準対照とし て泳動した。ＤＮＡマーカーは、ＲＮＡバンドに対するおおよそのサイズを示し ていた。

（Ｃ）ニトロセルロースフィルターへのＲＮＡの転写転写緩衝液とじｒ２ｏＸｓ ｓｃ　［１ｘＳＳＣは、０゜１５ＭＮａｃＩ、Ｏ，０１５Ｍクエン酸ナトリウム （ｐＨ７，０）である］を用いてゲルを一晩プロットすることによって、ＲＮＡ をニトロセルロースフィルター（＃ＢＡ８５、スライヒャー＆シュネル社、ニュ ーハンプシャー州ケーネ）に転写した。転写後、フィルターを風乾し、真空オー ブン中で２〜３時間８０℃で乾燥させた。

（ｄ）放射活性プローブを用いたプレハイブリダイゼーション ６ｘＳＳＣ，ＩＯＸデンハルト溶液（ＩＸＸシンルト溶液は、０．０２％フィコ ール、０．０２％ポリビニルピロリドン、０．０２％ウシ血清アルブミンである ）、０．５％ＮＰ−４０、および２００μｇ／ｍｌ大腸菌転写ＲＮＡ中で５０℃ にて４時間、フィルターをハイブリダイズした。ハイブリダイゼーシヨンは、２ ×ｌＯ・ｃｐａ＋／ｍｌのＥＰＳＰ−１またはＥＰＳＰ−２プローブを含む類似 の新鮮溶液中で３２℃にて４８時間行われた。ＥＰＳＰ−３プローブの試験は行 わなかった。それが、ツクバネアサガオゲノム中に希にしか見られないコドン（ ＡＴＡ）を含むからである。それぞれの場合に使用したハイブリダイゼーション 温度（３２℃）は、混合物で最低のＧＣ含有量を有するオリゴヌクレオチドに対 して計算されＩ；解離温度（Ｔｄ）より１０℃低かった・プローブのＴｄは、２ °ＯＸ　（Ａ＋Ｔ）＋４℃ｘ　（Ｇ十〇）の式によって概算された。

（ｅ）フィルターの洗浄 フィルターを６ＸＳＳＣ中で室温にて１５〜２０分間２回洗浄した後、ゆっくり 装置しながら３７℃で５分間洗浄した。次いで、フィルターをプラスチックフィ ルムに包み、２枚の増感板を用いて１２〜１４時間−７０℃でオートラジオグラ フィーにかけた。次いで、４２℃の温度でゆっくりｉｌ！！ｋＬながらフィルタ ーを再び５分間洗浄した。フィルターを再び１２〜１４時間オートラジオグラフ ィーにかけた。このオートラジオグラフによれば、プローブＥＰＳＰ−１は、Ｍ Ｐ４−Ｇ細胞系から得られたポＩＫＲＮＡを含むレーンにおける約１．９ｋｂの ＲＮＡとハイブリダイズしたことが示されｔ；。ＭＰ４細胞系から得られたボＭ 　ＲＮ　Ａを含むレーンでは、このＲＮＡに対するハイブリダイゼーションは検 出されなかった。この結果は、ＭＰ４−Ｇ細胞系によるＥＰＳＰ合成酵素ｍＲＮ Ａの過剰産生に起因するものであった。プローブＥＰＳＰ−２は、単一のヌクレ オチドだけでＥＰＳＰ−１とは異なっており、ＭＰ４−Ｇ細胞系の１．９ｋｂｍ ＲＮＡとはほとんど検出不可能なハイブリダイゼーマ°−六フを一カ１′ シッンｔキ４祐−メ両細胞系から得られた１、ＯｋｂのｍＲＮＡとは強くハイブ リダイズした。しかし、１．ＯｋｂのＤＮＡは、ｓｏ、ｏｏｏダルトンのポリペ プチドをコードするには不十分であり、ＥＰＳＰ−２プローブにおける配列の１ つがライブラリー中で全く異なった配る正しい配列を含むことが示唆された。こ の混合物は、すべてその後の縮退プローブハイブリダイゼーション実験に使用さ れた。

Ｅ、λｇｔｌｏｃＤＮＡライブラリーの作成（ａ）使用材料 ＡＭＶ逆転写酵素をセイガカク・アメリカ社（７０リダ州セントペテルスブルク ）から、ＤＮＡポリメラーゼエ（クレノーポリメラーゼ）の大きな断片をニュー イングランド・ヌクレア社（マサセッツ州ボストン）から、Ｓｌヌクレアーゼお よびｔ　ＲＮＡを／グマ社から、ＡｃＡ３４カラム床樹脂をＬＫＢ社（メリーラ ンド州ガータースバーグ）から、ＥｃｏＲＩ　ｓ　ＥｃｏＲＩメチラーゼおよび ＥｃｏＲＩリンカ−をニューイングランド・バイオラブズ社（マサセッツ州べべ り）から、ＲＮＡ５ｉｎ（リボヌクレアーゼ阻害剤）をプロメガ・バイオチク社 （ウイスコンシン州マディソン）から、そして、すべての放射活性化合物をアマ ジャム社（イリノイ州アーリントンＨｔｓ、）から購入した。

λｇｔｌｏベクター（ＡＴＣＣＮｏ、４０１７９）および関連の大腸菌細胞系は 、スタッフォード大学医学部のターン・７ユン氏およびロナルド・ディビス氏（ ７ユン、１９８５年参照）によって供与された。このベクターは、３つの重要な 特徴を有している。すなわち、（１）非反復ＥｃｏＲＩ挿入部位をもっており、 これによって、新しいＤＮＡを挿入する前にファージＤＮＡからＤＮＡの中心部 分を除く必要がなくなる。（２）０から約８，０００塩基サイズにあるＤＮＡは このベクターを用いてクローニングされ得る。（３）大腸菌ＭＡ　ｌ　５０細胞 （ＡＴＣＣＮｏ、５３１０４）を用いてライブラリーを処理し、ＤＮＡ挿入片を もたないクローンを除去することができる。

（ｂ）ｃＤＮＡの第１鎖の合成 ポＭｍＲＮＡを、ヤクツウ３ッ。、（２）ア記載。

たように調製し、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ（ｐＨ８，５）　、１０ｍＭＭｇＣ１＊　 、４ＤＩＭ　ＤＴＴ１４０ｍＭ　ＫＣＩ、　５００ｇＭのｄ　（ＡＧＣＴ）ＴＰ 、ｌ　Ｏμｇ／ｍｌ　ｄ　Ｔ　＋ｚ−＋ａプライマーおよび２７．５本位／ｍｌ 　ＲＮＡ　ｓ　ｉ　ｎに再懸濁した。

容量１２０μｌの反応溶液中に、５μｇのポ＋’）４　ＲＮ　Ａ＋こ対して７０ 単位の逆転写酵素を添加しｔ：。１本の反応管には、γ−”Ｐ−ｄＣＴＰ　（５ μＣｉ／１２０μ１反応溶液）が含まれ、ｃＤＮＡのサイズおよび収率のモニタ ーが可能であって、後の反応をモニターするために第１鎖を標識した。ｍＲＮＡ の２次構造を崩すために、水に溶けたｍＲＮＡを７０℃で３分間インキュベーシ ョンして、反応管を氷上で冷却した。逆転写酵素を添加して、ｃＤＮＡを４２℃ で６０分間かけて合成した。この反応を、ＥＤ　Ｔ　Ａ　ヲ５０　ｍＭまで添加 することによって停止させた。

ｃＤＮＡの収率を、反応の開始時点および６０分後に取り出した試料のＴＣＡ沈 澱によってモニターした。ｃＤＮＡ合成の後、このｃＤＮＡはｃＤＮＡ−ＲＮＡ バイブリドとして存在した。このｃＤＮＡ−ＲＮＡバイブリドを、沸騰水浴中で 混合物を１．５時間加熱することによって変性させ、氷上で冷却した。

（ｃ）第２鎖のＤＮＡの合成 １木調ｃＤＮＡを第２鎖の合成のためにセルフプライムさせた。タレノーポリメ ラーゼおよび逆転写酵素を使って、１木調ｃＤＮＡを２重鎖ｃＤＮＡに転換した 。クレノーポリメラーゼを最初に使用する。３′末端−５′末端工キソヌクレア ーゼ修復機能が、セルフプライミングによって生じた非平滑ＤＮＡ末端を消化し 得ると考えられ、続いて、ポリメラーゼ活性によって平滑末端を延長し得るから である。　−゛−°　ク レノーポリメラーゼに加えて、逆転写酵素が使用される。

それは、逆転写酵素は一度鋳型鎖に結合すると、途中で停止することが少ないと 考えられているからである。タレノーポリメラーゼ反応の最終容量は、酵素を除 いて１００μｍであった。この反応混合物は、５０ｍＭＨＥＰＥＳ　（ｐＨ６， ９）、ｌ　ＯｍＭ　Ｍ’ｇＣ１ｘ　、５０ｍＭ　ＫＣＩ、５００μＭの各ｄＮＴ ＰおよびｃＤＮＡを含んでいた。

反応を開始させるために、２０〜４０単位のタレノーポリメラーゼ（通常、５μ ｍ未満）を添加し、管を１５℃で５時間インキュページ腸ンした。反応はＥＤＴ Ａを５０ｍ１Ｍまで添加することによって停止させた。混合物をフェノールで抽 出してから、核酸を沈澱させ、遠心して乾燥した。

反相補性ＤＮＡ鎖をさらに伸長させる逆転写酵素反応を、もとからｃＤＮＡ合成 の反応として記載されたとおりに実施しｌ；が、その際、ｄＴｌ。−１８プライ マーおよびＲＮＡ５ｉｎを加えず、１２０μｌ反応溶液に溶けた３２単位の逆転 写酵素を使用した。反応はＥＤＴＡを５０ｍＭまで添加することによって停止さ せた。混合物を等量のフェノールで抽出してから、核酸を沈澱させ、遠心して乾 燥した。

（ｄ）Ｓｌヌクレアーゼ処理 ２００μｌの２ＸＳ　ｌ緩衝液（ＩＸＳＩ緩衝液は、３０ｍＭ酢酸ナトリウム（ ｐＨ４，４）　、２５０ｍＭ　ＮａＣ１％　１ｍＭＡｎｃｌ、である）、１７５ μｌの水および５２５単位のＳｌヌクレアーゼを、第２鎖の合成反応産物１２５ μｌを含む試験管に加えた。この試験管を３７℃で３０分間インキュベーション し、反応をＥＤＴＡを５０＋ａＭまで添加することによって停止させた。混合物 を等量の７エノール／クロロホルム（１：　ｌ）で抽出した。

水相をエチルエーテルで抽出して残ったフェノールを除いた。ＤＮＡをエタノー ルで沈澱させ、風乾した。

（ｅ）ＥｃｏＲＩメチル化反応 ２末鎖ｃＤＮＡが多種類のｍ　ＲＮ　Ａからコピーされたので、２末鎖ｃＤＮＡ の多くは、おそらく内部にＥｃｏＲＩ制限酵素切断部位を含んでいるはずであっ た。こういった切断部位をＥｃｏＲＩ切断から保護すること、ＥｃｏＲＩで連続 的に切断されて粘着末端を生じる平滑末端ＥｃｏＲＩリンカ−の使用を可能とす ることが望ましい。

内部のＥｃｏＲ１部位の好ましくない切断を防ぐために、２末鎖ｃＤＮＡｔＥｃ ｏＲＩメチラーゼを使ってメチル化した。ＤＮＡペレットを４０μｍの５０ｍＭ 　Ｔｒｉｓ　（ｐ　Ｈ７，５）、ＩＩｏＭＥＤＴＡ、５＋ＩＩＭ　ＤＴＴに溶解 した。１００ｇＭ５−アデノシル−Ｌ−メチオニン４■およびＥｃｏＲＩメチラ ーゼｌμｌ　（８０単位）を添加した。試験管を３７℃で１５分間、続いて７０ ℃で１０分間インキュベーションして、メチラーゼを不活化した。

その結果、上記のメチル化反応はＥＰＳＰ合成酵素フード領域中の内部部位での ＥｃｏＲＩ切断を防げないことが分かったが、これは、明らかに不活性なメチラ ーゼ試薬のためであった。この内部のＥｃｏＲＩ郁位の切断には、下記のように 、完全な長さのｃＤＮＡを分離する追加の工程が必要であった。これら追加の工 程を行わないためには、ｃＤＮＡおよび対照のＤＮＡ断片上でメチル化試薬およ び反応条件を同時に使用すべきであって、ｃＤＮＡ上で消化が行われる前に、対 照断片の保護をＥｃｏＲＩ消化によって確認しなければならない。

（ｆ）ＤＮＡポリメラーゼエの挿入反応４５μｍのｃＤＮＡ　（上記のように調 製）の試験管に、０．１Ｍ　ＭｇＣ１ｇ　、０−　２ｍＭ　ｄ　（ＡＣＧＴ）Ｔ Ｐおよび１０単位のＤＮＡポリメラーゼＩを添加した。この試験管を室温で１０ 分間インキュベーションした。反応はＥＤＴＡを２５＋ａＭまで添加することに よって停止させた。１μｇの非切断λｇ　ｔ　ｌ　０ＤＮＡをキャリヤーとして 添加し、その混合物をフェノール／クロロホルム（ｌ：１）で抽出した。混合物 中の核酸をエタノール沈澱し、遠心して乾燥した。

（ｄ）メチル化２本鎖ｃＤＮＡへのＥｃｏＲＩリンカ−の連結 約４００　ｐ＋ｎｏｌのＥｃｏＲＩリンカ−（５’　−ＣＧＣ，ＡＡＴＴＣＣＧ −３”）を、２０１１ＭのＴｒｉｓ（ｐＨ１３，０）、１０ｍＭ　ＭｇＣ５，５ ０μＣ４のγ−”Ｐ−ＡＴＰ　（５０００Ｃ４／ｍｍｏｌ）を含むｌｏｍＭＤＴ Ｔ、および２単位のＴ４ポリヌクレオチドキナーゼに溶解した。複数のオリゴヌ クレオチドを３７℃で３０分間インキュベージ□ンし、互いにアニーリングさせ たところ、２本鎖の平滑末端υ分間３７℃でインキュベーションした。これらリ ンカ−を−２０℃に保存した。メチル化ＤＮＡのベレットを、４００　ｐｆｆｌ ａｌのキナーゼ処理リンカ−を含む試験管に再懸濁した。メチル化ＤＮＡへのＥ ｃｏＲＩリンカ−の連結は、ｌｕｌのＴ４リガーゼの添加、および１２〜１４℃ で２日間の反応混合物のインキュベージ５ンによって行われた。

（ｈ）粘着末端を作成するためのＥｃｏＲＩによる消化上記のセクッション１． Ｅ、（ｇ）からの反応産物１１ＪＺＩに、５０ｍＭ　Ｔｒｉｓ　（ｐ　Ｈ７、５ ）、ｌｏ＋ｍＭ硫酸マグネシウム、２００ｍＭＮａＣ１を添加した。Ｔ４ＤＮＡ リガーゼを、７０℃ｌＯ分間のインキュベージ１ンによる加熱で不活化した。４ ０単位のＥｃｏＲＩを添加し、インキュベージ１ンを３７℃で３時間行った。反 応はＥＤＴＡを５０ｍＭまで添加することによって停止させた。

この試料を、遠心、によって清澄にし、ＡｃＡ３４カラムにかけた。

（ｉ）ＡｃＡ３４カラムクロマトグラフイー遊離のリンカ−（２本鎖ＤＮＡに連 結されなかったもの）を、リンカ−を結合させた２本鎖ＤＮＡから除去して、遊 離リンカ−が、クローニングベクター中への目的とする２本ｐ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ の挿入を干渉することを防いだ。

２１ＩＩＭクエン酸緩衝液で予備的に膨潤させたＡｃＡ３４樹脂（アクリルアミ ドとアガロースピーズの混合物）および０．０４％アジ化ナトリウム水溶液を、 ガラスウール蓋つきのｌａ＋１プラスチック製注射器に１ｍｌのマークのところ まで加えた。このカラムをｌ　Ｑ　ｗＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣ１（ｐＨ７，５）、１ ｍＭ　ＥＤＴＡ、　４００ｍＭ　Ｎ　ａ　Ｃｌで平衡化させた。連結リンカ−を 有する２末鎖ｃＤＮＡ混合物および遊離リンカ−（〜４５μｌ）を、４００ｍＭ Ｎａ　ＣＩ　Ｃ加えた。ｌμｌの０．５％ブロモフェノールブルー（Ｂ　Ｐ　Ｂ ）を添加し、試料を、室温で平衡緩衝液を流しておいたカラムにかけた。１０本 の２００ｇ１分画を集めた。一般にＢＰＢ色素は、６本目以降の試験管にカラム から溶出した。試験管ｌおよび２を一緒にして、クローニングのための２末鎖ｃ ＤＮＡの材料として使用しｔこ。

（ｊ）λｇｔｌｏクローンの構築 ２末鎖ｃＤＮＡをｌμｇのＥｃｏＲＩ切断λｇｔｌＯＤＮＡと混合し、エタノー ル沈澱させて、遠心にかけた。

ペラレットを７０％エタノールで１回洗浄した後、このＤＮＡペッレットを風乾 し、ｌ　ＯｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ　Ｈ７，５）、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣｈ　 、５０ｍＭ　ＮａＣｌの溶液４．５μｍに再懸濁した。ｃＤＮＡ挿入片をλｇｔ 　１０ＤＮＡの左右の端にアニーリングおよび連結するために、混合物を７０℃ で３分間、続いて５０℃で１５分間加熱した。この混合物を氷上で冷却し、ｌ　 Ｏ１！１Ｍ　ＡＴＰ、　Ｏ。

ＬＭ　ＤＴＴ、および少なくとも９０％までの反応が完了するに足るＴ４ＤＮＡ をそれぞれ０．５μｌ添加した。

１４℃で一晩インキユベーシコンして反応させたところ、２ｇ　ｔ　ｌ　０ＤＮ ＡのＥｃｏＲＩ部位に２末鎖ｃＤＮＡが挿入されていた。得られたＤＮＡを、シ ェラ−（１９８１年）記載の方法を用いてインビトロでファージ粒子中に（ｋ） 挿入片をもたないファージの除去ｇｔ１０７ｙ−ジ（すなわち、挿入片を有する もの）は、大腸菌ＭＡ　ｌ　５０細胞中で正常に複製する。対照的に、挿入片を もたないλｇｔｌｏファージは、大腸菌のＭＡ１５０株中で複製し得ない。これ は、挿入片をもたないλｇｔｌＯクローンを除く方法を提供する。

まずライブラリー中の７アージを、λｇｔｌＯＤＮＡを修飾してそれを大腸菌Ｍ Ａ１５０制限酵素切断系から保護した大腸菌ＣＣ６００（″Ｒ−）細胞中で複製 させた。

比較的小数の大腸菌Ｃ６００細胞を、２０倍過剰のＭＡ種した。こうして、第１ 次感染は、すべての細胞が増殖するＭ”Ｒ−細胞で生じたが、継続的な複製は、 挿入片を含まない７アージの複製を妨害するＭＡ１５０細胞で生じた。増幅され た７アージライブラリーをプレートから回収しｌ；。そして、遠心によって寒天 および他の夾雑物を除去した後、組換え７アージは、スクリーニング実験にすぐ 使用できるまでになった。

Ｆ−ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング、およびｐＭＯＮ９５３１の選択 約６００個のファージ（各プレート）を、０．７％アト上で増殖していた。ファ ージが大腸菌に感染してこれを殺傷した部分は、「プラーク」と呼ばれる透明な 領域によって確認された。このプラークは、３７℃でプレートラ−晩インキュベ ーションしｔ；後に細菌層に対して肉眼で判別されるものであった。６枚のプレ ートをこのようにして調製した。これらのプラークを、前もって切っチオいたニ トロセルロースフィルターに約３０分間押シ付けた。これによって、プラークの 対称的なレプリカが形成された。ファージＤＮＡを固定するために、このフィル ターを０．５Ｍ　ＮａＯＨおよび２．５ＭＮａＣｌ？５分間処理した。次いで、 フィルターをｌ　、　ＯＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ　（ｐ　Ｈ７、５）および２．５ １４ＮａＣ１を含む０゜真空下で２時間乾燥してから、室温で冷却させた。さら にフィルターを、セクション１．Ｄ（ｅ）で記載したように、３２Ｐ−標識ＥＰ ＳＰ−１プローブ（２ＸｌＯ・ｃｐｍ／フィルター）を用いてハイブリダイズし た。ハイブリダイゼーションの４８時間後、フィルターを６×ＳＳＣ中で室温に て２０分間２回、統いて３７°Ｃで５分間洗浄した。これらの洗浄によって、非 特異的結合プローブ分子は除去される一方、正確に対応する配列（この時点では ジオグラフィーによって解析した。最初のスクリーニング工程の後、陽性を示す ７個のハイブリダイズシグナルがオートラジオグラム上に黒いスポットとして現 れた。

これらのプレートを上記の方法を用いてスクリーニングした。陽性を示す４個の ハイブリダイズ７アージを選択した。ＤＮＡを、これら４個のクローンのそれぞ れから分離し、ＥｃｏＲＩで消化して、ｃＤＮＡの挿入片のサイズを測定した。

最大のｃＤＮＡ挿入片（約３３０　ｂ　ｐ）を含むクローンを選択し、λＥ３と 命名した。λＥ３からのｃＤＮＡ挿入片をプラスミドｐＵＣ９（ビエイラ、１９ ８１年）に挿入し、得られたプラスミドをｐＭＯＮ９５３１と命名した。

よって挿入片をｐＭＯＮ９５３１クローンから除去しｊ；。

次いで、このＤＮＡ断片の配列を、マキサムの化学分解法（１９７７年）によっ て決定した。このヌクレオチド配列から推測されるアミノ酸配列は、表１に示す ＥＰＳＰ合成酵素の部分的アミノ酸配列に相当していた。

Ｇ、λＦ７ゲノムＤＮＡクローンの作成ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子全体を得るため に、ＭＰ４−Ｇ細胞系からの染色体ＤＮＡをＢａｍＨＩで消化して７アージベク ターにクローニングし、ライブラリーを作成した。これを、プローブとしてｐＭ ＯＮ９５３１からのＥＦ’ＳＰ合成酵素の部分的配列を用いてスクリーニングし た。

（ａ）ＭＰ４−Ｇ染色体ＤＮＡ断片の調製ＭＰ４−Ｇ細胞を凍結させ、液体窒素 の存在下、圧縮ガラスを用いて乳鉢中で凍結細胞を粉末化した。粉末細胞を、８ ．０Ｍ尿素、０．３５Ｍ　ＮａＣ１，０，０５ＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５ ）　、０．０２Ｍ　ＥＤＴＡ、２％サルコシルおよび５％フェノールを含む８　 ｍ１７ｇの冷溶解緩衝液と混合した。混合物をガラス棒を用いて撹拌し、大きな 塊をほぐした。５％イソアミルアルコールを含む、等量のフェノール／クロロホ ルム（３：１）６１物を添加した。ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）　を、最 終濃度が０．５％となるまで添加した。この混合物を、室温で１０〜１５分間回 転板上で装置させた。６．００ＱＸｇで１５分間の遠心によって相を分離させた 。フェノール／クロロホルム抽出を繰り返した。酢酸ナトリウムを、最終濃度が Ｏ，１５Ｍに達するまで水相に添加し、ＤＮＡをエタノールで沈澱させた。この ＤＮＡを遠心によって回収し、Ｉ　ＸＴＥ　［１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ　（ ｐＨ８゜０）、１ｍＭＥＤＴＡ］中に溶解し、ＣｓＣｌ−臭化エチジウムの密度 勾配中でバンドに分けｔ；。ＤＮＡを、１６番ゲージ針でチューブの側面を穿刺 することによって回収した。臭化エチジウムを、ＣｓＣ１−飽和インプロパノー ルで抽出して、ＤＮＡをｌ　ＸＴＨに対して徹底的に透析した。細胞１２ｇから 約４００μｇのＤＮＡを分離した。

ＭＰ４−Ｇの染色体ＤＮＡ（ＩＱμｇ）を、３７℃で２時間、１０ｍＭ　Ｔｒｉ ｓ　（ｐ　Ｈ７，８）、１ｍＭＤＴＴ。

１０＋ａＭ　ＭｇＣＩｚ　、５０ｍＭ　Ｎａ　ＣＩ　ヲ含ｔａｌｉｌ液ｉ−溶け た３０単位のＢａｍＨＩで完全に消化した。このＤＮＡをフェノールで抽出した 後、クロロポルムで抽出して、エタノール沈澱した。ＤＮＡ断片をｌ　ＸＴＥ中 に０．５μｇ／μｌの濃度で懸濁した。

（ｂ）ＭＰ４−Ｇの染色体ＤＮＡ断片の２ＭＧ１４中へのクローニング ファージλＭＧ１４［ワシントン大学医学部（ミズリー州セントルイス）のメイ ナードオルソン博士より供与）からのＤＮＡを、マニアチス記載（１９８２年） の方法によって調製した。１５０ｇｇのＤＮＡを、ｌＯｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ（ ｐＨ７，８）、１ｍＭ　ＤＴＴ、ｌ　ＯｍＭ　ＭｇＣ１ｚ　、５０ｍＭ　Ｎ　ａ 　Ｃ１を含む緩衝液に溶けたＢａｍＨＩで完全に消化した。消化の完了は、０． ５％アガロースゲルによる電気泳動によって調べられた。次いで、ファージＤＮ Ａを、フェノール／クロロホルム／イソアミルアの濃度で再懸濁した。ＭｇＣ１ ，をｌｏｍＭになるまで添加し、４２℃で１時間インキュベージコンして、λＤ ＮＡの粘着末端に再アニーリングさせた。アニーリングは、アガロースゲル電気 泳動によって調べられた。

アニーリングの後、ＤＮＡを層に分離したが、これは、ペックマン５Ｗ２７超遠 心管中で３８＋ｅｌ（１０〜４０％Ｗ／Ｖ）のショ糖密度勾配をかけて行った。

密度勾配溶液は、ＬＭ　ＮａＣＩ、２０＋ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ８，０ ）、５ｍＭＥＤＴＡを含む緩衝液中で調製された。試料をベックマンＳＷ２７０ −グーにかけて１５℃にて２４時間２６．０ＯＯｒｐＩ１１で遠心した。分画（ ０，５ｍ１）を遠心管の頂上から採取し、ゲル電気泳動によってＤＮＡの有無に 関して分画を分析した。アニーリングされたλＤＮＡの左右の端を含む分画を一 緒にし、ＴＨに対して透析して、エタノール沈澱させた。この沈澱物を７０％エ タノールで洗浄し、乾燥した。ＤＮＡを５００μｇ／＋ｓ　ｌの濃度でＴＥに溶 解した。

上記ベクターの精製端とＭＰ４−Ｃ，ＤＮＡのＢａｓ＋ＨＩ断片とをモル比４： ｌおよび２：ｌで混合し、６６ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣＩ　（ｐＨ７，５）　、５ｄ 　ＭｇＣ１ｇ　、５ｍＭ　ＤＴＴおよび１ｍＭＡＴＰを含むリガーゼ緩衝液中の Ｔ４ＤＮＡリガーゼによって連結した。連結は１５℃で一晩行われ、これをアガ ロースゲル電気泳動によって調べた。

ＭＰ４−ＧＤＮＡの挿入片を有する連結ファージＤＮＡを、市販のバッケイジン グ抽出物（プロメガ・バイオチク社、ウィスコンシン州マディソン）を用いて、 インビトロで７アージキヤグシド中にパッケイジングした。バッケイジング７ア ージを、大腸菌ｃ６００細胞を用いてｌグレートあたり約６０００プラーク密度 で、０．７％アションした後、プラークが形成されたので、プレートをインキュ ベーターから取り出し、少なくとも１時間４℃で冷却した。寒天プレートを３０ 分間ニトロセルロースフィルターに押し付け、ファージをフィルターに転写して 、このファージＤＮＡを上記のとおり７アージに固定した。各フィルターを、マ ニアチス（１９８２年）記載の方法に従ってｐＭＯＮ９５３１　（切断修復で標 識されたもの）クローンから分離された３３０ｂｐのｃＤＮＡ挿入片約１．　Ｑ ｘ　ｌ　Ｏ’ｃｐｍ／フィルターと４０時間４２℃でハイブリダイズした。この プローブの比活性は、２−３　Ｘ　Ｉ　Ｏ’ｃｐｍ／ＩμｇＤＮＡであった。ハ イブリダイゼーションを、５０％ホルム声、５ｘｓｓｃ、ｓ×デンハルト溶液、 ２００μｇ／ｍ　１のｔ　ＲＮＡおよびＯ１１％ＳＤＳを含む溶液中で実施した 。フィルターを、５０℃にて１ＸＳＳＣ，０，２％ＳＤＳ中で洗浄し、オートラ ジオグラフィーにかけた。数種の陽性シグナルが認められたが、これらを対応の プレート上でプラークと合わせて比べた。選択されたプラークをプレートから分 離ナルを示すまで、このレプリカプレートのスクリーニング工程を低密度で繰り 返した。さらに分析を行うために１つの分離物を選択し、これをλＦ７と命名し た。

Ｈ，ｐＭＯＮ９５４３おＪ：びｐＭＯＮ９５５６１７）調製λＦ７かものＤＮＡ を、ＢａｍＨｌ、Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩ％ＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄｌｌｌ（別偏に ）消化した。このＤＮＡを、ｐＭＯＮ９５３１から得られ、切断修復で標識され たＥＰＳＰ合成酵素配列とサザン法を用いてハイブリダイゼーションした。この 実験から得られた結果は、λＦ７からの相補配列が４．８ｋｂのＢｇｌｌｌ断片 上にあったことを示していた。この断片をプラスミドｐＵＣ９（ビエラ、１９８ ２年）中に挿入し、複製させ、切断修復で標識して、ツクバネアサガオのｃＤＮ Ａライブラリーを検索するために使用した。この際、セクシ２ン１　、　（Ｇ） に記載されているようなハイブリダイゼーション条件を用いた。λＦ７配列と結 合する配列を有するｃＤＮＡクローンを同定し、ｐＭＯＮ９５４３と命名した。

ＤＮＡ配列の分析（マキサム、１９７７年）によれば、ｐＭＯＮ９５４３が停止 コドンまたはＥＰＳＰ合成酵素遺伝子の３′末端非翻訳領域を含まないことが示 された。

したがって、ＥＰＳＰ合成酵素配列を、ｐＭＯＮ９５４３から取り出し、切断修 復で標識して、再びｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするためのグローブ として使用した。ＥＰＳＰ合成酵素配列とハイブリダイズするクローンを同定し 、これをｐＭＯＮ９５５６と命名しＩ；。

ＤＮＡ配列の分析によれば、この挿入片は、ポリアデニレート化末端など、ＥＰ ＳＰ合成酵素遺伝子の全３′末端領域を含むことが示された。この挿入片の５’ ＥｃｏＲ素配列を、ｐＭＯＮ９５３１およびｐＭＯＮ９５５６から得られたＥＰ ＳＰ合成酵素挿入片同士を連結することによって作成した。

１、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子を有するｐＭＯＮ５４６ベクター の作成 ｐＭＯＮ９５３１へのＥＰＳＰ合成酵素挿入片を、Ｍ１３ベクター（メリック、 １９８１年および１９８２年）を用いた部位特異的突然変異誘発（シラーら、１ ９８３年）によって修飾し、ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子の５′非翻訳末端領域にＢ ｇ１１１部位を創製し乙。修飾ＥＰＳＰ合成酵素配列を、ＥｃｏＲＩおよび１３ ｇ１ｌ＋消化によって分離し、アグロバクテリウムに基づく植物形質転換用のバ イナリベクターであるｐＭＯＮ５３０ベクターに挿入し、ｐＭＯＮ５３６を得た 。次いで、ｐＭＯＮ９５５６から得られた１、６２ｋｂのＥｃｏＲＩ−ＥｃｏＲ Ｉ断片を、ｐＭＯＮ５３６中に挿入し、ｐＭＯＮ５４６を得た。ｐＭＯＮ５３０ は、Ｂｇｌ１１部位に隣接してカリフラワーモザイクウィルス（ＣａＭＶ）から 得られた３５Ｓプロモーターをすでに含んでいたので、これがｐ　Ｍ　ＯＮ　５ ４６中でキメラのＣａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ　／　Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ合成酵素遺伝子 を創製していた。

３５５ＮｏＳカセツトを運搬するｐＭＯＮ５０５（７）誘導体であるｐＭＯＮ５ ３０を、以下の通りに作成した。

Ａｌｕｌ（ｎ　７１４３）−ＥｃｏＲＩ（ｎ　７５１７）断片トシテ、Ｃａ　Ｍ 　Ｖ　３５　ＳプロモーターをＭＰ４−．１８４のｐＯ３−１クローンから分離 した。なお、この断片は、最初にＢａｍＨＩで切断されたｐＢＲ３２２に挿入さ れ、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノー断片で処理されてから、ＥｃｏＲＩで切断 されたものであった。次いで、プロモーター断片をＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ を使ってｐＢＲ３２２から切りだし、クレノーポリメラーゼで処理し、Ｍ１３ｍ ｐ８のＳｍａＩ部位に挿入した結果、ｍｐ４１（ガードナーら、１９８１年）の 配列を指す。次いで、部位特異的突然変異を利用して、ヌクレオチド７４６４に Ｇを導入し、Ｂｇ１１１部位を作成しＩ；。続いて、ＣａＭＶ３５Ｓプロモータ ー断片をＣａＭＶ３５Ｓプロモーターを含む３３０ｂｐのＥｃｏＲＩ−Ｂｇｌｌ ＋断片としてＨ１３から切りだしたが、翻訳開始部位および非翻訳リーダー５′ 末端の３０個のヌクレオチドは、いかなるＣ　ａ　Ｍ　Ｖ翻訳イニシエーターも 、翻訳の開始点から下レージ運ンシグナルも含んでいなかった（フンベイら、１ ９８１年；ギレイら、１９８２年）。このＣａ　Ｍ　Ｖ　３５Ｓプロモ一ター断 片を合成マルチリンカ−およびＮ。

Ｓ３’末端非翻訳領域ニ連結し、ｐＭＯＮ２００　（７ラレイら、１９８５年； ロジャーら、１９８６年）に挿入して、ｐＭＯＮ３１６（ロジャーら、１９８７ 年）を得た。

プラスミドｐＭＯＮ３１６は、５′末端リーダーとＮＯＳポリアゾニレ−ジョン シグナルとの間に位置する、Ｂｇｌ目、Ｃ１ａ１．Ｋｐｎ１％ＸｈｏｌおよびＥ ｃｏＲＩの非反復切断部位を含む。プラスミドｐＭＯＮ３１６は、ｐＭＯＮ２０ ０の特性のすべてを保持している。ＣａＭＶ３５ｓプロモーター、マルチリンカ −およびＮ○Ｓ３’末端セグメントの完全な配列は、ロジャーら（１９８７年） によって記載されている。この配列は、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターセグメント の５°末端に位置するＥｃｏＲ１部位を除去するクレノーポリメラーゼ処理によ って生じるＸｍｎＩ部位から始まる。

プラスミドｐＭＯＮ５３０　（＋１７ジヤーら、１９８７年）は、ｐＭＯＮ３１ ６のＳ　ｔ　ｕ　ｌ−Ｈ４ｎｄｌｌ＋断片（２，３ｋｂ）のｐＭＯＮ５２５への 移入によって作成された。

ＭＯＮ５０５の誘導体である。プラスミドｉ／ｌ０Ｎ５２６はｐＭＯＮ５０５の 単純な誘導体であって、そこでは、Ｓｍａ　１部位がＸｍａｌでの消化、タレノ ーポリメラーゼでの処理および連結によって除去されている。プラスミドｐＭＯ Ｎ５３０は、ｐＭＯＮ５０５の特性オヨびＣａＭＶ３５Ｓ−ＮＯ３発現カセット のすべてを保持しており、プロモーターとポリアデニレーシａンシグナルとの間 におけるＳｍａ　Ｉの非反復切断部位を含んでいる。

バイナリベクターｐＭＯＮ５０５は、ｐＭＯＮ２００の誘導体であって、そこで は、Ｔｉプラスミドの相同領域（Ｌ　Ｉ　Ｈ）が、ミニＲＫ２プラスミドｐ　Ｔ 　Ｊ　Ｓ　７５における、Ｓｍａ　Ｉへの３．８ｋｂのＨｉｎｄｌｌ！セグメン トで置換されている（シュミットハウザーおよびヘリンスキー、１９８５年）。

このセグメントは、トリバレンタル対合法（ホルシュおよびクニー、１９８６年 ）を用いてアグロバクテリウムへ接合するための複製起点ＲＫ２　。

（ｏ　ｒ　ｉ　Ｖ）およびトランスファー起点（ｏ　ｒ　ｉ　Ｔ）を含む。

図６を参照すると、プラスミドｐＭＯＮ５０５は、目的とするＤＮＡ断片挿入用 の合成マルチリンカ−１形質転換植物中での選択用のキメラＮ０３−ＮＰＴＩ　 Ｉ’　−ＮＯＳカナマイシン耐性決定因子、大腸菌およびＡ、ツメファシェンス での選択用ストレプトマイシン／スペクチノマイシン遺伝子、子孫の形質転換体 および遺伝を容易に記録するための完全なツバリン合成遺伝子、ならびに大腸菌 中で大量のベクター作成を容易にするためのｐＢＲ３２２複製開始点を含むｐＭ ＯＮ２００の重要な特徴のすべてを保持している。グラスミドｐＭＯＮ５０５は 、ｐＴｉＴ３７ノパリン型Ｔ−ＤＮＡの右端に由来する単一のＴ−ＤＮＡ端を含 む。サチン法分析によれば、プラスミドｐＭＯＮ５０５およびそれを有するいか なるＤＮＡも植物ゲノムに組み込まれること、すなわち、全プラスミドが植物ゲ ノムに挿入されるＴ−ＤＮＡであることが示された。組み込まれたＤＮＡの一端 は、右端配列とツバリン合成酵素との間に位置しており、他端は、その端の配列 とｐＢＲ３２２配列との間に位置する。

プラスミドｐＭＯＮ５４６は、（１）ＣａＭＶ３５Ｓ／Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ合成酵素 遺伝子、（２）カナマイシン耐性（Ｋａｎ”）のための選択可能なマーカー遺伝 子、（３）記録可能なマーカーとしてのツバリン合成酵素（ＮＯ９）遺伝子、お よび（４）Ｔ−ＤＮＡの右端を含むものであった。そして、これによって、「転 写ＤＮＡＪ　（Ｔ−ＤＮＡ）としてＡ、ツメ７７シエンス細胞によって処理され るべき全プラスミドが効果的に生じた。

このプラスミドを、ヘルパープラスミドのｐＧＶ３１１１−、Ｓ　Ｅを含むＡ、 ツメファシェンス細胞中に挿入した。ヘルパープラスミドは、植物細胞の染色体 に挿入されるはずのｐＭＯＮ５４ＢからのＤＮＡを生じるに十分なある種の酵素 をフードする。また、これは、細菌中で機能するカナマイシン耐性遺伝子を含む 。

ｐＭＯＮ５４６ｊ５Ｊ：びｐＧＶ３１１１−３Ｅを含むＡ。

ツメファシェンスの培養物は、アメリカン・タイプ・力これらプラスミドのいず れか１つを、標準法を用いて細胞培養物から分離することができる。例えば、こ れらの細胞を、ｐＲＫ２０１３　（ディツタ、１９８０年）などの移動プラスミ ドを含む大腸菌細胞とともに培養することもできる。Ｓｐｃ／Ｓｔｒ”・Ｋａ　 ｎ’となる細胞はｐＭＯＮ５４６を含み、Ｋａ　ｎ”　Ｓ　ｐ　ｃ／Ｓ　ｔ　ｒ ”となる細胞はｐＧＶ３１１１−３Ｅを含むであろう。

グリホセート耐性のツクバネアサガオ植物直径６ｍｍ（１／４インチ）の円盤状 の葉肉を、表面を殺菌したツクバネアサガオの葉から切り出した。傷のついた表 面で部分的な細胞壁形成を促進させるために、ＭＳ１０４寒天培地上で２日間こ れらを培養した。次いで、これら円盤状の葉を、２８℃にてシリア肉汁中で一晩 増殖すセタ、ｐＭＯＮ５４６おＪ：びＧＶ３１１１−５Ｅを含むＡ、ツメファシ ェンス細胞の培養物に浸漬し、ゆっこｌ タバコの細胞の「栄養」培養物上で置いた濾紙に対）−七′裏返してインキュベ ーションした。２または３日後、円盤状の業を、５００μｇ／ｍｌのカルベニシ リンおよびｏｌｏ、ｌ、０．２５または０．５ｍＭグリホセート（ナトリウム塩 ）入りのＭＳ培地を含む（栄養培養物は含まれない）シャーレに移した。

対照組織を、ヘルパープラスミドｐＧＶ３１１１−Ｅおよび異なった植物形質転 換ベクター（ｐＭＯＮ５０５）を含むＡ、ツメファシェンス細胞を用いて調製し た。なお、このベクターは、ＮＯ３／ＮＰＴＩ　Ｉ／ＮＯｓカナマイシン耐性遺 伝子およびｐＭＯＮ５４６と同一のＮ。

Ｓ選択可能なマーカー遺伝子を含むが、Ｃａ　Ｍ　Ｖ　３５　Ｓ／ＥＰＳＰ合成 酵素遺伝子は含まれない。

グリホセートを含む培地に移して１０日後に、活発に増殖するカルス組織が、グ リホセートを含まない対照プレート上のすべての円盤状葉の周辺に現れた。０９ １ｍＭグリホセートを含む培地上で、対照の円盤状葉と形質転換組織との間に検 出可能な差異はほとんど認められなかった。０．２５ｍＭグリホセートでは、対 照の円盤状葉からのカルス増殖はほぼ全く認められなかったが、形質転換組織の 実質的な増殖が生じた。０．５ｍＭグリホセートでは、対照の円盤状葉からのカ ルス増殖は全く認められなかったが、形質転換した円盤状葉からは有意な数のカ ルスが増殖した。このことによって、ＣａＭＶ３５Ｓ／ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子 が形質転換細胞にグリホセート耐性を付与することが確認された。　。

形質転換されたツクバネアサガオの植物体は、ホルシュら（１９８５年）の記載 する方法に従って、上記の形質転換円盤状集からの再生によって生じた。得られ た形質転換植物体は、上記のｐＭＯＮ５４６ベクターを含んでいた。このベクタ ーには、野生型ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素遺伝子に融合したＣａＭＶ３ ５Ｓプロモーターが含まれている。

４つのそれぞれ代表的な形質転換苗木を選択し増殖せて、４つの非形質転換（野 生型）ツクバネアサガオの苗木とともに、下記の試験法で試験した。

１日あたり１２時間の光を当て、２６℃で増殖チャンバーに入った増殖培地中で 増殖させた。これら植物体は、毎週水溶性の肥料を与え、必要に応じて水も与え た。植物体には、自動トラック噴霧器を使って、均一で再現性のある噴霧率で陳 草剤を噴霧した。使用したグリホセートを、１ニーカーあたりグリホセートの酸 等個物のポンド数として測定した。これら等個物を、グリホセートのイソプロピ ルアミン塩としてイオン性界面活性剤と混合した。

４つの別個の野生型（非形質転換）ツクバネアサガオ植物体を、対照植物体とし て使用するために選択した。

４つの別個の形質転換植物体は、ホルシュら（１９８５年）が記載したように、 カナマイシン耐性に基づいて選択された。

対照植物体および形質転換植物体に、下記の表２に示した適用レベルでグリホセ ートのイソプロピルアミン塩を噴霧した。この実験の結果も表２に総括する。

表２ グリホセート噴霧に対する植物の応答 植物型　グリホセート用量本　外観 り 対照　０．８７９ｋｇ／ヘクタール　完全に死滅。

（０，８１／ニーカー）　植物体は非常に急速な葉緑体破壊および 白色化を示し、枯死 した。

キメ２　０．８７９ｋｇ／ヘクタール　よく成長し、Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｐ　（０，８ ＃／ニーカー）　正常な形態で増殖する新案で若干の 葉緑体破壊を示すが、 植物体は正常な外観 を晶し、開花した。

本酸当量　１野生塁植物または対照ベクター（＄）ＭＯＮ、５０５）で形質転換 した植物 表２に示すように、対照の植物体は、グリホセートを０．８９７ｋｇ／ヘク９− ル（０，８ボンド／−１−−１−）で噴霧した場合、枯死した。対照的に、形質 転換されたツクバネアサガオの植物体は、０．８９７ｋｇ／ヘクタ−ル（０，８ ボンド／ニーカー）の噴霧後、正常で生気を帯びていた。形質転換植物体は、非 形質転換植物体よグリホセート耐性ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素ツクバネ アサガオＥＰＳＰ合成酵素でアラニンへのグリシン（ｌ　Ｏｌ）変異型を運搬す る植物の形質転換ベクターを以下のような方法で調製した。

プラスミドｐＭＯＮ５３０をＢｇｌｌ＋およびＣ１ａＩで消化し、これに、ｐＭ ＯＮ５３６から得られた３３０ｂｐのＢ　ｇ　１．＋１−ＥｃｏＲＩ　Ｅ　Ｐ　 Ｓ　Ｐ合成酵素５′末端断片およびｐＭＯＮ９５６６からの精製された１、４ｋ ｂのＥｃｏＲＩ　−ＣＩ　ａ　Ｉ　ＥＰＳＰ合成酵素３′末端断片を添加してか ら、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで処理した。形質転換した後、ＣａＭＶ３５Ｓプロモー ターに隣接し、完全なアラニンへのグリシン（１０１）変異型のツクバネアサガ オＥＰＳＰ合成酵素コード配列（クロロプラストのシグナルペプチドのコード配 列を有する）を運搬するプラスミドを分離した。このプラスミドを、ｐＭＯＮ５ ６７と命名した。プラスミドｐＭＯＮ５６７を、ヘルパープラスミド（７）ｐＧ Ｖ３１１１−３Ｅを含むＡ、　ツメファシェンス細胞に挿入した。

ｐＭＯＮ５６７／ｐＧＶ３１１１−５Ｅを含むＡ、ツメファシェンスの培養物を 、ホルシュ（１９８５年）が記載したように、タバコ植物体（Ｎｉｃｏｔｉａｎ ａ　ｔｏｂａｃａｍ　ＣＶＨ４２５）から得た円盤状葉と接触させた。このアグ ロバクテリウム細胞は、変位型ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子を植物細胞の染色体に挿 入させた。ホルシュ（１９８７年）の方法によって、カナマイシンに耐性の植物 細胞を選択して、分化した植物中で再生させた。

これら植物の子孫を、ロゼツトの直径が約１０ｃｍになるまで繁殖および増殖さ せた。これは、約４適齢の植物に相当する。植物体に、０．４４８ｋｇ／ヘクタ ール、２．２４２ｋｇ／ヘクタールおよび４．０３５ｋｇ／ヘクタール（０，４ ，２，０および３．６ボンド酸当量／ニーカー）。形質転換植物に対するグリホ セートの効果を、７．８および２８日目に記録した。この効果を、ｌから１０の 数字で表した。ここで、０は全枯死を示し、ｌＯは正常の未噴霧植物を示す、以 下のデータから、グリホセート耐性のツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素遺伝子 で形質転換されたタバコ植物体が、これら高レベルのグリホセートに対しても実 質的な耐性を示すことが分かる。

これらの値は、野生ｆｆ１Ｅ　Ｐ　Ｓ　Ｆ’合成酵素とグリホセート耐性ＥＰＳ Ｐ合成酵素の両遺伝子に関する最良の形質転換体を示す。

表３ グリホセートの相対効果１ Ｆｉ数ｋｇ／ヘクタール（ポンド／ニーカー）０．４８８（０，４）　２．２４ ２（２，０）　４．０３５（３，６）ＧＴ”　ＷＴ’　ＧＴ　ＷＴ　ＧＴ　ＷＴ ７　Ｂ、０　６．０　８．０　５．０　５．０　５−０１４　８．０　７．０　 ８．３　１８　７．４　１．７２８　９．０　９．０　７．ＯＯ，８７，００， ８１０は全枯死を、ｌＯは無効を示す。

２グリホセ一ト耐性ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素１野生型ＥＰＳＰ合成酵 素 ！＋、）マドのＥＰＳＰ合成酵素ｃＤＮＡクローン相補性ＤＮＡ　（ｃＤＮＡ） ライブラリーを、ポリＡ１および７ユンら（１９８５年）およびグブラーら（１ ９８３年）の方法の改良法によって、成熟トマトの雌しべおよび朽から分離した ＲＮＡより作成した。

するために使用されたものである。朽のｃＤＮＡライブ５０％エタノールに溶け た４００μｇ／＋１のアクチノマイシンＤ（シグマ・ケミカル社）１０μＩをサ バント（ＳＢｖａｎＬ）の急速真空器において各反応管中で乾燥した。

以下の試薬をこの管に添加した（試薬を列挙した順に添加した）。

容量　物質　最終濃度／量 ６２μｌ　高圧滅菌水　最終１００μｌまで１０μｌ　１．ＯＸ第１鎖緩衝液　 以下参照ｌＯμｍ　５ｍＭ　ｄＮＴＰ　Ａ、　Ｃ，Ｇ、　Ｔ”各５００１１１Ｏ μ１１００μｇ／ｍｌ　オリゴｐ（ｄＴ）　１ｕｇ　’２１　ＲＮＡ５ｉｎ（３ ０単位／ｇｌ）　６０単位１２μｌ　ＲＮＡ　〜ｌ−５μｇ ３μｌ　逆転写酵素　４０単位条 Ｉｇ！　３”　Ｐ　−ｄＣＴＰ　２０ｕＣｉ　’１シグマ社（ミズリー州セント ルイス）２コラポラテイブ・リサーチ社（マサセッツ州レキシントン） ３プロメガ・バイオチク社（ウィスコンシン州マジソン）６　ライフサイエンス 社（フロリダ州セントペータースパーグ） １　アマジャム社（イリノイ州アーリントンハイツ）この反応混合物を４２℃で ６０分間インキュベーションした。この反応混合物をドライアイス上で凍結させ 、−２０℃で保存した。

１０Ｘ第１ＩＩＩＩ緩衝液 ５００ｍＭ　Ｔｒ　ｉ　５−ＨＣ１（ｐＨ８−３）３００ｍＭ　Ｋ　Ｃ１ １００ｍＭ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ　２ ４ｍＭジチオスレイトール（ＤＴＴ） 合成されたｃＤＮＡ量は、トリクロロ酢酸を用いた反応部分の沈澱、およびシン チレーシジン計測によって測定し、〜１．３１Ｊ１ｇであることが明らかにされ た。

第１鎖の精製 １’ｏｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ／　１ｍＭ　ＥＤＴＡ　（ｐＨ８、０）（ＴＥ） 中で予備的に膨潤させたバイオゲルＰ６０（１００〜２００メツシユ、バイオラ ド社、カリフォルニア州すッチモンド）を、シリコン処理ガラスクールで栓をし たシリコン製パスツールピペットのカラムに注ぎ入れた（ベッド容−１ｕｌｌ） 。このカラムを、数容のｌ＋ａｌＪＴｒｉｓ（ｐＨ７，６）１０．Ｏ１ｍＭ　Ｅ ＤＴＡで洗浄した。

このカラムに同一溶液９０μｌ十カラムマーカー緩衝液ｌＯμｍ　（以下参照） を上から流すことによって校正した。排除体積を、青色色素を含む分画によって 測定した。

さらに多量の緩衝液をカラムに流して、赤色色素を溶出させた。

第１鎖の反応物を当量のフェノールで２回抽出した。

２％ブロモフェノールブルー０．５μｍ　をｃＤＮＡに添加し、これをカラムに かけ、排除体積を集めた。

カラムマーカー緩衝液 ５％ブルーデキストラン（２Ｍダルトン、シグマ社）、２Ｃ１ａＭＴｒｉｓ　（ ｐＨ７〜８）／ｌ＋ｓＭＥＤＴＡに溶解した０、０５％フェノールレッド（また は０．１％のブロモフェノールブルー） 第２鎖合成およびメチル化 第１鎖を、サバントの高速真空装置で約１０μｌまで乾燥させた。

容積　物質　初濃度／量 ３、ｈｌ　ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　−５００ｎｇの第１鎖１０μｌ　ＩＯＸ第２鎖緩衝 液　ｌ× ０．８μｌ　５ｍＭｄＮＴＰ　４０℃Ｍのそれぞれ８１．５μｍ水　１００μｌ の最終容積 ２μｌ　ＤＮＡポリメラーゼ１２０単位（ＮＥＢ） ０．４μｍ　大腸菌ＤＮＡリガーゼ２単位（ＮＥＢ） ０．５μＩ　ＲＮＡアーゼＨ（ＢＲＬ）１単位３μｌ　３２Ｐ　ｄＣＴＰ　３０ μＣｉ１μＩ　ＢＳＡ　５０℃ｇ／ｍ１ （ＢＲＬの１：１０希釈液） ＮＥＢ−ニューイングランド・バイオラブズ社、マサセッツ州ペルベリ ＢＲＬ−ベセスダリサーチ・ラブズ社、メリーランド州ガータースバーグ 反応物を、１４℃で６０分間、続いて、室温で６００分間インキュページンした 。

以下の物質を添加した。

５＋ａＭのｄＮＴＰＯ，５μ１ Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼ（ＮＥＢ）ｌμ１反応物を、室温で３０分間インキュベ ーションした。

以下の物質を添加した。

１．２μｌ−１Ｉｌ！ＭＳ−アデノシルし一メチオニン（シグマ社）１２℃Ｍｉ 、ｏｕｔ　Ｅ　ｃｏＲＩメチラーゼ（ＮＥＢ）　２０単位２．４μｌ　０．５Ｍ 　Ｅ　Ｄ　Ｔ　Ａ　１２ｍＭ反応物から５μｌを取り出し、メチル化のための対 照としての野生型λＤ　Ｎ　Ａ　（ＮＥＢ）２６０　ｎｇに添加した。

反応物を、３７℃で４５分間インキュページ、ンした。

主要反応物と試験反応物の両方を１０分間６８℃に加熱し、酵素を不活化した。

トリクロロ酢酸不溶性部分のカウントを測定することによって、〜５００ｎＨの ２本鎖ＤＮＡを反応物中シ警生じたことが示された。

１０Ｘ＠２鎖緩衝液 ２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，４−７，５）　１Ｍストック５０ｍＭ 　ＭｇＣ１ｚ　１Ｍストック １．０Ｍ　ＫＣＩ　４Ｍストック １００ｍＭ　ｔＬ酸アンモニウム　１Ｍストック１．５＋Ｍ　１−ＨＡＤ　１５ ０＋ｉＭ　ス）　ツタメチル化の終了を調べるための検定法 産物を、未消化ｐＵｃ１９ならびにサイズマーカーとしてＥｃｏＲＩおよびＨ１ ｎｄｌｌ＋で消化したλＤＮＡとともに、アガロースミニゲル上で展關させた０ 反応物中のｐＵＣｌ３は完全に消化されたが、このことは、ＥｃｏＲＩは効果的 に作用し、ＡＤＮＡは消化されなかったこと、ＡＤＮＡがメチル化反応から保護 されていたことを示す。

これによって、メチラーゼは、ｃＤＮＡ中のＥｃｏ１１部位を保護して消化させ ない点で有効であることが示され゛る。

２末鎖ｃＤＮＡの浄化 第２鎖反応混合物を当量の７エノールで２回抽出し、上記のようにＰ−６０カラ ムに流し、排除容量を回収してサバント急速真空装置中に凍結乾燥した。ｃＤＮ Ａを、１ｍ１Ｊ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，５）１０−０１ｍＭ　ＥＤＴＡ３ μｌ中に溶解した。

ｃＤＮＡへのリンカ−の連結 以下の物質をミクロ遠心管中で混合した。

３μｍ　２末鎖ｃ　Ｄ　Ｎ　Ａ　（５００ｎｇ）２．５１１１　リン酸化Ｅｃｏ ＲＩリンカ−（ＮＥＢ、　２５０ｎｇ）１μｌ　ＩＯＸ連結緩衝液 ｌμｌ　ｌｏｍＭＡＴＰ １．５μｌ　水（最終容量ｆｏｕｌとするために）１μｌ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ （〜４００単位ＮＥＢ）この反応物を１４℃で１２時間インキュベーションした 。

１０Ｘ連結緩衝液 ３００＋ｏＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）ｌｏａｄ　Ｍ　ｇ　Ｃｌ。

５０ａＭ　Ｄ　Ｔ　Ｔ リンカ−の除去 この反応物を１０分間で６８℃まで加熱し、リガーゼを不活化した。

以下の試薬を添加した。

２μｌ　Ｅ　ｃｏＲＩ　（４０単位、ＮＥＢ）この反応物を３７℃で２．５時間 インキュベージ１ンした。反応物を６８℃で１０分間加熱し、ＥｃｏＲＩを不活 化した。

５μｍの充填緩衝液を、消化されたｃＤＮＡ／ＥｃｏＲＩリンカ−反応物に添加 した。この試料を、０．８％ジ−プラーク・アガロース（ＦＭＣ社、メリーラン ド州ロックランド）１０．３μｇ／ｍｌ臭化エチジウムを含むＴＥＡ（４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−酢酸（ｐＨ８，２／１．６ｍＭ　ＥＤＴＡ）ミニゲル上で電気泳動に かけた。ブロモフェノールブルーの色素が４ｃｍ移動するまで、ゲルに４　Ｖ　 ／　ｃ＋ｏの電圧をかけて泳動させた。ＨｉｎｄｌｌｌおよびＥｃｏＲＩで消化 したＡＤＮＡを、サイズマーカーとして使用した。ＵＶ蛍光によって目で確認し たところ、６００ｂｐから１ｏｋｂを超えるまでのサイズにあるｃＤＮＡを含む ゲル断片が移動していた。

充填緩衝液 ２５０ｍＭ　ＥＤＴＡ（ｐＨ７） ０．２％　ブロモフェノールブルー５０％グリセロール 精製、連結およびパフケージング 重量を測定し、密度を１．Ｏｇ／ｍｌと仮定することによって、ゲルスライスの 容積は〜５００μｍと判明し、１４０μ＋の２０ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐ） ！７．５）／２００ｍＭ　ＮａＣｌ／１．ＯｍＭ　ＥＤＴＡおよび２０μｌの５ ＭＮａＣｌをゲル断片に添加した。この混合物を５００μｌのフェノールで２回 抽出した。ＤＮＡを、製造元の手引に従ってＥｌｕＴｉｐＤカラム（シュライヒ ヤー＆シュネル社、ニューハンプシャー州キーン）上でのクロマトことによって 測定した。そして、７０ｎｇのｃＤＮＡが溶出容積中に含まれていたことが分か つＩ：。

２μｌ（２μｇ）のλｇｔｌｏ端（ベクター・クローニング・システムズ社、カ リフォルニア州すンジエゴ）をｃＤＮＡに添加してから、２容の冷エタノールを 添加した。試料を１５分間で一８０℃に冷却し、その沈澱物を１５分間微小遠心 管中で遠心してペレット化した。この遠心管を排水し、ベレットを崩さないよう に、入念に一２０℃の７０％エタノール２００μｍで洗浄した。ペレットを３０ 分間かけて風乾した。

以下の物質を添加した。

７．２μｌ水 １μｍ　１０Ｘ連結緩衝液 １μｌ　ＡＴＰ ０．８μＩ　Ｔ４ＤＮＡリガーゼ この反応物を１４℃で２０時間インキュベーションした。

１０Ｘ連結緩衝液 ２００ｍＭ　Ｔｒｉｓ−ＨＣＩ（ｐＨ７，６）１００ｍＭ　Ｍ　ｇ　ＣＩ　２ ５０ｍＭ　ジチオスレイトール（ＤＴＴ）この連結反応液の１／、４（２，５μ ｌ）を、製造元の手引に従ってギガパックパツケイジング抽出物（ストラタギー ン・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州すンディエゴ）を用いてイ ンビトロでパフケージングした。ファージを継続的に播種すると、この反応液は ｌＯｓ個の組換え７ア一ジ形成単位（ＰＦＵ）を含むことが分かった。したがっ て、全連結混合物のバフケイジングから、４Ｘ１０’ＰＦＵが生じることになろ う。連結混合物の残りを、その後の使用に備えて一２０℃で保２つのライブラリ ーから得られたプラークの転写物を、完全なツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素 コード配列を含むｐＭＯＮ６１４５からの■Ｐ−標識断片を用いてスクリーニン グした。ｐＭＯＮ６１４５は、上記のプラス２）の大きなＥ’ｅｏＲＩ断片を、 ｐＵｃ１９（二！−イングランド・バイオラブズ社）にサブクローニングし、小 さなＥｃｏＲＩ断片をｐＵｃ１１９にクローニングし、それぞれプラスミド９５ ９１９５８９．９５９５および９５９６を形成した。

ｐＵｃ１１９は、バクテリオファージＭ１３の７４６ｂｐのＨｇｉ　Ａｉ／Ｄｒ ａ！断片を分離すること、およびその断片をＴ４ＤＮＡポリメラーゼエにニーイ ンクレノ−ＤＮＡポリメラーゼにューイングランド・バイオラブズ社）を用いて 結合させたｐＵｃ１９（ヤニツシューペロンら、１９８５年）に挿入した。得ら れたプラスミドを有する細胞がＲ４０８（ストランタジーン・クローニング・シ ステムズ社）などの欠陥ファージの感染を受けた場合、このプラスミド（ｐＵｃ 　ｌ　ｌ　９）を用いて１本鎖ＤＮＡを作成することができる。

大腸菌でのインビトロ発現のための成熟酵素のコード開始点と予想される部位に 、Ｎｃｏ工部工部上びＡＴＧ翻訳開始コドンを導入するために、ｐＭＯＮ９５９ １の１．６ｋｂのＥ　ｃｏＲＩ　／　Ｈ１ｎｄｌ　ＩＩ断片をＥｃｏＲＩ／Ｈｉ ｎｄｌｌ＋消化Ｍ１３ｍｐ１８にューイングランド・バイオラブズ社）にクロー ニングすると、Ｍ９５６８と命名された７アージが生じる。上記のように、この クローンの突然変異をオリゴヌクレオチド（５’　−Ａ（１，ｃＡｃＡＡ異が生 じたことが確認され、得られたファージをｐ　Ｍ　ＯｐＭＯＮ６１４５に関して 記載したと同じの、ツクバネアサガオＥＰＳＰ合成酵素の完全な長さのｃＤＮＡ クローンを運搬するｐＧＥＭＩ　（プロメガ・バイオチク社、ウィスコンシン州 マジソン）の誘導体である。

ｐＭＯＮ９７１７のインビトロ転写および翻訳では、活性酵素が産生されなかっ た。次いで、このクローンが作成されるｃ　ＤＮＡ　（ｐＭＯＮ　９５９１　） の配列を決定したところ、コード配列中のフレームシフトにつながる、コード配 列中での単純なヌクレオチド欠失が見い出された。この欠失を含む領域を、ｐＭ ＯＮ９７１７の９００ｂｐのＢ　ａｌａＨＩ　／　Ｈ１ｎｄＴＩ＋断片を対応す るｐＭＯＮ９５８９の断片と交換することによってｐＭＯＮ９５８９から得られ る対応領域と置換した。このプラスミドをｐＭＯＮ９７１８と命名した。ｐＭＯ Ｎ９７１８のインビトロ解析によって、これがトマトのＥＰＳＰ合成酵素をコの ＥＰＳＰ合成酵素の特徴をさらに調べた。トマトのＥＰＳＰ合成酵素コード配列 を含むｐＭＯＮ９７１８のＮｃ　ｏ　Ｉ　／　Ｈｉｎｄ！ＩＩ断片を、Ｎ　ｃ　 ｏ　Ｉ　／　Ｈ１ｎｄＴＩ＋で消化されたｐＭＯＮ５５２１に挿入した。これに よって、トマトＥＰＳＰ合成酵素コード配列が大腸菌Ｒｓ　ｃＡプロモーターの 支配下に置かれた（ホリイら、１９８０年：サンカーラ、　ｌ　９　ｓ　ｏ年＞ 　、ニップ５スミト−１−ｒＭＤＮ’ｔ’７１’ｌ’ｅ’ｆ’、Ｓこ升。

７°う入ミｌ−”　ＭＯ＃（１７１’ｌｔ↓　Ｅ、ｃ、ｔ、ｌｉ　−ｉ’口Ａ変 、累不葦（バトマトのＥＰＳＰ合成酵素の１０１位でアラニンへのグリシン置換 を導入するために、上記のようにシーラーとスミスの方法（１９８３年）によっ て、ファージＭ９５６８中の野生型ＥＰＳＰ合成酵素コード配列に、オリゴヌク レオチド（５’　−ＧＣＣＧＣＡＴＴＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＴＴＣＣＡＡ ＧＧ−３’　）を用いて突然変異を誘発させた。次いで、このファージに、オリ ゴヌクレオチド（５’　−ＣＴＣＡＴＣＣＴＡＧＧＡＡＣＧＴＣＡＴＣＡＡＧＡ ＡＣＡＴＡ−３’　）を用いて突然変異を誘発させ、成熟酵素の１４４位でグリ シンをアスパラギン酸に置換した。形質転換植物中でトマトＥＰｓＰ合ｐＭＯＮ ９５９６上で部位特異的突然変異を誘発させることによってトマトのプレＥＰＳ Ｐ合成酵素のＡＴＧ翻訳開始コドンの上流で、Ｂｇｌ＋１部位を処理した。この 突然変異誘発は、オリゴヌクレオチド（５’　−ＧＣＣＡＴＴＴＣＴＴＧＴＧＡ ＡＡＡＡＡＧＡＴＣＴＴＴＴＣＡＧＴＴＴＴＴＣ−３’　）を使ッＩ；ケンケル （７）方法（１９８５年）によって行われる。

次いで、アラニンへのグリシン（ｌ　Ｏｌ）置換およびアスパラギン酸へのグリ シン（１４４）置換を含むように処理されたファージの７００ｂｐのＥ　ｃｏＲ Ｉ　／　Ｈ１ｎｄｌｌｌ断片を、Ｅ　ｃｏＲＩ　／　Ｈ１ｎｄｌｌｌで消化され たｐ　Ｍ　ＯＮ　９７１８に移入し、対応する野生型断片を置換した。

続イテ、修飾ｐＭＯＮ９５９６（７）７０ｂｐ（７）Ｂｇ　ＩＩＩ／ＥｃｏＲＩ 断片を、ｐＭＯＮ９７１８誘導体のＥｃｏＲＩ／　Ｈ１ｎｄｌ　ｌ　Ｉ断片と結 合させて、Ｂ　ｇ　Ｉ　ＩＩ／　Ｈ１ｎｄｌｌ＋消化ｐＭＯＮ　５５　ｏ＋＝入 ｔする。ｐＭＯＮ５５０は、合成りＮ３’　−ＡＡＧＡＴＣＴＴＣＴＡＧＡＧ（ ｙＡ４！ＴＡＣＣＴＣＣＧＧＡＣ−５’　）をＨｉｎｄ■目およびＫｐｎ　Ｉで 消化したｐＵｃ１９に挿入するこシューペロンら、１９８５年）。これは、アラ ニンへのグリシン（１０１）置換を含む、完全なトマトのＥＰＳＰ合成酵素前駆 体遺伝子を再構成するものである。

植物形質転換ベクターへの挿入には、Ｈｉｎｄｌｌｌを用いた消化、平滑末端の 形成およびＣ１ａＩりンカーにューイングランド・バイオラボ社）の挿入によっ て、コード配列の３′末端における適切な部位を処理することである。次いで、 このプラスミドの１．７ｋｂのＢｇｌｌｌ／Ｃ１ａＩ断片を、ｐＭＯＮ３１６な ど、８ｇｌｌｌ／Ｃ１ａＩで消化された植物形質転換ベクターに挿入する。

得られたプラスミドには、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーターの調節下で成熟ＥＰＳＰ 合成酵素配列において、アラニンへのグリシン（１０１）置換およびアスパラギ ン酸へのグリシン（１４４）置換を有するトマトのＥＰＳＰ合成酵素前駆体コー ド配列が存在する。トマトなどの植物の形質転換は、高レベルのグリホセート耐 性酵素の産生をもたらし、グリホセート耐性植物が得られる。

ＩＩ！、アラビドプシスのＥＰＳＰ合成酵素のゲノムクロアラビドプシス・サリ アナのゲノムバンクは、サイズ分画（１５〜２０　ｋ　ｂ）されてＭｏｂｌで部 分消化されたＤＮＡを、ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩで消化されたλＥＭＢＬ３ （ストラテジーン・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州すンディエ ゴ）中にクローニングすることによって作成された。このライブラリーから得ら れたファージのプラーク約１０，０００個を、３！ｐ−標識ツクバ不アサガオＥ ＰＳＰ合成酵素プローブでスクリーニングしｆ−（後述のｐＭＯＮ９５６６）。

強力にハイブリダイズしたプラークを、ＥＩと命名し、精製した。

ＥＰＳＰ合成酵素プローブを用いたファージＤＮＡのサチンプロット法によって 、非常に強くハイブリダイズした２つの断片を同定した。１番目の断片は１．Ｏ ｋｂのＨｉｎｄｌｌ＋断片であって、他の断片は７００ｂｐのＢａｍＨ■断片で あった。これら断片をプラスミドｐＵｃｌ１９にサブクローニングし、ｐＭＯＮ ５７４およびｐＭＯＮ５７８と命名した。

２つの挿入片のＤＮＡ配列を、サンガーの方法（１９７７年）によって決定した 。この配列データによって、この７アージは、ツクパネアサガオＥＰＳＰ合成酵 素配列に対する強い相同性からアラビドプシスのＥＰＳＰ合成酵素遺伝子を含ま ないことが示されｌ；。この７００ｂｐのＢａｍＨＩ断片をこのファージおよび アラビドプシスゲノムＤＮＡに対するハイブリダイゼーショングローブをして使 用し、全ＥＰＳＰ合成酵素遺伝子のクローニングに適しｔ；制限酵素切断部位断 片を同定した。６、Ｏｋｂおよび３．２ｋｂの２つのハイブリダイズＢｇｌｌ＋ 断片が、Ｅｌファージクローン中で同定された。これらの断片を別個にｐＭＯＮ ５５０にサブクローンし、後の実験用のＤＮＡｔ得、ｐＭＯＮ５８２およびｐＭ ＯＮ５８３とそれぞれ命名した。グラスミドｐＭＯＮ５８４は、ＰＵＣｌ　ｌ　 ８中にアラビドプシスＥＰＳＰ合成酵素遺伝子の５′末端を含む、１．８ｋｂの ＥｃｏＲＩ部位からＢａｍＨＩ部位への断片である。なお、ｐＵｃ１１８は、上 記のｐｔｒｃ　１９からｐＵｃ１１９の調製に類似の方法でｐＵｃ、１８から調 製される。プラスミドｐＭＯＮ５８９は、ｐＵｃ１１９中にアラビドプシスＥＰ ＳＰ合成酵素遺伝子の３′末端を含む、２．８ｋｂのＢａｍＨ１部位からＢ１ｇ １１部位への断片である。ｐＭＯＮ５８４のＢａｎＨ１部位、およびｐＭＯＮ５ ８９のＢａｍＨＩ部位から配列決定することによって、この遺伝子のコード領域 の配列が完全に解明される。

発現されたアラビドプシスＥＰＳＰ合成酵素が成熟酵素（７）１０１位でアラニ ンによるグリシン置換を含むように、コード配列が変えられた。プラスミドｐＭ ＯＮ５７８を、ケンケルの方法（１９８５年）によってオリゴヌクレオチド（５ ’　−ＣＴＴＴＡＣＣＴＣＧＧＴＡＡＴＧＣＡＧＣＴＡＣＡＧＣＡＡＴＧＣＧ− ３”）で突然変異させた。得られたプラスミドｐＭＯＮ５９４の配列を決定して 、その突然変異を証明した。次いで、ｐＭＯＮ５９４を、ケンケルの方法（１９ ８５年）によってオリゴ成熟酵素の１４４位でアスパラギン酸塩によるグリシン 突然変異を導入した。得られたプラスミドの配列を部分的に決定し、突然変異が 確実に誘発されていることを証明した。アラニンへのグリシン（１０１）突然変 異およびアスパラギン酸へのグリシン（１４４）突然変異を有するアラビドプシ スＥＰＳＰ合成酵素遺伝子において内部に７３０ｂｐのＢａｍＨＩ断片を含む構 成体をｐＭＯＮ９９３０と命名した。

ＣｌａＩＩＳ位が必要とされるのは、植物の形質転換／発現ベクター−、アラビ ドプシスＥＰＳＰ合成酵素遺伝子を挿入するための翻訳開始部位のちょうど上流 にあたる。

翻訳開始部位を含むｐＭＯＮ５８４の３７０ｂｐの５ｎａＢＩ／ＢａｍＨＩ断片 および６５　ｂ’ｐの５′末端非翻訳領域を、Ｅ　ｃｏＲＩ　／　Ｂ　ａｍＨＩ で消化されたブルースクリプト（ＢｌｕｅｓｃｒｉｐＬ）　Ｋ　Ｓ　（ストラタ ジーン・クローニング・システムズ社、カリフォルニア州すンジアゴ）にクロ、 −ニングし、ｐＭＯＮ９７３４が得られた。

む３．ＯｋｂのＢａｍＨＩからＢｇｌｌ＋断片をｐＭＯＮ５８３から切り出し、 ｐＭＯＮ９７３４の非反復Ｂｇｌ１１部位に挿入しｔ；。このプラスミドｐＭＯ Ｎ５８Ｂは、遺伝子の中央部に非反復Ｂｇｌ＋１部位を有する。次いで、ｐＭＯ Ｎ９９３０からの８００ｂｐのＢａｎ）（１断片を、ｐＭＯＮ５８８の非反復Ｂ ａｍＨ１部位に挿入した。得られたプラスミドｐＭＯＮ９８２は、成熟タンパク においてアラニンへのグリシン（１０１）置換およびアスパラギン酸へのグリシ ン（１４４）置換を含む。ｐＭＯＮ９８２をＣ１ａｌで消化して、ｄＡＴＰ、ｄ ＣＴＰ、ＴＴＰおよびｄＧＴＰの存在下、クレノーポリメラーゼで処理して、平 滑末端を作成した。次いで、このプラスミドをＥｃｏＲＩで消化して、成熟タン パクにおいてアラニンへのグリシン（１０１）置換およびアスパラギン酸へのグ リシン（１４４）置換を有する完全な変興型アラビドプシスＥＰＳＰ合成酵素コ ード領域を含む３．５ｋｂの断片を、Ｃ’ａＭＶ（ケイら、１９８７年）の２本 鎖３５Ｓプロモーターを対照としてｐＭＯＮ９７９に挿入する。

さらに、得られた構成体ｐＭＯＮ９８７（図５）を上記のように、アグロバクテ リウム・ツメファシェンスＡＣＯに導入する。

ｐＭＯＮ９８７ブラスミドを有するアグロバクテリウムを使って、７レイらの方 法（１９８７年）による記載どうりに、ブラシカ・ナプスの植物体を形質転換す る。

この植物体は、これらのゲノムを組み込んだ９ＭＯ８９８７を有し、グリホセー ト耐性を示すことになろう。

ＩＶ、グリシン・マ・ンクスのＥＰＳＰ合成酵素れたライブラリーから分離した 。市販のアマジャム社製ｃ　ＤＮＡ合成キット（アマジャム社、イリノイ州アー リントンＨｔｓ、）およびベクター・クローニング・システムズ社（カリフォル ニア州すンジエゴ）から得られるλ８，１ｏを用いて、このライブラリーを構成 した。このライブラリーをアラビドプシスＥＰＳＰ合成酵素遺伝子の一部を含む ｐＭＯＮ５７８からの挿入片でスクリーローニング・システムズ社、カリフォル ニア州すンジエゴ）にサブクローニングした。（ＤＮＡクローンの１つの一部分 の配列（ｐＭＯＮ９７５２’Ｑ’１６００ｂｐのｃＤＮＡを含む）を決定した。

図２を参照にすると、このヌクレオチド配列から推測されるタンパク質には、成 熟゛れる３債のアミノ酸挿入は、番号性の相違が原因である〕９８５年）の方法 に従ってオリゴヌクレオチド（５′−ＴＴＴＣＣＡＡ−３’　）を用いた部位特 異的突然変異誘発ニよって、１０４位（ツクバネアサガオにおける１０１位のグ リシンに相当）のグリシンをアラニンに置換した。その結果プラスミドｐＭＯＮ ９９２３が得られた。

アスパラギン酸へのグリシン（１４７）突然変異（ツクバネアサガオのアスパラ ギン酸へのグリシン（１４４）従って合成オリゴヌクレオチドブライマー（５’ 　−ＧＣＡＡＴＣＡＡＣＡＴＣＴＧＣＧＴＣＡＡＧＴＴＡＡ−３突然変異および アスパラギン酸へのグリシン（１４７）９ｃｔＰＸ変異を、ＤＮＡ配列の解析に よって確認した。その結果得られた、岡突然変異を含むプラスミドをｐＭＯＮ９ ９５２と命名し１；。

ズコード配列の予想開始点でＮｃｏ１部位を処理することによって構成された。

次いで、この配列を＄）ＭＯＮ９ベクターを構成するために、ｐＭＯＮ９９５２ のＫｐｎＳＲ４８１のアロＡ欠損に相補的であることが示された。

これらの細菌から抽出されたＥｐｓｐｌａ−成酵素は、グリホセート耐性である ことが示された。

た、高等植物中でダイズＥＰＳＰ合成酵素変異型の発現ベクターを構成するため には、完全なコード配列が必要であった。ダイズのゲノムライブラリーをクロー ンチク社（カリフォルニア州バロアルト）から購入した。このライブラリーを、 ダイズｃＤＮＡから作成された３２Ｐ−標識プローブでスクリーニングした。ハ イブリダイズク配列を含むことが示された。φンケルの方法（１９８５年）に従 ったオリゴヌクレオチド部位特異的突然変異誘ドウマメのＥ９ｒｂｃＳ遺伝子の ３′末端を有する植物形質転換ベクターであるｐＭＯＮ９７７のＦ！ｇｉ１１消 化聾にクローニングして、ＥＰＳＰ合成酵素（ｐＭＯＮ１６１９）を発現させた 。植物発現ベクターを完全に構成次いで、得られたプラスミドは、グリホセート ｖｋ草剤に対して高い耐性を示す植物に導入される。

■、ダブラカ・ナプスからのＥＰＳＰ合成酵素遺伝子標準法によってブラシカ・ ナブス（ウニスター参照）からＤＮＡを分離した。このＤＮＡを、制限酵素エン ドヌクレアーゼＭｂｏｌにューイングランド・パイオラより小さい断片および大 きい断片から分離し、ＤＥＡＥ膜（アマジャム社）上のゲルから分離した。これ らの断片を布板のλクローニングベクターのラムダ・ダッシュ（ストラタジーン 社）に連結した０組換え７アージなプレートに播種し、ニトロセルロースフィル ターのレプリカを標準法によってこのプレートから作成した。このフイｂｐのＨ １ｎｄｌｌｌ断片を使って調べた。ハイブリダイズクローンを拾い上げてから、 再スクリーニングを、同一のプローブおよび上記のトマトＥＰＳＰ合成酵素のｃ ＤＮＡであるｐＭＯＮ９７１７から作成したプローブを用いて行った。両グロー ブに強くハイブリダイズするクローンを分離して、ＤＮＡ精製のために増殖させ た。３．８ｋｂのＢｇｌｌ＋断片をｐＵｃ１１９にクローニングして、植物の形 質転換ベクターの構成を容易にするために、ＭＯＮ　６６３諦ンシル、１９８５ 年）の突然変異誘発によって、Ｂ、ナプスＥＰＳＰ合成酵素遺伝子のＡＴＧ翻訳 開始コドンのすぐ上流にＢｇｌ！１部位を導入した。

へのグリシＳニーーー置換を、オリゴヌクレオチド（５’　−ＧＧＡＣＧＣＡＴ ＧＧＣＴＧＴＡＧＣＴＧＣＡＴＴＣＣＣＡＡＧ−３”）を有する得られたプラス ミドの類似の突然変異誘発によって導入した。

さらに、第３の突然変異を誘発させ、オリゴヌクレオチド（５’　−ＡＣＴＣＡ ＡＣＡＴＣＡＧＣＡＴＣＡＡＧＣＴＧＣＴＴＡＡＧ−３”）を用いて、成熟タン パク質のアミノ酸（１４４）のグリシンからアスパラギン酸塩へ置換されるよう にコドンを変化させた。

続いて、得られたプラスミドをＢ、ｌＩｌおよびＥｃｏＲＩで消化して、変異型 Ｂ、ナグスＥＰＳＰ合成酵素遺伝子を分離し、上記のｐＭＯＮ９８７に類似の植 物形質転換ベクターに挿入する。次いで、このプラスミドを、上記のＡＣＯなと の適当なアグロバクテリウム株に導入し、ブラシカ・ナプスなどの植物を形質転 換するために使用する。これらゲノム中にこの遺伝子で構成されたプラスミドま たは他の類似のプラスミドを組み込んだ植物は、グリホセート耐性となるであろ う。

Ｖｒ、）ウモロコシからのＥＰＳＰ合成酵素遺伝子グリホセート耐性トウモロコ シ遺伝子の構成トウモロコシの種子を水中に１２時間浸し、胚盤を含む胚をその 種子から切り出して、ロッシェスターらの方法（１９８６年）の方法によってＲ ＮＡをこの材料から精製した。オリゴｄＴセルロースのクロマトグラフィーによ ってＲＮＡがらポリＡ　ｍ　Ｒ’Ｎ　Ａを単離して、これを使って上記のように ｅＤＮＡライブラリーを構Ｅた。

このライブラリーを、Ｈ１ｎｄｌｌｌで線形にされたｐＭＯＮ９７１７からイン ビトロで合成された３２ｐ−標識ＲＮＡグローブを用いてスクリーニングした。

このプローブを、製造元の手引に従ってＴ７ＲＮＡポリメラーゼ（プロメガ社、 ウィスコンシン州マジソン）を用いて合成した。

ハイブリダイズプラークを分離し、プレートに播種して、このプレートから転写 したニトロセルロース膜を同一の−りを分離し、増殖させ、これを用いてＤＮＡ を調製した。λｚｌｄと命名されたクローンは、１．８ｋｂのＥｃｏＲＩ挿入片 を含むことが分かった。このファージの挿入片を、ブルースクリプトＫＳ＋　（ ストラタジーン社、カリフォルニア州すンジエゴ）のＥｃｏＲＩＩＳ位にサブク ローンして、ｐＭＯＮ９９３５を得た。このｃＤＮＡクローンの完全な配列を決 定し、図１に示されたアミノ酸易にするために、オリゴヌクレオチド（５’　− ＴＡＣＣＡＡＣＣＡＴＣＧＧＣＧＴＣＴＡＧＡＧＧＣＡＡＴＧＧＣＧＧＣ−３″ ）を用いたケンケルの方法に従って、オリゴヌクレオチド媒介突然変異を誘発さ せることによって、このクローンの最初の開始フドンＡＴＧのすぐ上流でＸｂａ １部位を処理したところ、プラスミドｐ　Ｍ　ＯＮ９９５０が得られた。ｐＭＯ Ｎ９９５０をＸｂａ　ＩＴ消化して再連結して、ｃＤＮＡの５′末端における１ ２６ｂｐ（７）ＸｂａＩ断片を険去した。そして、ｐＭＯＮ９９５１が生じた。

トウモロコシＥＰＳＰ合成酵素のグリホセート耐性型をフードするコード配列を 作成するために、オリゴヌクレオチド（５’　−ＣＴＴＣＴＴＧＧＧＡＡＴＧＣ ＴＧＣＴＡＣＴＧＣＡＡＴにＧＣＧＣ−３’　）　を用いたケンケルの方法によ ってＰＭＯＮ９９５１を突然変異させたところ、ｐＭＯＮ９９６０が得られた。

この突然変異の誘発によってＧＧＡコドンがＧＣＴコドンに変化して、得られた タンパク質の保存配列（−Ｌ−Ｇ−Ｎ−Ａ−Ｇ−Ｔ−Ａ−）中の第２のグリ７ン 残基がアラニン残基に置換される。このグリシン残基は、予想されたトウモロコ シのプレＥＰＳＰ合成酵素の１６３位のアミノ酸である。これは、成熟タンパク 質のアミノ酸（９５〜１０５位）に相当するであろうが、シー決定の厳密なシグ ナルペプチド切断部位に依存する。次いで、ｐＭＯＮ９９６０を、オリゴヌクレ オチド（５°　−ＴＣＧＧＡＴＴＧＡＡＧＣＡＧＣＴＴＧＡＣＧＣＡＧＡＴＧＴ ＴＧＡＴ−３”）を用いた同様の方法で突然変異させた。その連結、ｐＭＯＮ８ ６１７が形成されたが、これは、トウモロコシのＥＰＳＰ合成酵素前駆体の２０ ６位でのアスパラギン酸塩へのグリシン置換を含むであろう。これは、成熟タン パクの１３９から１４９位の間の位置に相当するであろう。

この置換がトウモロコシＥＰＳＰ合成酵素のグリホセート耐性を引き起こしたこ とを証明するために、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いたインビトロでの転写、そ れに続くインビトロでの翻訳によってｐＭＯＮ９９５１およびｐＭＯＮ８’６１ ７から産生させた。すなわち、完全な長さのＥＰＳＰｆ成酵素ｃＤＮＡを含むプ ラスミドＤＮＡ（ｐＭＯＮ９９５１およびｌ１１Ｍ０Ｎ８６１７）をＥｃ。

Ｒ１で線形化した。基本的にはクリーブも（１９８４年）が記載したように、こ の線形プラスミドＤＮＡを、Ｔ７ポリメラーゼを用いてインビトロで転写した。

この標準反応緩衝液には、最終反応容量１００μｌ中に４０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣ Ｉ（ｐＨ７，９）　、６ｍＭ　Ｍｇｅｔ、、１０１１１Ｍジチオスレイトール、 ２ＩＩＩＭスペルミジン、８０単位のＲＮＡ５ｉｎリボヌクレアーゼ阻害剤、各 ０．５ｍＭのＡＴＰ、ＧＴＰ、ＣＴＰおよびＵＴＰが含まれていた。最終ＲＮＡ ペレ７トを２０μ】の滅菌水に再懸濁して、−８０℃で保存した。標準翻訳反応 溶液には、１００μｍのヌクレアーゼ愁理ウサギ赤血球溶解物、５．７μｍのＲ ＮＡ　（０、６３ｕｇ　ｆ）フ５　スミＦＤＮＡ由来（７）全ＲＮＡ転写物）、 １６μｍのＲＮＡ５　ｉｎ　（２０単位／μｍ）リボヌクレアーゼ阻害剤および ５８．３μｌの［”Ｓ］メチオニン（１４〜１５μＣｉ／＋ａｌ　）が含まれて いた。インビトロでの翻訳産物を一８０℃で凍結保存した。

次いで、インビトロ翻訳産物を、ここで記載したように、ＥＰＳＰ合成酵素活性 を調べるために測定した。ｐＭＯＮ８６］７の産物は、グリホセート非存布下で 検出可能なＥＰＳＰ合成酵素活性を示した。この測定をｌ。

０ｍＭグリホセートの存在下で繰り返した場合、活性は全く検出されなかった。

対照的に、ｐＭＯＮ８６１７の変異型プレ酵素産物は、グリホセートに対する高 レベルの耐性を示した。ｌｌ１１Ｍのグリホセートでは若干の阻害が見られ、ｌ ＯＩＩＩＭでは２５％以上の阻害が見られ、１００＋＋＋Ｍグリホセートでも検 出可能な活性がなおも示され　ｔこ　。

トウモロコシ細胞中での発現を調べるために、トウモロコシのプレＥＰＳＰ合成 酵素のグリホセート耐性変異型のフード配列を、ｐＭＯＮ９９６０から切り出し 、ＣａＭＶ３５５プロモーターなどトウモロコシ細胞中で機能することが知られ ているプロモーターと、ツバリン合成遺伝子またはもう一つの適切な遺伝子のポ リＡ添加部位との間に挿入される。さらに、ＡＤＨＩ遺伝子の最初のイントロン などのイントロンは、キメラ遺伝子（カリスら、１９８７年）の発現を充進し得 る発現単位の５′プラスミドｐＵｃｌ１９（１掲）をＥｃｏＲＩおよびＨｉｎｄ ｌｌ＋で消化した。この合成りＮＡ断片（５’　−ＡＡＴＴＧＣＧＧＣＣＧＣＧ ＲＲＡＡＣＴＧＣＡＧ（、ＣＣＧＧＧＣＧにＣＣＧＣ−３’３’　−ＣＧＣＣＧ ＧＣＧＣＡＡＴＴＧＡＣにＴＣＧＧＧ四ＣＧＣＣＧＧＣＧＴＣＧＡ−５”）を、 その消化プラスミドに挿入して、ｐＭＯＮ９１４を作成した。一連の工程を経て 、３５Ｓプロモーター（ケイら、１９８７年）、マルチリンカ−配列、およびツ バリン合成遺伝子の３′末端をプラスミドｐＭＯＮ９１４に挿入し、ｐＭＯＮ９ ９８４を作成した。トウモロコシＡＤＨＩ遺伝子（カリスら、１９８７年）の最 初のイントロンを含むＢＣＩＩ／Ｂａａ＋ＨＩ断片をｐＭＯＮ９９４８のＢｇｌ １１部位に挿入し、ｐＭＯＮ９９５５を作成した。トウモロコシ細胞および植物 で発現させるために、ＥＰＳＰ合成酵合成酵素変異−ド配列をＸｂａＩ／Ｅｃ。

ＲＩ断片上のｐＭＯＮ８６１７から除去し、ＸｂａＩおよびＥｃｏＲＩで消化し ておいたｐＭＯＮ９９５５に挿入した。その結果、Ｉ）ＭＯＮ８６３１が得られ た（図７）。

このプラスミドには、ＣａＭＶ３５Ｓプロモーター、トウモロコシＡＤ）（１遺 伝子（５′末端の非翻訳配列中に存在する）、アラニンへのグリシン置換および アスパラギン酸へのグリシン置換を有するトウモロコシのプレＥＰＳＰ合成酵素 ｃＤＮＡ、ならびにツバリン合成酵素の３′末端が含まれる。

形質転換トウモロコシ細胞は、懸濁細胞系のＢＭＳ　１（ＡＴＣＣＮｏ、５４０ ２２）などのトウモロコシ細胞に、フレインらの方法（１９８８年）またはクリ ストウらの方法（１９８８年）によッテｐＭＯＮ８６３１　”ｌ’）　−）した 粒子を当てることによって調製可能である９次いで、細胞を、５＋ｎＭグリホセ ートを含む培地中で１〜３週間選択してから、５ｍＭグリホセートを含む固形培 地上で選択した。取り込まれたカルスであって、キメラ変異型ＥＰＳＰ合成酵素 遺伝子を発現するカルスを、固形培地上でそれらの急速な増殖によって同定する ことができる。

さらには、ＥＰＳＰ合成酵素の発現単位を、Ｃａ　Ｍ　Ｖ３５Ｓプロモーターの 調節下にネオマイシン７オス７オトランス７エラーゼ遺伝子を含むベクター、ま たは形質転換トウモロコシ細胞の選択を可能にする異なったマーカー遺伝子を有 する類似のベクターに挿入す、る、続いて、このベクター、またはこの出願の請 求の範囲および実施例で記載したように構成された他のグリホセート耐性を有す る類似ベクターを、以下の実施例に記載するとおりにトウモロコシ細胞に導入す る。

トウモロコシのプロトプラストのｖ４展クロムら（１９８５年および１９８６年 ）の記載どう一ト（ＢＭＳ）　トウモロコシ懸濁細胞系のＢＭＳＩ（ＡＴＣＣＮ ｏ、５４０２２）から調製する。ＢＭＳ　ｌ懸濁細胞を、ＭＳ塩、２０ｇ／Ｉの ショ糖、２ｍｇ／ｌの２．４−ジクロロフェノキシ酢酸、２００ｍｇ／ｌのイノ シトール、１３０　ｍｇ／Ｉのアスパラギン、１．３ｍｇ／ｌのニアシン、０− ２５ｍｇ／ｌのチアミン、０．２５＋ｏｇ／ｌのピリドキシン、０．２５ｍｇ／ ｌのパントテン酸カルシウム（ｐＨ５゜８）を含む８ＭＳ培地中で増殖させる。

１２５三角フラスコ中の培養物４Ｑｍｌを２６℃で１５　Ｏｒｐｍにて装置する 。この培養物を、３日間毎に等量の新鮮な培地で希釈する。新鮮培地添加の１な いし２日後に、プロトプラストを活発に増殖する細胞から分離する。プロトプラ ストの分離では、細胞を、スイッチ式パケットテーブルトップ遠心機中で２００ Ｘｇの遠心によってペレット化スる。

この上清を、プロトプラスト培養用のコンディションド培地として保存する。細 胞ベレット５ｍｌを、１％セルラーゼ、０．５％へミセルラーゼおよび０．０２ ％ペクチナーゼを含む、０．２Ｍマンニトール１５ＱｍＭＣａＣｌ！　／　ｌ　 ＯｍＭ酢酸ナトリウム溶液４０ｍ１中に再懸濁する。２６℃で２時間インキュベ ージジンした後、プロトゲラストを、６０ｕ＋ｍナイロンメツシュスクリーンを 通す濾過によって分離し、２００Ｘｇでの遠心にかけ、酵素を含まない同一溶液 で一度洗浄する。

電気穿孔法を用いたトウモロコシプロトプラストの形質転換 電気穿孔法用のプロトプラストを、２ｍＭ　リン酸カリウム（ｐＨ７，１）、４ ｍＭ塩化カルシウム、１４０ｍＭ塩化ナトリウムおよび０．２Ｍマンニトールを 含む溶液中で洗浄することによって調製する。洗浄の後、プロトプラストを、濃 度４Ｘ１０Ｅ６プロトプラスト／ｍｌで同一溶液中に再懸濁する。プロトプラス ト溶液０．５＋ａｌを、超コイルプラスミドベクターＤＮＡ５０μｌを含む同一 溶液Ｑ、５ｍｌと混合し、１ｍＭの電気穿孔キュベツトに入れる。電気穿孔法は 、フロムら（１９８６年）が記載した通りに実施される。記載通りに、２００■ に充電した１２２または１２５マイクロフラツドコンデンサーから、電気パルス を送る。４℃にて１０分間および室温にて１０分間放置した後、プロトゲラスト を、ＭＳ塩、０．３Ｍマンニトール、２％シ３糖、２ｍｇ／ｌの２．４−り、２ ０％のコンデションドＢＭＳ培地（１掲）およ。

び０．１％低融解アガロースを含む培地８＋ｏｌで希釈する。２６°Ｃの暗所で ２週間放置した後、液体からミクロカルスを除き、１００ｍｇ／ｌ　カナマイシ ンを含むアガロ−−ス固形培地上のニトロセルロースフィルター上に置く。

形質転換トウモロコシ細胞からなるカナマイシン耐性カルスが、１〜２週間後に 見られる。

グリホセート耐性のトウモロコシ細胞 クロムら（１９８６年）の記載しｔ：通りに、形質転換されたトウモロコシ細胞 を、ＤＮＡベクターを用いた電気穿孔法を行った後、カナマイシンを含む培地中 での増殖によって選択することができる。なお、このＤＮＡベクターは、Ｃｐｃ 　ｍ　Ｖ　３５　Ｓプロモーターからなるカナマイシン耐性遺伝子、ＮＰＴＩＩ コード領域およびＮＯ３３′末端を含む。これらの細胞も、ＥＰＳＰ合成酵素の グリホセート耐性をを産生ずるであろうし、高レベルのグリホセートに耐性とな るであろう。

電気穿孔された細胞も、上記のように、これらの細胞をグリホセート含有液体培 地に直接移し入れ、グリホセートを含む固形培地上での選択によって選ぶことが できる。

また、トウモロコシ、その他の単子葉植物細胞にプラスミドを導入する別の方法 として、ニューハウスら（１９８７年）の注入法、デラベナら（１９８７年）の 注入法、またはフレインら（１９８７年）およびマクヵーベら（１９８８年）の 顕微注射法が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

上記の実施態様は、この発明の実施をより詳細に説明するために提供されたもの である。これらの実施態様は、単に例示を目的として提供されたものであって、 この発明の範囲を限定するものではない。

参考文献 Ａｄａｍｓ、　Ｓ、　Ｐ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ｊ、　Ａｍｅｒ 、　Ｃｈｅｍ、　Ｓｏｃ。

１０５　：６６１゜ Ａｕ５ｕｂｅｌ、　Ｆ、、　ａｔ　ａｌ、、　（１９８０）　Ｐｌａｎｔ　Ｍｏ １．　Ｂｉｏ、　Ｎｅｗｓｌｅｔｔｅｒｌ：２６−２６− ３２−Ｂａｃｈ、　Ｂ、　Ｊ、、　ｅｔ　ａｌ、、　（１９８０）　Ｍｉｃｒｏ ｂ、　Ｒｅｖ、　４４：１−５６゜Ｂｒａｕ、　ｅｔ　ａｌ、、　Ｍｏ１．　Ｇ ｅｎ、　Ｇｅｎｅｔ、　１９３：１７９−４８７　（１９８４）。

Ｂｒｏｇｌ、ｉｅ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　（１９８３）　Ｂｉｏ　ｅｃｈｎ ｏｌｏ　１：５５−６１゜Ｂｒｏｇｌｉｅ、　Ｒ，、ｅｔ　ａｌ、、　（１９８ ４）　５ｃｉｅｎｃｅ　２２４：８３８−８４３゜ｄｅ　ｌａ　Ｐｅｎａ、　Ａ 、、　Ｌｏｒｚ、　Ｅ、　ａｎｄ　５ｃｈｅｌｌ、　Ｊ、　（１９８７）　Ｎａ ｔｕｒｅ３２５　：２７４−２７６゜ ＤｅＰｉｃｋｅｒ　Ａ、、　ｅｔ　ａｌ−、（１９８２）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ａ ｔ＋　１．　Ｇｅｎ、　１：５６１゜Ｄｉｔｔａ、Ｇ−、ｅｔ　ａｌ、、（１９ ８０）　Ｐｒｏ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、ｓｅｉ、ＵＳＡ７７：７３４７゜ Ｇｕｂｌｅｒ、　Ｕ、、　ａｎｄ　Ｅｏｆｆｍａｎ、　Ｂ、　Ｈ，（１９８３） 　Ｇｅｎｅ　２Ｓ：２６３−２６９゜Ｅｏｒｉｉ、Ｔ、、ｅｔ　ａｌ、（１９８ ０）Ｐ、Ｎ、Ａ、Ｓ−ＵＳＡ　７７：３１３゜Ｋｕｎｋｅｌ　（１９８５）Ｐ− Ｎ−Ａ−５，ＵＳＡ　８２：４８８−４９２゜Ｌａｍｋｅ、　Ｇ、　ａｎｄ　Ａ ｘｅｌ、　Ｒ，（１９８５）　Ｃｅ１ｌ　４０＝５０１−５０８゜ＭｃＣａｂｅ 、　Ｄ、　Ｅ、、　ｅｔ　ａｌ、（１９８Ｂ）　Ｂｉｏ　ｅｃｈｎｏｌｏ　６： ９２３゜Ｍｅｓｓｉｎｇ、　Ｊ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８１）　Ｎｕｃｌｅｉｃ 　Ｒｅｓ、　９：３０９−３２１゜５ａｎｃａｒ、Ａ、、ｅｔ　ａｌ、（１９８ ０）Ｐ、Ｎ、Ａ−５，ＵＳＡ　７７：２６１１゜５ｃｈｅｒｅｒ、　ｅｔ　ａｌ 、（１９８１）　Ｄｅｖｅｌｏ　ｍｅｎｔａｌ　Ｂｉｏ、　８６：４３８−４４ ７゜５ｏｂｅｒｓｏｎ、　ｅｔ　ａｌ、（１９８０）、≦：ｎｅ　９：２８７− ３０５゜５ｏｕｔｈｅｒｎ、　Ｅ、　Ｍ、（１９７５）　Ｊ、　Ｍｏ１．　Ｂｉ ｏｌ、　９Ｂ＝５０３−５１７゜５ｔｅｉｎｒｕｃｋｅｎ、　Ｈ，ａｎｄ　Ａｍ ｒｈｅｉｎ、　Ｎ、　（１９８０）　Ｂｉｏｃｈｅｍ、　＆Ｂ１ｏ　ｈ　ｓ、Ｒ ｅｓ、Ｃｏｍｍ、９４：１２０７−１２１２゜Ｖｉｅｉｒａ、Ｊ、ｅｔ　ａｌ、 、（１９８２）　Ｇｅｎｅ　１９：２５９−２６８゜Ｚｏｌｌｅｒ、Ｍ−Ｍ、ｅ ｔ　ａｌ、（１９８３）Ｍｅｔｈｏｄｓ　Ｅｎｚ　ｏｌ、１００：４６８゜１− 事件の表示 ２０発明の名称 氏名（名称） モンサンド　カンパニー ４−代理人 居　所　〒１００東京郁千代田区大手町二丁目２番１号６、補正により増加する 請求項の数 ７−補正の対象 図面の翻訳文 国際調査報告 国際調査報告 ＵＳ　９００３４９５ Ｓ＾　４１４８２

Claims (47)

【特許請求の範囲】
1. １．グリホセート耐性の５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート（ＥＰＳ Ｐ）合成酵素を調製する方法であって、成熟野生型ＥＰＳＰ合成酵素のアミノ酸 配列中の８０から１２０位の間に位置するアミノ酸配列【配列があります】を有 する第１の保存領域 中でアラニン残基を２番目のグリシン残基と置換する工程、ならびにアミノ酸配 列【配列があります】を 有する第２の領域中［ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６およびＸ７はいず れかのアミノ酸であり、Ｘ５はアルギニンまたはリシンであって、該第２の領域 が成熟野生型ＥＰＳＰ合成酵素のアミノ酸配列中の１２０から１６０位の間に位 置する］でアスパラギン酸およびアスパラギンからなる群より選ばれたアミノ酸 残基を末端グリシン残基と置換する工程を含む調製方法。
2. ２．グリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素が、野生型植物のＥＰＳＰ合成酵素から 産生される、請求項１記載の調製方法。
3. ３．グリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素が、野生型細菌のＥＰＳＰ合成酵素から 産生される、請求項１記載の調製方法。
4. ４．第２のアミノ酸配列のグリシン残基がアスパラギン酸残基で置換される、請 求項１記載の調製方法。
5. ５．成熟ＥＰＳＰ合成酵素配列のアミノ酸配列中の８０から１２０位の間に位置 する第１のアミノ酸配列【配列があります】ならびに第２のアミノ 酸配列【配列があります】 （ただし、Ｘ１、 Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６およびＸ７はいずれかのアミノ酸であり、Ｘ５はアルギ ニンまたはリシンであって、該第２の配列は成熟野生型ＥＰＳＰ合成酵素のアミ ノ酸配列中の１２０から１６０位の間に位置する）を含むグリホセート耐性５− エノールピルビル−３−ホスホシキメート（ＥＰＳＰ）合成酵素。
6. ６．図１に示されるような、請求項５記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素 。
7. ７．上記の野生型ＥＰＳＰ合成酵素コード配列が、図１に示されるような、ツク バネアサガオ、トマト、トウモロコシ、アラビドプシス・サリアナ、ダイズ、ブ ラシカナプス、大腸菌Ｋ−１２、百日咳菌およびネズミチフス菌からなるＥＰＳ Ｐ合成酵素の群より選ばれる請求項２記載の方法によって調製された、請求項５ 記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素。
8. ８．請求項５記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をコードする植物遺伝子 。
9. ９．第１のアミノ酸配列【配列があります】ならびに第２のアミノ酸配列【配列 があります】（ただし、Ｘ１、Ｘ２、Ｘ３、Ｘ４、Ｘ６およびＸ７はいずれかの アミノ酸であり、Ｘ５はアルギニンまたはリシンであって、該第２の配列は放熟 野生型ＥＰＳＰ合成酵素のアミノ酸配列中の１２０から１６０位の間に位置する ）を有するグリホセート耐性５−エノールピルビル−３−ホスホシキメート（Ｅ ＰＳＰ）合成酵素をコードする遺伝子を含む植物の形質転換ベクター。
10. １０．グリホセート耐性植物のＥＰＳＰ合成酵素を含む、請求項９記載のベクタ ー。
11. １１．グリホセート耐性細菌のＥＰＳＰ合成酵素を含む、請求項９記載のベクタ ー。
12. １２．グリホセート耐性カビのＥＰＳＰ合成酵素を含む、請求項９記載のベクタ ー。
13. １３．請求項８記載の遺伝子を含む形質転換植物細胞。
14. １４．トマト、タバコ、セイヨウアブラナ、アマ、ダイズ、ヒマワリ、テンサイ 、アルファルファ、ワタ、イネおよびトウモロコシからなる群より選ばれた、請 求項１３記載の形質転換植物細胞。
15. １５．トマトから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
16. １６．タバコから得られた、請求項１記載の形質転換細胞。
17. １７．セイヨウアブラナから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
18. １８．アマから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
19. １９．ダイズから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
20. ２０．ヒマワリから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
21. ２１．テンサイから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
22. ２２．アルファルファから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
23. ２３．トウモロコシから得られた、請求項１３記載の形質転換細胞。
24. ２４．請求項１３記載の形質転換細胞からなる植物。
25. ２５．上記植物がトマトである請求項２４記載の植物。
26. ２６．上記植物がタバコである請求項２４記載の植物。
27. ２７．上記植物がセイヨウアブラナである請求項２４記載の植物。
28. ２８．上記植物がアマである請求項２４記載の植物。
29. ２９．上記植物がヒマワリである請求項２４記載の植物。
30. ３０．上記植物がテンサイである請求項２４記載の植物。
31. ３１．上記植物がアルファルファである請求項２４記載の植物。
32. ３２．請求項２４記載の植物によってつくられた種子。
33. ３３．上記植物がトマトである請求項３２記載の種子。
34. ３４．上記植物がタバコである請求項３２記載の種子。
35. ３５．上記植物がセイヨウアブラナである請求項３２記載の種子。
36. ３６．上記植物がアマである請求項３２記載の種子。
37. ３７．上記植物がヒマワリである請求項３２記載の種子。
38. ３８．上記植物がテンサイである請求項３２記載の種子。
39. ３９．上記植物がアルファルファである請求項３２記載の種子。
40. ４０．請求項５記載の植物遺伝子を含む植物を繁殖させることからなる、グリホ セート耐性植物の作成方法。
41. ４１．上記植物が、トウモロコシ、トマト、タバコ、セイヨウアブラナ、アマ、 ヒマワリ、テンサイ、アルファルファ、ワタおよびイネからなる群より選ばれた 、請求項４０記載の方法。
42. ４２．第１の植物が、上記第１の植物と第２の植物との間の交配によって繁殖さ れ、その結果、該交配植物の少なくとも何種類かの子孫がグリホセート耐性を示 す、請求項４０記載の方法。
43. ４３．上記植物が、トウモロコシ、トマト、タバコ、セイヨウアブラナ、アマ、 ヒマワリ、テンサイ、アルファルファ、ワタおよびイネからなる群より選ばれた 、請求項４２記載の方法。
44. ４４．請求項５記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をコードするＤＮＡ配 列。
45. ４５．長さが２０キロ塩基対未満である、請求項４４記載のＤＮＡ配列。
46. ４６．請求項６記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をコードする、請求項 ４５記載のＤＮＡ配列。
47. ４７．請求項７記載のグリホセート耐性ＥＰＳＰ合成酵素をコードする請求項４ ４記載のＤＮＡ配列。