ES2647767T3 - Generación por ingeniería genética de proteínas enzimáticamente susceptibles - Google Patents

Abstract

Un método para aumentar la sensibilidad de una fitasa a una proteasa que comprende las siguientes etapas en el orden de: a) crear variantes con estabilidad termodinámica aumentada; b) modelar la estructura tridimensional de la proteína; c) identificar dominios del modelo tridimensional, donde los dominios se seleccionan del grupo constituido por dominios de glicosilación, residuos de cisteína y bucles de una estructura proteica que están expuestos al medio circundante; d) crear variantes de la proteína alterando dichos dominios del modelo tridimensional; e) seleccionar variantes con termotolerancia y actividad específica de fitasas al menos iguales a la proteína de la etapa a); y f) someter a ensayo las variantes para determinar su sensibilidad a una proteasa donde la sensibilidad da como resultado la digestión de la variante cuando se expone a la proteasa.

Description

DESCRIPCIÓN

Generación por ingeniería genética de proteínas enzimáticamente susceptibles Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo de la biología molecular, la biología computacional y, más 5 específicamente, a métodos de ingeniería genética de proteínas mediante un diseño racional para generar proteínas con una susceptibilidad enzimática aumentada.

Antecedentes de la invención

Los procesos industriales requieren con frecuencia la adición de proteínas para realizar una función específica dentro de un proceso. La demanda de proteínas con características nuevas o diferentes crece a medida que los 10 procesos industriales evolucionan y se vuelven más eficaces. Un método para desarrollar proteínas con nuevas características es modificar por ingeniería genética proteínas usadas actualmente para que contengan nuevas características y, de este modo, generar nuevas variantes de la proteína. La ingeniería genética de proteínas se ha centrado en el desarrollo de termotolerancia en muchas enzimas. Por ejemplo, el documento US 2007/196449 describe un método para obtener mutantes de la fitasa PhyA de Aspergillus niger con una termoestabilidad 15 mejorada. La ingeniería genética de proteínas también ha desarrollado proteínas que tienen una mayor sensibilidad a enzimas. Por ejemplo, el documento US 2004/096934 describe proteínas Cry de Bacillus subtilis que presentan un aumento de la sensibilidad a la pepsina, una enzima específica del tracto digestivo de los mamíferos. La presente

solicitud describe el uso de técnicas de ingeniería genética de proteínas para generar por ingeniería genética

variantes enzimáticamente susceptibles de una proteína. Los métodos descritos pueden usarse en una diversidad de 20 proteínas. Además, los métodos descritos pueden usarse para generar por ingeniería genética una susceptibilidad enzimática a una amplia variedad de proteasas.

Sumario de la invención

Se describe un método de generación de proteínas por ingeniería genética con una susceptibilidad aumentada a una proteasa, en particular un método para aumentar la sensibilidad de una fitasa a una proteasa que comprende las 25 siguientes etapas en el orden de:

a) crear variantes con estabilidad termodinámica aumentada;

b) modelar la estructura tridimensional de la proteína;

c) identificar dominios del modelo tridimensional, donde los dominios se seleccionan del grupo constituido por dominios de glicosilación, residuos de cisteína y bucles de una estructura proteica que están expuestos al medio

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d) crear variantes de la proteína alterando dichos dominios del modelo tridimensional;

e) seleccionar variantes con termotolerancia y actividad específica de fitasas al menos iguales a la proteína; y

f) someter a ensayo las variantes para determinar su sensibilidad a una proteasa donde la sensibilidad da como resultado la digestión de la variante cuando se expone a la proteasa.

35 La ingeniería genética de proteínas mediante un diseño racional se basa en el modelo estructural tridimensional de una proteína y la posterior identificación de dominios proteicos que pueden modificarse sin efectos perjudiciales sobre los sitios de unión, sitios activos y la estructura tridimensional global. Cualquier fitasa puede modificarse por ingeniería genética para aumentar su susceptibilidad a cualquier proteasa.

Descripción detallada de la invención

40 Los procesos industriales usan proteínas como un componente de fabricación. Las proteínas que son enzimas son particularmente útiles como componentes en procesos industriales, puesto que catalizan reacciones que convierten un sustrato de una forma en otra. Las características de una proteína y, en particular, el perfil de actividad (es decir, temperatura, pH, concentración salina, iones, etc. óptimos) de una enzima contribuye a la utilidad de una proteína para un proceso particular. A medida que se desarrollan nuevos procesos industriales, existe una demanda creciente 45 de proteínas con características modificadas. Las nuevas características que se buscan pueden ser, además del conjunto actual de características de las proteínas, o pueden implicar la modificación de una característica. Las características de las proteínas pueden incluir, pero sin limitación, características del perfil de actividad, capacidad para absorber agua, capacidad para impedir la absorción de agua, capacidad gelificante, etc. Por ejemplo, puede desearse generar por ingeniería genética una proteína que presente termotolerancia y estabilidad ácida con la 50 característica adicional de una susceptibilidad aumentada a digestión por proteasas. En este ejemplo, las características originales de la proteína (termotolerancia y estabilidad ácida) deben conservarse, al tiempo que se añade la nueva característica (sensibilidad aumentada a una proteasa). También puede tenerse en cuenta la

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actividad específica de una enzima en la que la “actividad específica” de una enzima se define como la cantidad de sustrato que es capaz de convertir o catalizar una enzima a lo largo de una unidad de tiempo dada.

Existen varias técnicas disponibles para evolucionar proteínas para generar variantes con características modificadas. Por ejemplo, las técnicas basadas en cambios de aminoácidos aleatorios o mutagénesis aleatoria incluyen mutagénesis química (Smith, Ann. Rev. Genet. 19: 423-462 (1985)), evolución directa; (Patente de Estados Unidos N° 5.830.696); mutagénesis de saturación de sitio génico (GsSm) (Patentes de Estados Unidos N° 6.171.820 y 6.579.258), ensamblaje de genes mediado por exonucleasa en la evolución dirigida (Patentes de Estados Unidos N° 6.361.974 y 6.352.842), selección final en la evolución dirigida (Patentes de Estados Unidos N° 6.358.709 y 6.238.884), barajado de síntesis basado en recombinación (Patentes de Estados Unidos N° 5.965.408 y 6.440.668 y Patente Australiana N° AU724521) y evolución dirigida de enzimas termófilas (Patentes de Estados Unidos N° 5.830.696 y 6.335.179). Estas técnicas dan origen a una combinación de variantes con mutaciones aleatorias y, después, esta combinación de variantes se explora para identificar las variantes individuales con el conjunto de características deseadas.

Una alternativa a la mutagénesis aleatoria es el diseño racional, en el que se identifican regiones específicas de la proteína para una modificación basada en lo que se sabe de la propia proteína. El diseño racional incorpora los conocimientos de la estructura tridimensional, la localización del sitio o sitios activos y la localización de un sitio o sitios de unión importantes para predecir regiones de la proteína que pueden modificarse. Con esta información, pueden generarse proteínas con modificaciones específicas y ensayarse para determinar su actividad. Las modificaciones específicas pueden realizarse individualmente o en combinaciones con otras modificaciones para observar los efectos combinados de varios cambios en la estructura proteica (Fersht, y col., Angewandte Chemie Int. Ed. 23: 467-538 (1984)).

El diseño racional tiene en cuenta la relación entre las características de la proteína, el modelo tridimensional y el grado en el que la proteína puede modificarse es complejo. Las mutaciones a generar en la proteína se mapean en el modelo tridimensional y se tienen en cuenta los sitios de unión, los sitios activos y la estructura proteica; este análisis pretende aumentar la probabilidad de generar variantes que conserven la actividad además de presentar las nuevas características. Además, el número de variantes exploradas es relativamente bajo en comparación con el número de variantes exploradas usando una mutagénesis aleatoria.

El diseño racional se facilita por un entendimiento del modelo tridimensional de la proteína. El modelo tridimensional puede elucidarse por métodos que determinan físicamente la estructura tridimensional de la proteína, tales como cristalografía de rayos X y RMN (resonancia magnética nuclear) o puede modelarse informáticamente. Se conocen bien en la técnica métodos para resolver físicamente la estructura cristalina de la proteína (Schuetz, y col., EMBO J. 25: 4245-4252 (2006); Peterson y col. Mol. Cell 13: 665-676 (2004); Allingham y col. Cell 128: 1161-1172 (2007)).

En la biología computacional existen tres métodos diferentes para la predicción/modelado de la estructura tridimensional de una proteína; ab initio, modelado por homología y enhebrado de proteínas. Los métodos de modelado de proteínas ab initio o de novo buscan construir modelos proteicos tridimensionales “desde el principio”, es decir, basándose en los principios físicos más que directamente en estructuras físicas previamente resueltas. Existen muchos procedimientos posibles que intentan mimetizar el plegamiento de proteínas o aplicar algún método estocástico para buscar posibles soluciones. Estos procedimientos tienden a requerir grandes recursos informáticos y se han llevado a cabo para proteínas pequeñas.

El modelado por homología se basa en la asunción razonable de que dos proteínas homólogas compartirán estructuras muy similares. Debido a que el plegamiento de una proteína está más conservado evolutivamente que su secuencia de aminoácidos, puede modelarse una secuencia diana con una precisión razonable sobre un molde muy lejanamente relacionado, con tal de que la relación entre la diana y el molde pueda apreciarse a través del alineamiento de secuencias. Se ha sugerido que el principal cuello de botella en el modelado comparativo surge de dificultades en el alineamiento más que de errores en la predicción de la estructura dado un buen alineamiento conocido. Como era de esperar, el modelado por homología es más preciso cuando la diana y el molde tienen secuencias similares. El método de modelado por homología, como se proporciona por el programa informático Modeler (Accelrys Inc.), puede usarse para modelar la estructura tridimensional de proteínas homólogas sin la necesidad de resolver la estructura real por rayos X o RMN (Webster “Protein Structure Prediction, Methods and Protocols”; Methods in Molecular Biology; Humana Press vol 143 (2000) y Bourne y Weissig, “Structual Bioinformatics”, Wiley-Liss Publisher (2003)).

El método de enhebrado de proteínas enhebra la secuencia de aminoácidos de una secuencia diana con una estructura desconocida a través de una biblioteca de plegamientos estructurales de proteínas clasificados. En cada caso, se usa una función de puntuación para evaluar la compatibilidad de la secuencia con la estructura, seleccionando de este modo el molde tridimensional más posible para modelar la proteína diana. Este tipo de método se conoce también como reconocimiento de plegamiento 3D-1D debido a su análisis de compatibilidad entre estructuras tridimensionales y secuencias proteicas lineales. Este método también ha dado origen a métodos que realizan una búsqueda de plegamiento inverso por evaluación de la compatibilidad de una estructura dada con una extensa base de datos de secuencias, prediciendo de este modo qué secuencias tienen el potencial de producir un plegamiento dado.

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Una vez que se genera el modelo tridimensional de la proteína, sirve como fundamento para añadir información adicional conocida acerca de la proteína. Es importante identificar regiones de la proteína que se sabe que son necesarias para una actividad básica, tales como dominios de unión y sitios activos. Las regiones conservadas de una proteína pueden proporcionar una percepción de áreas de la proteína que deberían evitarse cuando se realizan modificaciones. La compresión de las estructuras físicas de la proteína que son necesarias para la actividad ayuda a identificar áreas que pueden modificarse. Generalmente, las áreas que pueden modificarse son las que no contribuyen a la formación de dominios de unión o sitios activos. Además, las áreas de la proteína seleccionadas para la modificación no deberían interferir con los dominios de unión o sitios activos una vez que se hayan realizado las modificaciones. Por lo tanto, todas las modificaciones en la proteína se mapean sobre el modelo tridimensional usando técnicas informáticas, tales como el programa MODELER de Accelyrs para determinar si se conserva la estructura básica de la proteína.

La actividad de proteínas variantes generadas por mutagénesis aleatoria o diseño racional se evalúa para seleccionar variantes que cumplan unos criterios específicos. Estos criterios específicos coinciden con las nuevas características deseadas en la proteína. Estas nuevas características pueden incluir, pero sin limitación, una actividad catalítica modificada de una enzima, actividad a una temperatura superior o inferior, actividad en un intervalo amplio o estrecho de temperatura, actividad a un pH superior o inferior, actividad en un intervalo amplio o estrecho de pH, sensibilidad a la degradación a un pH superior o inferior, susceptibilidad aumentada a la digestión por una proteasa o resistencia aumentada a la digestión por una proteasa. Un especialista en la técnica será capaz de tomar la información descrita en este documento y diseñar y generar un intervalo de variantes de una proteína con características o actividad proteica modificada.

Se han empleado técnicas de diseño racional para desarrollar variantes de proteínas con características específicas tales como termotolerancia (Perry y Wetzel, Science 226: 555-557 (1984); Sauer y col., Biochemistry 25: 5992-5998 (1986); Volkin y col. J. of Biol. Chem 262: 2945-2950 (1987); Roesler y col. Protein Science 9: 1642-1650 (2000)), estabilidad en presencia de proteasas (Wyss y col. Applied and Enviro. Micro. 65: 359-366 (1999)) y estabilidad a pH reducido (Kim y col Applied and Enviro. Micro. 72: 4397-4403 (2006)). También se han empleado técnicas de diseño racional para desarrollar protoxinas insecticidas que cuando se exponen a un intestino de insecto se escinden por una proteasa de intestino de insecto para liberar una toxina insecticida (solicitud de patente de Estados Unidos 10/229.346). En este documento se describen métodos para usar técnicas de diseño racional con el fin de desarrollar proteínas con una susceptibilidad aumentada a proteasas en la que la susceptibilidad conduce a una inactivación de la proteína.

Los siguientes factores relacionados con la estructura proteica pueden contribuir a aumentar la sensibilidad de la proteína a proteasas; el grado y la localización de glicosilaciones, el grado de formación de puentes disulfuro, la localización y la secuencia de sitios de escisión de proteasas potenciales y bucles de proteínas que pueden modificarse para contener sitios de escisión de proteasas altamente favorables.

La glicosilación puede tener varios efectos sobre las propiedades de una enzima. En primer lugar, puede tener un impacto sobre la estabilidad de una proteína o puede influir en las propiedades catalíticas. En segundo lugar, en el caso de una modificación con carbohidratos ácidos, puede influir en el pI de una proteína y de este modo cambiar el comportamiento de la proteína durante la purificación. Y en tercer lugar, por desviación de la energía metabólica puede disminuir el nivel de expresión de una enzima (Wyss y col. Applied and Enviro. Micro. 65: 359-366 (1999)). La glicosilación de una proteína implica añadir cadenas de glucanos a la proteína que pueden interferir físicamente con la capacidad de una proteasa para contactar con un sitio de unión (Bagger y col. Biochemistry 42: 10295-10300 (2003)). La disminución de la glicosilación de una proteína puede aumentar la sensibilidad a una proteasa por apertura de la estructura de la proteína para permitir la interacción de la proteasa con sitios de unión potenciales.

Las estructuras proteicas altamente estables (o plegamientos de proteínas) pueden impedir que la proteína se despliegue lo suficiente para permitir que una proteasa acceda a sitios de escisión potenciales que estén dentro de la estructura proteica tridimensional. Los puentes disulfuro contribuyen a la estabilidad de una estructura tridimensional por formación de puentes entre restos de cisteína que se aproximan físicamente entre sí cuando se pliega la proteína. Estos restos de cisteína no están necesariamente próximos entre sí cuando se examina la secuencia de aminoácidos lineal de la proteína. Véase Stryer, Biochemistry 4a Ed., W. H. Freeman y Co, Nueva York (1995). El reemplazo de restos de cisteína específicos puede disminuir el grado de puentes disulfuro intramoleculares que puede desestabilizar una proteína lo suficiente como para permitir que una proteasa acceda a un sitio de escisión que esté interno en la proteína plegada.

La incorporación de sitios de escisión de proteasas puede aumentar la sensibilidad a una proteasa. Las secuencias proteicas nativas que son similares a un sitio de escisión de proteasas de gran afinidad pueden modificarse para reflejar un sitio altamente favorable. Este tipo de modificación en la secuencia de la proteína representa una modificación minoritaria en la proteína. Como alternativa, pueden introducirse sitios de escisión de proteasas altamente favorables en la proteína de novo que representan una modificación importante en la proteína. En cualquier caso, el cambio minoritario o importante en la proteína, el modelo tridimensional se usa para identificar regiones de la proteína plegada que son candidatas para dicha modificación. En particular, los bucles de proteínas que se expone al medio circundante son candidatos para la modificación. Además, estos bucles no deberían interferir con los sitios de unión o sitios activos en la proteína.

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Generalmente se piensa que la estabilidad estructural de una proteína está unida a la capacidad de la proteína de resistir condiciones extremas tales como de temperatura y pH. Las características estructurales tales como glicosilación y formación de puentes disulfuro contribuyen a la estabilidad de una proteína y también pueden contribuir a aumentar una capacidad de proteínas a resistir condiciones extremas de temperatura y pH. A estas mismas características estructurales, es decir, glicosilación y formación de puentes disulfuro se dirigen para modificar por ingeniería genética la susceptibilidad enzimática. El desacoplamiento de la actividad en condiciones extremas de características que potencian la estabilidad de la proteína plegada es un desafío para modificar por ingeniería genética proteínas enzimáticamente susceptibles.

Las consideraciones descritas anteriormente para la generación de proteínas por ingeniería genética con una susceptibilidad aumentada a proteasas conducen al diseño de una diversidad de mutaciones que afectan a la glicosilación, formación de puentes disulfuro y generación de sitios de escisión de proteasas altamente favorables. Las modificaciones predichas en la secuencia proteica pueden generarse como modificaciones individuales o en diversas combinaciones (Roesler y col. Protein Science 9: 1642-1650 (2000)). Por ejemplo, puede ser que se encuentre que existen múltiples sitios de glicosilación en una proteína particular. Estos sitios pueden modificarse de uno en uno o pueden modificarse todos en una sola variante. Como otro ejemplo, un sitio de glicosilación y la modificación de un puente disulfuro pueden combinarse en una sola variante. En esencia, las variaciones identificadas a través del análisis del modelo tridimensional pueden considerarse módulos que pueden combinarse a voluntad para generar variantes para ensayo.

Los términos dominio y sitio, cuando se refieren a una proteína, se usan de forma intercambiable y pueden referirse a secuencias de aminoácidos lineales identificadas dentro de una proteína o pueden referirse a áreas estructurales que existen cuando la proteína está en un estado plegado.

Una realización de la invención es un método de aumento de la susceptibilidad enzimática por técnicas de diseño racional, en el que la estructura tridimensional de una proteína se modela y la posterior identificación de características de la proteína se selecciona del grupo constituido por sitios de unión, sitios activos, sitios de glicosilación, puentes disulfuro y bucles de proteínas expuestos al medio circundante.

Otra realización de la invención es un método de aumento de la susceptibilidad enzimática por técnicas de diseño racional en el que la proteína diana se modifica primero por ingeniería genética para tener una estructura tridimensional más estable. La estabilidad puede aumentarse a través de un diseño racional o técnicas de mutagénesis aleatoria. La estabilidad puede medirse por la capacidad de la proteína para funcionar en condiciones de temperatura más elevada (estabilidad termodinámica) o en condiciones de pH extremo. La estabilidad puede adoptar muchas formas, tales como puentes disulfuro que estabilizan interacciones intramoleculares, además de modificaciones en las estructuras de plegamiento que contribuyen a una estructura tridimensional más compacta (estabilidad conformacional). Se conocen en la técnica métodos para modificar por ingeniería genética la termoestabilidad en una proteína, tales como Nosoh y col. TIBTECH Vol 8: 16-20 (1990) e Imanaka y col. Nature vol. 324: 695-697 (1986).

La estabilidad termodinámica se define en términos de temperatura y actividad y se determina por comparación de la actividad de la variante con la proteína de partida. La temperatura máxima de la proteína se determina por mantenimiento de la proteína a una temperatura especificada y después medición de la actividad de la proteína. La temperatura máxima se define como la temperatura en la que la proteína conserva aproximadamente el 50% de la actividad después de mantenerse durante 5 minutos a una temperatura especificada. Una variante termoestable es una en la que la variante presenta al menos el 50% de la actividad cuando se mantiene durante 5 minutos a una temperatura que es 5 grados C superior a la temperatura máxima de la proteína. Por ejemplo, si la proteína de partida conserva el 50% de actividad cuando se mantiene durante 5 minutos a 45 grados C, entonces las variantes termoestables serán todas las variantes que conserven al menos el 50% de la actividad cuando se mantienen a 50 grados C durante 5 minutos.

Cualquier proteína puede modificarse por ingeniería genética para ser más enzimáticamente susceptible en base a la descripción anterior. Las proteínas que tienen una función en un proceso industrial sirven como buenas candidatas para la ingeniería genética dirigida debido a pueden conocerse ya las características estructurales y funcionales de la proteína. La información estructural y funcional sirve como un fundamento para modificar adicionalmente la proteína para que sea enzimáticamente susceptible. Existen una diversidad de proteínas con importancia para procesos industriales, incluyendo: enzimas o proteínas que contribuyen a un rasgo de valor añadido, proteínas que confieren resistencia a enfermedades o plagas en plantas transgénicas, proteínas o enzimas que confieren tolerancia a herbicidas en una planta transgénica.

Los ejemplos de genes que confieren o contribuyen a un rasgo de valor añadido incluyen, pero sin limitación, una enzima fitasa que degrada el fitato, un elemento no nutritivo en piensos animales a base de cereal. Por ejemplo, véase Van Hartingsveldt y col., Gene 127: 87 (1993), para una descripción de la secuencia de nucleótidos de un gen de fitasa de Aspergillus niger. Podría introducirse un gen que reduzca el contenido de fitato. En el maíz, por ejemplo, esto puede conseguirse por clonación y después reintroducción de ADN asociado con el alelo individual que es responsable de mutantes de maíz caracterizados por niveles reducidos de ácido fítico. Véase, Raboy y col., Maydica 35: 383 (1990). La composición de carbohidratos modificada efectuada, por ejemplo, por transformación de plantas

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con un gen que codifica una enzima que modifica el patrón de ramificación del almidón. Véase Shiroza y col., J. Bacteriol. 170: 810 (1988) (secuencia de nucleótidos del gen de la fructosiltransferasa de Streptococcus mutans), Steinmetz y col., Mol Gen. Genet. 200: 220 (1985) (secuencia de nucleótidos del gen de la levansucrasa de Bacillus subtilis), Pen y col., Bio/Technology 10: 292 (1992) (producción de plantas transgénicas que expresan a-amilasa de Bacillus licheniformis), Elliot y col., Plant Molec. Biol. 21: 515 (1993) (secuencias de nucleótidos de genes de la invertasa del tomate), S.o-gaard y col., J. Biol. Chem. 268: 22480 (1993) (mutagénesis dirigida de la cebada (gen de la a-amilasa), y Fisher y col., Plant Physiol. 102: 1045 (1993) (enzima ramificante del almidón del endospermo de maíz II). Proteínas que modifican el sabor del alimento tales como la proteína brazeína.

Los genes que confieren resistencia a plagas o enfermedades también pueden modificarse por ingeniería genética para ser enzimáticamente susceptibles. Las defensas de las plantas se activan con frecuencia mediante la interacción específica entre el producto de un gen de resistencia a enfermedad en la planta y el producto de un gen de avirulencia correspondiente en el patógeno. Una planta puede transformarse con un gen de resistencia clonado para generar por ingeniería genética plantas que sean resistentes a cepas de patógeno específicas. Véase, por ejemplo Jones y col., Science 266: 789 (1994) (clonación del gen Cf-9 del tomate para resistencia a Cladosporium fulvum); Martin y col., Science 262: 1432 (1993) (el gen Pto del tomate para resistencia a Pseudomonas syringae pv. tomato codifica una proteína quinasa); Mindrinos y col. Cell 78: 1089 (1994) (gen RSP2 de Arabidopsis para resistencia a Pseudomonas syringae). Una proteína de Bacillus thuringiensis, un derivado de la misma o un polipéptido sintético modelado sobre ella. Véase, por ejemplo, Geiser y col., Gene 48: 109 (1986), que describen la clonación y la secuencia de nucleótidos de un gen de delta-endotoxina Bt. Además, pueden adquirirse moléculas de ADN que codifican genes de delta-endotoxina de la Colección Americana de Cultivos Tipo (Rockville, Md.), por ejemplo, bajo los números de acceso de la ATCC 40098, 67136, 31995 y 31998. Existen muchos ejemplos de proteínas de Bacillus thuringiensis que incluyen, pero sin limitación, Cry1A, Cry1B, Cry3A, Cry4A y Cry9C. Una lectina, como se describe por Van Damme y col., Plant Molec. Biol. 24: 25 (1994), que describen las secuencias de nucleótidos de varios genes de lectina de unión a manosa de Clivia miniata. Una proteína de unión a vitaminas tal como avidina, como se describe en la solicitud PCT US93/06487, muestra el uso de avidina y homólogos de avidina como larvicidas frente a plagas de insectos. Un inhibidor de enzimas, por ejemplo, un inhibidor de proteasa o un inhibidor de amilasa, por ejemplo, Abe y col., J. Biol. Chem. 262: 16793 (1987) (secuencia de nucleótidos del inhibidor de la cisteína proteinasa del arroz), Huub y col., Plant Molec. Biol. 21: 985 (1993) (secuencia de nucleótidos del ADNc que codifica el inhibidor de la proteinasa del tabaco I) y Sumitani y col., Biosci. Biotech. Biochem. 57: 1243 (1993) (secuencia de nucleótidos de Streptomyces nitrosporeus (inhibidor de x-amilasa). Un péptido o neuropéptido específico de insecto que, tras la expresión, altere la fisiología de la plaga afectada. Por ejemplo, véanse las descripciones de Regan, J. Biol. Chem. 269: 9 (1994) (la clonación de expresión produce ADN que codifica el receptor de la hormona diurética de insectos) y Pratt y col., Biochem. Biophys. Res. Comm. 163: 1243 (1989) (se identifica una alostatina en Diploptera puntata). Véase también la Patente de Estados Unidos N° 5.266.317 que describe genes que codifican neurotoxinas paralíticas específicas de insecto. Un veneno específico de insectos producido en la naturaleza por una serpiente, una avispa, etc. Por ejemplo, véase Pang y col., Gene 116: 165 (1992), para la descripción de la expresión heteróloga en plantas de un gen que codifica un péptido insectotóxico de escorpión. Una enzima implicada en la modificación, incluyendo la modificación postraduccional de una molécula biológicamente activa; por ejemplo, una enzima glicolítica, una enzima proteolítica, una enzima lipolítica, una nucleasa, una ciclasa, una transaminasa, una esterasa, una hidrolasa, una fosfatasa, una quinasa, una fosforilasa, una polimerasa, una elastasa, una quitinasa y una glucanasa, ya sean naturales o sintéticas. Véase la solicitud PCT WO 93/02197 a nombre de Scott y col., que describe la secuencia de nucleótidos de un gen de calasa. Pueden obtenerse moléculas de ADN que contienen secuencias que codifican quitinasa, por ejemplo, de la ATCC bajos los N° de Acceso 39637 y 67152. Véase también Kramer y col., Insect Biochem. Molec. Biol. 23: 691 (1993), que muestran la secuencia de nucleótidos de una ADNc que codifica la quitinasa del anquilostoma del tabaco y Kawalleck y col., Plant Molec. Biol. 21: 673 (1993), que proporcionan la secuencia de nucleótidos del gen de la poliubiquitina ubi4-2 del perejil. Una molécula que estimula la transducción de señales. Por ejemplo, véase la descripción por Botella y col., Plant Molec. Biol. 24: 757 (1994), de secuencias de nucleótidos para clones de ADNc de la calmodulina del frijol chino y Griess y col., Plant Physiol. 104: 1467 (1994), que proporcionan la secuencia de nucleótidos de un clon de ADNc de calmodulina del maíz. Una permeasa de la membrana, un formador de canales, un bloqueante de canales, por ejemplo, véase la descripción por Jaynes y col., Plant Sci. 89: 43 (1993), de la expresión heteróloga de un análogo peptídico cecropin-beta-lítico para dar plantas de tabaco transgénicas resistentes a Pseudomonas solanacearum. Una proteína invasiva viral o una toxina compleja derivada de la misma. Por ejemplo, la acumulación de proteínas de cubierta viral en células vegetales transformadas confiere resistencia a infecciones víricas y/o al desarrollo de enfermedades producidas por el virus del que procede el gen de la proteína de cubierta, así como por virus relacionados. Véase Beachy y col., Ann. Rev. Phytopathol. 28: 451 (1990). La resistencia mediada por proteína de cubierta se ha conferido sobre plantas transformadas frente al virus del mosaico de la alfafa, el virus del mosaico del pepino, el virus de la estría del tabaco, el virus X de la patata, el virus Y de la patata, el virus del grabado del tabaco, el virus del traqueteo del tabaco y el virus del mosaico del tabaco. Un anticuerpo específico de insectos o una inmunotoxina derivada del mismo. Por lo tanto, un anticuerpo dirigido contra una función metabólica crítica en el intestino del insecto inactivaría una enzima afectada, destruyendo al insecto. Consúltese Taylor y col., Resumen N° 497, Seventh Int'l Symposium On Molecular Plant-Microbe Interactions (Edimburgo, Escocia, 1994) (inactivación enzimática en tabaco transgénico a través de la producción de fragmentos de anticuerpo de cadena sencilla). Un anticuerpo específico de virus. Véase, por ejemplo, Tavladoraki y col., Nature 366: 469 (1993), que muestran que plantas transgénicas que expresan genes de anticuerpos recombinantes están

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protegidas del ataque de virus. Una proteína de interrupción del desarrollo producida en la naturaleza por un patógeno o un parásito. Por lo tanto, las endo-alfa-1,4-D-poligalacturonasas fúngicas facilitan la colonización fúngica y la liberación de nutrientes vegetales por solubilización de la homo-alfa-1,4-D-galacturonasa de la pared celular vegetal. Véase Lamb y col., Bio/Technology 10: 1436 (1992). La clonación y la caracterización de un gen que codifica una proteína inhibidora de la endopoligalacturonasa de la judía se describe por Toubart y col., Plant J. 2: 367 (1992). Una proteína de interrupción del desarrollo producida en la naturaleza por una planta. Por ejemplo, Logemann y col., Bio/Technology 10: 305 (1992), han demostrado que las plantas transgénicas que expresan el gen inactivador del ribosoma de la cebada tienen una resistencia aumentada a enfermedades fúngicas.

Los genes que confieren resistencia a un herbicida, por ejemplo, también pueden modificarse por ingeniería genética para ser enzimáticamente susceptibles. Por ejemplo, proteínas que median la tolerancia a un herbicida que inhibe el punto de crecimiento o meristemo, tales como una imidazalinona o una sulfonilurea. Los genes ejemplares en esta categoría codifican una enzima ALS y AHAS mutante como se describe, por ejemplo, por Lee y col., EMBO J. 7: 1241 (1988) y Miki y col., Theor. Appl. Genet. 80: 449 (1990), respectivamente. Glifosato (resistencia conferida por genes de 5-enolpiruvil-3-fosfiquimato sintasa (EPSP) y aroA mutantes, respectivamente) y otros compuestos fosfono tales como glufosinato (genes de fosfinotricin acetil transferasa (pAt) y fosfinotricin acetil transferasa de Streptomyces hygroscopicus (bar)) y ácidos piridinoxi o fenoxi propriónicos y ciclohexonas (genes que codifican un inhibidor de ACCasa). Véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 4.940.835, que describe la secuencia de nucleótidos de una forma de EpSp que puede conferir resistencia a glifosato. Puede obtenerse una molécula de ADN que codifica un gen aroA mutante bajo el N° de acceso de la ATCC 39256, y la secuencia de nucleótidos del gen mutante se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.769.061. La solicitud de patente europea N° 0 333 033 y la Patente de Estados Unidos N° 4.975.374 describen secuencias de nucleótidos de genes de glutamina sintetasa que confieren resistencia a herbicidas tales como L-fosfinotricina. La secuencia de nucleótidos de un gen de fosfinotricin-acetil-transferasa se proporciona en la solicitud europea N° 0 242 246. De Greef y col., Bio/Technology 7: 61 (1989), describen la producción de plantas transgénicas que expresan genes bar quiméricos que codifican actividad fosfinotricina acetil transferasa. Son ejemplos de genes que confieren resistencia a ácidos fenoxi propiónicos y ciclohexonas, tales como setoxidim y haloxifop, los genes Acc1-S1, Acc1-S2 y Accl-S3 descritos por Marshall y col., Theor. Appl. Genet. 83: 435 (1992). Un herbicida que inhibe la fotosíntesis, tal como una triazina (genes psbA y gs+) y un benzonitrilo (gen de nitrilasa). Przibilla y col., Plant Cell 3: 169 (1991), describen la transformación de Chlamydomonas con plásmidos que codifican genes psbA mutantes. Se describen secuencias de nucleótidos para genes de nitrilasa en la Patente de Estados Unidos N° 4.810.648 y están disponibles moléculas de ADN que contienen estos genes bajo los N° de Acceso de la ATCC 53435, 67441 y 67442. La clonación y la expresión de ADN que codifica una glutatión S-transferasa se describe por Hayes y col., Biochem J. 285: 173 (1992).

Puede modificarse por ingeniería genética la susceptibilidad enzimática para generar una proteína susceptible a cualquier proteasa. Las proteasas son enzimas que hidrolizan enlaces peptídicos (Barrett, y col. Handbook of Proteolytic Enzymes, Academic Press, San Diego, San Francisco, Nueva York, Boston, Londres, Sydney, Tokio (1998)). Puede hacerse referencia a proteasas como peptidasas y generalmente están dentro de una de las clases de serina peptidasas, cisteína peptidasas, aspártico peptidasas y metalopeptidasas. Las proteasas específicas incluyen, pero sin limitación, pepsina, tripsina, quimotripsina, endopeptidasa pancréatica, catepsina G, quimasa, triptasa, papaína, elastasa, carboxipeptidasa, quimopapaína, caspasa-1 y dipeptidasa E. Puede encontrarse una amplia lista de proteasas en el Handbook of Proteolytic Enzymes al que se ha hecho referencia anteriormente.

Otro aspecto de la descripción es un casete de expresión en el que una proteína enzimáticamente susceptible está unida operativamente a al menos un elemento regulador, tal como un promotor, un potenciador, un intrón, una secuencia de terminación o cualquier combinación de los mismos y, opcionalmente, a una secuencia señal que dirige la proteína enzimáticamente susceptible a una localización celular particular, por ejemplo, vacuola, aleurona, embrión o retículo endoplásmico. Los casetes de expresión también pueden comprender cualquier elemento adicional necesario o seleccionado para la expresión de la proteína enzimáticamente susceptible. Dichos elementos incluyen, pero no se limitan a, terminadores de la transcripción, secuencias extrañas para potenciar la expresión tales como intrones, secuencias virales y secuencias destinadas a la dirección del producto génico a orgánulos y compartimentos celulares específicos. La expresión unida operativamente se refiere a unida como parte de la misma molécula de ácido nucleico, convenientemente colocada y orientada. En el caso de elemento reguladores, la orientación de los elementos reguladores (es decir, con sentido o antisentido) puede no afectar a la capacidad de los elementos reguladores para influir en la transcripción.

Los ejemplos representativos de promotores incluyen, pero sin limitación, promotores que se sabe que controlan la expresión de genes en células procariotas o eucariotas o sus virus. Las células procariotas se definen como células que no tienen un núcleo y pretenden incluir la clase recientemente identificada de arqueobacterias. En un aspecto, el casete de expresión comprende un promotor bacteriano. Los ejemplos de promotores bacterianos incluyen, pero sin limitación, lac o trp de E. coli, el promotor Pl del fago lambda, lacI, lacZ, t3, T7, gpt y Pr de lambda. Los promotores eucariotas incluyen, pero sin limitación, el temprano inmediato de CMV, timidina quinasa de HSV, SV40 temprano y tardío, LTR de retrovirus y metalotioneína I de ratón. Se describen en general promotores procariotas y eucariotas en Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Segunda edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, (1989); Ausubel y col., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Nueva York, (1987); Kriegler, Gene Transfer and Expression: A Laboratory Manual (1990).

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Otro aspecto de la descripción es un casete de expresión en el que una proteína enzimáticamente susceptible está unida operativamente a un promotor capaz de la expresión en una célula de levadura. Cualquier promotor capaz de expresarse en huéspedes de levadura puede usarse como el promotor. Los ejemplos incluyen promotores para genes de hexoquinasa y similares en la ruta glicolítica y promotores tales como el promotor gal 1, promotor gal 10, promotor de proteína de choque térmico, promotor MFa-1 y promotor CUP 1. Pueden encontrarse ejemplos de promotores de levaduras en MacPherson y col Micro. and Molec. Bio. Revs. 70: 583-604 (2006).

Otro aspecto de la descripción es un casete de expresión en el que una proteína enzimáticamente susceptible está unida operativamente a un promotor capaz de la expresión en hongos filamentosos. Puede usarse cualquier promotor capaz de la expresión en hongos filamentosos. Son ejemplos un promotor para glucoamilasa o alfa- amilasa del género Aspergillus (DeVries y col. Micro. and Molec. Bio. Revs. 65: 497-522 (2001)) o celulasa (celobiohidrasa) del género Trichoderma, un promotor para enzimas en la ruta glicolítica, tales como fosfoglicerato quinasa (pgk) y glicerilaldehído 3-fosfato deshidrogenasa (gpd), etc. Pueden encontrarse ejemplos de promotores caracterizados en hongos filamentosos en Lorang y col. Appl. and Enviro. Micro. 67: 1987-1994 (2001).

Otro aspecto de la descripción es un casete de expresión en el que una proteína enzimáticamente susceptible está unida operativamente a un promotor capaz de la expresión en plantas. La selección del promotor a usar en casetes de expresión determinará el patrón de expresión espacial y temporal de la proteína enzimáticamente susceptible en la planta transgénica. Los promotores seleccionados expresarán transgenes en tipos celulares preferidos (tales como células epidérmicas de la hoja, células del mesófilo, células de la corteza de la raíz) o en tejidos u órganos preferidos (raíces, hojas o flores, por ejemplo) o en fase preferidas del desarrollo vegetal (desarrollo de flores, desarrollo de las hojas o fase de crecimiento de la planta, por ejemplo) y la selección debería reflejar la localización deseada de acumulación del producto génico. Como alternativa, el promotor seleccionado puede dirigir la expresión del gen en diversas condiciones, de inducción. Los promotores pueden variar en su potencia, es decir, en su capacidad para promover la transcripción. Dependiendo del sistema celular huésped utilizado, puede usarse uno cualquiera de varios promotores adecuados, incluyendo el promotor nativo del gen. Los promotores que son útiles para la expresión de transgenes en plantas incluyen los que son inducibles, virales, sintéticos, constitutivos, regulados temporalmente, regulados espacialmente, específicos de tejido y regulados espacio-temporalmente.

Un aspecto de la descripción es un casete de expresión en el que la proteína enzimáticamente susceptible está unida operativamente a un promotor constitutivo capaz de la expresión en plantas. Los ejemplos de algunos promotores constitutivos que se han descrito incluyen la actina 1 del arroz (Wang y col., Mol. Cell. Biol., 12: 3399 (1992); Patente de Estados Unidos N° 5.641.876; McElroy y col. Plant Cell 2: 163-171 (1990)). Los promotores 35S de CaMV (Odell y col., Nature 313: 810 (1985)), 19S de CaMV (Lawton y col., Mol. Cell. Biol. 7: 335 (1987)), de la sucrosa sintasa y de ubiquitina (Binet y col. Plant Science 79: 87-94 (1991); Christensen y col. Plant Molec. Biol. 12: 619-632 (1989); Norris y col., Plant Mol. Biol. 21: 895-906 (1993)).

Un aspecto de la descripción es un casete de expresión en el que la proteína enzimáticamente susceptible está unida operativamente a un promotor vegetal inducible. Los promotores inducibles que se han descrito incluyen los promotores inducibles de ABA y turgor, el promotor del gen de la proteína de unión a auxina (Schwob y col., Plant J. 4: 423 (1993)), el promotor del gen de la UDP glucosa flavonoide glicosil transferasa (Ralston y col., Genetics, 119: 185 (1988)), el promotor del inhibidor de la proteinasa MPI (Cordero y col., Plant J. 6: 141 (1994)) y el promotor del gen de la gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa (Kohler y col., Plant Mo. Biol. 29: 1293 (1995); Quigley y col., J. Mol. Evol. 29: 412 (1989); Martinez y col., J. Mol. Biol, 208: 551 (1989)); el promotor PR-1a que es químicamente inducible se describe en la Patente de Estados Unidos N° 5.614.395; el promotor PR-1a también es inducible por lesiones (Lebel y col., Plant J. 16: 223-233 (1998)). Pueden emplearse diversos reguladores químicos para inducir la expresión de la secuencia polinucleotídica seleccionada en plantas transgénicas, incluyendo los compuestos benzotiadiazol, ácido isonicotínico y ácido salicílico, descritos en las Patentes de Estados Unidos N° 5.523.311 y 5.614.395. Un promotor de este tipo es, por ejemplo, el promotor del gen alcA de Aspergillus nidulans (Caddick y col. Nat. Biotechnol 16: 177-180 (1998)). En A. nidulans, el gen alcA codifica la alcohol deshidrogenasa I, cuya expresión está regulada por los factores de transcripción de AlcR en presencia de la inducción química. También puede usarse el sistema de inducción mediado por glucocorticoides (Aoyama y Chua (1997) The Plant Journal 11: 605-612). También pueden ser adecuados para la expresión génica promotores inducibles por lesiones. Se han descrito numerosos de dichos promotores (por ejemplo, Xu y col. Plant Molec. Biol. 22: 573-588 (1993), Logemann y col. Plant Cell 1: 151-158 (1989), Rohrmeier y Lehle, Plant Molec. Biol. 22: 783-792 (1993), Firek y col. Plant Molec. Biol. 22: 129-142 (1993), Warner y col. Plant J. 3: 191-201 (1993)). Se conocen en la técnica varios promotores inducibles. Muchos se describen en una revisión por Gatz, Current Opinion in Biotechnology 7: 168 (1996) (véase también Gatz, Annual Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol 48: 89 1997). Los ejemplos incluyen sistema represor de tetraciclina, sistema represor Lac, sistema inducible por cobre, sistemas inducibles por salicilato (tales como el sistema PR1a), sistemas inducibles por glucocorticoides (Aoyama T. y col., N-H Plant Journal, 11: 605 (1997)) e inducibles por ecdisona (solicitud de patente WO 01/52620). También se incluyen los sistemas inducibles por benceno sulfonamida (Patente de Estados Unidos N° 5.364.780) e inducibles por alcohol (documentos Wo 97/06269, WO 97/06268 y WO 02/061102) y los promotores de glutatión S-transferasa y el sistema quimérico de hormona y receptor de insectos descrito en el documento WO 02/061102.

Un aspecto de la descripción es un casete de expresión en el que la proteína enzimáticamente susceptible está unida operativamente a un promotor de tejido preferido capaz de la expresión en plantas. Los ejemplos de

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promotores de tejido preferido que se han descrito incluyen, pero sin limitación, la lectina (Vodkin, Prog. Glin. Bio. Res., 138: 87 (1983); Lindstrom y col., Der. Genet., (1990)), la alcohol deshidrogenasa 1 del maíz (Vogel y col., EMBO J., 11: 157 (1989); Dennis y col., Nucleic Acids Res., 12: 3983 (1984)), complejo recolector de luz del maíz (Simpson, Plant Mo. Bio., 19: 699 (1986); Bansal y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 3654 (1992)), proteína de choque térmico del maíz (Odell y col., Nature, 313: 810 (1985)), subunidad pequeña de la RuBP carboxilasa del guisante (Poulsen y col., Mol. Gen. Genet. 205: 193 (1986)), manopina sintasa del plásmido Ti (Langridge y col., Cell 34: 1015 (1989)), nopalina sintasa del plásmido Ti (Langridge y col., Cell 34: 1015 (1989)), charcona isomerasa de la petunia (vanTunen y col., EMBO J. 7: 1257 (1988)), proteína 1 rica en glicina de la judía (Keller y col., EMBO J. 8: 1309 (1989)), 35s de CaMV truncado (Odell y col., Nature 313: 810 (1985)), patatina de la patata (Wenzler y col., Plant Mol. Biol. 13: 347 (1989)), células de la raíz (Yamamoto y col., Nucleic Acids Res. 18: 7449 (1990)), zeína del maíz (Reina y col., Nucleic Acids Res. 18: 7449 (1990); Kriz y col., Mol. Gen. Genet 207: 90 (1987)); Wandelt y col., Nucleic Acids Res. 17: 2354 (1989); Langridge y col., Cell 34: 1015 (1983); Reina y col., Nucleic Acids Res. 18: 7449 (1990)), globulina 1 (Belanger y col., Genetics 129: 863 (1991)), alfa-tubulina, cab (Sullivan y col., Mol. Gen. Genet. 215: 431 (1989)), PEPCasa (Hudspeth y col., Plant Mo. Bio., 12: 579 (1989)), promotores asociados con el complejo del gen R (Chandler y col., Plant Cell 1: 1175 (1989)) y promotores de la chalcona sintasa (Franken y col., EMBO J. 10: 2605 (1991)). Estos incluyen, por ejemplo, el promotor rbcS preferido por tejidos verdes; los promotores ocs, nos y mas que tienen mayor actividad en raíces o tejidos de las hojas lesionados; un promotor 35S truncado (-90 a +8) que dirige la expresión aumentada en raíces, un gen de alfa-tubulina que dirige la expresión en raíces y promotores derivados de genes de proteínas de almacenamiento de zeína que dirigen la expresión en el endospermo.

En un aspecto, el promotor es un promotor preferido por el endospermo, tal como un promotor de gamma-zeína glutelina-2 del maíz o el promotor de la gamma-zeína glutelina-2 de 27 KD del maíz (Woo y col. The Plant Cell 13: 2297-2317 (2001)) o un promotor de la ADP-glucosa pirofosforilasa del maíz (Brangeon, y col. Plant Physiol. Biochem. 35: 847-858 (1997)). El promotor puede ser un promotor específico de embrión, tal como una globulina 1 del maíz o promotor de 18 kD de la oleosina del maíz (Qu y col. J. of Biol. Chem. 265: 2238-2243 (1990).

En el caso de un organismo multicelular, el promotor también puede ser específico para un tejido, órgano o fase del desarrollo particular. Los ejemplos de dichos promotores incluyen, pero sin limitación, el ADP-gpp del Zea mays (Greene y col. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13342-13347 (1998)) y el promotor de gamma-zeína de Zea mays (Woo y col. The Plant Cell 13: 2297-2317 (2001)).

Se han descrito en plantas varios genes regulados específicos de tejido y/o promotores. Estos incluyen, pero sin limitación, genes que codifican las proteínas de almacenamiento en las semillas (tales como napina, cruciferina, beta-conglicinina y faseolina) zeína o proteínas de cuerpo oleosos (tales como oleosina) o genes implicados en la biosíntesis de ácidos grasos (incluyendo proteína transportadora de acilo, estearoil-ACP desaturasa y desaturasas de ácidos grasos (fad 2-1)) y otros genes expresados durante el desarrollo del embrión (tales como Bce4, véase, por ejemplo, documento EP 255378 y Kridl y col., Seed Science Research 1: 209 (1991)). También es útil para la expresión específica en semillas el promotor de la vicilina del guisante (Czako y col., Mol. Gen. Genet., 235: 33 (1992); véase también la Patente de Estados Unidos N° 5.625.136)). Otros promotores útiles para la expresión en hojas maduras son los que se conectan al comienzo de la senescencia, tales como el promotor SAG de Arabidopsis (Gan y col., Science 270: 1986 (1995)). Los promotores preferidos de raíces incluyen el promotor del gen similar a metalotioneína (MTL) del maíz descrito por de Framond (FEBS 290: 103-106 (1991)) y también en la Patente de Estados Unidos N° 5.466.785. La Solicitud de Patente WO 93/07278 describe el aislamiento del gen trpA del maíz que se expresa de forma preferencial en células de la médula. Se ha descrito un gen de maíz que codifica la fosfoenol carboxilasa (PEPC) por Hudspeth y col. (Plant Molec Biol 12: 579-589 (1989)). Usando técnicas de biología molecular convencionales el promotor de este gen puede usarse para dirigir la expresión de cualquier gen de una forma específica de hojas en plantas transgénicas. El documento WO 93/07278 describe el aislamiento del gen de la proteína quinasa dependiente de calcio (CDPK) del maíz que se expresa en células de polen.

Una clase de promotores específicos del fruto expresados en o durante la antesis a lo largo del desarrollo del fruto, al menos hasta el comienzo de la maduración, se analiza en el documento U.S. 4.943.674. Se han aislado clones de ADNc que se expresan de forma preferencial en la fibra de algodón (John y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5769 (1992)). Se han aislado y caracterizado clones de ADNc del tomate que presentan una expresión diferencial durante el desarrollo del fruto (Mansson y col., Gen. Genet., 200: 356 (1985), Slater y col., Plant Mol. Biol. 5: 137 (1985)). El promotor para el gen de la poligalacturonasa es activo en la maduración del fruto. El gen de la poligalacturonasa se describe en la Patente de Estados Unidos N° 4.535.060, Patente de Estados Unidos N° 4.769.061, Patente de Estados Unidos N° 4.801.590 y Patente de Estados Unidos N° 5.107.065 y el promotor de la poligalacturonasa del tomate de maduración potenciada se describe en Bird y col., Plant Molecular Biology 11: 651 (1988).

Otros ejemplos de promotores específicos de tejidos incluyen los que dirigen la expresión en células de hojas después de lesiones en la hoja (por ejemplo, de insectos masticadores), en tubérculos (por ejemplo, promotor del gen de la patatina) y en células de fibra (un ejemplo de una proteína celular de fibra regulada por el desarrollo es E6 (John y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 5769 (1992)). El gen E6 es más activo en fibra, aunque se encuentran bajos niveles de transcritos en la hoja, el óvulo y la flor.

La especificidad de tejido de algunos promotores "específicos de tejido" o “de tejido preferido” puede no ser absoluta y puede ensayarse por un especialista en la técnica usando la secuencia de la toxina de difteria. También se puede

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conseguir una expresión en tejido preferido con expresión "por goteo" mediante una combinación de promotores específicos de tejido diferentes (Beals y col., Plant Cell 9: 1527 (1997)). Pueden aislarse otros promotores de tejido preferido por un especialista en la técnica (véase el documento U.S. 5.589.379). Los promotores específicos de tejido o de tejido preferido no deben interpretarse como promotores que sólo se expresan en un tejido específico. Los específicos de tejido o de tejido preferido se refieren a promotores que favorecen la expresión en un tejido particular, pero este favorecimiento de un tipo tisular no siempre es absoluto.

Otro aspecto de la descripción es un casete de expresión que comprende una proteína enzimáticamente susceptible unida operativamente a una secuencia de dirección. Una secuencia de dirección es cualquier secuencia que dirige al transcrito de un producto génico específico dentro de las células de una planta transgénica o dirige a una proteína a un entorno intracelular o extracelular particular. Las expresiones secuencia de dirección, secuencia de clasificación y secuencia señal son intercambiables. Las secuencias de dirección comprenden péptidos de tránsito o péptidos señal o secuencias de retención que pueden ser secuencias peptídicas diferentes o pueden usarse en combinaciones unidas entre sí directamente o unidas a la proteína enzimáticamente susceptible individualmente o en múltiplos.

La dirección se logrará generalmente por unión de una secuencia de ADN que codifica una secuencia de tránsito a la secuencia polinucleotídica de un gen particular. La secuencia de tránsito puede unirse al extremo amino terminal (N-terminal) de la fitasa enzimáticamente susceptible o al extremo carboxi terminal (C-terminal) de la fitasa enzimáticamente susceptible. El péptido de tránsito resultante transportará la proteína a un destino intracelular o extracelular particular, respectivamente, y después puede eliminarse postraduccionalmente. Los péptidos de tránsito actúan facilitando el transporte de proteínas a través de las membranas intracelulares, por ejemplo, membranas de vacuolas, vesículas, plastos y mitocondrias, o dirigen a proteínas a través de la membrana extracelular.

En plantas la secuencia señal puede dirigir el polipéptido codificado por el polinucleótido a un compartimento específico dentro de una planta. Los ejemplos de dichas dianas incluyen, pero sin limitación, una vacuola, amiloplasto, retículo endoplásmico, cloroplasto, apoplasto o gránulo de almidón. Un ejemplo de una secuencia señal incluye la secuencia señal N-terminal de la gamma-zeína del maíz para la dirección al retículo endoplásmico y la secreción en el apoplasto (Torrent y col., Plant Mol. Biol. 34: 139 (1997)). Otra secuencia señal es la secuencia de aminoácidos SEKDEL para retener los polipéptidos en el retículo endoplásmico (Munro y col. Cell 48: 899 (1987)). Un polipéptido también puede dirigirse al amiloplasto por fusión con el péptido de dirección a amiloplastos cerosos (Klosgren y col., Mol. Gen. Genet. 203: 237 (1986)) o a un gránulo de almidón.

Otro aspecto de la descripción es una célula vegetal, parte de planta o una planta transformada que comprende una molécula de ácido nucleico que codifica un polipéptido que comprende una proteína enzimáticamente susceptible unida operativamente a una secuencia señal. En un aspecto, la planta comprende un polipéptido que comprende una secuencia señal N-terminal de gamma-zeína unida operativamente a la proteína enzimáticamente susceptible. En otro aspecto, la planta comprende un polipéptido que comprende SEKDEL unida operativamente al extremo C- terminal de una proteína enzimáticamente susceptible. En otro aspecto, la planta comprende un polipéptido que comprende un péptido de dirección a amiloplastos cerosos N-terminal unido operativamente a una proteína enzimáticamente susceptible. En otro aspecto, la planta comprende un polipéptido que comprende un dominio encapsulante de almidón ceroso unido operativamente al extremo C-terminal de una proteína enzimáticamente susceptible.

Otro aspecto de la descripción es un casete de expresión que comprende una proteína enzimáticamente susceptible y comprende además un potenciador para la expresión génica. Se han descubierto numerosas secuencias que potencian la expresión génica desde dentro de la unidad transcripcional y estas secuencias pueden usarse junto con el polinucleótido que codifica una proteína enzimáticamente susceptible para aumentar su expresión en plantas transgénicas.

Los intrones han demostrado el potencial para potenciar la expresión de transgenes. Por ejemplo, Callis y col. Genes and Develop. 1: 1183 (1987) describen un intrón del gen de la alcohol deshidrogenasa del maíz que es capaz de potenciar la expresión de transgenes en células vegetales transgénicas. De forma similar, Vasil y col. Mol. Microbiol. 3: 371 (1989) describen un intrón del gen de la sucrosa sintasa del maíz que tiene una actividad potenciadora similar. El intrón de la actina 1 del arroz se ha usado ampliamente en la potenciación de la expresión de transgenes en varios cultivos transgénicos diferentes (McElroy y col., Mol. Gen. Genet. 231: 150 (1991)).

Un potenciador es una secuencia de ADN que puede estimular la actividad del promotor y puede ser un elemento innato del promotor o un elemento heterólogo insertado para potenciar el nivel o la preferencia de tejido de un promotor particular. Un potenciador es capaz de funcionar en ambas orientaciones (5' a 3' y 3' a 5' con respecto a la secuencia polinucleotídica del gen de interés) y es capaz de funcionar incluso cuando se desplaza cadena arriba o cadena abajo del promotor. Un ejemplo de un elemento potenciador es el elemento potenciador ocs. Este elemento se identificó por primera vez como un potenciador palindrómico de 16 pb del gen de la octopina sintasa (ocs) de Agrobacterium (Ellis y col., EMBO J. 6: 3203 (1987)) y está presente en al menos 10 otros promotores (Bouchez y col., EMBO J. 8: 4197 (1989)). El uso de un elemento potenciador, tal como el elemento ocs y, particularmente, de múltiples copias del elemento, actuará para aumentar el nivel de transcripción de los promotores adyacentes.

También se conocen varias secuencias líder no traducidas procedentes de virus para potenciar la expresión y éstas

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son particularmente eficaces en células dicotiledóneas. En concreto, secuencias líder del virus del mosaico del tabaco (TMV, la “secuencia W”), el virus del moteado clorótico del maíz (MCMV) y el virus del mosaico de la alfalfa (AMV) han demostrado ser eficaces en potenciar la expresión (por ejemplo Gallie y col. Nucl. Acids Res. 15: 86938711 (1987); Skuzeski y col. Plant Molec. Biol. 15: 65-79 (1990)). Otras secuencias líder conocidas en la técnica incluyen, pero sin limitación: líderes de picornavirus, por ejemplo, líder de EMCV (región 5' no codificante del virus de la encefalomiocarditis) (Elroy-Stein, O., Fuerst, T. R. y Moss, B. PNAS USA 86: 6126-6130 (1989)); líderes de potivirus, por ejemplo, líder de TEV (virus del grabado del tabaco); líder de MDMV (virus del mosaico enano del maíz); líder de la proteína de unión a la cadena pesada de inmunoglobulina (BiP) humana, (Macejak y col., Nature 353: 90-94 (1991); líder no traducido del ARNm de la proteína de cubierta del virus de mosaico de la alfalfa (AMV RNA 4), (Jobling y col., Nature 325: 622-625 (1987); líder del virus del mosaico del tabaco (TMV), (Gallie, D. R. y col., Molecular Biology of RNA, páginas 237-256 (1989); y líder del virus moteado clorótico del maíz (MCMV) (Lommel y col., Virology 81: 382-385 (1991). Véase también, Della-Cioppa y col., Plant Physiology 84: 965-968 (1987). El INPACT es otro método disponible para aumentar la expresión génica (documento WO 01/72996).

Otro aspecto de la descripción es un casete de expresión que comprende una proteína enzimáticamente susceptible unida operativamente a un terminador de la transcripción. Están disponibles para el uso en los casetes de expresión una diversidad de terminadores de la transcripción. Los terminadores de la transcripción son responsables de la teminación de la transcripción más allá del transgén y de la poliadenilación correcta del ARNm. Son terminadores de la transcripción adecuados los que se sabe que funcionan en plantas e incluyen, pero sin limitación, el terminador 35S de CaMV, el terminador tml, el terminador de la nopalina sintasa derivado de Agrobacterium tumefaciens (Bevan y col. Nucl. Acids Res., 11: 369 (1983)) y el terminador rbcS E9 del guisante, el terminador para el transcrito T7 del gen de la octopina sintasa de Agrobacterium tumefaciens y el extremo 3' de los genes del inhibidor de proteasa I o II de la patata o del tomate. Pueden incluirse además elementos reguladores tales como el intrón 1 de Adh (Callis y col., Genes and Develop., 1: 1183 (1987)), el intrón de la sucrosa sintasa (Vasil y col., Plant Physiol. 91: 1575 (1989)) o el elemento omega de TMV (Gallie, y col., Plant Cell 1: 301 (1989)) cuando se desee. Están disponibles regiones de terminación vegetales convenientes del plásmido Ti de A. tumefaciens, tales como las regiones de terminación de la octopina sintasa y la nopalina sintasa. Véase también, Guerineau y col., Mol. Gen. Genet., 262: 141 (1991); Mogen y col., Plant Cell, 2: 1261 (1990); Munroe y col., Gene, 91: 151 (1990); Ballas y col., Nucleic Acids Res., 17: 7891 (1989); Joshi y col., Nucleic Acid Res., 15: 9627 (1987). Estos pueden usarse tanto en monocotiledóneas como en dicotiledóneas. Además, puede usarse un terminador de la transcripción nativo del gen.

Otros elementos reguladores incluyen los que pueden regularse por agentes endógenos o exógenos, por ejemplo, por proteínas de dedos de cinc, incluyendo proteínas de dedos de cinc de origen natural o proteínas de dedos de cinc quiméricas. Véanse, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos N° 5.789.538, los documentos WO 99/48909; WO 99/45132; WO 98/53060; WO 98/53057; WO 98/53058; WO 00/23464; WO 95/19431; y WO 98/54311.

Otro aspecto de la descripción es un vector de transformación que comprende una proteína enzimáticamente susceptible que es adecuada para la transformación de bacterias. Típicamente, un vector de expresión bacteriano contiene (1) elementos de ADN procariótico que codifican un origen de replicación bacteriano y un gen de resistencia a antibióticos para proporcionar la amplificación y la selección del vector de expresión en un huésped bacteriano; (2) elementos de ADN que controlan el inicio de la transcripción tales como un promotor; (3) elementos de ADN que controlan el procesamiento de transcritos; (4) elementos potenciadores; y (5) un gen de interés que está unido operativamente a los elementos de ADN que controlan el inicio de la transcripción. El vector de expresión usado puede ser uno capaz de replicarse de forma autónoma en el huésped anterior (tal como en un plásmido) o capaz de integrarse en el cromosoma, que contiene originariamente un promotor en un sitio que permite la transcripción del gen unido que codifica una proteína enzimáticamente susceptible.

Los vectores adecuados incluyen, a modo de ejemplo: para bacterias, pQE70, pQE60, pQE-9 (Qiagen), pBluescript II (Stratagene), pTRC99a, pKK223-3, pDR540, pRlT2T (Pharmacia). Dichos vectores comerciales incluyen, por ejemplo, pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia) y GEM1 (Promega Biotec, Madison, Wis., Estados Unidos). Sin embargo puede usarse cualquier otro plásmido o vector siempre que pueda replicarse y sea viable en el huésped.

Como ejemplos representativos de huéspedes bacterianos apropiados pueden mencionarse: células bacterianas tales como de E. coli, Streptomyces, Bacillus subtilis; y diversas especies dentro de los géneros Escherichia, Pseudomonas, Serratia, Streptomyces, Corynebacterium, Brevibacterium, Bacillus, Microbacterium y Staphylococcus, aunque también pueden emplearse otros como una cuestión de elección.

Otro aspecto de la descripción es un vector de transformación que comprende una proteína enzimáticamente susceptible capaz de transformar hongos. La transformación de hongos puede efectuarse de acuerdo con Gonni y col. Agric. Biol. Chem., 51: 2549 (1987). Como ejemplos representativos de huéspedes fúngicos apropiados pueden mencionarse: células fúngicas, tales como células fúngicas que pertenecen a los géneros Aspergillus, Rhizopus, Trichoderma, Neurospora, Mucor, Penicillium, etc., tales como levaduras que pertenecen a los géneros Kluyveromyces, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, Trichosporon, Schwanniomyces, etc..

Otro aspecto de la descripción es un vector de transformación que comprende una proteína enzimáticamente susceptible capaz de transformar una célula eucariota. Están disponibles varias líneas celulares eucariotas

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(incluyendo células animales y de insectos) como huéspedes que pueden transformarse para expresar una proteína enzimáticamente susceptible. Células de insecto tales como Drosophila S2 y Spodoptera Sf9; células animales tales como líneas celulares CHO, COS o melanoma de Bowes, C127, 3T3, CHO, HeLa y BHK. Puede usarse cualquier huésped siempre que pueda expresar el gen de interés. La Colección Americana de Cultivos Tipo (
http://www.atcc.org/) mantiene líneas celulares de una amplia diversidad de fuentes y muchos de estos cultivos pueden usarse para generar una línea celular transgénica capaz de expresar una proteína enzimáticamente susceptible. Están disponibles en el mercado vectores de transformación apropiados para células eucariotas tales como pXT1, pSG5 (Stratagene) pSVK3, pBPV, pMSG y pSVLSV40 (Pharmacia). Se conocen bien en la técnica métodos para la transformación y selección de células eucariotas transgénicas.

Otro aspecto de la descripción es un vector de transformación que comprende una proteína enzimáticamente susceptible capaz de transformar una planta. Puede encontrarse una descripción general de vectores de transformación de plantas, casetes de expresión y genes indicadores en Gruber, y col., Methods in Plant Molecular Biology & Biotechnology, Glich y col., Eds. págs. 89-119, CRC Press (1993).

En cierto aspecto, se contempla que puede desearse emplear vectores virales de replicación competente en la transformación de monocotiledóneas. Dichos vectores incluyen, por ejemplo, vectores "lanzadera" del virus enano del trigo (WDV) tales como pW1-11 y pW1-GUS (Ugaki y col., Nucl. Acids Res., 19: 371 (1991)). Estos vectores son capaces de una replicación autónoma en células de maíz así como en E. coli, y como tales pueden proporcionar una sensibilidad aumentada para detectar ADN suministrado a células transgénicas. También puede ser útil un vector de replicación para el suministro de genes flanqueados por secuencias de ADN de elementos transponibles tales como Ac, Ds o Mu. También se contempla que los elementos transponibles sean útiles para introducir fragmentos de ADN que carecen de los elementos necesarios para la selección y mantenimiento del vector plasmídico en bacterias, por ejemplo, genes de resistencia a antibióticos y orígenes de replicación de ADN. También se propone que el uso de un elemento transponible tal como Ac, Ds o Mu promovería activamente la integración del ADN deseado y, por lo tanto, aumentaría la frecuencia de células transformadas de forma estable.

La construcción de vectores que pueden emplearse junto con la presente descripción será conocida para los especialistas en la técnica a la luz de la presente descripción (véase, por ejemplo, Sambrook y col., Molecular Cloning: A Laboratory Manual (2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York) (1989); Gelvin y col., Plant Molecular Biology Manual (1990)).

Se describen métodos de preparación y uso de una molécula de ácido nucleico (polinucleótido) que codifica una proteína enzimáticamente susceptible. Se sabe en la técnica que la expresión de proteínas puede potenciarse por optimización de las regiones codificantes de genes con la preferencia de codones del huésped. Para la expresión en una célula huésped microbiana, tal como de levadura, bacteriana, fúngica y similar puede ser necesario optimizar los codones de la ORF para la expresión micriobiana. El uso de codones preferido en plantas difiere del uso de codones preferido en ciertos microorganismos. La comparación del uso de codones dentro de una ORF microbiana clonada para usar en genes de plantas (y, en particular, genes de la planta diana) permitirá una identificación de los codones dentro de la ORF que deberían modificarse preferiblemente. Típicamente, la evolución vegetal ha tendido hacia una intensa preferencia de los nucleótidos C y G en la posición de la tercera base de monocotiledóneas, mientras que las dicotiledóneas usan con frecuencia los nucleótidos A o T en esta posición. Por modificación de un gen para incorporar el uso de codones preferido para una especie transgénica diana particular pueden superarse muchos de los problemas asociados con una expresión génica eficaz en plantas. En resumen, se obtiene una tabla de uso de codones que indica los codones óptimos usados por el organismo diana y se seleccionan los codones óptimos para reemplazar los del polinucleótido diana y, después, la secuencia optimizada se sintetiza químicamente. Se describen los codones preferidos para el maíz en la Patente de Estados Unidos N° 5.625.136.

Están disponibles y son conocidas para los especialistas en la técnica una diversidad de métodos para la introducción de construcciones en un huésped celular. Un aspecto de la descripción es un huésped transgénico en el que se mantiene por el huésped una secuencia polinucleotídica que codifica una proteína enzimáticamente susceptible. El huésped puede seleccionarse del grupo constituido por bacterias, células eucariotas, células animales, células de insecto, células fúngicas, células de levaduras y plantas.

Transformación de bacterias y muchas células eucariotas puede efectuarse a través del uso de polietilenglicol, cloruro de calcio, infección vírica, DEAE dextrano, infección por fagos, electroporación y otros métodos conocidos en la técnica. La introducción del vector recombinante en levaduras puede efectuarse por métodos que incluyen electroporación, uso de esferoplastos, acetato de litio y similares. Puede usarse cualquier método capaz de introducir ADN en células animales: por ejemplo, electroporación, fosfato de calcio, lipofección y similares.

El casete de expresión puede insertarse en una célula de insecto usando un baculovirus (véase, por ejemplo, Baculovirus Expression Vectors, A Laboratory Manual (1992)). Por ejemplo, el vector en el que se ha introducido el gen recombinante puede introducirse junto con el baculovirus en una célula de insecto, de tal modo que se obtiene un virus recombinante en el sobrenadante de la célula de insecto cultivada. Después, las células de insecto se infectan con el virus recombinante, mediante lo cual puede expresarse la proteína. El vector de introducción del gen usado en este método puede incluir, por ejemplo, pLV1392, pVL1393 y pBlueBaclII (siendo todos productos de Invitrogen). Los baculovirus, pueden ser, por ejemplo, virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica, que

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es un virus que infecta a ciertos insectos polilla. Las células de insecto pueden ser células de ovario Sf9 y Sf21 de Spodoptera frugiperda y High 5 (Invitrogen), que es una célula de ovario de Trichoplusia ni, etc. Para la introducción conjunta tanto del vector que tiene el gen recombinante como del baculovirus en una célula de insecto para preparar un virus recombinante, pueden usarse los métodos de fosfato de calcio o lipofección.

Las plantas huésped usadas para la transformación pueden ser de cualquier especie vegetal, incluyendo, pero sin limitación, maíz (Zea mays), Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea); particularmente las especies de Brassica útiles como fuentes de aceite de semillas, tales como colza, alfalfa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeno (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), mijo (por ejemplo, mijo perla (Pennisetum glaucum), mijo proso (Panicum miliaceum), mijo cola de zorra (Setaria italica), mijo dedo (Eleusine coracana)), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), cacahuetes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta), café (Cofea spp.), coco (Cocos nucífera), piña (Ananas comosus), árboles cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), té (Camellia sinensis), plátano (Musa spp.), aguacate (Persea americana), higo (Ficus casica), guayaba (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaya (Carica papaya), anacardo (Anacardium occidentale), nueces de Macadamia (Macadamia integrifolia), almendra (Prunus amygdalus), remolacha azucarera (Beta vulgaris), caña de azúcar (Saccharum spp.), avena, cebada, vegetales, plantas ornamentales y coníferas.

Los vegetales incluyen tomates (Lycopersicon esculentum), lechuga (por ejemplo, Lactuca sativa), judías verdes (Phaseolus vulgaris), frijoles (Phaseolus limensis), guisantes (Lathyrus spp.) y miembros del género Cucumis tales como pepino (C. sativus), cantalupo (C. cantalupensis) y melón almizclero (C. melo). Las ornamentales incluyen azalea (Rhododendron spp.), hortensia (Macrophylla hydrangea), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa spp.), tulipanes (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus spp.), petunias (Petunia hybrida), claveles (Dianthus caryophyllus), flor de pascua (Euphorbia pulcherrima) y crisantemo. Las coníferas que pueden emplearse incluyen, por ejemplo, pinos tales como pino tadea (Pinus taeda), pino ellioti (Pinus elliotii), pino amarillo occidental (Pinus ponderosa), pino contorta (Pinus contorta) y pino de Monterrey (Pinus radiata), abeto de Douglas (Pseudotsuga menziesii); falso abeto del Canadá (Tsuga canadensis); picea blanca (Picea glauca); secuoya roja (Sequoia sempervirens); abetos verdaderos tales como abeto plateado (Abies amabilis) y abeto balsámico (Abies balsamea); y cedros tales como cedro rojo occidental (Thuja plicata) y ciprés de Nootka (Chamaecyparis nootkatensis). Las plantas leguminosas incluyen judías y guisantes. Las judías incluyen guar, algarrobilla, alholva, soja, judías verdes, caupí, frijol chino, garrafón, haba, lentejas, garbanzo, etc. Las legumbres incluyen, pero sin limitación, Araquis, por ejemplo, cacahuetes, Vicia, por ejemplo, coronilla, veza vellosa, azuki, frijol chino y garbanzo, Lupinus, por ejemplo, lupine, trifolium, Phaseolus, por ejemplo, judía común y garrafón, Pisum, por ejemplo, haba, Melilotus, por ejemplo, trébol, Medicago, por ejemplo, alfalfa, Lotus, por ejemplo, trebol, Lens, por ejemplo, lenteja y falso índigo. Las forrajeras y cespitosas para usar como plantas huésped incluyen, pero sin limitación alfalfa, dáctilo, festuca alta, ballico perenne, agróstide rastrera, pasto varilla (Panicum virgatum), Miscanthus y agróstide blanca.

Las plantas huésped incluyen, pero sin limitación, plantas de cultivo o plantas usadas para producir alimentos o piensos, por ejemplo, maíz, alfalfa, girasol, Brassica, soja, algodón, girasol, cártamo, cacahuete, sorgo, trigo, avena, centeno, mijo, tabaco, cebada, arroz, tomate, patata, calabaza, melones, caña de azúcar, cultivos de leguminosas, por ejemplo, guisante, judía y soja, y tubérculos/raíces almidonosos, por ejemplo, patata, batata, mandioca, taro, achira y remolacha azucarera y similares.

Las técnicas de transformación para plantas se conocen bien en la técnica e incluyen técnicas basadas en Agrobacterium y técnicas que no requieren Agrobacterium. Las técnicas que no requieren Agrobacterium implican la captación de material genético exógeno directamente por protoplastos o células. Esto puede conseguirse por captación mediada por PEG o electroporación, suministro mediado por bombardeo de partículas o microinyección. Se describen ejemplos de estas técnicas por Paszkowski y col., EMBo J 3: 2717-2722 (1984), Potrykus y col., Mol. Gen. Genet. 199: 169-177 (1985), Reich y col., Biotechnology 4: 1001-1004 (1986), y Klein y col., Nature 327: 70-73 (1987). También se ha descrito la transformación de monocotiledóneas usando Agrobacterium. Véase el documento WO 94/00977 y la Patente de Estados Unidos N° 5.591.616. En cada caso, las células transformadas se regeneran hasta plantas completas usando métodos convencionales conocidas en la técnica.

Están disponibles muchos vectores para la transformación usando Agrobacterium tumefaciens. Típicamente, estos llevan al menos una secuencia de borde de ADN-T e incluyen vectores tales como pBIN19 (Bevan, Nucl. Acids Res. 11: 369 (1984)). El vector binario pCIB10 contiene un gen que codifica resistencia a kanamicina para la selección en plantas y secuencias de borde derecha e izquierda de ADN-T e incorporan secuencias del plásmido de amplio intervalo de huéspedes pRK252, permitiendo que se replique tanto en E. coli como en Agrobacterium (Rothstein y col. Gene 53: 153-161 (1987)).

La transformación de la especie vegetal diana mediante Agrobacterium recombinante habitualmente implica el cocultivo del Agrobacterium con explantes de la planta y sigue protocolos bien conocidos en la técnica. El tejido transformado se regenera en el medio de selección que lleva el marcador de resistencia a antibiótico o herbicida presente entre los bordes de ADN-T del plásmido binario.

Otro enfoque para transformar una célula vegetal con un gen implica propulsar partículas inertes o biológicamente

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activas en tejidos y células vegetales. Esta técnica se describe en las Patentes de Estados Unidos N° 4.945.050, 5.036.006 y 5.100.792. Generalmente este procedimiento implica propulsar partículas inertes o biológicamente activas en las células en condiciones eficaces para penetrar la superficie externa de la célula.

Las Solicitudes de Patente EP 0 292 435, EP 0 392 225 y WO 93/07278 describen técnicas para la preparación de callos y protoplastos a partir de una línea endogámica élite del maíz, la transformación de protoplastos usando PEG o electroporación y la regeneración de plantas de maíz a partir de protoplastos transformados. Gordon-Kamm y col. Plant Cell 2: 603-618 (1990) y Fromm y col. Biotechnology 8: 833-839 (1990) tienen técnicas publicadas para la transformación de una línea de maíz derivada de A188 usando bombardeo de partículas. Además, el documento WO 93/07278 y Koziel y col. Biotechnology 11: 194-200 (1993) describen técnicas para la transformación de líneas endogámicas élite de maíz por bombardeo de partículas.

Se ha descrito la transformación de plastos usando bombardeo de partículas (Svab y col. PNAS 90: 913-917 (1993); Svab y col PNAS 87: 8526-8530 (1990); McBride y col. PNAS 91: 7301-7305 (1994)). Puede usarse la transformación de plastos para producir plantas que expresan la proteína enzimáticamente susceptible sin la necesidad de transformación de genoma nuclear. Se conocen bien en la técnica métodos para transformación de plastos.

La selección de células transformadas se facilita mediante el uso de marcadores de selección de antibióticos o herbicidas que están unidos operativamente a la secuencia polinucleotídica que codifica una proteína enzimáticamente susceptible. Para ciertas especies diana, pueden preferirse marcadores de selección de antibióticos o herbicidas diferentes. Los marcadores de selección usados de forma rutinaria en la transformación incluyen el gen nptII, que confiere resistencia a kanamicina y antibióticos relacionados (Messing y col. Gene 19: 259268 (1982); Bevan y col., Nature 304: 184-187 (1983)), el gen bar, que confiere resistencia al herbicida fosfinotricina (White y col., Nucl. Acids Res 18: 1062 (1990), Spencer y col. Theor. Appl. Genet 79: 625-631 (1990)), el gen hph, que confiere resistencia al antibiótico higromicina (Blochinger y col. Mol Cell Biol 4: 2929-2931) y el gen dhfr, que confiere resistencia a metotrexato (Bourouis y col., EMBO J. 2 (7): 1099-1104 (1983)), el gen EpSpS, que confiere resistencia a glifosfato (Patentes de Estados Unidos N° 4.940.835 y 5.188.642) y el gen de la manosa-6-fosfato isomerasa (también denominado en este documento como el gen de la fosfomanosa isomerasa), que proporciona la capacidad de metabolizar la manosa (Patentes de Estados Unidos N° 5.767.378 y 5.994.629).

Otro aspecto de la descripción es un huésped transgénico en el que la secuencia polinucleotídica que codifica una proteína enzimáticamente susceptible se integra cromosómicamente. La integración cromosómica se refiere a la integración de un gen extraño o construcción de ADN en el ADN huésped mediante enlaces covalentes. El ADN integrado cromosómicamente es genéticamente estable y heredable por la progenie a través de generaciones sucesivas. Otro aspecto de la descripción es una célula huésped transgénica en la que el polinucleótido codifica una fitasa enzimáticamente susceptible se expresa de forma transitoria. La expresión transitoria de un gen se refiere a la expresión de un gen que no se integra en el cromosoma huésped pero funciona de forma independiente, como parte de un plásmido o casete de expresión de replicación autónoma.

Las plantas huésped transformadas con una proteína enzimáticamente susceptible pueden propagar la secuencia polinucleotídica que codifica una proteína enzimáticamente susceptible en otras variedades de la misma especie, particularmente incluyendo variedades comerciales, usando técnicas de reproducción tradicionales (Plant Breeding Reviews Vol. 14, editado por Jules Janick, John Wiley & Sons Publisher (1997)). Otro aspecto de la descripción son plantas transgénicas que comprenden una proteína enzimáticamente susceptible además de otras secuencias transgénicas. Las plantas transgénicas que comprenden una proteína enzimáticamente susceptible pueden cruzarse con otras plantas transgénicas usando técnicas de reproducción tradicionales para acumular uno o más rasgos transgénicos en una sola planta o híbrido.

En un aspecto del método de la descripción, la proteína enzimáticamente susceptible se acumula en la semilla de la planta. Otro aspecto de la descripción es la semilla de la planta transgénica que comprende la proteína enzimáticamente susceptible. Las plantas huésped que comprenden una proteína enzimáticamente susceptible pueden adoptar una diversidad de formas. Las plantas huésped pueden ser quimeras de células transformadas y células no transformadas; las células huésped pueden ser transformantes clonales (por ejemplo, todas las células transformadas para contener el casete de expresión); las plantas huésped pueden comprender injertos de tejidos transformados y no transformados (por ejemplo, una raíz madre transformada injertada en una vástago no transformado, por ejemplo, una especie de cítrico). Las plantas huésped pueden propagarse por una diversidad de medios, tales como por propagación clonal o técnicas de reproducción clásicas. Por ejemplo, la primera generación (o T1) de plantas transformadas pueden autopolinizarse para dar una segunda generación homocigota (o T2) de plantas transformadas y las plantas T2 propagarse adicionalmente a través de técnicas de reproducción clásicas. Un marcador de selección dominante (tal como npt II) puede asociarse con el casete de expresión para ayudar en la reproducción.

Se demostraron técnicas de diseño racional para la modificación por ingeniería genética de proteínas, como se ha explicado anteriormente, usando la enzima fitasa, Nov9X, para generar enzimas fitasas enzimáticamente susceptibles con sensibilidad a la proteasa pepsina. Nov9X es una fitasa derivada del gen appA de Escherichia coli modificado para una termoestabilidad elevada, así como para expresión vegetal optimizada en maíz. El término

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“fitasa” describe una clase de amplia variedad de enzimas que catalizan el fitato (mio-inositol-hexafosfato) en inositol y fosfato inorgánico. Se han identificado enzimas fitasas en múltiples fuentes de organismos procariotas y eucariotas (es decir, Aspergillus ficuum, Sacchoromyces cerevisiae, Escherichia coli, etc.). Un aspecto de la descripción es una fitasa enzimáticamente susceptible codificada por una de las secuencias polipeptídicas de las SEC ID N°: 1-33 o un polipéptido con una identidad del 98% con una de las secuencias polipeptídicas de las SEC ID N°: 1-33 o una variante conservativa de una de las secuencias polipeptídicas de las SEC ID N°: 1-33.

Para la comparación de secuencias, típicamente, una secuencia actúa como una secuencia de referencia con la que se comparan secuencias de ensayo. Cuando se usa un algoritmo de comparación de secuencias, las secuencias de ensayo y de referencia se introducen en un ordenador, se designan las coordenadas posteriores si es necesario y se designan los parámetros del programa de algoritmo de secuencias. Después, el algoritmo de comparación de secuencias calcula el porcentaje de identidad de secuencia para la secuencia o secuencias de ensayo con respecto a la secuencia de referencia en base a los parámetros del programa designados.

Puede realizarse un alineamiento óptimo de secuencias por comparación, por ejemplo, mediante el algoritmo de homología local de Smith y Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981), mediante el algoritmo de alineamiento por homología de Needleman y Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), mediante el método de búsqueda de similitud de Pearson y Lipman, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 85: 2444 (1988), mediante las aplicaciones computarizadas de estos algoritmos (GAP, BESTFIT, FASTA y TFASTA en el Wisconsin Genetics Software Package, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, WI) o mediante inspección visual.

Un ejemplo de un algoritmo que es adecuado para determinar el porcentaje de identidad de secuencia y de similitud de secuencia es el algoritmo BLAST, que se describe en Altschul y col., J. Mol. Biol. 215: 403-410 (1990). Está disponible públicamente un programa informático para realizar análisis de BLAST a través del National Center for Biotechnology Information (
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Este algoritmo implica identificar primero pares de secuencias de alta puntuación (HSP) por identificación de palabras cortas de longitud W en la secuencia problema, que se ajusten a o cumplan alguna puntuación T umbral de valor positivo cuando se alinean con una palabra de la misma longitud en una secuencia de la base de datos. Se hace referencia a T como el umbral de puntuación de palabras vecinas (Altschul y col., J. Mol. Biol 215: 403-410 (1990)). Estas coincidencias de palabras vecinas iniciales actúan como semillas para iniciar búsquedas para encontrar HSP más largas que las contengan. Después, las coincidencias de palabras se extienden en ambas direcciones a lo largo de cada secuencia en tanto en cuanto pueda aumentarse la puntuación de alineamiento acumulativa. Las puntuaciones acumulativas se calculan usando, para secuencias de nucleótidos, los parámetros M (puntuación de recompensa para un par de restos emparejados; siempre >0) y N (puntuación de penalización para restos emparejados erróneamente; siempre <0). Para secuencias de aminoácidos, se usa una matriz de puntuación para calcular la puntuación acumulativa. La extensión de las coincidencias de palabras en cada dirección se interrumpe cuando la puntuación de alineamiento acumulativa disminuye en la cantidad X desde su valor máximo conseguido, la puntuación acumulativa se hace cero o inferior a cero debido a la acumulación de uno o más alineamientos de restos de puntuación negativa o se alcanza el final de cualquier secuencia. Los parámetros del algoritmo BLAST W, T y X determinan la sensibilidad y la velocidad del alineamiento. El programa BLASTN (para secuencias de nucleótidos) usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 11, una esperanza (E) de 10, un límite de corte de 100, M = 5, N = -4 y una comparación de ambas cadenas. Para secuencias de aminoácidos, el programa BLASTP usa como parámetros por defecto una longitud de palabra (W) de 3, una esperanza (E) de 10 y la matriz de puntuación BLOSUM62 (véase Henikoff y Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915 (1989)).

Además de calcular el porcentaje de identidad de secuencia, el algoritmo BLAST también realiza un análisis estadístico de la similitud entre dos secuencias (véase, por ejemplo, Karlin y Altschul, Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90: 5873-5787 (1993)). Una medida de similitud proporcionada por el algoritmo BLAST es la probabilidad de suma menor (P(N)), que proporciona una indicación de la probabilidad por la que una coincidencia entre dos secuencias de nucleótidos o aminoácidos se producirá por azar. Por ejemplo, una secuencia de ácido nucleico de ensayo se considera similar a una secuencia de referencia si la probabilidad de suma menor en una comparación de la secuencia de ácido nucleico con respecto a la secuencia de ácido nucleico de referencia es menor de aproximadamente 0,1, más preferiblemente menor de aproximadamente 0,01 y, más preferiblemente, menor de aproximadamente 0.001.

Una preparación que contiene la fitasa enzimáticamente susceptible puede adoptar muchas formas incluyendo, pero sin limitación, una preparación seca, una preparación líquida, una preparación que contiene material vegetal transgénico y similar.

En un aspecto de la descripción, el método comprende aislar la fitasa enzimáticamente susceptible. La fitasa enzimáticamente susceptible se aísla a partir de cualquier huésped que exprese la enzima fitasa. El huésped puede ser transgénico o puede expresar la fitasa enzimáticamente susceptible de forma transitoria. La célula huésped se selecciona del grupo constituido por bacterias, levaduras, hongos, insectos y plantas. La célula huésped vegetal puede ser monocotiledónea, tal como una célula de maíz o trigo, o dicotiledónea tal como una célula de soja.

Otro aspecto de la descripción es un extracto de un huésped que contiene una enzima fitasa enzimáticamente susceptible. Para la preparación de fitasa recombinante, después de la transformación de un huésped adecuado y

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del cultivo del huésped, puede inducirse un promotor seleccionado por medios apropiados (por ejemplo, cambio de temperatura o inducción química) y las células cultivarse durante un periodo adicional para producir la enzima recombinante. Después, típicamente las células se recogen por centrifugación, se rompen por medios físicos o químicos y el extracto bruto resultante se conserva para una purificación adicional.

Las células empleadas en la expresión de proteínas pueden romperse por cualquier método conveniente, incluyendo ciclos de congelación-descongelación, sonicación, rotura mecánica o uso de agentes de lisado celular, conociéndose bien dichos métodos por los especialistas en la técnica.

La enzima puede recuperarse a partir de cultivos celulares recombinantes por métodos que incluyen precipitación con sulfato de amonio o etanol, extracción ácida, cromatografía de intercambio de aniones o cationes, cromatografía de fosfocelulosa, cromatografía de interacción hidrófoba, cromatografía de afinidad, cromatografía de hidroxilapatita y cromatografía de lectina. Pueden usarse etapas de replegamiento de la proteína, según sea necesario, en la terminación de la configuración de la proteína madura. Por último, puede emplearse la cromatografía líquida de alto rendimiento (HPLC) para las etapas de purificación final. La recuperación de la enzima se refiere a cualquier método usado para recoger la enzima del huésped. Las preparaciones de enzima recuperada pueden contener contaminantes tales como proteínas, lípidos, hidratos de carbono y ADN del huésped. Las preparaciones de enzima recuperada también pueden ser preparaciones de enzima altamente purificada que tienen más del 95% de proteína pura.

El extracto que contiene una fitasa enzimáticamente susceptible puede ser un producto de procedimientos sintéticos químicos o producirse por técnicas recombinantes a partir de un huésped. El huésped puede ser un huésped procariota tal como bacterias o un huésped eucariota tal como una planta superior.

El extracto que contiene una enzima fitasa enzimáticamente susceptible puede emplearse para cualquier propósito en el que sea necesaria o se desee dicha actividad enzimática. Un aspecto de la descripción es un método de producción de piensos animales en el que se emplea una fitasa enzimáticamente susceptible para catalizar la hidrólisis de fitato en el pienso animal. En otro aspecto, la enzima se emplea para catalizar la hidrólisis de fitato en alimentos.

Otro aspecto de la descripción es una composición líquida que contiene una enzima fitasa enzimáticamente susceptible. Las composiciones líquidas no deben contener nada más que la enzima fitasa. Sin embargo, puede añadirse un estabilizante tal como glicerol, sorbitol o monopropilenglicol. La composición líquida también puede comprender otros aditivos, tales como sales, azúcares, conservantes, agentes de ajuste del pH, proteínas y fitato (un sustrato de la fitasa). Son composiciones líquidas típicas suspensiones acuosas o a base de aceite. Las composiciones líquidas pueden añadirse a un alimento o pienso antes o después de una granulación opcional de la composición de pienso.

Otro aspecto de la descripción es una composición seca que contiene una fitasa enzimáticamente susceptible. Las composiciones secas pueden ser composiciones secadas por congelación o secadas por pulverización, en cuyo caso la composición no debe contener nada más que la fitasa en una forma seca. Las composiciones secas pueden ser granulados que pueden mezclarse fácilmente, por ejemplo, con componentes del alimento o del pienso o formar un componente de una premezcla. El tamaño de partícula de los granulados de enzima es compatible con el de los otros componentes de la mezcla. Esto proporciona un medio seguro y conveniente de incorporación de fitasas, por ejemplo, en alimentos procesados o piensos animales.

Por ejemplo, puede prepararse una formulación de enzima fitasa estable por congelación de una mezcla de solución enzimática líquida con un agente formador de masa tal como harina de soja molida y después liofilización de la mezcla. La reducción en humedad y las interacciones de unión de la fitasa con el agente formador de masa protegen a la enzima de los factores ambientales externos, tales como las temperaturas extremas experimentadas durante la fabricación del pienso compuesto. Las formulaciones secas pueden potenciar adicionalmente la estabilidad por minimización de la actividad de enzimas proteolíticas potenciales que pueden estar presentes como subproductos en la mezcla de fermentación líquida usada para fabricar la enzima diana. La mezcla de enzima seca-harina de soja resultante puede resistir temperaturas muy extremas. La mezcla enzimática formulada puede usarse como un complemento del pienso para usar en producción de aves y cerdos.

Otro aspecto de la descripción es una planta o parte de planta que contiene una enzima fitasa enzimáticamente susceptible. Pueden usarse plantas o partes de plantas como un mecanismo de administración para la enzima. Pueden seleccionarse plantas del grupo constituido por maíz, trigo, soja y un grano de cualquiera de estas plantas. El grano intacto protege a la enzima diana de los factores ambientales externos. El grano que contiene la enzima puede añadirse al pienso animal en forma de semilla agrietada, semilla molida o en una forma más refinada. Como alternativa, un extracto de proteína puede estar hecho de semilla y ese extracto puede procesarse adicionalmente en un líquido estabilizado o en un estado seco mediante secado por liofilización o pulverización.

Otro aspecto de la descripción es una composición que comprende una enzima fitasa enzimáticamente susceptible. Un ejemplo de una composición son granulados por aglomeración. Los granulados por aglomeración se preparan usando técnicas de aglomeración en una mezcladora de alta cizalla durante las que se aglomeran de forma conjunta

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un material de carga y la enzima para formar gránulos. Se preparan granulados por absorción teniendo núcleos de un material de soporte para absorber/recubrirse por la enzima.

Las composiciones o gránulos por aglomeración también pueden contener materiales de carga. Son materiales de carga típicos sales tales como sulfato disódico. Otras cargas incluyen caolín, talco, silicato de magnesio y aluminio y fibras de celulosa. Opcionalmente, también se incluyen aglutinantes tales como dextrinas en los granulados por aglomeración.

Las composiciones o gránulos por aglomeración también pueden contener materiales de vehículo. Los materiales de vehículo típicos incluyen almidón, por ejemplo, en forma de mandioca, maíz, patata, arroz y trigo. También pueden usarse sales.

Opcionalmente, los gránulos se recubren con una mezcla de recubrimiento. Dicha mezcla comprende agentes de recubrimiento, preferiblemente agentes de recubrimiento hidrófobos, tales como aceite de palma hidrogenado y sebo de vaca y, si se desea, otros aditivos tales como carbonato de calcio o caolín.

Además, las composiciones pueden contener otros sustituyentes tales como agentes colorantes, compuestos aromatizantes, estabilizantes, vitaminas, minerales, otras enzimas mejoradoras del pienso o alimento, etc. Esto es así en particular para las denominadas premezclas. Un aspecto de la descripción es una premezcla que comprende una enzima fitasa enzimáticamente susceptible.

Otro aspecto de la descripción es un aditivo alimentario o del pienso que comprende una fitasa termotolerante enzimáticamente susceptible. Un aditivo alimentario o del pienso es un compuesto esencialmente puro o una composición multicomponente destinada o adecuada para añadirse al alimento o pienso. Es una sustancia que, por su uso deseado, se convierte en un componente de un producto alimenticio o pienso o afecta a cualquier característica de un producto alimenticio o pienso. Por lo tanto, un aditivo de fitasa enzimáticamente susceptible se entiende que significa una fitasa que no es un constituyente natural de las sustancias principales del pienso o alimento o que no está presente en su concentración natural en el mismo, por ejemplo, la fitasa enzimáticamente susceptible se añade al pienso por separado de las sustancias del pienso sola o en combinación con otros aditivos del pienso, o la fitasa enzimáticamente susceptible es una parte integrante de una de las sustancias del pienso pero se ha producido en la misma por tecnología de ADN recombinante. Un aditivo típico comprende habitualmente uno o más compuesto tales como vitaminas, minerales o enzimas potenciadoras del pienso y vehículos y/o excipientes adecuados.

Un aditivo de fitasa enzimáticamente susceptible listo para usar se define en este documento como un aditivo que no se produce in situ en el pienso animal o en el alimento procesado. Un aditivo de fitasa enzimáticamente susceptible listo para usar puede suministrarse a seres humanos o animales directamente o, preferiblemente, directamente después de la mezcla con otros constituyentes del pienso o alimento. Por ejemplo, un aditivo del pienso puede combinarse con otros componentes del pienso para producir el pienso. Dichos otros componentes del pienso incluyen uno o más de otros complementos enzimáticos, aditivos de vitaminas del pienso, aditivos minerales del pienso y aditivos de aminoácidos del pienso. Los aditivos del pienso resultantes (combinados), incluyendo posiblemente varios tipos diferentes de compuestos, pueden mezclarse después en una cantidad apropiada con los otros componentes del pienso, tales como complementos de cereales y proteínas, para formar un pienso animal. El procesamiento de estos componentes en un pienso animal puede realizarse usando medios de cualquiera de los aparatos de procesamiento usados actualmente, tales como una máquina granuladora doble, una granuladora por vapor, un expansora o una extrusora. Otro aspecto de la descripción es un pienso animal que comprende una enzima fitasa enzimáticamente suceptible.

Otro aspecto de la descripción es un aditivo alimentario que comporende una fitasa enzimáticamente susceptible que comprende además otros componentes alimentarios para producir productos alimenticios procesados. Dichos otros componentes alimentarios incluyen uno o más de otros complementos enzimáticos, aditivos de vitaminas del alimento y aditivos minerales del alimento. El aditivo alimentario resultante (combinado), incluyendo posiblemente varios tipos diferentes de compuestos, puede mezclarse después en una cantidad apropiada con los otros componentes alimentarios, tales como proteínas de cereales y plantas, para formar un producto alimenticio procesado. El procesamiento de estos componentes en un producto alimenticio procesado puede realizarse mediante el uso de cualquiera de los aparatos de procesamiento usados actualmente. Un aditivo de piensos animales se complementa para el animal antes o de forma simultánea con la dieta. La fitasa enzimáticamente susceptible puede ser activa durante la fabricación solamente y puede no ser activa en el producto alimenticio o pienso final. Este aspecto es particularmente importante, por ejemplo, en la preparación y horneado de masas y en la producción de otros productos a base de cereales listos para usar.

Otro aspecto de la descripción es una composición de fitasa enzimáticamente susceptible que comprende además una cantidad eficaz de uno o más enzimas mejoradoras del pienso, alimento o combustible. Las enzimas mejoradoras se seleccionan del grupo constituido por alfa-galactosidasas, beta-galactosidasas, lactasas, otras fitasas, beta-glucanasas, en particular endo-beta-1,4-glucanasas y endo-beta-1,3(4)-glucanasas, celulasas, xilosidasas, galactanasas, en particular, arabinogalactano endo-1,4-beta-galactosidasas y arabinogalactano endo- 1,3-beta-galactosidasas, endoglucanasas, en particular, endo-1,2-beta-glucanasa, endo-1,3-alfa-glucanasa y endo-

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1,3-beta-glucanasa, enzimas degradantes de pectina, pectinesterasas, liasas de pectina, poligalacturonasas, arabinanasas, ramnogalacturonasas, ramnogalacturonano acetil esterasas, ramnogalacturonan-alfa-ramnosidasa, pectato liasas y alfa-galacturonisidasas, mananasas, beta-manosidasas, manano acetil esterasas, xilano acetil esterasas, proteasas, xilanasas, arabinoxilanasas y enzimas lipolíticas tales como lipasas, fosfolipasas, cutinasas, alfa-amilasa, glucoamilasa, glucosa isomerasa, glucanasa, beta-amilasa, alfa-glucosidasa, isoamilasa, pululanasa, neo-pululanasa, iso-pululanasa, amilopululanasa, celulasa, exo-1,4-beta-celobiohidrolasa, exo-1,3-beta-D-glucanasa, beta-glucosidasa, endoglucanasa, L-arabinasa, alfa-arabinosidasa, galactanasa, galactosidasa, mananasa, manosidasa, xilanasa, xilosidasa, proteasa, glucanasa, xilanasa, esterasa, ácido ferúlico esterasa, fitasa y lipasa.

Otro aspecto de la descripción es una composición de fitasa enzimáticamente susceptible que comprende además una cantidad eficaz de una o más enzimas mejoradoras.

En otro aspecto puede ser deseable generar una proteína con una estabilidad gástrica disminuida. Una estabilidad gástrica de la proteína puede determinarse llevando a cabo un ensayo de digestibilidad de fluido gástrico simulado (SGF) como se describe en Thomas y col., Regulatory Toxicology and Pharmacology 39: 87-98(2004)) y en el ejemplo 9 de la presente solicitud. Las proteínas que presentan estabilidad gástrica son típicamente estables en SGF durante al menos 10, 15, 20, 30, 60 minutos o más. Una proteína estable es una proteína que no disminuye en peso molecular como se indica visualmente en un gel de proteínas en un análisis de SGF, en el que el análisis de SGF se llevó a cabo durante al menos 10, 15, 20, 30, 60 minutos o más.

Otro aspecto de la descripción es un método de producción de piensos humanos o animales que comprenden una enzima fitasa enzimáticamente susceptible. Los granos y harinas destinadas para alimentos humanos pueden tratarse enzimáticamente con una fitasa enzimáticamente susceptible para reducir el contenido de fitina del material. Los niveles reducidos de fitina aumentan la calidad del alimento por aumento de la disponibilidad de nutrientes de minerales esenciales tales como hierro, calcio y cinc. Además de aumentar la calidad nutricional del alimento, una fitasa enzimáticamente susceptible usada durante el procesamiento del alimento puede mejorar la eficacia global del método de producción del alimento. Por ejemplo, la adición de una fitasa enzimáticamente susceptible a copos de soja blancos durante la fabricación de aislado de proteína de soja puede aumentar significativamente el rendimiento y la calidad de la proteína extraíble. Durante la fabricación del alimento, la fitasa enzimáticamente susceptible es activa solamente durante la fabricación y el procesamiento y no es activa en el producto alimenticio final. Este aspecto es importante, por ejemplo, en la preparación y horneado de masas. De forma similar, puede procesarse previamente el grano del pienso animal, tal como harina de soja o harina de colza tostada, con una fitasa enzimáticamente susceptible antes de la fabricación del pienso compuesto. La eliminación de los factores antinutritivos en componentes de piensos animales antes de la fabricación de piensos compuestos produce una calidad nutricionalmente más elevada e ingredientes del pienso animal de mayor valor. En este método de procesamiento, la fitasa enzimáticamente susceptible es activa durante la fabricación del pienso y puede ser o no activa en el tracto digestivo del animal tras la ingesta del pienso tratado.

Otra posibilidad para la adición de fitasa enzimáticamente susceptible al pienso animal y al alimento procesado es añadir material vegetal o semillas transgénicas que contienen fitasa enzimáticamente susceptible al pienso. Las partes de las plantas que expresan la fitasa enzimáticamente susceptible, por ejemplo, la semilla de las plantas transgénicas u otros materiales vegetales tales como raíces, tallos, hojas, madera, flores, corteza y/o frutos pueden incluirse en piensos animales, como tales o después de un procesamiento adicional. En un pienso o alimento a base de cereal, el cereal es preferiblemente trigo, cebada, maíz, sorgo, centeno, avena, triticale o arroz. La fitasa enzimáticamente susceptible también puede usare ventajosamente en monogástricos, así como en poligástricos, especialmente en terneros jóvenes. Las dietas para peces y crustáceos también pueden complementarse con fitasa enzimáticamente susceptible para mejorar adicionalmente la proporción de conversión de pienso y reducir el nivel de fósforo excretado para sistemas de producción intensivos. El pienso también puede suministrarse a animales tales como aves, por ejemplo, pavos, gansos, patos, así como a suinos, equinos, bovinos, ovinos, caprinos, caninos y felinos, así como a peces y crustáceos. Los piensos también pueden suministrarse a cerdos o a aves incluyendo, pero sin limitación, pollos de engorde, gallinas, gallinas ponedoras, pavos y patos. El pienso animal puede usarse en animales monogástricos o poligástricos. El pienso animal puede suministrarse para aves o suinos, o terneros o animales de compañía, tales como perros o gatos o caballos

Otro aspecto de la descripción es un pienso animal que comprende una fitasa enzimáticamente susceptible. Una fitasa termotolerante enzimáticamente susceptible es capaz de sobrevivir a la etapa de acondicionamiento térmico que se encuentra en un molino de gránulos comercial durante la formulación del pienso, por lo tanto, se describe un método de preparación de pienso animal, por ejemplo, gránulos de pienso de gránulo duro que comprenden una fitasa enzimáticamente susceptible. Para preparar el pienso, la fitasa enzimáticamente susceptible formulada puede mezclarse con componentes del pienso, la mezcla acondicionarse con vapor en un molino de gránulos, de tal modo que al menos el 50% de la actividad enzimática pretratada térmicamente se conserva y el pienso se extruye a través de un troquel de gránulos. Por lo tanto, la fitasa enzimáticamente susceptible puede usarse como un complemento en piensos animales en sí misma, además de con vitaminas, minerales, otras enzimas del pienso, coproductos agrícolas (por ejemplo, entrefinos de trigo o harina de gluten de maíz) o en combinación con los mismos. La enzima también puede añadirse a dietas trituradas, es decir, dietas que no han pasado por una granuladora.

Otro aspecto de la descripción es un método para preparar un pienso animal en el que una preparación que

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comprende la fitasa enzimáticamente susceptible se trata con calor a una temperatura superior a 50°C, de tal modo que se produce una mezcla de pienso animal tratada térmicamente. La preparación de fitasa enzimáticamente susceptible puede ser material vegetal transgénico. El material vegetal transgénico puede ser grano de maíz, maíz agrietado, harina de maíz o un extracto enzimático preparado a partir del maíz.

Las operaciones de producción animal intensiva aspiran a limitar la contaminación con el fosfato que está contenido en las heces de los animales que se producen. La cantidad de fosfato presente en la dieta y la disponibilidad del fosfato en la dieta para el animal son los factores principales que influyen en el fosfato excretado presente en las heces del animal. Actualmente, la disponibilidad del fosfato vegetal o procedente de grano presente en harina de soja, grano de maíz (y otros materiales de piensos) es reducida puesto que el fosfato está principalmente en la forma de ácido fítico. Para maximizar las eficiencias de crecimiento de los animales, se añade fosfato inorgánico al pienso dando como resultado una composición de pienso que contiene niveles adecuados de fosfato disponible. Sin embargo, estas formulaciones de pienso contienen demasiado fosfato total y dan como resultado la contaminación con fosfato.

Otro aspecto de la descripción es una composición de pienso animal que comprende una fitasa enzimáticamente susceptible y comprende además niveles de fósforo inorgánico sustancialmente disminuidos. Las composiciones de pienso comprenden ingredientes, micronutrientes, vitaminas, etc. de pienso típicos y una cantidad eficaz de fitasa enzimáticamente susceptible y fosfato inorgánico, en las que las cantidades de la fitasa enzimáticamente susceptible y del fósforo son de aproximadamente entre los niveles de 50-20.000 unidades de fitasa enzimáticamente susceptible por kg de pienso y menos del 0,45% de fósforo inorgánico; entre los niveles de 100-10.000 unidades de fitasa enzimáticamente susceptible por kg de pienso y menos del 0,225% de fósforo inorgánico; entre los niveles de 150-10.000 unidades de fitasa por kg de pienso y menos del 0,15% de fósforo inorgánico o entre los niveles de 25020.000 unidades de fitasa por kg de pienso y sin fósforo inorgánico añadido exógenamente.

Otro aspecto de la descripción es un método de uso de una fitasa enzimáticamente susceptible para mejorar las ganancias de peso y las proporciones de conversión de pienso (FCR) asociadas con la producción de animales de granja. Una fitasa enzimáticamente susceptible de la presente descripción permite una ganancia de peso y una FCR mejoradas. Los métodos para una ganancia de peso y una FCR mejoradas también pueden incluir una dieta que sea baja en fosfato inorgánico. El método para mejorar la FCR o la ganancia de peso a través de una dieta baja en fosfato inorgánico por suministro de una dieta a un animal que comprende una fitasa enzimáticamente susceptible y un nivel de fosfato inorgánico a o por debajo del nivel del 0,45%. El método puede comprende suministrar una dieta que contiene una fitasa enzimáticamente susceptible y menos del 0,225% de fosfato inorgánico o el método comprende el suministro de una dieta que contiene la fitasa enzimáticamente susceptible y nada de fósforo inorgánico añadido.

Se describe un método de mejora del valor nutritivo de un producto de grano procesado o un método de procesamiento de grano que comprende añadir una fitasa enzimáticamente susceptible al producto de grano durante el procesamiento del grano en una cantidad eficaz para mejorar el valor nutritivo del pienso. En un aspecto, el grano es maíz y el método de procesamiento del grano es molienda húmeda y los productos del procesamiento son pienso de gluten de maíz, gluten de maíz y almidón de maíz. En otros aspectos, el grano es maíz, trigo, soja, colza o caña de azúcar. En otros aspectos, el grano es una semilla de oleaginosa, tal como soja o colza o semilla de colza y el producto de grano procesado es la harina de semilla de oleaginosa.

Un aspecto de la descripción es el producto de una célula vegetal transformada que comprende un polinucleótido que codifica una fitasa enzimáticamente susceptible. El producto puede ser una semilla, grano o fruto. El producto puede ser una planta y, en particular, una planta híbrida o una planta endogámica. El producto también puede ser un producto de procesamiento de grano que comprende la fitasa termotolerante de la descripción, tal como el producto de procesamiento de grano de maíz y el producto de procesamiento de grano de semillas oleaginosas descritos anteriormente en este documento o un producto de procesamiento de semillas de oleaginosas.

Los animaes de la descripción incluyen animales poligástricos, por ejemplo, terneros, así como animales monogástricos tales como suinos, aves (por ejemplo, pollos, pavos, gansos, patos, faisanes, urogallos, codorniz y avestruz), equinos, ovinos, caprinos, caninos y felinos, así como peces y crustáceos. Otro aspecto de la descripción incluye un pienso o pienso animal preparado como pienso para aves o cerdos.

Aunque en la memoria descriptiva anterior esta invención se ha descrito en relación con ciertos aspectos preferidos de la misma y se han expuesto muchos detalles con fines ilustrativos, será evidente para los especialistas en la técnica que la descripción es susceptible de aspectos adicionales y que ciertos de los detalles descritos en este documento pueden variarse considerablemente sin alejarse de los pricipios básicos de la descripción.

Ejemplos:

La invención se describirá adicionalmente mediante los siguientes ejemplos que no pretenden limitar el alcance de la invención de ningún modo.

Ejemplo 1: Modelado de proteínas de Nov9X

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Se seleccionó Nov9X como la molécula de fitasa para el modelado de proteínas. Se han resuelto seis estructuras cristalinas de fitasa de E. coli y se han depositado en el Research Collaboratory for Structural Bioinformation Protein Data Base (PDB) (http: //
www.rcsb.org/pdb/home/home.do) con las PDB ID: 1DKL, 1DKM, 1DKN, 1DKO, 1DKP, 1DKQ. Para seleccionar un molde apropiado para modelar la proteína Nov9X, se extrajeron todas las estructuras cristalinas de la fitasa de la PDB. Se seleccionó la estructura 1DKM (Resolución: 2,25 Angstrom) como el molde para modelar Nov9X. Se generaron cinco modelos optimizados mediante el programa informático Modeler dentro del paquete Insight II de Accelrys, Inc., y se seleccionaron los modelos con el menor valor de función objetivo. El modelo de Nov9X seleccionado era muy similar a 1DKM con sólo 0,23 Angstrom de diferencia con respecto al RMS del C- alfa de la cadena principal.

Se modelaron mutaciones para desglicosilación, eliminación de puentes disulfuro intramoleculares potenciales e introducción de sitios de escisión de pepsina con la ayuda del programa informático SwissPdb Viewer (Guex, N. y Peitsch, M. C. SWISS-MODEL y el Swiss-PdbViewer: An environment for comparative protein modeling. Electrophoresis, 18, 2714-2723 (1997)) de inspección de estructura, análisis de superficie y generación de gráficos.

Los cambios de aminoácidos para Nov9X para generar las variantes se registran en las Tablas 1, 2, 3, 4 y 9. Las posiciones de aminoácidos modificadas son con respecto a la posición en la proteína Nov9X descrita en la SEC ID N°: 34. La proteína Nov9X comienza con el aminoácido “A”. Las moléculas de fitasa variantes se generaron sin la “A” y además, las variantes de fitasa pueden comenzar con cualquier aminoácido o sin aminoácido en la primera posición. Esta variabilidad en el primer aminoácido para las enzimas fitasas variantes se muestra en la lista de secuencias y se indica mediante una “X” al comienzo de la secuencia de aminoácidos.

Ejemplo 2: Diseño racional de variantes de Nov9X: sitios de glicosilación

Se identificaron informáticamente dos sitios de N-glicosilación en Nov9X, así como mediante análisis espectrométrico de masas de variantes proteicas de Nov9X expresadas en Pichia y endospermo de maíz. Se seleccionaron para la modificación estos dos sitios de la proteína que se glicosilaron durante la expresión en sistemas de expresión eucariotas. Estos sitios de glicosilación se corresponden con los restos aminoacídicos 139161 y los restos aminoacídicos 318-320 de Nov9X (SEC ID N°: 34). La Tabla 1 muestra las modificciones de aminoácidos realizadas en los dominios de glicosilación identificados para dar origen a los polipéptidos descritos en las SEC ID N°: 1-3.

TABLA 1: Modificaciones para Nov9X basadas en glicosilación

Sitio

Aminoácido anterior - posición de base - nuevo aminoácido SEC ID N°: (nombre del mutante)

Glicosilación

N140Q; N318Q 1 (Mut1)

Glicosilación

T142R; N318Q 2 (Mut2)

Glicosilación

T142R; T320V 3 (Mut3)

Ejemplo 3: Diseño racional de variantes de Nov9X: puentes disulfuro

Se identificaron restos de cisteína específicos en la fitasa Nov9X a partir de la secuencia de aminoácidos de Nov9X y de la información estructural (Lim y col. Nature, 7 (2) 108-113(2000)). Las modificaciones se dirigieron a los restos de cisteína que participan en puentes disulfuro intramoleculares. Además, las modificaciones se dirigieron a restos de cisteína que participaban potencialmente en puentes disulfuro intermoleculares. Las modificaciones en la formación de puentes disulfuro se mapearon en el modelo tridimensional de la proteína para evitar realizar modificaciones en la estructura global y la capacidad de la proteína para plegarse en la conformación correcta. Se modificaron aminoácidos de cisteína en Nov9X para generar las secuencias descristas en las SEC ID N°: 4-14. Los cambios aminoacídicos específicos se muestran en la Tabla 2.

TABLA 2: Modificación para Nov9X basada en puentes disulfuro

Dominio

Aminoácido anterior - posición de base - nuevo aminoácido SEC ID N°: (nombre del mutante)

Cisteína

C76K; C205N 4 (Mut4)

Cisteína

C76K; C205N; C179A; C189A 5 (Mut5)

Cisteína

C76K; C205N; C383A; C392A 6 (Mut6)

Cisteína

C76K; C205N; C179A; C189A; C383A, C392A 7 (Mut7)

Cisteína

C76K; C205N; C78A; C109A 8 (Mut8)

Cisteína

C76K; C205N; C134A; C409A 9 (Mut9)

Cisteína

A26F, C76V, T115H, N138E, T142R, E147R, G158R, C205D, V212W, Q254V, R268A, T328Y, C179A, C189A 10 (Mut10)

Cisteína

A26F, C76V, T115H, N138E, T142R, E147R, G158R, C205D, V212W, Q254V, R268A, T328Y, C383A, C392A 11 (Mut11)

Cisteína

A26F, C76V, T115H, N138E, T142R, E147R, G158R, C205D, V212W, Q254V, R268A, T328Y, C179A, C189A, C383A, C392A 12 (Mut12)

Cisteína

A26F, C76V, T115H, N138E, T142R, E147R, G158R, C205D, V212W, Q254V, R268A, T328Y, C78A, C109A 13 (Mut13)

Cisteína

A26F, C76V, T115H, N138E, T142R, E147R, G158R, C205D, V212W, Q254V, R268A, T328Y, C134A, C409A 14 (Mut14)

Ejemplo 4: Diseño racional de variantes de Nov9X: sitios de escisión de pepsina potenciales

El modelo de estructura tridimensional de Nov9X se analizó para identificar bucles en la estructura proteica que fueran candidatos para modificación por ingeniería genética con sitios de escisión de pepsina potenciales. Los 5 bucles particulares identificados para la modificación debían cumplir varios criterios incluyendo: 1) el bucle no estaba enterrado dentro de la estructura tridimensional de la proteína, 2) el bucle estaba en la superficie de la proteína y, por lo tanto, expuesto al medio circundante y accesible a proteasas cuando la proteína estaba correctamente plegada, 3) el bucle no estaba implicado en la formación del sitio activo o el sitio de unión a sustrato o producto de la enzima y 4) el bucle contenía una secuencia de aminoácidos similar a un sitio de escisión de pepsina favorable, de 10 tal modo que facilitaba la generación de un cambio minoritario en la secuencia de aminoácidos (uno o dos restos cambiados) para introducir sitios de escisión de pepsina favorables en el bucle.

Este enfoque no modifica la longitud de los bucles y mantiene las mutaciones a un nivel mínimo para evitar la alteración de la estructura local y global de la proteína plegada. Se identificaron varios bucles de proteína que cumplían los criterios anteriores y estos bucles se correspondían con los siguientes restos aminoacídicos en Nov9X 15 (SEC ID N°: 34), 33-46, 105-137, 172-177, 229-240, 281-293, 316-330 y 364-373. Se generaron por ingeniería genética sitios de escisión de pepsina potenciales dentro de uno o más de estos bucles para contener una secuencia de aminoácidos que se sabe que es atacada más fácilmente por la enzima pepsina. Las enzimas fitasas enzimáticamente susceptibles se muestran en la Tabla 3 y se corresponden con las secuencias de aminoácidos descritos en las SEC ID N°: 15-25.

20 TABLA 3: Modificaciones para Nov9X basadas en sitios de escisión de proteasas potenciales

Sitio

Aminoácido anterior - posición de base - nuevo aminoácido SEC ID N°: (nombre del mutante)

Sitio de escisión de pepsina

W37F; P38Y 15(Pep1)

Sitio de escisión de pepsina

P124E; P127L 16(Pep2)

Sitio de escisión de pepsina

N126Y; P127V 17(Pep3)

Sitio de escisión de pepsina

P174Y 18(Pep4)

Sitio de escisión de pepsina

G233E; G235Y 19(Pep5)

Sitio de escisión de pepsina

K286F; Q287Y 20(Pep6)

Sitio de escisión de pepsina

N317L; W318Y 21 (Pep7)

Sitio de escisión de pepsina

S367F 22 (Pep8)

Sitio de escisión de pepsina

W37F; P38Y; P124E; P127L 23 (Pep9)

Sitio de escisión de pepsina

W37F; P38Y; N126Y; P127V 24(Pep10)

Sitio de escisión de pepsina

P174Y; N317L; W318Y 25(Pep11)

Ejemplo 5: Diseño racional de mutantes de Nov9X: inserción de sitios de escisión de pepsina altamente favorables

Los blucles de proteína identificados en el Ejemplo 4 se modificaron por inserción en o reemplazo de la secuencia del bucle en su totalidad. La secuencia del bucle se reemplazó con la secuencia de una secuencia de sitio de 5 escisión de pepsina altamente favorable (Keil B., Spedficity of Proteolysis. Springer-Verlag Berlin-Heidelber-Nueva York pág. 335 (1992)). Las modificaciones para la proteína Nov9X eran moderadas debido a la inserción de una secuencia nueva en su totalidad que tenía varios aminoácidos de longitud. La Tabla 4 muestra las modificaciones de aminoácidos realizadas en Nov9X y se corresponden con las secuencias de aminoácidos que se describen en las SEC ID N°: 26-33.

10 TABLA 4: Modificaciones para Nov9X basadas en sitios de unión de pepsina de alta afinidad

Sitio

Aminoácido anteriores - posiciones de base - nuevos aminoácidos SEC ID N°: (nombre del mutante)

Sitio de inserción

DAWPTW 36-41 IEFFRL 26(Pep41)

Sitio de inserción

QADTSSP 116-122 PTEFFRL 27(Pep42)

Sitio de inserción

PDPLFNP 122-128 PIEFFRL 28(Pep43)

Sitio de inserción

PQ 174-175 PIEFFRLQ 29(Pep44)

Sitio de inserción

EPGWGRI 232-238 PIEFFRL 30(Pep45)

Sitio de inserción

PPQKQAY 284-290 PPEFFRL 31 (Pep46)

Sitio de inserción

WTLPGQP 319-325 PIEFFRL 32 (Pep47)

Sitio de inserción

TPLSLNT 365-371 PPEFFRL

33(Pep48)

Ejemplo 6: Optimización de codones de variantes para expresión bacteriana

La secuencia proteica de la enzima fitasa enzimáticamente susceptible se convirtió en una secuencia polinucleotídica. La secuencia polinucleotídica se modificó de tal modo que el codón usado para la traducción en 5 aminoácidos reflejaba el codón óptimo usado en E. coli.

Las secuencias polinucleotídicas optimizadas para E. coli, como se describen en las SEC ID N°: 35-67, se sintetizaron y se subclonaron en el vector de expresión de E. coli pFLEX HX por GeneArt, Regensburg, Alemania. El vector final contenía un casete de expresión que incluía la secuencia polinucleotídica de codones optimizados para la fitasa enzimáticamente susceptible unida a una secuencia que añadía un marcador His N-terminal. Para facilitar la 10 consulta, la Tabla 5 muestra la relación entre secuencias polipeptídicas y polinucleotídicas contenidas en la Lista de secuencias.

Tabla 5: Secuencias polinucleotídicas y secuencias polipeptídicas de codones optimizados

Secuencia polipeptídica SEC ID N°: (nombre del mutante)

Secuencia polinucleotídica de codones optimizados para E. coli correspondiente (SEC ID N°: ) Secuencia polinucleotídica optimizada para planta correspondiente (SEC ID N°: )

1 (Mut1)

35 70

2 (Mut2)

36 71

3 (Mut3)

37 72

4 (Mut4)

38 73

5 (Mut5)

39 74

6 (Mut6)

40 75

7 (Mut7)

41 76

8 (Mut8)

42 77

9 (Mut9)

43 78

10 (Mut10)

55 90

11 (Mut11)

56 91

12 (Mut12)

57 92

13 (Mut13)

58 93

14 (Mut14)

59 94

15(Pep1)

44 79

16(Pep2)

45 80

17(Pep3)

46 81

18(Pep4)

47 82

19(Pep5)

48 83

20(Pep6)

49 84

21 (Pep7)

50 85

22(Pep8)

51 86

23(Pep9)

52 87

24(Pep10)

53 88

25(Pep11)

54 89

26(Pep41)

60 95

27(Pep42)

61 96

28(Pep43)

62 97

29(Pep44)

63 98

30(Pep45)

64 99

31 (Pep46)

65 100

32 (Pep47)

66 101

33(Pep48)

67 102

103 (Mut 15)

124 145

104 (Mut 17)

125 146

105 (Mut 18)

126 147

106 (Mut 19)

127 148

107 (Mut 20)

128 149

108 (Mut 21)

129 150

109 (Mut 22)

130 151

110 (Mut 23)

131 152

111 (Mut 24)

132 153

112 (Mut 25)

133 154

113 (Mut 26)

134 155

5

10

15

20

25

30

114 (Mut 27)

135 156

115 (Mut 28)

136 157

116 (Mut 29)

137 158

117 (Mut 30)

138 159

118 (Mut 31)

139 160

119 (Mut 32)

140 161

120 (Mut 33)

141 162

121 (Mut 34)

142 163

122 (Mut 35)

143 164

123 (Mut 36)

144 165

Ejemplo 7: Construcción de vector para expresión bacteriana

Los casetes de expresión de codones optimizados bacterianos descritos en el Ejemplo 6 se clonaron en el vector de expresión pET24a (Invitrogen).

Los casetes de expresión que contenían las secuencias polinucleotídicas descritas en las SEC ID N°: 35, 36 y 38 se clonaron como fragmentos NdeI/ Xhol.

Los casetes de expresión que contenían las secuencias polinucleotídicas descritas en las SEC ID N°: 37, 39-43 y 59 se clonaron como fragmentos NdeI/ Notl.

Las digestiones de restricción para generar los fragmentos de vector e inserto se llevaron a cabo siguiendo protocolos convencionales (Sambrook y col. Molecular Cloning: A Laboratory Manual 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, Nueva York (1989)). Los productos digeridos se separaron mediante electroforesis en gel en un gel de agarosa al 0,8% y las bandas correctas se cortaron del gel y se purificaron usando el Gene clean spin kit de Qbiogene. Los fragmentos de inserto y vector purificados se ligaron después entre sí usando la ligasa Clonables de Novagen o la T4 ADN ligasa de Epicentre Biotechnologies, siguiendo los protocolos de los fabricantes. Los vectores ligados se transformaron después en células de E. coli TOP 10 de Invitrogen siguiendo el protocolo prescrito por el fabricante y se seleccionaron en placas de agar Luria + kanamicina (50 |ig/ml).

Las colonias que crecieron las placas se exploraron mediante PCR de colonias con el cebador directo descrito en la SEC ID N°: 68 y el cebador inverso descrito en la SEC ID N°: 69 para confirmar la presencia del plásmido correcto. Las PCR se prepararon de la forma siguiente: 2,8 pmol de cada cebador, mezcla de PCR Jumpstart 2x de Sigma, colonia de E. coli como molde y agua hasta un volumen de reacción final de 5 |il. Se usaron las siguientes condiciones de ciclado: una desnaturalización inicial de 94°C durante 3 minutos seguida de 25 ciclos de 94°C durante 30 segundos, 55°C durante 30 segundos y 72°C durante 60 segundos, seguidos de una etapa de extensión final de 72°C durante 10 minutos. Después, las colonias con los plásmidos deseados se cultivaron durante una noche en caldo de Luria + kanamicina (50 |ig/ml) a 37°C, 260 rpm, y el ADN plasmídico se extrajo usando el kit de minipreparaciones de Qiagen. El gen insertado en el ADN plasmídico resultante se secuenció para confirmar completamente que se había generado la construcción correcta.

Los casetes de expresión que contenían las fitasas enzimáticamente susceptibles cuya secuencia polinucleotídica se describe en las sEc ID N°: 44-54 se clonaron como fragmentos BsgI/AscI en el vector pFLEXHX T7. El pFLEXHX T7 se generó por reemplazo del promotor pFLEX HX con el promotor T7 de pET24a usando técnicas de biología molecular convencionales.

Ejemplo 8: Método de aislamiento de proteínas de bacterias

Los vectores pET24 y los vectores pFLEXHX T7 que contienen los casetes de expresión que contienen las secuencias polinucleotídicas como se describen en el Ejemplo 7, se transformaron en células de E. coli BL21[DE3] (Invitrogen). Se inocularon alícuotas de 10 ml de medio LB que contenía kanamicina (50 |ig/ml) (Sigma) con una

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

colonia de las placas de transformación y se incubaron durante una noche con agitación a 30oC. Se transfirieron 510 ml de estos cultivos a alícuotas de 500 ml de medio LB que contenía kanamicina a 50 |ig/ml en matraces con agitación de 1 l. Los matraces se incubaron a 37oC con agitación hasta que se alcanzaba una DO600 de aproximadamente 0,6. Los matraces con agitación se transfirieron a un incubador a 15oC. Se añadió IPTG (Sigma) para dar una concentración final de 0,1 mM y los matraces se incubaron durante una noche con agitación. La biomasa celular se recogió por centrifugación a 24.000 X g durante 15 minutos. La densidad celular a la recogida estaba en el intervalo de 2,5 a 3,5 DO600. La biomasa celular se congeló a -20oC.

Las muestras de biomasa celular se descongelaron y se resuspendieron en 50 ml de tampón de extracción (Tris 20 mM, imidazol 25 mM, NaCl 500 mM, pH 7,5). Las células se lisaron por paso de la suspensión a través de un disruptor celular de Constant Systems a 172,32 MPa (25.000 psi) y la muestra se lavó abundantemente con 25 ml de tampón de extracción. El material insoluble se retiró por centrifugación a 24.000 X g durante 30 minutos, seguido de filtración a través de dispositivos de filtro al vacío de 0,22 |im (Millipore Steritop). Los lisados aclarados se mantuviero en hielo.

Una columna HisTrap FF de 5 ml (GE Healthcare, resina Ni-Sepharose FF, diámetro de lecho de 1,6 cm) se equilibró con tampón de extracción. Se cargaron 43 ml de las muestras de lisado aclarado a 4 ml/min. Se lavó el material no unido a través de la columna con tampón de extracción a 4 ml/min. Se eluyeron las proteínas purificadas por afinidad con tampón de elución (Tris 20 mM, imidazol 500 mM, NaCl 500 mM, pH7,5) a 4 ml/min y se recogió el pico de elución a A280nm. Las soluciones recogidas se cambiaron de tampón en Tris 20 mM a pH7,5 usando concentradores centrífugos MWCO de 10 kDa (Millipore Amicon Ultra-15) y se concentraron hasta aproximadamente 3 ml en los mismos dispositivos. Las muestras se centrifugaron a 3700 X g durante 10 minutos para eliminar cualquier precipitado. Las concentraciones proteicas se estimaron por A280nm usando los coeficientes de extinción específicos. Las concentraciones estaban en el intervalo de 4-15 mg/ml y los rendimientos eran típicamente de 15-30 mg a partir de 500 ml de cultivo. Las muestras se almacenaron a -80oC.

Ejemplo 9: Estabilidad en fluido gástrico simulado (SGF)

Se realizó la digestibilidad en fluido gástrico simulado de muestras de proteína como se describe en Thomas y col., Regulatory Toxicology and Pharmacology 39: 87-98(2004)). Cada proteína de ensayo se purificó como se describe en el Ejemplo 8. La concentración de proteína de cada muestra se determinó usando el kit de BCA de Pierces.

La solución de G-Con se preparó de acuerdo con el siguiente protocolo: se disolvieron 200 mg de cloruro de sodio en 90 ml de agua mili-Q con mezcla. Esta solución se valoró a un pH de 1,2 usando HCl 6 N y se añadió agua mili-Q hasta un volumen final de 100 ml.

Se preparó fluido gástrico simulado con pepsina (SGF 1X) para cada proteína de ensayo para dar 10 unidades de pepsina por 1 g de proteína de ensayo en las soluciones de reacción. Por lo tanto, se usó una proporción de 10 U de actividad de pepsina/1 g de proteína de ensayo a lo largo de todo el estudio. La pepsina se adquirió de Sigma Chemical (St. Louis, MO) en un solo lote que tenía 3460 U/mg de proteína como se analizó por Sigma. El NaHCO3 200 mM se preparó con 1,68 g de NaHCO3 en 100 ml de agua mili-Q y se valoró con HCl a un pH de 11,0.

Cada proteína de ensayo se incubó en tres mezclas de reacción diferentes durante 60 minutos a 37oC en una placa caliente. Cada tubo que contenía G-Con o SGF se incubó a 37oC durante 2 minutos antes de añadir la proteína de ensayo. Las mezclas de reacción se prepararon de la forma siguiente:

Mezcla de reacción 1: 400 |il de volumen total, que contenía SGF (pepsina a una proporción de 10 unidades de pepsina por 1 |ig de proteína de ensayo en G-Con) y solución de proteína de ensayo.

Mezcla de reacción 2: 150 |il de volumen total, que contenía G-Con (HCl diluido, NaCl 100 mM l) a pH 1,2 y solución de proteína de ensayo (0,135 mg/ml de concentración final); esto es una muestra de control para estabilidad de proteína de ensayo en tampón de reacción sin pepsina.

Mezcla de reacción 3: 150 |il de SGF y agua; esto es una muestra de control para autodigestión de pepsina (pepsina sin proteína de ensayo).

Se retiraron muestras de 50D |il de las mezclas de reacción 1 y 3 (controles) a los 0 y 60 minuto, y de la mezcla de reacción 2 (ensayo) a los 0.5, 2, 5, 10, 20, 30 y 60 minutos. Cada una de estas muestras se transfirió a una solución de parada que contenía 35 |il tanto de NaHCO3 200 mM (pH 11,0) como tampón de carga Bio-Rad XT 4X. Las muestras de digestión de proteína a punto de tiempo cero se prepararon por inactivación de la pepsina en la solución antes de la adición de la proteína de ensayo. Todas las muestras se incubaron durante 5 minutos en un baño de agua a 70oC para detener la reacción y después se analizaron usando SDS-PAGE. Se analizaron 20 |il de cada muestra en un gel Bis-Tris al 4-12% (Biorad) en tampón de procesamiento XT MOPS (Biorad). La cantidad total de proteína cargada por carril era de 1,9 |ig. Se usó SeeBlue Plus2 Prestained Standard (Invitrogen) como el marcador de pesos moleculares. Después de la electroforesis, los geles se tiñeron con SimplyBlue SafeStain (Invitrogen). Las muestras de digestión se analizaron por inspección en visual de bandas de proteína teñidas después de la electroforesis.

La estabilidad en fluido gástrico simulado para las variantes de fitasa enzimáticamente susceptible generadas se muestra en la Tabla 6. La estabilidad en SGF de cada proteína se indica como la extensión de tiempo (en minutos) que la proteína o su fragmento o fragmentos peptídicos son visualmente detectables por tinción del gel después del SDS- PAGE.

5 Tabla 6: Estabilidad en SGF de enzimas fitasas enzimáticamente susceptibles

Variante

Estabilidad en SGF (minutos) Presencia de polímeros

Mut1

60+ Sí

Mut2

60+ Sí

Mut3

60+ Sí

Mut4

60+ No

Mut5

<20 No

Mut6

60+ No

Mut7

<20 No

Mut8

60+ No

Mut9

<5 No

Pep1

<10 Sí

Pep2

<10 Sí

Pep3

<10 Sí

Pep4

60+ Sí

Pep5

<30 Sí

Pep6

60+ Sí

Pep7

<30 Sí

Pep8

<30 Sí

Pep9

<20 Sí

Pep10

<2 Sí

Pep11

<30 Sí

Existe información contradictoria disponible con respecto a si las enzimas fitasas funcionan como proteínas monoméricas o si funcionan como multímeros. Las fitasas aisladas de Aspergillus niger, Aspergillus terreus, Aspergillus fumigatus, Emericella nidulas, Myceliophthora thermophila y Talaromyces thermophilus (Wyss y col. Appl. And Envior.

10 Micro. 65: 359-366 (1999)) funcionan como proteínas monoméricas. Además, las fitasas de semillas de soja (Gibson y col. Arch. Biochem. Biophys. 260: 503-513 (1988)), E. coli y Klebsiella terrigena (Greiner, y col. Arch. Biochem. Biophys. 303: 107-113 (1993); Greiner, y col. Arch. Biochem. Biophys. 341: 201-206 (1997)) y Bacillus subtilis (Schimizu, Biosci.

5

10

15

20

25

Biotechnol. Biochem. 56: 1266-1269 (1992)) parecen ser monoméricas. Se han demostrado pruebas de la formación de multímeros en fitasas de Aspergillus terrus, Aspergillus oryzae, Schwanniomyces castellii por Hubel, y col. Plant Physiol 112: 1429-1436 (1996); Segueilha, y col. J. Ferment. Bioeng. 74: 7-11 (1992); Schimizu Biosci. Biotechnol. Biochem, 57: 1364-1365 (1993) y Yamamoto y col. Agric. Biol. Chem. 36: 2097-2103.

Se observó formación de multímeros de la fitasa enzimáticamente susceptible en el análisis de SDS-PAGE del ensayo de SGF. No se observaron multímeros en el ensayo de SGF en las variantes de cisteína descritas en las SEC ID N°: 49.

Ejemplo 10: Actividad fitasa de las proteínas mutantes a lo largo de un intervalo de pH

Se llevaron a cabo ensayos de actividad fitasa siguiendo el método de ensayo descrito por Engelen y col. Journal of AOAC Int. 77 (3): 760-764 (1994). La enzima (Nov9X o las variantes de fitasa enzimáticamente susceptible a intervalos de concentración de 0,5-10 mg/ml) se diluyeron de 10000 a 50000 veces en agua antes del ensayo a diferentes pH. Se prepararon soluciones tampón con sustrato fitato de la forma siguiente:

Tampón glicina-HCl - se usó glicina 100 mM que contenía ácido fítico 3 mM para valores de pH de 2,0, 2,5, 3,0, y 3,5.

Tampón acetato - se usó acetato 100 mM que contenína ácido fítico 3 mM para valores de pH de 4,0, 4,5, 5,0 y 5,5.

Tampón Mes - se usó Mes 100 mM que contenía ácido fítico 3 mM para valores de pH de 6, 6,5 y 7,0.

Se llevaron a cabo reacciones de ensayo a diferentes pH por duplicado por 300 |il de tampón con 150 |il de sustrato de fitato diluido. Las incubaciones, durante 10 y 20 minutos, se llevaron a cabo a 37°C seguidas de la inactivación simultánea y la detección colorimétrica. El producto de fosfato inorgánico generaba complejos con iones molibdato y vanadato dando como resultado una formación de color. La absorbancia del ácido vanadomolibdofosfórico de color amarillo, cuya concentración es proporcional a la concentración de ión fosfato en la mezcla de reacción, se midió a una longitud de onda de 415 nm. La absorbancia medida se usó para determinar la concentración de ión fosfato por comparación con una curva de calibración patrón de fosfato.

La actividad fitasa relativa a pH 4,5 a 37°C en presencia de fitato 3 mM se muestra en la Tabla 7. La actividad relativa se expresa como porcentaje de la actividad de Nov9X. La actividad fitasa relativa a pH 2,5 a 27°C en presencia de fitato 3 mM se muestra en la Tabla 7. La actividad relativa se expresa como porcentaje de la actividad de Nov9X a pH 4,5.

Tabla 7: Actividad relativa de variantes de fitasa enzimáticamente susceptible

Variante

Actividad relativa a pH 4,5 Actividad relativa a pH 2,5

Mut1

142,0 84,7

Mut2

33,7 ND

Mut3

60,1 ND

Mut4

175,7 105,0

Mut5

161,7 97,4

Mut6

173,3 ND

Mut7

176,9 102,0

Mut8

184,4 ND

Mut9

176,9 110,7

Pep1

64,5 38,9

Pep2

60,0 ND

Pep3

55,2 30,0

Pep4

161,8 83,8

Pep5

121,4 68,8

Pep6

66,7 ND

Pep7

138,3 110,7

Pep8

195,3 120,5

Pep9

122,5 52,6

Pep10

13,5 ND

Pep11

100,2 67,4

ND: datos no generados

Ejemplo 11: Comparación de la termotolerancia de las proteínas mutantes

Se diluyó proteína de ensayo en tampón acetato 100 mM (pH 4,5), que contenía Tween 20 al 0,01% antes del tratamiento térmico. Se trataron térmicamente 100 |il de cada solución de enzima diluida usando un Gradient PCR 5 Cycler a 40-95°C (incrementos de 5°C por incubación) durante 5 minutos. Las enzimas sometidas a choque térmico se colocaron inmediatamente y se mantuvieron en condiciones de refrigeración hasta que se realizó la dilución de ensayo. La actividad fitasa residual en la fracción enzimática tratada térmicamente se estimaba usando un ensayo de fitasa normalizado después de una dilución de 10000 a 50000 veces en tampón acetato 100 mM (pH 4,5), que contenía sustrato fitato 3 mM y Tween 20 al 0,01%. La mezcla de reacción de fitasa se incubó a 37oC durante 15-40 10 minutos. El ensayo de cada fracción tratada térmicamente se realizó por duplicado en bloques de 96 pocillos profundos y se estimó la cantidad de fosfato inorgánico liberado por comparación de la absorbancia de las reacciones colorimétricas con la curva de fosfato patrón. La actividad fitasa residual se calculó por comparación con la actividad observada en la fracción enzimática sin tratar.

Se determinó la termotolerancia relativa de las enzimas fitasas enzimáticamente susceptibles a partir de una 15 representación de la actividad fitasa residual frente a la temperatura de pretratamiento. Los valores que se muestran en la Tabla 8 representan la temperatura a la que 5 minutos de tratamiento térmico darán como resultado una pérdida de actividad fitasa del 50% en comparación con la enzima sin tratar.

Tabla 8: Termotolerancia relativa de fitasa termotolerante enzimáticamente susceptible

Variante

Temperatura

Mut1

68

Mut2

68

Mut3

63

Mut4

70

Mut5

68

Mut6

68

Mut7

66,5

Mut8

68

Mut9

63

Pep1

70

Claims (5)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un método para aumentar la sensibilidad de una fitasa a una proteasa que comprende las siguientes etapas en el orden de:

   a) crear variantes con estabilidad termodinámica aumentada;

   5 b) modelar la estructura tridimensional de la proteína;

   c) identificar dominios del modelo tridimensional, donde los dominios se seleccionan del grupo constituido por dominios de glicosilación, residuos de cisteína y bucles de una estructura proteica que están expuestos al medio circundante;

   d) crear variantes de la proteína alterando dichos dominios del modelo tridimensional;

   e) seleccionar variantes con termotolerancia y actividad específica de fitasas al menos iguales a la proteína de la etapa

   10 a); y

   f) someter a ensayo las variantes para determinar su sensibilidad a una proteasa donde la sensibilidad da como resultado la digestión de la variante cuando se expone a la proteasa.
2. 2. El método de la reivindicación 1, donde el modelado se selecciona del grupo constituido por cristalografía de rayos X, resonancia magnética nuclear y modelado computacional.

   15 3. El método de la reivindicación 1, donde la proteasa se selecciona del grupo constituido por pepsina, tripsina,

   quimiotripsina, endopeptidasa pancreática, catepsina G, quimasa, triptasa, papaína, quimopapaína, caspasa-1, elastasa, carboxipeptidasa y dipeptidasa E.
3. 4. El método de la reivindicación 1, donde dicha sensibilidad a una proteína en la etapa f) da como resultado una estabilidad gástrica disminuida.

   20 5. El método de cualquiera de las reivindicaciones 1-4, donde dicha fitasa se deriva de un organismo procariota.
4. 6. El método de la reivindicación 5, donde dicha fitasa se deriva de Escherichia coli.
5. 7. El método de la reivindicación 6, donde dicha fitasa es Nov9x caraterizada por la SEC ID N°: 34.