CN114292319A

CN114292319A - 水稻ETFβ基因在调控植物育性中的应用

Info

Publication number: CN114292319A
Application number: CN202111676711.7A
Authority: CN
Inventors: 程祝宽; 杨晗; 李亚非; 唐丁; 沈懿; 杜桂杰
Original assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Current assignee: Institute of Genetics and Developmental Biology of CAS
Priority date: 2021-12-31
Filing date: 2021-12-31
Publication date: 2022-04-08
Anticipated expiration: 2041-12-31
Also published as: CN114292319B

Abstract

本发明公开了水稻ETFβ基因在调控植物育性中的应用。本发明提供了ETFβ蛋白或其相关生物材料在调控植物育性中的应用；所述相关生物材料为表达ETFβ蛋白的基因或含有所述基因的表达盒、重组载体、重组菌或转基因细胞系；ETFβ蛋白为SEQ ID No.1或其经一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或序列具有80％以上同源性且具有相同功能的蛋白，或其N端和/或C端连接标签后得到的融合蛋白。本发明为人工控制水稻育性提供了途径，即通过调节突变体所处的土壤环境中氮营养水平来达到控制育性的目的；同时为水稻如何在贫瘠的土壤环境中维持育性的稳定创造了可能性。

Description

水稻ETFβ基因在调控植物育性中的应用

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，具体涉及水稻ETFβ基因在调控植物育性中的应用。

背景技术

水稻是全世界范围内重要的经济作物，供养着全球超过半数的人口。东亚和东南亚的绝大部分口人均以大米为重要主食。

自二十世纪末，我国三系法杂交水稻重要奠基人袁隆平在此基础上，利用光温敏不育系的育性转换与光温变化的关系，突破了两系杂交粳稻育种与种子生产技术瓶颈，建立了两系杂交稻制种法，促进了杂交粳稻的发展。两系法杂交水稻技术将水稻亩产量由700公斤提高到988公斤，为保障我国的粮食安全做出了巨大贡献。两系法杂交稻具有育性受核基因控制，没有恢保关系，配组自由；种子繁育程序简单，成本低；稻种资源利用率高，选育出优良组合机率高等优点。两系杂交稻制种法解决了三系法的主要限制因素，使水稻杂种优势利用进入一个新阶段。光温敏不育系是两系法的关键。但是目前发现的光温敏不育系极其有限(Yu et al.,2017；Zhu et al.,2020)，能投入两系法利用的就更少了。此外，除了光温条件，自然界中影响水稻育性的环境因素还包括湿度和土壤养分条件等(Xue et al.,2018；Zhang and Chu,2020)。

氮作为水稻所必须的大量元素，充足的氮营养对于生殖生长至关重要(Yoneyamaet al.,2016；Zhang et al.,2021)。氮素利用缺陷突变体往往会表现出育性降低和花器官发育异常(Liu et al.,2018；Martin et al.,2006)。然而目前针对氮营养对于植物减数分裂的影响却几乎没用过相关报道。

发明内容

本发明的目的是提供水稻ETFβ基因在调控植物育性中的应用。

第一方面，本发明要求保护ETFβ蛋白或其相关生物材料在调控植物育性中的应用；

所述ETFβ蛋白可为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/ 或缺失和/或添加且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、 90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白。

上述蛋白质中，所述蛋白标签(protein-tag)是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/ 或纯化。所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、 GST标签和/或SUMO标签等。

上述蛋白质中，同一性是指氨基酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定氨基酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter 设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost 和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对氨基酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述蛋白质中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

所述相关生物材料可为能够表达所述ETFβ蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

所述表达盒是指能够在宿主细胞中表达ETFβ的DNA，该DNA不但可包括启动 ETFβ基因转录的启动子，还可包括终止ETFβ转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。可用于本发明的启动子包括但不限于：组成型启动子，组织、器官和发育特异的启动子，和诱导型启动子。启动子的例子包括但不限于：泛生素基因Ubiqutin启动子(pUbi)；花椰菜花叶病毒的组成型启动子35S；来自西红柿的创伤诱导型启动子，亮氨酸氨基肽酶("LAP",Chao等人(1999)Plant Physiol 120:979-992)；来自烟草的化学诱导型启动子，发病机理相关1(PR1)(由水杨酸和 BTH(苯并噻二唑-7-硫代羟酸S-甲酯)诱导)；西红柿蛋白酶抑制剂II启动子(PIN2) 或LAP启动子(均可用茉莉酮酸曱酯诱导)；热休克启动子(美国专利5，187，267)；四环素诱导型启动子(美国专利5，057,422)；种子特异性启动子，如谷子种子特异性启动子pF128(CN101063139B(中国专利2007 1 0099169.7))，种子贮存蛋白质特异的启动子(例如，菜豆球蛋白、napin,oleosin和大豆beta conglycin的启动子(Beachy等人(1985)EMBO J.4:3047-3053))。它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用。此处引用的所有参考文献均全文引用。合适的转录终止子包括但不限于：农杆菌胭脂碱合成酶终止子(NOS终止子)、花椰菜花叶病毒CaMV 35S终止子、tml终止子、豌豆rbcS E9终止子和胭脂氨酸和章鱼氨酸合酶终止子(参见，例如：Odell等人(I⁹⁸⁵)Nature 313:810；Rosenberg等人(1987)Gene,56:125；Guerineau等人(1991) Mol.Gen.Genet,262:141；Proudfoot(1991)Cell,64:671；Sanfacon等人Genes Dev., 5:141；Mogen等人(1990)PlantCell,2:1261；Munroe等人(1990)Gene,91:151； Ballad等人(1989)Nucleic AcidsRes.17:7891；Joshi等人(1987)Nucleic Acid Res., 15:9627)。

构建含有所述ETFβ基因表达盒的重组表达载体。所利用的植物表达载体可为双元农杆菌载体或Gateway系统载体等，如pBin438、pCAMBIA1302、pCAMBIA2301、 pCAMBIA1301、pCAMBIA1300、pBI121、pGWB411、pGWB412、pGWB405、 pCAMBIA1391-Xa或pCAMBIA1391-Xb。使用ETFβ构建重组表达载体时，在其转录起始核苷酸前可加上任何一种增强型、组成型、组织特异型或诱导型启动子，如花椰菜花叶病毒(CAMV)35S启动子、泛素基因Ubiqutin启动子(pUbi)等，它们可单独使用或与其它的植物启动子结合使用；此外，使用本发明的基因构建植物表达载体时，还可使用增强子，包括翻译增强子或转录增强子，这些增强子区域可以是ATG 起始密码子或邻接区域起始密码子等，但必需与编码序列的阅读框相同，以保证整个序列的正确翻译。所述翻译控制信号和起始密码子的来源是广泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻译起始区域可以来自转录起始区域或结构基因。

为了便于对转基因植物细胞或植物进行鉴定及筛选，可对所用植物表达载体进行加工，如加入可在植物中表达的编码可产生颜色变化的酶或发光化合物的基因(GUS 基因、萤光素酶基因等)、具有抗性的抗生素标记物(庆大霉素标记物、卡那霉素标记物等)或是抗化学试剂标记基因(如抗除莠剂基因)等。

上述应用中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述应用中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)(如根癌农杆菌EHA105)，黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。

所述调控植物育性是通过调控对氮素的吸收利用实现的。

所述调控植物育性可体现为：在缺氮条件下，在所述植物中所述ETFβ蛋白的表达量和/或活性降低，所述植物的育性降低，所述ETFβ蛋白的表达量和/或活性提高，所述植物的育性提高。

第二方面，本发明要求保护能够使植物中ETFβ蛋白的表达量和/或活性降低的物质在如下中应用：在缺氮条件下，降低所述植物的育性；所述ETFβ蛋白可为前文(A1) -(A4)中任一所示蛋白质。

第三方面，本发明要求保护一种培育氮素依赖型不育系的方法。

本发明要求保护的培育氮素依赖型不育系的方法，可包括使受体植物中ETFβ蛋白的表达量和/或活性降低的步骤。所述ETFβ蛋白可为前文(A1)-(A4)中任一所示蛋白质。

所述方法可以通过杂交手段实现，也可以通过转基因手段实现。

进一步地，所述方法可包括如下步骤：对受体植物中能够表达ETFβ蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；从所述转基因植物中获得氮素依赖型不育系。

在所述方法中，对所述受体植物中能够表达所述ETFβ蛋白的核酸分子进行抑制表达可通过任何能够实现这一目的的技术手段实现。如CRISPR-Cas9基因编辑技术。

在第三方面中，所述氮素依赖型不育系为在缺氮条件下表现为不育(雌雄均不育)，在不缺氮(如氮充足)条件下表现为可育(雌雄均可育)。

上述方法中，所述转基因植物理解为不仅包含第一代到第二代转基因植物，也包括其子代。对于转基因植物，可以在该物种中繁殖该基因，也可用常规育种技术将该基因转移进入相同物种的其它品种，特别包括商业品种中。所述转基因植物包括种子、愈伤组织、完整植株和细胞。

第四方面，本发明要求保护一种调控植物育性的方法。

本发明要求保护的调控植物育性的方法，可包括如下步骤P1和P2：

P1、按照前文第三方面中的所述方法制备氮素依赖型不育系；

P2、通过调控所述氮素依赖性不育系的培养基质中氮素的含量来调控其育性。

在P2中，当所述培养基质中缺乏氮素时，所述P1处理后植物表现为不育(雌雄均不育)，当所述培养基质中不缺乏氮素时，所述P1处理后植物表现为可育(雌雄均可育)。

第五方面，本发明要求保护一种恢复氮素依赖型不育系育性的方法。

本发明要求保护的恢复氮素依赖型不育系育性的方法，其中所述氮素依赖性不育系为按照前文第三方面中所述方法制备得到；所述方法可包括如下步骤Q1和/或Q2：

Q1、向处于氮素缺乏状态下的所述氮素依赖型不育系的培养基质中补充氮素至氮素不缺乏或氮素充足；

Q2、提高处于氮素缺乏状态下的所述氮素依赖型不育系中的所述ETFβ蛋白的表达量和/或活性。

在Q1中，所述培养基质可为培养基或土壤。

在Q2中，提高所述ETFβ蛋白的表达量和/或活性可通过向受体植物中导入能够表达所述ETFβ蛋白的核酸分子实现。

在上述各方面中，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组 DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如mRNA等。

在上述各方面中，能够表达所述ETFβ蛋白的核酸分子可为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第220-981位所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述ETFβ蛋白的 DNA分子；

(B3)与(B1)-(B2)中任一限定的DNA序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同源性且编码所述ETFβ蛋白的DNA分子。

上述核酸分子中，所述严格条件可为如下：50℃，在7％十二烷基硫酸钠(SDS)、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，2×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃， 1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA 的混合溶液中杂交，在50℃，0.5×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、 0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在50℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；还可为：50℃，在7％SDS、0.5M Na₃PO₄和1mM EDTA的混合溶液中杂交，在65℃，0.1×SSC，0.1％SDS中漂洗；也可为：在6×SSC，0.5％SDS的溶液中，在 65℃下杂交，然后用2×SSC，0.1％SDS和1×SSC，0.1％SDS各洗膜一次。

上述核酸分子中，同源性是指核苷酸序列的同一性。可使用国际互联网上的同源性检索站点测定核苷酸序列的同一性，如NCBI主页网站的BLAST网页。例如，可在高级BLAST2.1中，通过使用blastp作为程序，将Expect值设置为10，将所有Filter 设置为OFF，使用BLOSUM62作为Matrix，将Gap existence cost，Per residue gap cost 和Lambdaratio分别设置为11，1和0.85(缺省值)并进行检索一对核苷酸序列的同一性进行计算，然后即可获得同一性的值(％)。

上述核酸分子中，所述95％以上的同源性可为至少96％、97％、98％的同一性。所述90％以上的同源性可为至少91％、92％、93％、94％的同一性。所述85％以上的同源性可为至少86％、87％、88％、89％的同一性。所述80％以上的同源性可为至少81％、82％、83％、84％的同一性。

在上述各方面中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物。

进一步地，所述植物为禾本科植物。

更进一步地，所述植物为稻属植物，如水稻。

在上述各方面中，所述缺氮、所述氮素缺乏和所述缺乏氮素为同一个意思，均表示与植物对氮素的正常需求量相比氮素供应量较低。所述不缺氮、所述氮素不缺乏和所述不缺乏氮素为同一个意思，均表示氮素供应量等于或大于植物对氮素的正常需求量。

在本发明的具体实施方式中，所述氮素的正常需求量为0.9mM NH₄NO₃。

本发明通过⁶⁰Co～γ辐射诱变籼稻品种中籼3037的材料中鉴定到一个氮素依赖的减数分裂突变体etfβ。大田环境下突变体etfβ是不育的。通过图位克隆的方法我们分离了突变基因ETFβ。etfβ突变体的雌雄减数分裂缺陷均可通过外施过量氮素得到完美恢复。本发明为人工控制水稻花粉育性提供了途径，即通过调节突变体所处的土壤环境中氮营养水平来达到控制花粉育性的目的。本发明在水稻杂交育种领域具有重要应用价值和创新性。

附图说明

图1为etfβ是一个不育突变体。

图2为etfβ突变体的雌雄减数分裂都表现出强烈的氮素依赖。A：etfβ突变体的在不同氮梯度下的花药发育状态。B：etfβ突变体的花药发育状态随着所处氮梯度发生渐变。C：etfβ突变体的胚囊发育依赖于过量氮营养。D：过量氮素可以帮助etfβ突变体产生正常的成熟花粉。图中，free表示用没有添加任何氮素的木村培养液种植的水稻；1N或1×表示木村营养液中标准的氮素含量，即正常氮素需求量；2N或2 ×表示木村营养液中标准的氮素含量的2倍，即正常氮素需求量的2倍。nomal表示这正常胚囊结构；ovule-free表示无胚囊结构或异常胚囊结构(本发明除了统计雄配子花粉育性，也统计了雌配子胚囊结构(可表征雌配子育性)的正常与不正常的比例，即图C中的柱形图)。

图3为etfβ突变体与野生型(籼稻品种中籼3037)相比，ETFβ基因缺失示意图(a)和测序图(b)。

图4为ETFβ的基因结构及蛋白的保守结构域。A：ETFβ的基因结构。黑色矩形表示外显子，黑线表示内含子，灰色长方形表示非编码区。B：ETFβ蛋白中的结构域。蓝色矩形指示ETF结构域。

图5为甲苯胺蓝染色的不同氮梯度下etfβ突变体的花药花药横切片。

图6为互补植株ETFΒ-C能够恢复育性。A：etfβ突变体植株(左)与互补植株 ETFβ-C(右)的比较。B：etfβ突变体(左)与互补植株ETFβ-C(右)的穗子比较。

具体实施方式

本发明设计水稻中一个不育基因的分离克隆，并对其影响水稻减数分裂起始的机理进行分析阐述。通过CRISPR-Cas9基因编辑技术在野生型水稻中敲除该基因可以造成条件型不育，产生氮素依赖型不育系。

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例中所示结果均为经过多次重复试验验证后的结果。

实施例1、水稻ETFβ基因在调控植物育性中的应用

籼稻品种中籼3037：记载于“Wang,K.,Tang,D.,Hong,L.,Xu,W.,Huang,J.,Li,M.,Gu,M.,Xue,Y.and Cheng,Z.(2010)DEP and AFO Regulate Reproductive Habit inRice. Plos Genetics,6”一文中的“Zhongxian 3037”，公众可从中国科学院遗传与发育生物学研究所获得。

粳稻品种中花11号：常规的水稻栽培品种，可以从选育单位中国农业科学院作物科学研究所获得。

一、突变体表型分析

对籼稻品种中籼3037进行⁶⁰Co～γ辐射诱变，得到一系列突变体。其中，etfβ突变体在大田环境下表现出不育表型，但是营养生长阶段与野生型无显著差异(图1)。

etfβ突变体表现其减数分裂阶段表现出强烈的氮素依赖。在缺氮情况下，etfβ突变体表现为雌雄均不育，而在氮营养充足的情况下，etfβ突变体雌雄育性均可恢复到野生型水平。etfβ突变体的表型会随着所处的氮梯度发生同步变动。etfβ突变体的雌雄减数分裂缺陷均可通过外施过量氮素得到完美恢复(图2)。

二、突变基因的图位克隆

我们采用ETFβ突变体植株(ETFβ基因杂合突变体)与粳稻品种中花11号杂交，对F₂中的97株不育个体进行突变基因的初定位分析，又通过F₃和F₄中的一共721 株不育个体进行精细定位。采用STS分子标记将该基因定位在4号染色体短臂上170kb的物理区间内。

通过在线RiceGAAS(Rice Genome AutomatedAnotation System)系统进行预测，发现该区间内有14个基因。通过测序发现，不育植株在基因LOC_Os04g10400内有1922bp的片段缺失，包括5’UTR和第一个外显子。图位克隆分子标记如表1所示。

表1、图位克隆分子标记

分子标记	正向引物	反向引物	BAC
				M1	ATGATACCTAGATGTGCGAT	CCGAAATAACGTCATTCTGC	AL606654
M2	GGAGGAGAGTTTTTGGGTTC	GCCTTAGTGGAGAAATCCGA	AL606997
				M3	CAGAGAGAAGTCTTAAGACATG	TACATTACGTTTCCGATCGA	CR933498
M4	CTGTGTGTCCAGATTCATAGC	CGAAATCTTGTTTCGGCACT	CR933498
				M5	CTCCATTATGAGTCTATGAC	GTTGAATGGCTCGGAGGGAA	AL606993
M6	CCGTTTGTACATGTGTTATCTG	GCCACAAATCAAACCACCAAATG	AL662934
				M7	GGGGGTAATTCATACTTTTTCC	GCATATTGGCCTGCATAATGTT	AL731620
M8	AACACACGAAGTGACTTTTAGG	GAAGGAGATAGAGACCTGAC	AL662994

etfβ突变体与野生型(籼稻品种中籼3037)相比，ETFβ基因上发生了1922bp 的片段缺失，etfβ突变体中突变后的ETFβ基因序列(包括5’UTR和第一个外显子) 具体如SEQ IDNo.5所示(测序结果参见图3)。野生型(籼稻品种中籼3037)中的 ETFβ基因序列(包括5’UTR和第一个外显子)具体如SEQ ID No.4所示。

三、ETFβ基因全长cDNA的获得和结构域分析

通过快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)，我们获得了该基因全长为1253bp的cDNA，与基因组DNA序列比对，发现该基因包含4个外显子和3个内含子(图4中A)。ETFβ编码一个包含253个氨基酸的蛋白，该蛋白只有一个ETF结构域(图4中B)。

ETFβ基因cDNA全长1253bp，如SEQ ID No.2所示，其中第220-981位为CDS 区域，编码SEQ ID No.1所示氨基酸序列。

四、不同氮梯度下etfβ突变体的花药发育状态观察

不同氮梯度的木村营养液的调配如下：

常规1×木村营养液：溶剂为水，溶质及浓度如下：0.37mM(NH₄)₂SO₄，0.18mM KNO₃，0.37mM Ca(NO₃)₂，0.18mM KH₂PO₄，0.09mM K₂SO₄，0.55mM MgSO₄·7H₂O， 1.6mM Na₂SiO₃·9H₂O，46.2μM H₃BO₃，0.32μM CuSO₄·5H₂O，9.14μM MnCl₂·4H₂O， 0.08μM(NH₄)6Mo₇O₂₄·4H₂O，0.76μM ZnSO₄·7H₂O，40μM Fe(II)-EDTA)；pH 5.75。

本发明在保证其他元素浓度不变的前提下，用CaCl₂·2H₂O代替Ca(NO₃)₂，用NH₄NO₃代替(NH₄)₂SO₄和KNO₃，并用NH₄NO₃来调节木村营养液中无机氮的浓度。水稻所能吸收的氮主要有两种形式：硝态氮和铵态氮。1×木村营养液中铵态氮的浓度为0.73mM，硝态氮的浓度为0.909mM，所以本发明将0.9mM NH₄NO₃定义为1 倍氮素，即1N。同理，1.8mM NH₄NO₃为2N，而0mM NH₄NO₃为N-free。

为了确定etfβ突变体在缺氮情况下败育的原因，我们对不同氮梯度下的etfβ突变体不同发育时期的花药进行半薄切片观察(图5)，发现：2倍氮素处理的突变体像野生型中籼3037一样产生成熟花粉，无氮木村和清水的处理结果一样，药室最终形成空腔。但是无氮木村里的etfβ突变体花药发育早期并没有明显异常，但是直到3层细胞时期，中央细胞仍然很小，胞质浅，不具有典型的造孢细胞特征。进入4层细胞时期后，药室中央紧密堆积着没有典型花粉母细胞特征的细胞，我们称之为造孢细胞产物。且外围体细胞排布极不规整，没有典型的绒毡层结构。最终造孢细胞产物逐渐凋亡，只剩下花药外层细胞形成一个空腔。因此我们认为突变体对氮素的依赖主要表现在减数分裂早期，从3层细胞时期开始表型出异常。

五、ETFβ的互补验证

pCAMBIA1300是北京鼎国昌盛生物技术有限公司的产品，货号为MCV033。

根癌农杆菌EHA105：北京天恩泽生物技术有限公司，产品目录号：140383。

AAM液体培养基：CaCl₂·2H₂O 440mg，MgSO₄·7H₂O 370mg，KH₂PO₄170mg， KCl2940mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg， Na₂MoO₄·2H₂O0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB11mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg， Na₂-EDTA·2H₂O₃7.3mg，蔗糖68.5g，葡萄糖36g，谷氨酰胺0.877g，水解酪蛋白0.5g，天冬氨酸0.266g，精氨酸0.228g，甘氨酸0.075g,去离子水加至1L，pH为5.2。

NB培养基：(NH4)₂SO₄ 463mg，KNO₃ 2830mg，CaCl₂·2H₂O 166mg，MgSO₄·7H₂O185mg，KH₂PO₄400mg，KI 0.8mg，H₃BO₃ 1.6mg，MnSO₄·4H₂O 4.4mg，ZnSO₄·7H₂O 1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，蔗糖30g，植物胶2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白 0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。

NBC培养基：(NH4)₂SO₄ 463mg，KNO₃ 2830mg，CaCl₂·2H₂O 166mg， MgSO₄·7H₂O185mg，KH₂PO₄400mg，KI 0.8mg，H₃BO₃ 1.6mg，MnSO₄·4H₂O 4.4mg， ZnSO₄·7H₂O 1.5mg，肌醇100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 1mg，VB6 0.5mg， FeSO₄·7H₂O 27.8mg，Na₂-EDTA·2H₂O37.3mg，蔗糖30g，葡萄糖10g，植物胶2.5g， 2,4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.2。倒平板之前加入乙酰丁香酮(AS)并使其浓度为100μM。

NBCS1培养基：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg， MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg， ZnSO₄·7H₂O5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为100mg/l。

NBCS2培养基：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg，MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg，ZnSO₄·7H₂O 5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇 90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg， Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，甘露醇36.43g，蔗糖20g，植物胶2.5g，2,4-D 2mg，水解酪蛋白0.5g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为 200mg/l。

NBA分化培养基：NH₄NO₃ 640mg，KNO₃ 1212mg，CaCl₂·2H₂O 588mg， MgSO₄·7H₂O247mg，KH₂PO₄136mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 3.1mg，MnSO₄·4H₂O 11.2mg， ZnSO₄·7H₂O 5.76mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.24mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇90mg，甘氨酸2mg，烟酸6mg，VB1 8.5mg，VB6 1mg，FeSO₄·7H₂O 27.8 mg，Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，麦芽糖20g，脱落酸(ABA)5mg，植物胶3g，2,4-D 2mg，6-BA 2mg，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。倒平板之前加入G418并使其浓度为200mg/l。

1/2MS培养基：NH₄NO₃ 825mg，KNO₃ 950mg，CaCl₂·2H₂O 220mg，MgSO₄·7H₂O185mg，KH₂PO₄85mg，KI 0.83mg，H₃BO₃ 6.2mg，MnSO₄·4H₂O 22.3mg，ZnSO₄·7H₂O 8.6mg，Na₂MoO₄·2H₂O 0.25mg，CuSO₄·5H₂O 0.03mg，CoCl₂·6H₂O 0.03mg，肌醇 100mg，甘氨酸2mg，烟酸0.5mg，VB1 0.1mg，VB6 0.5mg，FeSO₄·7H₂O 27.8mg， Na₂-EDTA·2H₂O 37.3mg，蔗糖30g，多效唑(MET)6mg，植物胶2g，萘乙酸(NAA)1mg，水解酪蛋白0.3g，去离子水加至1L，pH为5.8。

将野生型ETFβ全长基因组片段(SEQ ID No.3)通过根癌农杆菌EHA105介导的转基因技术导入etfβ突变体植株，具体操作如下：

1、重组载体构建

将SEQ ID No.4所示的DNA分子插入pCAMBIA1300互补载体的EcoRI和BamH I酶切位点间，并经测序验证正确后得到重组表达载体pCAMBIA1300-ETFβ。SEQ ID No.4所示的DNA分子包含ETFβ基因的编码序列，同时包含ETFβ基因ATG上游约 5.0kb的DNA序列，以及终止密码子下游约1.8kb的DNA序列。

2、农杆菌介导的遗传转化

(1)取步骤1得到的重组表达载体pCAMBIA1300-ETFβ，将其导入根癌农杆菌EHA105，得到重组农杆菌。

(2)将步骤(1)得到的重组农组菌的单菌落接种于3mL含50mg/L卡那霉素和 10mg/L利福平的YEB液体培养基中，28℃、150rpm振荡培养直至OD_600nm为0.6-0.8，用含有200μM乙酰丁香酮的AAM液体培养基重悬菌体，将OD_600nm值调为0.8-1.0，得到菌悬液。

(3)选取饱满的ETFβ突变体植株(ETFβ基因杂合突变体)上结的成熟种子，小心去除颖壳(避免胚受到损伤)。用70％酒精浸泡消毒2min后，使用0.1％HgCl₂水溶液浸泡12min，无菌水冲洗5次，每次5min。

(4)将经过步骤3处理后的种子在NB培养基中26℃避光培养14天以诱导愈伤组织，通过如下引物鉴定出etfβ纯和突变体愈伤组织，即仅能通过ETFβ-a-F和 ETFβ-a-R引物对扩增出约320bp片段为etfβ纯和突变体愈伤组织，而且不能通过 ETFβ-A-F和ETFβ-A-R扩增出目的条带大小约为370bp片段。

ETFβ-A-F：5’-CTCGCAACTCTCCTCTCTTC-3’；

ETFβ-A-R：5’-ACTAGGATCTTCATGCCTCG-3’；

ETFβ-a-F：5’-GGAGCATTAGGTCTAAAGG-3’；

ETFβ-a-R：5’-ATCTTTTCCTTACGGTTGC-3’。

(5)将步骤(4)挑选的etfβ纯和突变体愈伤组织浸泡于步骤(2)制备的菌悬液中，侵染20min，侵染后将菌悬液倒掉，取愈伤组织，用无菌滤纸吸干水分，然后转入NBC培养基，26℃避光培养3天。

(6)将步骤(5)培养的愈伤组织转入NBCS1培养基，26℃避光培养14天。

(7)将步骤(6)培养的愈伤组织转入NBCS2培养基，26℃避光培养14天。

(8)将步骤(7)生长状态较好的愈伤组织转入NBA分化培养基，26℃光照培养20天。

(9)将步骤(8)分化出的幼苗转入1/2MS培养基，26℃光照培养至生根。

(10)完成步骤(9)后，取出幼苗，洗净培养基，将幼苗用清水浸泡，26℃光照培养2天，然后移入大田，常规栽培管理。

3、转基因植株的PCR鉴定

取步骤2的10获得的植株，提取具有潮霉素抗性的植株的基因组DNA，用引物 ETFβ-C-F和ETFβ-C-R进行PCR鉴定，可以扩出约10600bp大小条带的植株；或者通过pCAMBIA13000载体上特异引物P1300-F和P1300-R可以扩增出约629bp大小条带的植株为转基因植株，命名为转ETFβ-C植株。

ETFβ-C-F：5’-CTTGTTGCTCGCTCACCATC-3’；

ETFβ-C-R:：5’-GTCTAGCTTGCGTTCGATC-3’；

P1300-F：5’-CCTTATCTGGGAACTACTCA-3’；

P1300-R：5’-GTGTATCACTGGCAAACTGT-3’。

4、向etfβ突变体中互补ETFβ的全长基因组片段后表型分析

结果显示：etfβ突变体中互补了ETFβ的全长基因组片段后，突变体的不育表型得到完全恢复，与野生型没有明显差异(图6)。说明etfβ突变体的不育表型是ETFβ的功能缺陷导致的。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

<110> 中国科学院遗传与发育生物学研究所

<120> 水稻ETFβ基因在调控植物育性中的应用

<130> GNCLN213494

<160> 5

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 253

<212> PRT

<213> Oryza sativa L.

<400> 1

Met Lys Ile Leu Val Ala Val Lys Arg Val Val Asp Tyr Ala Val Lys

1 5 10 15

Val Arg Val Arg Pro Asp Arg Thr Gly Val Glu Thr Ala Ser Val Lys

20 25 30

Met Ser Met Asn Pro Phe Cys Glu Ile Ala Val Glu Glu Ala Leu Arg

35 40 45

Leu Arg Glu Ser Gly Ala Ala Thr Glu Val Val Ala Ala Thr Val Gly

50 55 60

Pro Ser Gln Ser Ala Asp Thr Leu Arg Thr Ala Leu Ala Met Gly Ala

65 70 75 80

Asp Arg Ala Val His Val Leu His Asp Pro Asp Pro Ser Arg Pro Leu

85 90 95

Leu Pro Leu Ala Val Ala Lys Ile Leu Arg Ala Leu Ala Leu Gln Glu

100 105 110

Asn Pro Gly Leu Val Ile Leu Gly Lys Gln Ala Ile Asp Asp Asp Cys

115 120 125

Asn Gln Thr Gly Gln Met Leu Ala Gly Leu Leu Asn Trp Pro Gln Gly

130 135 140

Thr Phe Ala Ser Lys Val Ile Leu Asn Lys Glu Lys Ala Thr Val Glu

145 150 155 160

Arg Glu Val Asp Gly Gly Ile Glu Thr Ile Ser Leu Asp Leu Pro Ala

165 170 175

Val Ile Thr Thr Asp Leu Arg Leu Asn Gln Pro Arg Tyr Ala Thr Leu

180 185 190

Pro Asn Ile Met Lys Ala Lys Ser Lys Val Ile Lys Lys Val Thr Pro

195 200 205

Glu Asp Leu Asp Val Asp Ile Arg Ser Asp Met Glu Val Val Glu Val

210 215 220

Thr Glu Pro Pro Lys Arg Lys Ala Gly Val Ile Leu Ser Ser Val Asp

225 230 235 240

Glu Leu Val Asp Arg Leu Lys Asn Glu Ala Arg Val Leu

245 250

<210> 2

<211> 1253

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 2

tcttatataa gttaaaaaaa ataaaagttt ctccaatcta gtttttggct taataatatt 60

agagtggttt atgacttaaa aaaccaaacg aaaaagccac ttatttattt aggcttaaac 120

ttttcggcct gtaagaacct tactaccagt ggtctttccc cgtgaagagg aggaaggtga 180

ggtcgccggg cgcccaccat tgccgtcgcg tggcgaggca tgaagatcct agtggcggtg 240

aagcgggtgg tggactacgc cgtcaaggtg cgggtgaggc ccgaccggac gggcgtcgag 300

acggcgagcg tcaagatgtc catgaaccca ttctgcgaga tcgccgtcga ggaggcgctc 360

cgcctccgcg agtccggcgc cgccaccgag gtcgtcgccg ccaccgtcgg cccctcccag 420

tccgccgaca ccctccgcac cgcgctcgcc atgggcgccg accgcgccgt ccacgtcctc 480

cacgaccccg acccctcccg ccccctcctc cccctcgccg tcgccaagat cctccgcgcc 540

ctcgcgctcc aggagaaccc cggcctcgtc atcctcggca agcaggcaat tgatgatgat 600

tgcaaccaaa caggacaaat gctagctggg ttgcttaatt ggccacaagg aacctttgcc 660

tcaaaggtta tattgaacaa ggaaaaggct actgtggaga gagaggtcga tggcggaatc 720

gagaccatta gcttggattt gcctgcagtt atcaccacgg atttgagact gaaccaacca 780

aggtatgcaa cattgccaaa cataatgaag gcaaaatcaa aagtcatcaa gaaagtcacc 840

cccgaagatc tggatgtaga tatcagatca gacatggaag tagttgaggt cactgaacca 900

cctaagagaa aagccggtgt cattctttca tccgtcgatg agctcgttga caggttgaaa 960

aatgaagccc gtgttttata acattctttg tactaatgct catgagctaa ggaatgtggc 1020

atatgcaaat aaagtgtagt tataaatggt catcgtatgc aaataaaaat gtggcgttcc 1080

cgtatagcac cagtatacct gctaatggtc atcgaaatgc tagtgtgtgt gtgtgatttt 1140

aagaagccat gtaagcagaa gtgttcacta aaatcaatca atctttactc attcagaaaa 1200

aaagataatt ctatttatag aaataaagat ctaggcatct agcacacgta tga 1253

<210> 3

<211> 3552

<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

<400> 3

atgaagatcc tagtggcggt gaagcgggtg gtggactacg ccgtcaaggt gcgggtgagg 60

cccgaccgga cgggcgtcga gacggcgagc gtcaagatgt ccatgaaccc attctgcgag 120

atcgccgtcg aggaggcgct ccgcctccgc gagtccggcg ccgccaccga ggtcgtcgcc 180

gccaccgtcg gcccctccca gtccgccgac accctccgca ccgcgctcgc catgggcgcc 240

gaccgcgccg tccacgtcct ccacgacccc gacccctccc gccccctcct ccccctcgcc 300

gtcgccaaga tcctccgcgc cctcgcgctc caggagaacc ccggcctcgt catcctcggc 360

aagcaggtag gcgcgcccaa tcttcgattt gaccgatttt gtggtataga gattgaattt 420

acttgatttc actgataaat tcgtgggatt gtaggtaggt gatgttcctg catgattacc 480

tagttgtggt gattcttttt tgcttcacag tgtgattatc caaggatttt cttaatggga 540

agagttcatg ggatttcagg attattatat atttcttgcc tcattacata tcttttatgt 600

tttattgcat tagggattag ggattcttgt tagcttgttg agactgggat tggggtatct 660

caatttgatc gagagctttc attcttaatg cgaagagttc atgggatttc aggattatta 720

tatacttctt gcctcattac atatcttgtt atgttttatt gcattaggga ttagggattc 780

ttgttagctt gttgagactg ggattggggt atctcaattt gatcgagagc tttcattctt 840

aatgttctta taatgttctt aatgcgaaga gttcatggga tttcaggatt attatatact 900

tcttgcctca ttacatatct tgttatgttt tattgcatta gggattcttg ttagcttgtt 960

gagactggga ttgggtatct caatttgatc gagagctttc atttttgcag cataattaat 1020

tgtgtgcttg tgattacatt ttgacggctt catctaatca agacatattc ctgtgatttg 1080

gggggcatga cttttgtgaa tatggaatga ttgactctgt atttggagct tagtacttca 1140

ttcttacgat aataaaggtt gctatttccc cgcaaaaaaa aaataataaa ggttgctatt 1200

agtgtgtttt gggttgaatc ttagtggttt acttcttggt tcgttgaagc ttgtgtaaat 1260

tgacaatgtt gatatccatg tgattgtata gtgcaaattt agttaccaat atgcactatg 1320

gtaccaacag tgagatccca tctcaaaaaa taaagtgaga tctgagagaa ccatggttgt 1380

gttaatgcaa gccatttgct gattttgctt ctaccttaat ttaatttatt gccctaaagt 1440

gaggtatagt attattctga gacactaggg tgcatctcta tacagtgtac ttgtgttcaa 1500

catccatgaa attggcaaat tgctcctaca catgtcctcg tagtgcttga ctttgttgac 1560

cctgtttaat atgaaagttc aaagtgtaga attggtgcat tttcccccct ttagacctaa 1620

tgctcctgga ttatttcatg acattgtcta attgctgcat ataagacttg aatccttagt 1680

actattttat taaactttga cgtcttgatt ttttttcaaa atgttgacag tctttgctgt 1740

catgagcaaa tgagtacgta caaaagacaa ataagaaaat attagctaac tagtgatagg 1800

aaatttaact tgaaattata tatattgata atcatcaggt attatatctt ctggtaattg 1860

caggcaattg atgatgattg caaccaaaca ggacaaatgc tagctgggtt gcttaattgg 1920

ccacaaggaa cctttgcctc aaaggtgtgt tttttgttac tccttccatt gctttttact 1980

gctgtcatga ttgccctcgc atgcaagtgg ggcgccaaga gcatggcaca gcaggctggg 2040

ctgggcttgt cattttaagt tcattacttg aagatttgtt ctccccttct catcacttcc 2100

ccccgtgcct gttaatcctc tcctcaaaca cagctcctgg ctggggagat ccagggccaa 2160

aacccccagt tacccaaggg ttgtcccatt gatatttaaa cctagacaac cattaccttt 2220

aatttgatta ccaaatgagt tcttaacaat gtatttgctc cttcaatttt tttctgcatt 2280

taaatgatct gctcctagac cctaaaccgt atgaagctcg tgttgaactt tggtatagtt 2340

tctcccacaa ttgtggaatt ggccacatag gaccttacag tttttttggt ttgctcattt 2400

ttgtccttct gccatgtggc gtcccgtgtg gacttgtcca gtcagcgcct tctttccaat 2460

ttagactatg caagtgactg aaatgcgtgc tttgcatcac ctgaaaaaac aaataatgaa 2520

ctacataggg tcatcctaca tcgatggtaa gaaaaattag ggcaattcag ttactttata 2580

tagtttgtag catttgaagg ccctgaatat tgcctgcccg aaccctggat attgcctgcc 2640

tgagaccatc tgtgatgtca taagaggcat taccattaaa acaagccaac taacgaagct 2700

cagggcgcta acataccaat tcacagttga atgaccaatt tgagcaagaa gcaagggacc 2760

aaatgaacta ttaatctttc agattgtgga aggaatttct gagcactgat ggaagtttgc 2820

tgttccgttt ttttaatccc attttaggaa cattaatttt ttcttctttc aagatatctg 2880

atttcctttt gttggccgaa catagtagag caaccaaaaa aaatcactgt aatggcgttt 2940

tctatgggtt cacattgacc aagtgtttat tggttttctc ttatcatggt gtttccaatt 3000

caagtttgtg ttacacaggc agttgtattc aaagatgctg tttgattctg gcaggttata 3060

ttgaacaagg aaaaggctac tgtggagaga gaggtcgatg gcggaatcga gaccattagc 3120

ttggatttgc ctgcagttat cacgtatgtt ccatgaaaca tttattttct ttcttttagt 3180

tttatttaac aaggctagta cttcgattct tcataagcat tgcgatcatt tagtgatctc 3240

tgtcacatag ctggatcttt gtattgcatt gtggttttga gccaatttca gaaattgcct 3300

aaactattgt ttgatttttg tgacagcacg gatttgagac tgaaccaacc aaggtatgca 3360

acattgccaa acataatgaa ggcaaaatca aaagtcatca agaaagtcac ccccgaagat 3420

ctggatgtag atatcagatc agacatggaa gtagttgagg tcactgaacc acctaagaga 3480

aaagccggtg tcattctttc atccgtcgat gagctcgttg acaggttgaa aaatgaagcc 3540

cgtgttttat aa 3552

<210> 4

<211> 10664

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

gaattccttg ttgctcgctc accatcttca tcgccgtaag aacagcagcc gaatggtctt 60

ttttttccct ccatccgagt ataatggcgc cctttttccc ctccagaaac agagcaacga 120

acggcggcgc acgacattga ggatgtttgt gggccatttt cactggcatg ggctgaccgc 180

gagcccgttt gaccgcctta ttcgttgcgc tcgcgcgacc gccgccgccg ctgtggaagc 240

cgtcgttgtc gaggacggca atgcctggaa gctctcgcgt gggggaggac atggggccga 300

gggatggaga ggagggcgag gtcgaagcag tcttcctcgg cagtccgctc ctctcacgcc 360

cgcgtcgaga aaggcgcgag ccacagcgga gcggtgggca gccatgccgg gggttgcctt 420

ttcttttctt tttttttgcg cgatggcaga ttgacgaatg acgagcagtc tcgttcgttt 480

ttgtccctcc gcggttgctc gtaaatgggc tgaatgggcc gtcctcgccg tgctcgtgcg 540

atgcggaacg aaggaagcag cagcaccgtg agatgtcgat cggacgatgg atcgacgctg 600

gacgtccctc tgacgttgtg cgcctaacgt cagacgatct gcttccacca gggggtcagt 660

gatattttgt actccctctg tcccaaaaaa aaaagacaaa ccctgagttt ccgtgtccaa 720

cgtttgaccg tcttatttga aaaaaatatg aaaaaaaaag ataagtcacg cataaagtat 780

taatcatgtt ttatcatcta acaacaataa aaatactaat tataaaaaaa attttatata 840

agacggacag tcaaacgttg gacacggaaa cccaggattt atcttttttt gggacgaaga 900

gagtatgtat agatcggctc aaactgtatg tcactcccat ttattcatgt acttagtacg 960

atctgataat acaacctgat aagactcatg taatgtaata tactatggtt gtgtttagtt 1020

acttggcaaa aattttttta agtatacgga tacacattta aagtgtttaa cgtagactaa 1080

taataaaaca aattatacat ttttcgcctg taaactacaa gacgaattta ttaagcctaa 1140

ttaattcatc attagcaaat gtttactata gcatcacatt gtcaaatcat ggagtaatta 1200

ggctctaaag attcgtctcg caatttacat gtaaactgtg caattgtttt ttttatccac 1260

atttaatact ccatgcatac gttcaaatat ttgatgtgac gaaattttcg gaagtttgaa 1320

gggggacata aacacggcct atataagttg ggatgtgtgt ttttgatgta tgggtccatg 1380

aggacgagtc cctcctgttt ggacctatat ctctgacttt agtgagaagc tgcttccaag 1440

tacaacccat gagctccttc agttaaaaga aaaatcagac acttcccatt tatgaacact 1500

ttcctagctc aatgtttttg tcctctcgat ttattaactt gaaaatattt cagctttgaa 1560

ccaaattacc tttaccaagc cagcactaca tcccacgaaa caacagcaac gaggttgaaa 1620

cgtaaatagt tgtagagctc aaggcatatc tagtggagac gaaactaatt ttaccacatc 1680

atacgtgtgc tagatgccta gatctttatt tctataaata gaattatctt tttttctgaa 1740

tgagtaaaga ttgattgatt ttagtgaaca cttctgctta catggcttct taaaatcaca 1800

cacacacact agcatttcga tgaccattag caggtatact ggtgctatac gggaacgcca 1860

catttttatt tgcatacgat gaccatttat aactacactt tatttgcata tgccacattc 1920

cttagctcat gagcattagt acaaagaatg ttataaaaca cgggcttcat ttttcaacct 1980

gtcaacgagc tcatcgacgg atgaaagaat gacaccggct tttctcttag gtggttcagt 2040

gacctcaact acttccatgt ctgatctgat atctacatcc agatcttcgg gggtgacttt 2100

cttgatgact tttgattttg ccttcattat gtttggcaat gttgcatacc ttggttggtt 2160

cagtctcaaa tccgtgctgt cacaaaaatc aaacaatagt ttaggcaatt tctgaaattg 2220

gctcaaaacc acaatgcaat acaaagatcc agctatgtga cagagatcac taaatgatcg 2280

caatgcttat gaagaatcga agtactagcc ttgttaaata aaactaaaag aaagaaaata 2340

aatgtttcat ggaacatacg tgataactgc aggcaaatcc aagctaatgg tctcgattcc 2400

gccatcgacc tctctctcca cagtagcctt ttccttgttc aatataacct gccagaatca 2460

aacagcatct ttgaatacaa ctgcctgtgt aacacaaact tgaattggaa acaccatgat 2520

aagagaaaac caataaacac ttggtcaatg tgaacccata gaaaacgcca ttacagtgat 2580

tttttttggt tgctctacta tgttcggcca acaaaaggaa atcagatatc ttgaaagaag 2640

aaaaaattaa tgttcctaaa atgggattaa aaaaacggaa cagcaaactt ccatcagtgc 2700

tcagaaattc cttccacaat ctgaaagatt aatagttcat ttggtccctt gcttcttgct 2760

caaattggtc attcaactgt gaattggtat gttagcgccc tgagcttcgt tagttggctt 2820

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agggaattta ctctattatg ccagattttg caacattgtt gtagctattg tatatatcgc 8940

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<212> DNA

<213> Oryza sativa L.

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gcccgcacat tgacacgtac gtgcaactgc gagggtcggc tgtgatatca tttgtaacaa 6600

ccactcttca gaaccacgta gcccagcaca tccgacggac gagccaactt acacatcact 6660

ccacttacac tttcttctac gctttgtgta aaaaggttaa cccagtagcg atatggttgg 6720

gagaacaaac ccttataagt tagttccacc cttgctaaac tagtaaggtg gtacgaaaca 6780

tgcacacaca gctctcatgg gccacacaag ctatatccta attaggctgg gatgtcacac 6840

aaatggtatc agatagaccc tagacaggga tcaagtagaa atttcgggtg tatagaaagg 6900

atcgtgtaaa ttttagaggt acgagagaga ttgcatgaat ttttaagagt acagggaatt 6960

tactctatta tgccagattt tgcaacattg ttgtagctat tgtatatatc gcacccaatt 7020

cttttttttt tttaaaaaaa gcaaatacta gctgcacccg gttcttatac tatatatact 7080

tgatgcagaa acatcaatat cttcaacaaa cagttgagtg cgttcatgaa acacagggac 7140

atgttgatat cgtcctcaac ctacaagaca tatgctgtaa ttattccctc aggtatcaat 7200

caattcagtt aacttttata tttctcaagt agaaatcata cgatatcact ttaaaataac 7260

atcatgttct ttcactgtgt tttttttttg caaatacatc taaaaatacc cgctgcaatg 7320

cgcggggtat tgtgtagtat gtgttgtcag tgttgatatc tcctccctaa tccaaccatc 7380

catccaatcg ccacctgagg tggaatgttt gtttctcaat ttttcacctt ttgcattcct 7440

cccatttgct ttaagattca ttttcagctt accaagtgaa cctaagaaag cacacaagaa 7500

tcattttata acttaggtaa tgttttcagt ataaataatg aaaatatgta aaattgcctc 7560

atgatcgact taaaggaaga atacgattag tttaaaatgt ttgacgtgta acatatccaa 7620

tattaaagtt tgagtattgc tatccatact taaaaaaaat taaaaacata tagtgtaaac 7680

tctatatata tgcagtgcaa atgtacgagg aaactatcgt taaaggatga ctaagattta 7740

tctacgtcac cgtagtttta ctcatgatga cgtagataaa tatcaggctt ccattttgta 7800

tccaacaata attttcaggt ttacacacta tatatgaagt tgcactacat attttacaaa 7860

aataccttac aaagttttta caagcaaagc taataacaat tctcactaaa aaaaaatgct 7920

cttgaccatt tgattttaac catatgaaag ttacagtact cacagcatgc aacatctgcg 7980

tttgaaaagt ttttaagaaa aagtttgcat gcaaatgaaa gtttaggtgt gcaaatagga 8040

tgaacgcaac cgttaagaag caaaccagac tttctcacta tgttctgctg ctgccgtatt 8100

gttaaagaca gcagtgcacg tctgaccgga aaaactatcc agtttgaacg ccatggctcg 8160

gcagcccgcg ctcgtcgtcg tcgtcgtcgc agctgtcgcg ctcgccggcg gcggctcgct 8220

cggcttcgag ttccatgagg ccaccgtcga cgccatccag ctcggcttca gcaacggcag 8280

cctcacctcc acggcgctcg tccgcttcta cctcgaccgc atcgcccgcc tcaacacgct 8340

cctccacgcc gtcatcgagg tcaaccccga cgcgctcgcc caggcggcgc gcgccgacgc 8400

cgagcgcgcc accggccacc gttgcggccc gctccacggc gtgcccgtcc tcctcaagga 8460

catcatcgcg acgcgcgacc ggctcaacac gacggccggg tcgctgtcgc tgctcggcgc 8520

ggtcgccagg cgcgacgccg gcgtggtggc ccggctgcgg cgcgccggcg ccgtcgtgct 8580

cggcaaggcc aacctccccg agtgggccaa cttccgcagc tcgccgggtc tccgcggctg 8640

gagcgcacgc ggcggccaat cccgggtaag cagccggcgg caagctcgac acagctgccg 8700

cctgccatgg cgatcgaacg caagctagac 8730

Claims

1.ETFβ蛋白或其相关生物材料在调控植物育性中的应用；

所述ETFβ蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

(A2)将SEQ ID No.1所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

(A3)与(A1)-(A2)中任一所限定的氨基酸序列具有99％以上、95％以上、90％以上、85％以上或者80％以上同一性且来源于水稻具有相同功能的蛋白质；

(A4)在(A1)-(A3)中任一所限定的蛋白质的N端和/或C端连接蛋白标签后得到的融合蛋白；

所述相关生物材料为能够表达所述ETFβ蛋白的核酸分子，或含有所述核酸分子的表达盒、重组载体、重组微生物或转基因细胞系。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述调控植物育性是通过调控对氮素的吸收利用实现的；和/或

所述调控植物育性体现为：在缺氮条件下，在所述植物中，所述ETFβ蛋白的表达量和/或活性降低，所述植物的育性降低；和/或

所述调控植物育性体现为：在缺氮条件下，在所述植物中，所述ETFβ蛋白的表达量和/或活性提高，所述植物的育性提高。

3.能够使植物中ETFβ蛋白的表达量和/或活性降低的物质在如下中应用：在缺氮条件下，降低所述植物的育性；

所述ETFβ蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

4.一种培育氮素依赖型不育系的方法，包括使受体植物中ETFβ蛋白的表达量和/或活性降低的步骤；

所述ETFβ蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

5.一种培育氮素依赖型不育系的方法，包括如下步骤：对受体植物中能够表达ETFβ蛋白的核酸分子进行抑制表达，得到转基因植物；从所述转基因植物中获得氮素依赖型不育系；

所述ETFβ蛋白为如下任一：

(A1)氨基酸序列为SEQ ID No.1的蛋白质；

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于：所述氮素依赖型不育系为在缺氮条件下表现为不育，在不缺氮条件下表现为可育。

7.一种调控植物育性的方法，包括如下步骤P1和P2：

P1、按照权利要求4-6中任一所述方法制备氮素依赖型不育系；

8.一种恢复氮素依赖型不育系育性的方法，所述氮素依赖性不育系为按照权利要求4-6中任一所述方法制备得到；

所述方法包括如下步骤Q1和/或Q2：

9.根据权利要求1-8中任一所述的应用或方法，其特征在于：能够表达所述ETFβ蛋白的核酸分子为如下任一：

(B1)SEQ ID No.2或SEQ ID No.2的第220-981位所示的DNA分子；

(B2)在严格条件下与(B1)限定的DNA分子杂交且编码所述ETFβ蛋白的DNA分子；

10.根据权利要求1-9中任一所述的应用或方法，其特征在于：所述植物为单子叶植物或双子叶植物；

进一步地，所述单子叶植物为禾本科植物；

更进一步地，所述禾本科植物为稻属植物；

更加具体地，所述稻属植物为水稻。