JPH01501598A - 植物の形質転換 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 植物の形質転換 え見立皇１ 本出願は１９８６年１１月３日に、出願されたＢｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌｌａｓ ｔｏｎらの米国特許出願第９２６゜６２９号の一部継続出願にあたる。

本発明は、植物細胞への異種ＤＮＡの組み込みに関する。

本明細書において「異種ＤＮＡＪの用語は、ＤＮＡ（遺伝子または他のＤＮＡ） であって、非植物由来のもの、修飾されたもの、合成のもの、興なる株若しくは 種の植物由来のもの、または同じ植物の真なる部位から誘導されたものを京味す る。

最近の農業の生産性は、改良された作物品種の開発によるところが大きい、この ような改良は、古典的植物育種法により、適合性の植物品種を交配して、所望の 改良を行うことにより威されてきた。しかしながら、このような方法には限度が ある０例えば、結果の正確性及び予測性に欠け、育種計画に長期間を要し、そし てまた、互いに交配しうる植物の遺伝子プールに限りがある（例えば、同一種の 遺伝子）ことである。

ある種の天然に存在するバクテリアのプラスミドは、一つのバクテリア細胞から 他の細胞に伝達させうる遺伝子配列を有することが、知られている（ｔｒａ％ｒ ｎ　ｏ　ｂ及びｏｒｉＴ部位もその例である）、このｔｒａ遺伝子群は、Ｈ胞− 細胞接触およびＤＮＡの伝達の接合ブリフジの形成に関与する。ｍ０ｂＤＮＡ配 列は、プラスミドＤＮＡの複製的伝達を可能にするために、該ＤＮＡをニックを 生ゼしめて該ＤＮＡを広げる何種かの蛋白質をコードする。これらの蛋白質は、 特異的にｏｒｉＴヌクレオチド配列をその標的として認識し、特定の蛋白質分子 は特定のｏｒｉＴ配列を認識する（Ｈｅｌｉｎｓｋｉ。

ｐ、Ｒ−＋　ｅｔ　ａｌ、（帽１　［バクテリア中のプラスミド（Ｐｌａｓｍｉ ｄｓ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）。

Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋｄ中の第５２１−５３４頁のＧｕ ｉｎｅｙ、Ｉ）、Ｇ−ｅｔ　ａｌ。

、（１９８５）：バクテリア接合の間のプラスミドＤＮＡの起源（Ｔｈｅ　Ｏｒ ｉｇｉｎ　ｏｆ　Ｐｌａｓｍｉｄ　ＤＮＡ　Ｔｒａｎｓｆｅｒ　Ｄｕｒｉｎｇ　 Ｂａｃｔｅｒｉａｌ　Ｃｏｎｊｕｇａｔｉｏｎ）を参Ｍ）。

１１旦１１ 本発明者らは、バクテリア（特にグラム−陰性）の接合の際に一つのバクテリア 細胞から他のバクテリア細胞へＤＮＡの伝達を促進する適合性ｏｒｉＴおよびｍ 　ｏ　ｂＤＮＡ配列は、バクテリア細胞から植物細胞へのＤＮＡ（特に所望の異 種遺伝子）の伝達を生じることができ、しかもこの伝達をΔ、ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓのＴ−ＤＮＡ（特にＴｉボーダーＤＮＡ（Ｔｉ　ｂｏｒｄｅｒＤＮＡ）’ ）を用いる公知の技術と類似の技術で行い得ることを見出した。この発見は、広 い範囲の新規且つ有用な植物の住度の可能性を与える。ＦＡえば、この発見は人 。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓによることなく、植物細胞の形質転換を可能とし、従っ て、Δ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ王を感染させることの出来ない植物（例えば、ト ウモロコシその他の穀類のようなある種の単子葉植物ならびにある種の双子０葉 植物）の形質転換の可能性を開いた。この発見は、さらにΔ、ｔｕｍｅｆａｃｉ ｅｎｓに感染可能な植物をｏｒｉＴおよびｍｏｂ＠箭をもつがＴｉボーダーＤＮ Ａを持たないベクターを用いて形質転換する可能性を与える。即ち、自己移動可 能な広範な宿主範囲をを、Δ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓに感染させることの可能 な任意の植物を形質転換するために、Δ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓと一緒に使用 することができる。

従って、本発明はその広い範囲において、ｏｒｉＴＤＮＡ配列およびＸｌ１ＤＮ Ａを含む遺伝子工学操作されたＤＮＡ構成物を含む植物に関する。好ましくは、 ＤＮＡ＊Ｊｉ！物は、植物の染色体に組み込まれ、そして植物中の該構成物は好 ましくは、ｏｒｉＴＤＮＡ配列の第一部分、異種ＤＮＡ及びｏｒｉＴＤＮＡ配列 の残部をこの順序で有する。他の好ましい態様において、植物中の構成物は、ｏ ｒｉＴ　ＤＮＡ配列の二つの部分の閾にｍｌ上　ＤＮＡ配列をも有する。

本発明の植物は、植物細胞を形質転換条件下で、異種ＤＮＡおよびｏｒｉＴ　Ｄ ＮＡ配列を有する第一プラスミドで、およびｔＪ［ｏ　ｒ　ｉ　Ｔ配列と適合性 のｍｏｂＤＮＡ配列て形質転換して製造することがてき、その際、該ｍｏｂ　Ｄ ＮＡ配列は第一プラス、ミドまたは第ニブラスミドのいずれにより運ばれていて も良（、また第一プラスミドと第ニブラスミドの両者はともにム、ｔｕｍｅユａ ｃｉｅｎｓのＴｉボーダーＤＮＡ由来もしくはこれと同一のＤＮＡを含んていな い。

本明細書において、異種遺伝子で形質転換された植物細胞とは、遺伝子が植物細 胞中に挿入され（必ずしも必須要件てはないが、該植物の染色体への組み込みに より挿入されるのが好ましい）、発現されそして安定に該細胞中に保持されるよ うな植物細胞を意味する０本明細書においては、ｍｏｂ配列によりコードされる 蛋白質が且しユＴ部位（一般に約１００〜５００塩基対の長さである）を認識し て、異種遺伝子とｏｒｉＴ配列を有するプラスミドＤＮＡをニックを生じて、植 物細胞へのプラスミドＤＮＡの伝達のための該プラスミドの直線化を行うことが 出来る塵りにおいて、ｏｒｉＴ配列とｍ　ｏ　ｂ配列とは適合性であるとする。

上記のとおり、適合性ｍｏｂ配列は、ｏｒｉＴ配列および１４＠遺伝子（これら は同じプラスミド上に存在すべきである）と同じプラスミド上に存在してもよく 、または異なるプラスミド上に存在しても良い。

好ましい！！様において、植物は単子葉または双子葉植物であり、ｇ＠ＤＮＡは 非植物遺伝子、修飾遺伝子、合成遺伝子、および異なる植物株若しくは種の遺伝 子を包含する。

本発明の植物細胞形質転換法における好ましい態様のあるものては、プラスミド 構成成分三種の全てが一つのプラスミド上に存在する０本発明の他の好ましい態 様においては、プラスミドＤＮＡは、バクテリア細胞、好ましくは植物細胞が由 来する根の表面（ｒｈｉｚｏｐｌａｎｅ）または根の細胞間（ｒｈｉｚｏｉｎｔ ｅｒｓｔｉｃｅｓ）て増殖可能な種のバクテリア細胞により運ばれる。　ｒｈｉ ｚｏｐｌａｎｅ中て増殖できるバクテリアは、植物の根または毛根に直接接触す るバクテリアであり、ｒｈｉｚｏｉｎｔｅｒｓｔ　１ｃｅｓ中で増殖するベクタ ｈｉｚｏｐｌａｎｅまたはｒｈｉｚｏｉｎｔｅｒｓｔｉｃｅｓ中で増殖可能な種 のバクテリアを伴うどの植物においても、入手が可能性があり、またそのような バクテリアは実質的に全ての植物種で知られている０例えば、リゾビラふ・メリ ロテ４　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍｅｌｉｌｏｔｉ）は、アルファルファと密接 な関連があることが知られており、リゾビウム・ジ中ボニカム（Ｒｈｉｚｏｂｉ ｕｍ　ａ　ｏｎｉｅｕｍ）は大豆に、そしてアゾスビリラム・ブラシレンス（Ｌ ＬＬ上上土エユユユ■　ｂｒａｓｉｌｅｎｓｅ）はトウモロコシに関連する、さ らに、アグロバクテリウム・ツメファシェンス（Ａ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　 ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｉ）は、多（の双子葉植物種に関連することが知られてい る。

そのようなバクテリアは、プラスミドＤＮＡの望ましい運び屋である：というの は、そのようなバクテリアは、形質転換において必要な第−Ｂ階であるバクテリ アが植物の存在を認識することがてきるようにする（おそらく植物分泌物によっ て）ｖｓｒｌｌ伝子群を素子群おり、そしてバクテリア細胞の接合に要求される ｔｒａ２１１伝子を要求しないからである（何故なら、ここて起こるのはバクテ リアの接合でなくて植物の形質転換だからである）。

植物に密接に関連するバクテリアはまた、有利なことに植物のｉｌｎおよび形質 転換を馳ける他の要素も含んでいる回旋性があることである。植物に密接に関連 する全てのバクテリアが必要なり１ｒＷｌ伝子を含むわけではないから、選択す べきバクテリア種は、植物に関連する種であるだけでなく、Ｖｉｒｉ伝子をも含 むべきである。もしバクテリアがｖｉｒ遺伝子を含んていないときは、そｅｆａ ｃｉｅｎｓのＴｉプラスミドから慣用の手段て誘導されたｖｉｒｉ伝子も含んで いなければならない（ヱＬ工遺伝子群の＊ｍｓａマフプに関しては、スタフチェ ルおよびネスター（Ｓｔａｃｂ＠ｌ　ａｎｄ　Ｎｅ５ｔｅｒ）　（１９８６）　 ＥＭＢＯＪ、５：ｌ４４５−１４５４を参Ｆり、ｖｉｒ遺伝子の必要性の例とし て、本発明者らは、Δ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのｖｉｒ−株のあるものは、異 種遺伝子、ｏｒｉＴ配列およびｍ　ｏ　ｂ配列を有し、ＴｉボーダーＤＮＡを欠 くプラスミドを植物へ形質転換させるための宿主として役立てることが出来ない ことを見出した。さらに、リゾビウム・メリロティ　（Ｒｈｉｚｏｂｉｕｍ　ｍ ｅｌｉｌｏｔｉ）は、植物関連バクテリア種であることが知られているが、異種 遺伝子、ｏｒｉＴならびにｍｏｂｆｉ＠を有するプラスミドで植物を形質転換す る宿主として作用しないことを、見出した。その理由の少なくとも一部は、リゾ ビウム・メリロティがｖｉｒ遺伝子を有しないためである。

好ましくは、プラスミドＤＮＡは選択可能マーカー蛋白質をコードするＤＮＡ配 列をも含んでおり、本発明の方法は、形質転換体を選択マーカー蛋白質の存在に 基づいて選択する工程も含んている（このマーカー蛋白質自体が異種遺伝子の所 望生産物であってもよい）。

本発明の他のＢｓおよび利点は、好ましい態様に関する以下の説明および請求の 範囲の記載から明らかにされる。

ましい箭　の 先ず、図面の簡単な説明したのち、好ましい態様の説明を行う。

ｌ且 第１図、￥ｉＩ７ｇおよび第８図は、本発明のプラスミドの概略図である。

第２１ｉ！Ｉハ、第１！ｉ！、ｊ１７１１８！び８８ｍ（Ｄ”ｆ５ス＠ドを製造 するために使用した、中間体遺伝子融合物の概略図である。

第３図および第５Ｗ４は、合成Ｔ　ｉ　ｉｌ−グーＤＮＡを含むプラスミドの概 略図である。

第４′ｍは、Ｔｉ　ＤＮＡもｍｏｂ配列およびｏｒｉＴ配列のいずれをも含まな いプラスミドの概略図である。

第６図は、ｏｒｉＴ部位およびｍｏｂ部位を含むＰＳＵＰ１０４領域の概略図で ある。

乙り入１ヱ基遣 上記のとおり、本発明のプラスミドは、これから詳述する種々のＤＮＡＩ［ｊｉ ！および部位を含んでいる。

マーカー 異種遺伝子を含むプラスミドでの植物細胞の形質転換は、比較的低い碕率で生じ るため、本発明のプラスミドは、好ましくは形質転換体の同定のための選択的マ ーカー蛋白質をコードするＤＮＡｇＩ域を含む。このマーカー蛋白質は、植物細 胞中で発現でき・該蛋白質を発現した植物細胞の表現型を同定できる任意の蛋白 質であってよい・好ましいマーカー蛋白質は、一種またはそれ以上）抗生物質に 対する耐性を与える蛋白質である・現時点で最も好ましいものは、アミノグリコ シド°ホス”ト５ｙｚ７エラーセ蛋白質であり、これは力ｆｖイシン−ネオマイ シンおよびＧ４１８のような抗生物質を不活性化し、形質転換体の植物細胞は抗 生物質の存在下で増殖てきる。他の例にはクロラムフェニコールに対する耐性を 与えるクロラムフェニコールア、ジルトランスフェラーゼ、メ）Ｆレキセードに 対する耐性を与えるジヒドロ葉酸リダクターゼ、およびＬＬ上上遺伝子によりコ ードされ抗生物質ヒグロマイシンＢに対する耐性を与えるヒグロマイシンーホス ホトランスフェラーゼが含まれる。

除草剤耐性もまた、選択性マーカーとして用いることができる。上記のとおり、 除草剤耐性は選択性マーカーであると同時に、それ自体所望の性質であることが てを、その場合、ベクター中に付加的ｊ！種遺伝子を挿入する必要はない。

現在、世界で市販されている除草剤の多くは、雑草のみならず作物植物、特に葉 が出るまで成長した作物植物に対して、ある程度害を与えるという望ましからぬ 作用ををする。このため、農家では時に、雑草成長前や作物このような作業は、 実際無駄であり（少なくとも雑草は害を及ぼす程度には成長していない）、そし て選択的除草剤の適用法としては不適当である。

本発明のベクターを使用すると、除草剤に非耐性の葉を含めて全ての植物組織中 に、外来遺伝子の発現によって、除草剤耐性を誘発する任意の蛋白質を生産させ ることが出来る。このような葉での発現は、作物植物上に葉が出現した後の期間 を含めて、作物成長の間の何時でも除草剤を適用することを可能とし、従って、 発芽後用除草剤に対する耐性を与えるために特に有用であろう。

耐性を誘発させることのできる市販除草剤の代表例には、２，２−ジクロロプロ ピオン酸（Ｄａｌａｐｏｎ）、グリホセー・）　（Ｎ−ホスホ−メチル　グリシ ン；Ｒｏｕｎｄｕｐ）　、シアナジン、クロルスルフロン、Ｌ−ホスフィノトリ シン、アトラジン、イミダシリン類、および６−クロロ−Ｎ−エチル−Ｎ−（１ −メチル）−１゜３．５−）リアジン−２，４−ジアミン（Ｇｅｓａｐｒｉｍ５ ００Ｌ）等が含まれる。

本発明においてベクターがコードする蛋白質が介在する、除草剤耐性が植物中に 誘発されるｉ構は、次のとおりである。

股ｌ立月 この作用は、酵素により除草剤の分子の置換基を除いて該分子を無毒化するか： 分子を開裂させるか：または分子に置換基を付加して該分子を無毒化することよ りなる。最初に挙げた置換基の除去は、バクテリアのデハロゲナーゼが除草剤ダ ラボン（Ｄａｌａｐｏｎ）をその塩ｉＡＭ子を除去して無毒化する機構である。

デハロゲナーゼの遺伝子を有するバクテリアのプラスミドは単離されており、Ｂ ｅｅｃｈｉｎｇ　ａｔ　ａｌ、（１９Ｂ３）Ｊ、Ｇｅｎ、Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、 　」１．２０７１に記載されている。植物にとって毒性の物質を無毒化するため に置換基を付加する例は、上記したアミノグリコシド・ホスホトランスフェラー ゼによるカナマイシンへのリン酸基の酵素的付加である。

草　標・の　飾 この機構は、除草剤による毒作用を受けない型の除草剤−標的酵素をコードする 突然変ｊ！遺伝子を、植物中へ導入する方法を含む。

ｌＡ亘１１ この機構は、植物により生産される酵素の量を増加させるため、除草剤の毒性作 用をうける酵素をコードする遺伝子を植物中に導入することを包含する。

種々のバクテリアは、自分自身を除草剤にたいして耐性とするために、解毒ｌｌ １ｌｌｌを利用する読方を持つ、これらのバクテリアは、除草剤耐性付与遺伝子 の都合よい供給源である。そのような遺伝子は一般にそのようなバクテリア（一 般に土壌バクテリア）から、先ず除草剤を栄養源として増殖できる能力または除 草剤を無毒化する能力で選択することにより、単離てきる。これらのバクテリア 中で、除草剤の無毒化に関与する酵素を特定し、そして該酵素をコードする遺伝 子を、標準的方法で単離する。

ポリアデニル　サイト 真核生物（例えば、植物）のメツセンジャーＲＮＡは、効率的転写およびプロセ シングのためには、ポリアデニル化される必要がある。ポリアデニル化のために は、この選択マーカーをコードするＤＮＡ領域の３”末端の近くに、ポリアデニ ル化酵素のための認識部位を必要とする。

ブースミド　゛のためのＤＮＡ 本発明のプラスミドを植物細胞中に伝達させるためには、自己移動可能もしくは 自己伝達可解バクテリアプラスミド（後者はＴ　ｒ　ａ遺伝子を有し、前者はこ れを持たない）のｍｏｂおよびｏｒｉＴ部位から誘導されたＤＮＡまたはこれと 実質的に同一のＤＮＡ　（ＩＴち、同じようにＳａＷするに充分似た構造を有す るＤＮＡ）を使用する。

前記Ｇｕｉｎｅｙらが述べているとおり、これらの部位の接合プラスミドＤＮＡ 伝達、特にグラム陰性バクテリアの一つから他への伝達における役割は、良く知 られている。上記のとおり、本発明者らは、ｏｒｉＴ−ｍｏｂ系がバクテリアか ら植物へＤＮＡを伝達するためにも有用であることを見出した。

多（の天然プラスミドは、ｍｏｂおよびｏｒｉＴ配列を有し、その中には、Ｐ− タイプ、Ｑ−タイプおよびＷ−タイプの非相容グループ（ｉｎｃｏｍｐａｔｉｂ ｉｌｉｔｙ　ｇｒｏｕｐ）も含まれる。一つのプラスミドのｍ　ｏ　ｂによりコ ードされる蛋白質は、一般に密接な関係を持つプラスミドのｏｒｉＴ部位のみを ！Ｉａするであろうから〜相容性ｍｏｂおよびｏｒｉＴ配列を一緒に用いねばな らない、好ましいｍ　ｏ　ｂおよびｏｒｉＴ配列０倶給源ハ、Ｑ−タイプ非相容 性グループのプラスミド％例えばＲ３ＦＩＯＩＯおよびその誘導体である。ある いはＰ−タイプのプラスミド、例えば、ＲＫ２またはその誘導体も使用できる。

相容性ｍｏｂおよびｏｒｉＴ配列を得ることのてきる他のプラスミド、は、他の 公知の数百の大型自己伝達性プラスミドである。一般に、これらのプラスミドは 大き過ぎて全体をそのまま本発明に使用することができな゛いので、慣用の技術 でｍ　ｏ　ｂおよびｏｒｉＴ配列を取り出すか、無関係なりＮＡを取り除き、ｌ 工１Ｔとｍ　ｏ　ｂを含む小さいプラスミドとして用いる。

Ｒ３ＦＩＯＩＯおよびＲＫ？を含めて、数種のプラスミドのｏｒｉＴ部位のヌク レオチド配列は％　Ｗ　ｔ　１１　ｅｔｔｓおよびＷｉ　１ｋｉｎｓ　（１９８ ４）Ｍｉ　ｃｒｏｂ。

Ｒｅｖ、、４８：２４−４１に記載されている。

１１星刀 効率的発現のための、選択マーカー遺伝子および所望異種遺伝子（もしマーカー 遺伝子と異なるとき）の転写は、好ましくは通常植物細胞中で発現する調節遺伝 子、例えば、プロモーター（例えばＡ　ｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ　ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓ　Ｔ−ＤＮＡのツバリンシンターゼ（ｎｏｐａｌｉｎｅ　５ｙｎｔｈ ａｓｅ）のプロモーターまたはオクトビンシンターゼ（ｏｃｔｏｐｉｎｅ　５ｙ ｎｔｈａｓｅ）のプロモーター（Ｏ３））のコントロールの下で行われる。他の 適当なプロモーター配列の例には、リブロース・ビホスフェート・カルボキシラ ーゼの小サブユニット遺伝子、ニトレートリダクターゼ遺伝子、グルタミンシン ターゼ遺伝子等のプロモーターおよびカリフラワーモザイクウィルス（ＣＡＭＶ ）の３５３プロモーターおよび１９Ｓプロモーターがある０合成プロモーター、 遺伝子工学で生産されたプロモーターまたは修飾された天然プロモーターも使用 できる。場合によっては、ｔｉｔＩＢされたプロモーター、例えば植物発生の限 られた期間のみ活性なプロモーターを用いることが好ましいこともあるであろう ０本発明のプラスミドは、構造遺伝子によりコードされる蛋白質の生産による形 質転換植物の代謝エネルギーの無駄な消費をさけるため、通常の状況で使用する 各プロモーターの調節下にある完全な構造遺伝子より小さい配列を有する。

鳴禽　の　α 所望異種遺伝子の挿入部位は、エンドヌクレアーゼが該所望Ｘ種遺伝子を挿入す るためにφ断することのてきる任意の部位てあってよい、好ましくは、エンドヌ クレアーゼがプラスミドを所望位電のみで切断するよう、プラスミドのユニーク 部位て切断する。

阪ＬＬＬ！ｌ皇ｌ 所望異種遺伝子は、植物中で発現されることが出来、かつ植物の有用な性質を増 強するかまたは有用な性質を付与する蛋白質をコードする任意の遺伝子である。

そのような遺伝子の例は、除草剤にたいする耐性をコードするもの、トマトのフ ザリウム（ｆｕｓａｒｉｕｍ）による萎九のような痛気にたいする耐性をコード するもの、！白質含量または他の植物栄養価を改善することのできる蛋白質をコ ードするもの、および、生物が産生ずる害虫防除成分をコードするもの等である 。もっとも簡単に実施できる修飾は、一種類の蛋白質によって調節される、従っ て一つの遺伝子にコードされる生化学的機能の改善等であるが、一種以上の異種 遺伝子を導入し、植物により複雑な生化学的機能を導入するために、調和的にコ ントロールされた複数の遺伝子を発現させることも可能である。そのような例は 、多酵素経路、例えばエネルギー発注反応、および生合成経路である。

前記のとおり、所望異種遺伝子の転写は、選択マーカー遺伝子の転写と同様に、 好ましくは植物細胞中で通常発現される調節配列のコントロール下に存在させる 。

（さらに、これも前記のとおり、マーカー自体が有用性を持つ時、例えばマーカ ーが植物に除草剤耐性を付与する時は、付加的異種遺伝子の必要は無い、）　異 種遺伝子の調節配列への融合は、慣用の手段により、ベクターへの異種遺伝子の 挿入の前に行う、別法として、遺伝子をベクターに直接挿入し、調節配列は該遺 伝子の挿入の前もしくは後に、該遺伝子の上流に別に挿入することも慣用の方法 で可能である。

ブースミドの　築 第１図を参照すると、本発明のプラスミドｐＪＰ１８写コントロール下で、抗生 物質カナマイシンおよびＧ４１８に対する耐性をコードする、トランスポゾンＴ 　ｎ　５からのアミノグリコシド・ホスホトランスフェラーゼ遺伝子（ｋａｎ’ 遺伝子）：ポリアデニル化部位：宿主範囲の広いプラスミドＲ３ＦＩＯＩＯ（Ｈ ｅｌ　１ｎｓｋｉ。

Ｅ、Ｒ，ら（ＩＩ集）ｓ　５ｃｈｏｌｚ、Ｐ、　ら著（１９８５）　「広宿主範 囲−プラスミドＲ３ＦＩＯＩＯの複製決定要因（Ｒｅｐｌｉｃａｔｉｏｎ　Ｄｅ ｔｅｒｍｉｎａｔｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　Ｂｒｏａｄ　Ｈｏｓｔ−Ｒａｎｇｅ　Ｐｌ ａｓｍｉｄ　Ｒ３ＦＩＯＩＯ）Ｊ　；　’バクテリア中のプラスミド（Ｐｌａｓ ｍｉｄｓ　ｉｎ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）Ｊ、Ｐｌｅｎｕｍ　Ｐｒｅｓｓ、ＮｅｗＹ ｏｒｋ、ｐｐ、２４３−２５９）からのｏｒｉＴ配列およびｍｏｂ配列：および ｉｔ遺伝子の挿入のためのユニークなＨｉｎｄｎ［または５ａｉ１部位を有する 。プラスミドｐＪＰ１８１は次のようにして、ｋａｎ’遺伝子をＮＯＳプロモー ターおよびポリアデニル化部位と融合させることから開始して、製造された。

この融合物は、プラスミドｐＶＷ１０４から誘導されたが１後者の造成はＢｕｃ ｈａｎａｎ−Ｗｏｌ　１ａｎｓｔｏｎら、「植物形質転換ベクター（Ｐｌａｎｔ 　Ｔｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎ　Ｖｅｃｔｏｒ）Ｊの名称の米国特許出願第８ ４５５４７号（本出願人に譲渡された）に記載されている。この融合物は、同じ く上記米国特許出願に記載されているプラスミドｐＶＷ１２５（ＡＴＣＣＮｏ、 ３９９２９）から誘導することも可能である。この融合物は、植物細胞中で選択 マーカーとして使用するためのｋａｎ’遺伝子の発現を可能にする。ｋａｎ’遺 伝子およびＮＯＳプロモーターに結合したボリアテニル化部位を含む、ｐＶＷｌ 　０４のＢｃ　１１−ＢｇＩＩＩフラグメント（第２図）を、ｐ　５Ｕ−Ｐ　１ ０４　（Ｒ３ＦＩＯＩＯから誘導されたプラスミド）のＢａｍＨＩ部位にクロー ン化して、プラスミドｐＪＰ１８１を得た（第１図）、プラスミドｐｓＵＰ１０ ４は、「バクテリアと植物の相互作用の分子遺伝学（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＧｅｎ ｅｔｉｃｓ　ｏｆ　ｔｈｅ　ＢａｃｔｅｒｉａＩ　Ｐｌａｎｔ　Ｉｎｔｅｒａｃ ｔｉｏｎ）」、Ｐｕｈｌｅｒｌｇ、ベルリン１９Ｂ３）の中のＳｉｍｏｎら（１ ９Ｂ３）’グラム陰性バクテリアのインビボおよびインビトロ操作のためのベク タープラスミド（ＶｅｃｔｏｒＰｌａｓｍｉｄｓ　ｆｏｒ　ｉｎ　ｖｉｖｏ　ａ ｎｄｉｎ　ｖｉｔｒｏ　Ｍａｎｉｐｕｌａｔｉｏｎｓ　。

ｆ　Ｇｒａｍ−Ｎｅｇａｔｉｖｅ　Ｂａｃｔｅｒｉａ）」に記載されており、そ してアグリジエネテイクス・コーポレーシッン（Ａｇｒｉｇｅｎｅｔｉｃｓ　Ｃ ａｒｐｏｒａｔｉｏｎ）から入手可能である。ｐＪＰ１８１の構成は、前記Ｂｕ ｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌ　１ａｓｔｏｎのｐＶＷ１４４（第３図）と似テイルカ、 ｐＶＷ１１４はΔ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓのＴ　ｉ　Ｄ　Ｎ　Ａから誘導され た２５ｂｐの合成ボーダー配列のシングルコピーを有し、植物細胞の形質転換を 行う事ができる。

後述するバイナリ−形質転換法に使用すると、ｐＪＰ１８１はΔ、ｔｕｍｅｆａ ｃｉｅｎｓの形質転換ＤＮＡからの天然または合成りＮＡが存在しないにも係わ らず、ｐＶＷ１４４と同様に、タバコの細胞をカナマイシンにたいして抵抗性に することを見出した。ｐＪＰ１８１の植物形質転換就力の機構を検討するため、 ｐｓＵＰ１０４の代わりにｐＲＫ２９０　（ＡＴＣＣＮｏ、３７１６８：ＲＫ２ 　（ＡＴＣＣＮｏ−３７１２５）から誘導された）を基本として類似のベクター を造成した。ｐＶＷ１０４のＢｃｌＩ−Ｂｇｌｌｒ７ラグメントおよびｐＶＷ１ ４４のＢａｍＨｒフラグメント（選択マーカーおよび２５ｂｐの合成ボーダー配 列を含んでいる）を別々にｐＲＫ２９０のＢｇｌｌ［部位に挿入して、プラスミ ドｐＶＷ１７０（第４図）およびｐＶＷ１７１（第５図）をそれぞれ製造した。

ｐＶＷ］７０およびｐＶＷ１７１を、バイナリ−形質転換に使用した。ｐＶＷ１ ７１は合成ボーダー配列の力によって、タバコ細胞を形質転換することが出来た が、ｐＶＷ１７０は形質転換できなかった。従って、発明者らは、ｐＪＰ１８１ が植物細胞を形質転換する能力は、このベクター上にＲ３ＦＩＯＩＯから誘導さ れた（ｐＲＫ２９０には存在しない）何んらかの配列が存在するためであ“ると 推定した。Ｒ３ＦＩＯＩＯに存在してｐＲＫ２９０には存在しない可能性のある ＤＮＡ配列は、ｌ工１Ｔおよびｍ　ｏ　ｂ部位の両方を有するものである。　（ ＰＲＫ２９０の前駆体であるＲＫ２ｔｔｏｒｉＴおよびｍｅ互の両者を確かに含 んでいるが、ｐＲＫ２９０の造成の際にｍｏｂ配列は除去されている。）、この 仮説の１１認は、ｏｒｉＴおよびｍ　ｏ　ｂ　６位を含むことが知られているＲ ３ＦＩＯＩＯの特定のＤＮＡセグメントのみを含むベクターを、下記の記載する ように製造することにより行った。

Ｒ３ＦＩＯＩＯのｏｒｉＴおよびｍ　ｏ　ｂ部位は２．９ｋｂのＡｖａ　Ｉフラ グメントに含まれていることが知られており、このフラグメントは、ｏｒｉＶ配 列（複製の住長起Ｈ）および−Ｌ」二ＡＢ遺伝子の一部をも含むことが知られて いる（第６図参照）、この２．９ｋｂのフラグメントをｐＶＷ１７０のＥｃｏＲ １サイトにクローン化しｒｐｖｗ２１０　（第７図）およびｐＶＷ２１４（第８ 図）を得た。これら二つは挿入物の方向のみの点で異なっている。

ＰＶＷ２１０およびｐＶＷ２１４の両プラスミドともに、下記のバイナリ−法で 植物細胞を形質転換することが可能であった。この事実は、ｐｓＵＰ１０４のｏ ｒｉＴ部位およびｍｏｂｌｉ位が形質転換に関与することを示唆している。

さ゛に　のベクタ一 本発明者らは、Ｒ３ＦＩＯＩＯのｏｒｉＴおよびユヱロマイシンＢに対する耐性 遺伝子（ｈｙｇ”）および／または異なるプロモーターとしてＣＡＭＶからの１ ９３および３５Ｓプロモーターを有する何種かのベクターを作成した。なお、ｈ ｙｇ”はＯｒ、ｉｔｚら（１９８３）Ｇｅｎｅ２５　：　１７９−１８０に記載 されている。これらのベクターはｐＪＰ１８１と同様にして造成したが、Ｊ！Ｎ 遺伝子で植物を形質転換するために、同様に有用である。

−ｈＦｇ”遺伝子を用いた造成の全てにおいて、この遺伝子は前記Ｂｕｃｈａｎ ａｎ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎらの記載したようにして修飾し、無関係なＡＴＧコド ンを除去して用いた＊ｈｙｇ”遺伝子がＮＯＳプロモーターのコントロールの下 にある本発明のベクターｐ　ＶＷ２０６は一前記Ｂｕｃｈａｎａｎ−Ｗｏｌ　１ ａｉｔｏｎらの記載したｐＶＷ１８９のＢｃｌｌ−３ａｌ１７５グメントをｐＳ ＵＰ１０４にクローニングして造成した。プラスミドｐ　ＶＷ２０６は、下記バ イナリ−法で植物細胞を形質転換できることが見出された。

ＣＡＭＶの３５３プロモーターＣＨｏｈｎら（１９８２）、、＊し／）−）ビフ クス・イン・ミクロパイオル。

イムツル＋　（Ｃｕｒｒｅｎｔ　Ｔｏｐｉｃｓ　ｉｎ　Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ、Ｉ ｍｍｕｎｏｌ、）、９６：１．９３−２３６）　、特に、前記Ｂｕｃｈａｎａｎ −Ｗｏｌ　１ａｓｔｏｎらの記載した０−４２ｋｂ（Ｆ）ＥｃｏＲＩ−３ａｕｌ ［Ａフラグメント（ヌクレオチド７０１７−７４３７　：　Ｈｏ　ｈｎら）を用 いた抽のベクターも造成した。ｐＪＰ１９４はｋａｎ”遺伝子を３５３プ０％− ターおよびポリアデニル化部位へ融合させたものを含み、ｐＪＰ１９５はｈｙｇ ”遺伝子を３５８．プロモーターおよびポリアデニル化部位へ融合させたものを 含み、両ベクターはｐｓＵＰ１０４骨格を持ち、Ｔｉ−ボーダー配列を欠いてい る。プラスミドｐＪＰ１９４およびｐＪＰ１９５は、下記バイナリ−法で植物細 胞を形質転換できることが見出された。

さらに別のベクターは、ＣＡＭＶ１９Ｓプロモーター（ＣＭ１８４１株＞ヲ１１ １イテ造成Ｌり、　ＣＡＭＶ　１９　Ｓプロモーターの配列は第１表に示した。

このプロモーターを含む１２９ｂｐフラグメントは、プラスミドＰＢＬ１０１か ら、先ず０．５ｋｂのＥｃｏＲ１フラグメントを取り出し、次いてＭｎ１ｌで響 断して単離した。二つのベクターでこのプロモーターフラグメントを用いた＝Ｉ ｐＳｐＪＰ３０４はｋａｎ″遺伝子を１９Ｓプロモーターおよびポリアデニル化 部位へ融合させたものを含み、ｐＪＰ３０５はｈｙｇ”遺伝子を１９３プロモー ターおよびポリアデニル化部位へ融合させたものを含む。

宵ベクターはｐｓＵＰ１０４骨格を有し、Ｔｉボーダー配列を欠いている。

５ｓｌ　ＣＡＭＶ　１９Ｓ　プロモーターＥ プラスミドｐＪＰ１８１はユニークなＨｉ　ｎ　ｄ　ｎｌ　ａｆｉ位および５ａ １１部位を有し、プラスミドｐＶＷ２１０はユニークなりｇｌＩＩＢ位を有し、 この中に所望のλ種遺伝子を慣用の手段で挿入できる。プラスミドｐＶＷ２０６ 、ｐＪＰｌ　９４、ｐＪＰ１９５、ｐＪＰ３０４＃よびｐＪＰ３０５にも、同じ ような部位が存在するか、または標準的技術で作ることが可能である。

１嵐立亙ｌ玉遣 本発明のプラスミドは、バイナリ−同時培養技術で、植物のプロトプラストまた は非−プロトプラスト細胞を形質転換するために用いることができる０次にこの 技術の一例を、Δ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓをバクテリア配給システムとして述 べる。ｏｒｉＴおよびｍ　ｏ　ｂ遺伝子を有するプラスミド（ｐＪＰｌ　８１、 ｐＶＷ２　］　０．ｐＶＷ２０６、ｐＪＰ１９４およびｐＪＰ１９５）を、Δ。

ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓの一株例えばＬＢＡ４４０４に伝達させた。このＬＢＡ ４４０４は同時培養が植物の腫瘍形成を引き起こさないように、Ｔ−ＤＮＡＩｉ 域を削除したＴｉプラスミド、ｐＬＢＡ４４０４を有している。

ｐＬＢＡ４４０４およびバイナリ−同時培養は、Ｈｏｅｋ　ｅ　ｍ　ａら（１９ ８３）Ｎａｔｕｒｅ　３０３ｐ５９１３に記載されている。しかしながら、ｐＬ ＢＡ４４０４は天然のＴｉｖｉｒｉｉ能（毒性）を保持しており、少なくとも、 そのある部分は、本発明のハイブリッドプラスミドをＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎ ｓ　ＬＢＡ４４０４がら植物細胞に伝達するために必須である。このバイブリフ トプラスミドを含むＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓを、次いで植物、ｉｉｍと同時 培養して、このハイブリッドプラスミドを植物細胞に挿入し、プラ、スミドＤＮ Ａを植物細胞の染色体に組み込ませる。植物の形質転換は、「クイック・デ４” ｊプ法（ｑｕｉｃｋ　ｄｉｐ　ｍｅｔｈ。

ｄ）」て行われるが、この方法は植物の移植片（ｅｘｐｌａｎｔ）を、形質転換 用プラスミドを含むバクテリア（例えばＡ、ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）の培養物 に浸漬し、次いで感染した植物の部分をカナマイシン耐性について選択する培地 にのせ、再発芽を促す；この方法はＨｏｒｓｃｈら（１９８５）Ｓｃｉｅｎｃｅ 　２２７．１２２９に記載されている。

１１旦１１ 形質転換体の選択の後、植物細胞（プロトプラストまたは他の細胞）を、成熟植 物が再生される条件で培養する。そのような方法、例えばカルス培養からのタバ コ植物の再生法は公知である０例えば、「植物組織培養；方法および農業への応 用（Ｐｌａｎｔ　Ｔｉ５ｓｕｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ＝　Ｍｅｔｈｏｄｓ　ａｎｄ　 Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ　ｉｎ　Ａｇｒｉｃｕｌｔｕｒｅ）Ｊ、Ｔｒｅｖｏｒ 　Ａ、Ｔｈｏｒｐｅ編、アカデミツクプレス、ニューヨーク、１９８１：　特に そのＯ，Ｌ、Ｇａｍ　ｂ　ｏ　ｒ　ｇおよびＪ−Ｐ−５ｈｙｌｕｋ著の頁２】− ２４の論文および３３頁のチャートを参照、染色体に本発明のベクターの組み込 みＤＮＡを有する、成熟植物が生じ、所望の異種遺伝子の情報が発現される。上 記のとおり、完全に証明されてはいないが、形質転換植物細胞の少なくとも一部 の中で形質転換用プラスミドＤＮＡが植物細胞の染色体中に組み込まれ、その際 、Ｘ１ｉＤＮＡがｏｒｉＴ配列の二つの部分に挟まれて染色体中に組み込まれる と信じられる。バクテリア接合による従来のｖｒ究によれば、一つの細胞から他 の細胞へプラスミドＤＮＡが伝達される前に、ｏｒｉＴ配列はニフキングを受け ること、およびＤＮＡの伝達は、そうした。ｒｉＴ配列から開始することが知ら れている。Ｒ３Ｆ１０１０の０ｆｉＴ配列のニフキングを受ける部位は、前記Ｗ 　ｉ　ｌ　１　ｅｔｔｓおよびＷｉｌｋｉｎｓによればＲ３ＦＩＯＩＯの１５３ ｂｐ配列部分に局在しており、Ｄｅｒｂｙｓｈｉｒｅら、Ｍ−Ｇ−Ｇｏ、２０６ ：１５４．１９８７によれば、その１５３ｂｐ配列の中の５ｏｂｐ配列に存在す る０本発明者らは、同様に、本発明の遺伝子工学ベクターは、植物細胞への伝達 の前に◇ｒｉＴ部位でニフキングを受け、結果として、ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列の 残部の前にある異＠ＤＮＡの隣にｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列の一部分を持つ、直１ｉ ＊ＤＮＡ分子を生じると考えている。この配列が、形質転換に続いて宿主植物の ゲノムに組み込まれるものと、本発明者らは考えている。

１立里１ 他の態様は特許請求の範囲に記載されている０例えば、ｏｒｉＴ配列およびｍ　 ｏ　ｂ配列は、他の自己移動性プラスミド、例えばプラスミドＲＫ２およびｐＰ Ｈｌから得ることも回旋である。ＲＫ２のｏｒｉＴＩｉ域は前記Ｗｅ１１ｅｔｔ ｓおよびＷｉｌｋｉｎ、ｓにより記載されており、ＲＫ２のｍｏｂ２ｉ４伝子は ｔｒａ群（ｔｒａ　ｃｌｕｓｔｅｒ）の一つに存在する（前記Ｇｕｉｎｅｙ参照 ）。

他のプロモーター配列、例えば、前記ＢｕｃｈａＨａＨ−Ｗｏｌｌａｓｔｏｎら の記載したプロモーターを用いることもてきる。

ψ Ｃ 国際調査報告 ＰＣＴ１０５８７７０２８８Ｂ 工Ｌ　ｒＩＥＬＤｓ　５ＥＡＲＣ’！！ｍ　にＯｒｍＦｍＡＴＩＯＮ　ｌ＋＊° ａ＋ｐｈ市−シ・畠−’ａｍ”ｔａＩ’ｌＩＰ’Ｉａつ、−ｔ、−ｑｃ、＝／ｎ ：ｃｐｐ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．ｏｒｉＴのＤＮＡ配列および異種遺伝子ＤＮＡを含む遺伝子工学操作したＤ ＮＡ構造物を含む植物。 ２．遺伝子工学操作したＤＮＡ構造物が、ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列の第一部分、異 種ＤＮＡおよびｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列の残りの部分を、この順序で含む請求項１ 記載の植物。 ３．遺伝子工学操作したＤＮＡ構造物が、ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列の第一部分とｏ ｒｉＴ　ＤＮＡ配列の残りの部分との間にｍｏｂ　ＤＮＡも含む、請求項１記載 の植物。 ４．下記、第一プラスミドド第二プラスミドもアグロバクテリウム・ツメファシ エンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉボーダーＤＮＡから誘導されたＤ ＮＡまたはＴｉボーダーＤＮＡと同じＤＮＡを含んではいないことを条件として 、異種ＤＮＡおよびｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列よりなる第一プラスミドおよび該第一 プラスミドまたはそれと別の第二プラスミド上に存在しｏｒｉＴ配列と相容性の ｍｏｂ　ＤＮＡ配列で形質転換された植物細胞。 ５．請求項４記載のに植物細胞を該植物の再発生が生じる条件下で培養する方法 で得られた植物。 ６．下記、第一プラスミドも第二プラスミドもアグロバクテリウム・ツメファシ ェンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉボーダーＤＮＡから誘導されたＤ ＮＡまたはＴｉボーダーＤＮＡと同じＤＮＡを含んではいないことを条件として 、植物細胞を形質転換条件下で、ａ）（１）異種遺伝子、および （２）ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列、 よりなる第一プラスミド、および ｂ）ｏｒｉＴ　配列と相容性であって、第一プラスミドまたは第二プラスミド上 に存在するｍｏｂ　ＤＮＡ配列、 と接触させる方法により得られに植物細胞。 ７．請求項６記載の植物細胞を該植物の再発生が生じる条件下で培養する方法で 得られた植物。 ８．異種ＤＮＡおよびｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列を有し、アグロバクテリウム・ツメ ファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉボーダーＤＮＡから誘導さ れたＤＮＡまたはＴｉボーダーＤＮＡと実質的に同じＤＮＡを含まないプラスミ ドのＤＮＡを染色体に組み込まれて有する植物。 ９．単子葉植物である請求項１、２、３、５、７または８のいずれか１項記載の 植物。 １０．双子葉植物である請求項１、２、３、５、７または８のいずれか１項記載 の植物。 １１．異種遺伝子が選択マーカーをコードする遺伝子を含む請求項１、２、３、 ５、７または８のいずれか１項記載の植物。 １３．異種ＤＮＡが非植物遺伝子、修飾遺伝子、合成遺伝子、および異なる植物 株または種の遺伝子からなる群から選ぼれる、請求項１記載の植物。 １４．下記、第一プラスミドも第二プラスミドもアグロバクテリウム・ツメファ シェンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ）のＴｉボーダーＤＮＡから誘導された ＤＮＡまたはＴｉボーダーＤＮＡと同じＤＮＡを含んではいないことを条件とし て、植物細胞を形質転換条件下で、ａ）（１）異種遺伝子、および （２）ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列、 よりなる第一プラスミド、および ｂ）ｏｒｉＴ　配列と容性であって、第一プラスミドまたは第二プラスミド上に 存在するｍｏｂ　ＤＮＡ配列、 と接触させることよりなる、植物細胞を異種ＤＮＡで形質転換する方法。 １５．プラスミドＤＮＡの３成分が全て第一プラスミド上に存在する、請求項１ 記載の方法。 １６．植物細胞が双子葉植物のものである、請求項１４記載の方法。 １７．プラスミドＤＮＡが植物細胞と接触させるときバクテリア細胞中に存在す る、請求項１４記載の方法。 １８．バクテリア細胞が、該バクテリアが由来する植物種の根表面（ｒｈｉｚｏ ｐｌａｎｅ）または根細胞間（ｒｈｉｚｏｉｎｔｅｒｓｔｉｃｅ５）で増殖でき るものである、請求項１７記載の方法。 １９．バクテリア細胞がグラム蔭性であり、植物種か双子素のものである、請求 項１７記載の方法。 ２０．ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列およびｍｏｂ　ＤＮＡ配列が、いずれも同じ天然に 存在するグラム陰性バクテリアのプラスミドに由来する、請求項１４記載の方法 。 ２１．天然に存在するプラスミドが、Ｐ−タイプ、Ｑ−タイプまたはＷ−タィプ のプラスミドである、請求項２０記載の方法。 ２２．天然に存在するプラスミドがＲＫ２またはＲＳＦ１０１０である、請求項 ２１記載の方法。 ２３．ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列およびｍｏｂ　ＤＮＡ配列が、異なるプラスミドに 存在する、請求項１４記載の方法。 ２４．プラスミドＤＮＡが選択マーカー蛋白質をコードするＤＮＡ配列をさらに 有し、そして形質転換体が該選択マーカーで選択される、請求項１４記載の方法 。 ２５．１）異種ＤＮＡおよび ２）ｏｒｉＴ　ＤＮＡ配列 を含み、アクロバクテリウム・ツメファシエンス（Ａ．ｔｕｍｅｆａｃｉｅｎｓ ）のＴｉボーダーＤＮＡから誘導されたＤＮＡまたはＴｉボーダーＤＮＡと実質 的に同じＤＮＡを含まず、 該異種ＤＮＡの転写が、通常植物中で発現される調節配列のコントロールの下で 行われる、プラスミド。 ２６．ｏｒｉＴ　配列と相容性のｍｏｂ　ＤＮＡ配列をさらに含む、８末項２５ 記載のプラスミド。