CN102079779B - 大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白，其具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。过表达大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2可明显促进植物(拟南芥)开花，使开花时间缩短，生育期缩短。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。

Description

大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及两个大豆开花基因及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。

背景技术

大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源。因为大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区域间的优异品种不能相互引种、生育期也受环境光周期的制约(Zhang et al.，2008)。如果能降低大豆对光周期的敏感性，突破大豆开花对光周期的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种育种方法具有对亲本的依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应性品种。

对拟南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受极其复杂的调节网络控制的(Mouradov et al.，2002；Turck et al.，2008)。但是，其中一个关键基因对开花时间的调节起着至关重要的作用，它就是FloweringLocus T(简称FT)，它在叶片中产生，通过维管组织系统运输到生长点并诱导生长点形成花(Blazquez and Weigel，2000；Lee et al.，2000；Samach et al.，2000；Turck et al.，2008)。因而，FT蛋白被称为成花素(Corbesier et al.，2007；Jaeger and Wigge，2007；Mathieu et al.，2007)。该成花素的表达可以降低植物对光周期的敏感性，促进植物开花。FT基因的功能在不同的植物中有报道(Bohlenius et al.，2006；Hsu et al.，2006；Yan et al.，2006；Corbesier et al.，2007；Jaeger and Wigge，2007；Lin et al.，2007；Mathieu et al.，2007；Tamaki et al.，2007；Liand Dubcovsky，2008)，但在大豆FT基因的功能及其应用未见报道。通过调节大豆开花基因表达来改变植物对光周期的敏感性和开花时间也没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供两个大豆开花基因及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。包括(1)克隆两个大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2；(2)提供基因及其编码蛋白的序列；(3)提供这两个基因在育种中的应用，尤其是在调节植物光周期以及开花时间中的应用。

为达到上述目的，本发明的技术方案提供一种大豆GmFTL1蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，以及大豆GmFTL2蛋白，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供编码上述的大豆GmFTL1蛋白和大豆GmFTL2蛋白的基因。大豆GmFTL1蛋白的基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。大豆GmFTL2蛋白的基因具有如SEQ IDNo.4所示的核苷酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个核苷酸形成的具有同等功能的核苷酸序列。本发明GmFTL1和GmFTL2(全称为Glycine max Flowering Locus T Like 1和2)是从大豆垦农18(Glycine max L.Kennong 18)中克隆到的两个基因，该基因编码蛋白的氨基酸序列相互间的同源性为94.3％，与拟南芥FT蛋白质的同源性分别为67％和73％。并且GmFTL1和GmFTL2蛋白与拟南芥FT具有相同的保守域。因此，GmFTL1和GmFTL2与拟南芥FT基因具有类似促进开花的功能。但是，GmFTL1和GmFTL2的蛋白质序列与拟南芥FT蛋白有重要不同。在重要功能域中，大豆GmFTL1和GmFTL2的蛋白质第128位氨基酸残基为谷氨酰胺(Q)，第129位是苯丙氨酸(F)，第132位是精氨酸(R)，第150位氨基酸残基是亮氨酸(L)，而拟南芥相应部位是亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和异亮氨酸(I)。这些差异导致GmFTL1和GmFTL2的活性比拟南芥FT高。大豆GmFTL1和GmFTL2基因主要在开花前期和开花期的叶中表达。

本发明包括通过各种方法获得的、如SEQ ID No.1-2所示氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质以及编码这些衍生蛋白质的基因。

本发明将GmFTL1和GmFTL2基因构建到表达载体p35S-GW，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将p35S-GW携带的GmFTL1和GmFTL2基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。实验结果表明，GmFTL1和GmFTL2具有降低植物对光周期的敏感性并促进拟南芥开花的作用。

本发明还包括含有GmFTL1和GmFTL2核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化植物细胞和转基因植物。

上述技术方案具有如下优点：

1、提供了大豆GmFTL1和GmFTL2基因及其编码的蛋白本身；

2、过表达GmFTL1和GmFTL2基因改变植物生育期、促进植物开花。过表达大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2明显促进植物(拟南芥)开花，使开花时间缩短，生育期缩短。因而，GmFTL1和GmFTL2具有调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。而且，大豆GmFTL1和GmFTL2的效应明显比拟南芥FT基因的效应强。

附图说明

图1是本发明大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2编码蛋白的结构分析；

图2为本发明实施例3的植物表达载体p35S-GW；

图3为本发明实施例4的克隆中间载体pGWGC；

图4为本发明实施例5的大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花图；

图5为本发明实施例6的大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花图；

图6为本发明实施例7的大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花图；

图7为本发明实施例8的大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花图；

图8为本发明实施例9的大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花图；

图9为本发明实施例10的大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花图；

图10为本发明实施例11的大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花图；

图11为本发明实施例12的大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2的表达水平；

图12为本发明实施例13的大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2在细胞核中的定位。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2的克隆

利用正向引物ATGCCTAGTGGTAGTAGGAAC(如SEQ ID No.5所示)和反向引物TCAAAATGTTCTACCACCAGA(如SEQ ID No.6所示)从大豆垦农18(Glycine max L.Kennong 18)中克隆并测序获得GmFTL1和GmFTL2，其基因序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.1和SEQ IDNO.2所示。

实施例2：大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2编码蛋白的结构分析(见图1)

大豆开花基因的GmFTL1和GmFTL2蛋白序列之间的同源性大于94.3％，C端的功能域与拟南芥高度同源，但存在重要区别。如大豆GmFTL1和GmFTL2的蛋白质第128位氨基酸残基为谷氨酰胺(Q)，第129位是苯丙氨酸(F)，第132位是精氨酸(R)，第150位氨基酸残基是亮氨酸(L)，而拟南芥相应部位是亮氨酸(L)、甘氨酸(G)、苏氨酸(T)和异亮氨酸(I)。这些差异导致GmFTL1和GmFTL2的活性比拟南芥FT高。

实施例3：大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2植物表达载体

大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2构建在图2所示的植物表达载体p35S-GW中，用于在植物中过表达大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行。植物中的筛选标记为Bar。

实施例4：大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2所用克隆的中间载体为pGWGC(见图3)。

从实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到pGWGC上。克隆前，pGWGC事先用Ahd I内切酶水解已获得T载体。连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩繁，阳性克隆经过测序筛选获得实施例1所示的序列。

应用实施例：

实施例5：大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花---转化系I

从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型COL)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时一起培育，直至转化植株开花(约20天)。图4显示大豆开花基因GmFTL1转化拟南芥，导致拟南芥早开花，对光周期不敏感。如图4所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTL1具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例6：大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花---转化系II

从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型COL)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时一起培育，直至转化植株开花(约20天)。图5显示大豆开花基因GmFTL1转化拟南芥，导致拟南芥极早开花，对光周期不敏感。如图5所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大GmFTL1具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例7：大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花---转化系III

从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型COL)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时一起培育，直至转化植株开花(约20天)。图6显示大豆开花基因GmFTL1转化拟南芥，导致拟南芥极早开花，对光周期不敏感。如图6所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTL1具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例8：大豆开花基因GmFTL1促进拟南芥开花---转化系IV

从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型COL)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时一起培育，直至转化植株开花(约20天)。图7显示大豆开花基因GmFTL1转化拟南芥，导致拟南芥早开花，对光周期不敏感。如图7所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTL1具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例9：大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花---转化系I

从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型COL)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时一起培育，直至转化植株开花(约20天)。图8显示大豆开花基因GmFTL2转化拟南芥，导致拟南芥极早开花，对光周期不敏感。如图8所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTL2具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例10：大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花---转化系II

从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型COL)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时一起培育，直至转化植株开花(约20天)。图9显示大豆开花基因GmFTL2转化拟南芥，导致拟南芥极早开花，对光周期不敏感。如图9所示，其中左图为转基因植株，右图为对照。说明大豆GmFTL2具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例11：大豆开花基因GmFTL2促进拟南芥开花---转化系III

从实施例3获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型COL)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时一起培育，直至转化植株开花(约20天)。图10显示大豆开花基因GmFTL2转化拟南芥，导致拟南芥早开花，对光周期不敏感。如图10所示，其中右图为转基因植株，左图为对照。说明大豆GmFTL2具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例12：大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2主要在开花前期和开花期的叶片中表达，在叶柄和茎中高水平表达。如图11所示。

通过利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2表达。图中，短线前面字母表示植株的发育时期，后面字母表示器官。U，单叶；T为复叶(T后面的数字为复叶的顺序)；F，花；Pd，荚；Pt，叶柄(其后数字表示不同时期的荚)；R，根；HH，上胚轴；EH，下胚轴；SAM，生长点；St，茎；L，侧生叶；C，子叶

实施例13：大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2编码蛋白定位于细胞核中

大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2与GFP的融合基因，通过基因枪法转化拟南芥原生质体和大豆叶片。转化细胞中GFP荧光信号表示大豆开花基因GmFTL1和GmFTL2编码蛋白的定位。图12显示大豆开花基因GmFTL1(A和C)和GmFTL2(B和D)编码蛋白在拟南芥原生质体(A和B)和大豆叶片(C和D)中定位于核。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>大豆GmFTL1蛋白和GmFTL2蛋白及其应用

<130>KHP09113517.7

<160>6

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>175

<212>PRT

<213>GmFTL1

<400>1

Met Pro Ser Gly Ser Arg Asn Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly

1               5                   10                  15

Glu Val Ile Asp Pro Phe Glu Ser Ser Ile Pro Phe Arg Val Thr Tyr

            20                  25                  30

Gly Asn Lys Glu Val Gly Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser Gln Val

        35                  40                  45

Pro Asn Gln Pro Arg Val Ser Ile Gly Gly Asp Asp Leu Arg Lys Phe

    50                  55                  60

Tyr Thr Met Val Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asn Pro

65                  70                  75                  80

Ser Phe Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Glu Thr

                85                  90                  95

Thr Gly Pro Asn Phe Gly Asn Glu Ile Val Ser Tyr Glu Ser Pro Arg

            100                 105                 110

Pro Thr Met Gly Ile His Arg Phe Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Gln

        115                 120                 125

Phe Arg Gln Arg Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr

    130                 135                 140

Arg Glu Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val

145                 150                 155                 160

Phe Phe Asn Cys Gln Arg Glu Thr Gly Ser Gly Gly Arg Thr Phe

                165                 170                 175

<210>2

<211>175

<212>PRT

<213>GmFTL2

<400>2

Met Pro Ser Gly Ser Arg Asn Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly

1               5                   10                  15

Glu Val Ile Asp Pro Phe Glu Ile Ser Ile Pro Phe Arg Val Thr Tyr

            20                  25                  30

Gly Asn Arg Glu Val Gly Asn Gly Cys Glu Leu Lys Pro Ser Gln Val

        35                  40                  45

Ala Asn Gln Pro Arg Val Ser Val Gly Gly Asp Asp Leu Arg Asn Phe

    50                  55                  60

Tyr Thr Met Val Leu Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asn Pro

65                  70                  75                  80

Asn Phe Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Glu Thr

                85                  90                  95

Thr Gly Pro Asn Phe Gly Asn Glu Val Val Ser Tyr Glu Ser Pro Arg

            100                 105                 110

Pro Thr Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Gln

        115                 120                 125

Phe Arg Gln Arg Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr

    130                 135                 140

Arg Glu Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val

145                 150                 155                 160

Phe Phe Asn Cys Gln Arg Glu Ser Gly Ser Gly Gly Arg Thr Phe

                165                 170                 175

<210>3

<211>528

<212>DNA

<213>GmFTL1

<400>3

atgcctagtg gtagtaggaa ccctcttgtt gttgggcgtg ttatagggga agtaatagac     60

ccctttgaaa gttctattcc tttcagggtg acctatggta ataaagaagt gggcaatggt    120

tgtgagctta aaccttctca agttcccaac caacctagag tgagtattgg tggagatgat    180

ctcaggaaat tctacactat ggtcatggtg gatcctgatg ctcctagccc aagtaaccct    240

agtttcagag agtatcttca ttggttggtg actgatattc ccgaaactac agggcctaat    300

ttcggtaacg agatcgtaag ctatgaaagc ccgcgaccca cgatggggat tcatcgtttc    360

gtgtttgtgt tattccgtca acagtttaga cagagggtgt atgctcctgg atggcgacaa    420

aatttcaata ctagagaatt tgctgaactt tacaaccttg gattgccggt tgctgctgtc    480

ttcttcaact gtcagaggga aactggctct ggtggtagaa cattttga                 528

<210>4

<211>528

<212>DNA

<213>GmFTL2

<400>4

atgcctagtg gtagtaggaa ccctcttgtt gttgggcgtg ttatagggga agtaatagat     60

ccctttgaaa tttctattcc tttcagggtc acctatggta atagagaagt gggcaatggt    120

tgtgagctta aaccttccca agttgccaac caacccagag tgagtgttgg tggagatgac    180

ctcaggaact tctacactat ggtcctggtg gatcctgatg ctcctagccc aagtaaccct    240

aatttcaggg agtaccttca ttggttggtg actgatattc cagaaactac agggcctaat    300

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gtgtttgtgt tattccgtca acagtttaga cagagggtgt atgctcctgg atggcgacaa    420

aatttcaata ccagagaatt tgctgaactt tacaaccttg gattgccggt tgctgctgtc    480

ttcttcaact gtcagaggga aagtggctct ggtggtagaa cattttga                 528

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

atgcctagtg gtagtaggaa c    21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

tcaaaatgtt ctaccaccag a    21

Claims (8)

1.大豆GmFTL1蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.大豆GmFTL2蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.编码权利要求1所述的大豆GmFTL1蛋白的基因。

4.编码权利要求2所述的大豆GmFTL2蛋白的基因。

5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.3所示。

6.如权利要求4所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.4所示。

7.含有权利要求3-6任一项所述基因的载体。

8.权利要求3-6任一项所述的基因在调节植物光周期和开花时间中的应用。

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