CN101148672A - 大豆开花时间调节基因gal2及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了大豆开花时间调节基因GAL2及其分离克隆方法与应用。本发明的所述的大豆开花时间调节基因，其编码蛋白具有SEQIDNO.2所示的氨基酸序列，或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。过表达该基因可以推迟大豆的开花时间，从而使大豆的生育期得以最大限度的延长，充分利用自然条件(如光、温等)，最终提高产量；同时可以解决当地缺乏优质品种或优质品种单一问题、育种亲本多样性问题、降低育种成本等生产和育种实际问题，实现品种轮换和更新换代。

Description

大豆开花时间调节基因GAL2及其应用

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及大豆开花时间调节的基因GAL2，及其在植物育种中的应用。

背景技术

大豆是我国五大类农作物之一，在国民经济中的作用相当广泛：(1)是人和动物植物蛋白质的重要来源；(2)是食用油的主要来源之一；(3)大豆是可再生能源——生物柴油的主要生产原料之一；(4)大豆中含有大量生物活性物质，如异黄酮、D-手性肌醇。但是，多年来，我国大豆供应状况一直是50％依赖于进口。进口大豆明显冲击着我们大豆生产。提高大豆的产量是改变这一状况、实现大豆自给的关键。

虽然我国的大豆资源很丰富，但各地的大豆品种相对单一，而且生育期受当地光周期制约，各地之间不能进行任意引种栽培。为了改变农作物的开花习性，在生产上常采用晚熟品种适时早播，提早通过光照阶段，提早开花，延长有效花期范围，提高和发挥晚熟大豆品种生产潜力；在生产上还利用各种生长调节剂来促进植物生长。但是这些措施不能从根本上解决大豆光周期广适性问题，而喷施各类植物生长调节剂会引起环境污染问题。另一方面，人们通过遗传育种方法进行大豆品种改良。如用光周期诱导方法来筛选广适性大豆亲本。通过日中性、耐低温、极早熟品种的选育，使大豆生产向高纬度、高海拔、高寒地区推广；同时，通过选育短光性强、适应高温条件的极晚熟品种，使大豆栽培向低纬度和亚热带地区延伸。虽然，这些传统的遗传育种方法应用很广，但是这种方法的周期长，效果也不显著。

目前，对拟南芥开花分子机理有较详细的认识。分子生物学和遗传学等方面的研究结果表明，拟南芥的开花受四条途径的控制，即光周期途径、自主与春化途径和赤霉素途径Mouradov A，Cremer F，Coupland G.2002.Control of flowering time：interacting pathways as abasis for diversity.Plant Cell，14 Suppl：S111-30。Blázquez MA，2005.The Right Time and Place for Making Flowers.Science，309：1024-1025。这些开花途径既相对独立，又相互影响，通过各自的一些关键基因和辅助基因将外界和内部信号进行加工分析，最后将信号传递给开花整合子FT和SOC1从而调节植物的开花过程(Suarez-Lopez P，Wheatley K，Robson F， Onouchi H，Valverde F，Coupland G，2001 CONSTANS mediates between the circadian clockand the control of flowering in Arabidopsis.Nature.410：1116-20.Hepworth SR，Valverde F， Ravenscroft D，Mouradov A，Coupland G， 2002.Antagonistic regulation of flowering-time geneSOC1 by CONSTANS and FLC via separate promoter motifs.EMBO J.Aug 15；21(16)：4327-37)。在拟南芥调节开花的分子网络中，AGL(AGAMOUS-Like)基因家族占据着重要的地位。该家族都是一些小分子基因，其mRNA长度一般在1kb以下，具有典型的结构域MADS-box，其成员多与开花调节有关。如开花整合子SOC1是AGL20，自主与春化途径的关键基因FLC是AGL25，另外还有重要的开花基因AG、AP1、AGL11等，它们在拟南芥开花调控中发挥了重要作用。

然而，有关大豆开花时间调节的分子机理目前还不清楚，通过开花时间调节相关基因来增加大豆栽培的广适性的技术还属空白。

发明内容

本发明的目的在于：1、分离克隆大豆GAL2基因；2、提供GAL2基因的编码蛋白质；3、提供上述基因在植物育种中的应用，特别是在选育大豆新品种中的应用。

GAL2是第二个从大豆中分离并获功能鉴定的AGL家族基因，其中的G为Glycine max(Linn)Merril的首字母，AL为AGL的缩写。

本发明用拟南芥AGL家族中的At4g09960(AGL11)基因在Genebank数据库中进行同源比较，获得含有候选基因的完整5’端的大豆EST序列，将大豆总mRNA反转录得cDNA，通过RACE获得GAL2全序列。其核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示，其编码蛋白的氨基酸序列如序列表SEQ ID NO.2所示。

本发明还包括序列表SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质，以及编码这些蛋白质的基因。

本发明将GAL2的cDNA序列克隆后构建表达载体，农杆菌介导转化植物，获得过表达GAL2的大豆和拟南芥植株。实施例3和4表明，GAL2对拟南芥和大豆的开花有明显的调节作用，能够抑制拟南芥和大豆开花。

本发明还包括含具有上述核苷酸序列或其片段的克隆载体或表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化的植物细胞和转基因植物。

本发明分离克隆了大豆开花调节基因GAL2，通过基因工程的方法，使之在大豆中过量表达或基因沉默，然后筛选出适合于不同地区栽培的大豆新品系，可以使大豆的生育期得以最大限度的延长，充分利用自然条件(如光、温等)，最终产量得以最大限度的提高；同时可以解决当地缺乏优质品种或优质品种单一问题、水平抗性问题、育种亲本多样性问题、降低育种成本、防治病虫害等生产和育种实际问题，实现品种轮换和更新换代。

附图说明

图1是野生型拟南芥和GAL2基因过表达拟南芥的对比，其中，左边为野生型，右边为转化型；

图2是野生型大豆和GAL2基因过表达大豆的对比，其中，右边为野生型，左边为转化型；

图3是野生型和过表达GAL2基因的大豆开花结荚时间对比。

具体实施方式

下面实施例用于对本发明的进一步说明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  GAL2基因的分离克隆

利用拟南芥AGL家族中的At4g09960基因(AGL11)的mRNA序列，在Genebank数据库中进行同源性比对，找到一批大豆EST序列，其中AW705451含有候选基因的完整5’端，从中设计PCR的正向引物F1：TTC ATT TCT TTG GAT TAG AAA TTT TTC C，以大豆总mRNA为模板，用加接头的oligo(dT)(GAC TCT GAT GCT GACAAT GAC TTT TTT TTT TTT TTT TT)为引物进行反转录得cDNA，在接头序列中设计反向引物R1：GAC TCT GAT GCT GAC AATGAC TTT，以F1、R1为引物进行PCR获得GAL2全序列。

PCR反应总体系为25μL，包括50ngcDNA，50μmol/L dNTP，1μmol/L引物，1U rTaq酶及1×缓冲液。PCR反应程序为：95℃预变性5min；然后95℃30s，62℃30s，72℃1min，进行32个循环；最后72℃10min补平末端。

实施例2  GAL2基因的分析鉴定

GAL2的mRNA序列全长958bp，其中71-739为CDS，编码222个氨基酸的蛋白，与拟南芥SOC1蛋白的同源性为70％。蛋白结构分析表明，其N端含有一个MADS-box，该域为AGL族转录调节因子的保守结构域，通过形成同源或异源二聚体与DNA结合；蛋白中部还含有一个K-box，该域可能是一个螺旋环螺旋结构，功能上可能与多聚体形成有关。

根据在NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)上的序列查询结果，到目前为止，大豆中尚无与GAL2相类似的序列信息；而且迄今也没有公开发表的涉及其功能研究的论文。因此认为GAL2是大豆的一个新基因。

实施例3  过表达GAL2基因拟南芥的获得

根据GAL2的序列信息，在ORF两端位置设计一对引物GW-F：ATG GGA AGG GGG AAG ATC G；GW-R：TCA CCC AAG ATG AAGAATC。以大豆总mRNA为模板，用这对引物进行RT-PCR获得GAL2完整编码区的cDNA序列，PCR反应总体系为25μL，包括50ngcDNA，50μmol/L dNTP，1μmol/L引物，1U rTaq酶及1×缓冲液。PCR反应程序为：95℃预变性5min；然后94℃30s，55℃30s，72℃1min，进行32个循环；最后72℃10min补平末端。将PCR产物克隆到pGEM-T载体(Promega公司)上(连接体系为10μL，包括75ngcDNA，25ngpGEM-T载体，5μL 2XBuffer，1μLTA连接酶，16℃反应过夜。)，经测序鉴定正确后构建过表达载体35S::GAL2和35S::GFP:GAL2。

将过表达载体用冻融法(Holsters Marcelle，de Wade Dirk，DepickerAnn，et al.Transfection and transformation of Agrobacteriumturnefaciens.Mol Gen Cenet，1978，163(2)：181-187.)导入农杆菌菌株GV3 101(Koncz C.，Schell J.The promoter of TL-DNA gene 5 controlsthe tissue-specific expression of chimaeric genes carried by a novel typeof Agrobacterium binary vector.Mol.Gen.Genet.1986，204：383-396.)中，用蘸花法(Steven J.Clough and Andrew E Bent.Floral dip：ASimpled Method for Agrobacterium-mediated Transformation ofArabidopsis thaliana.Plant Journal.1998.16(6)，735-743.)转化拟南芥，获得过表达GAL2的拟南芥植株。同期培养，结果如图1所示，转化植株表现出明显的开花延迟。

实施例4  过表达GAL2基因大豆的获得

利用上述导入农杆菌的表达载体，利用子叶节法(Zhang Z，AiqiuX，Staswick P，Clemente T E.The use of glufosinate as a selective agentin Agrobacteriummediated transformation of soybean.Plant Cell Tiss OrgCult，1999，56：37-46)转化大豆，获得过表达GAL2的大豆植株。同期培养，结果如图2及3所示，转化植株表现出开花延迟，最晚的比野生型迟开花20天。

序列表

<110>中国农业科学院作物科学研究所

<120>大豆开花时间调节基因GAL2

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>958

<212>DNA

<213>大豆

<220>

<221>CDS

<222>(71)..(739)

<400>1

ttcatttett tggattagaa atttttccca aagctgatcg agaagccagc caggccagag    60

ttgaagaaga atg gga agg ggg aag atc gaa atc aaa agg att gag aac      109

           Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn

           1               5                   10

aca aca aat cgg caa gtg acc ttc tgc aag aga aga aat ggg ctt ctg     157

Thr Thr Asn Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu

    15                  20                  25

aag aaa gct tat gag ctg tca gtg ctg tgt gat gca gaa gtt gcc ctc     205

Lys Lys Ala Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu

30                  35                  40                  45

atc gtc ttc tcc agc cgt ggc cgt ctc tat gag tat tcc aac aac aac     253

Ile Val Phe Ser Ser Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ser Asn Asn Asn

                50                  55                  60

ata aga tca aca ata gag agg tac aaa aag gca tgt tct gat cac tca     301

Ile Arg Ser Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ser Asp His Ser

            65                  70                  75

agc gcg agc act acc aca gaa atc aat gct cag tat tat caa caa gaa     349

Ser Ala Ser Thr Thr Thr Glu Ile Asn Ala Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu

        80                  85                  90

tct gca aag ctg cga cag caa ata cag atg ctg caa aat tct aac agg     397

Ser Ala Lys Leu Arg Gln Gln Ile Gln Met Leu Gln Asn Ser Asn Arg

    95                  100                 105

cac ctg atg ggt gat gcc tta agc aca ctg act gtg aag gaa ctt aag     445

His Leu Met Gly Asp Ala Leu Ser Thr Leu Thr Val Lys Glu Leu Lys

110                 115                 120                 125

cag ttg gag aat aga ctt gaa aga gga atc act aga atc aga tct aag    493

Gln Leu Glu Asn Arg Leu Glu Arg Gly Ile Thr Arg Ile Arg Ser Lys

                130                 135                 140

aaa cat gag atg cta ctg gct gaa att gaa tac ttc cag aaa agg gag    541

Lys His Glu Met Leu Leu Ala Glu Ile Glu Tyr Phe Gln Lys Arg Glu

            145                 150                 155

att gaa ctg gaa aat gaa aat ctt tgc ctc cga act aag ata act gac    589

Ile Glu Leu Glu Asn Glu Asn Leu Cys Leu Arg Thr Lys Ile Thr Asp

        160                 165                 170

gtg gag agg att cag caa gta aac atg gtt tct ggg cca gaa ctg aat    637

Val Glu Arg Ile Gln Gln Val Asn Met Val Ser Gly Pro Glu Leu Asn

    175                 180                 185

gcc att cag gca tta gct tcc cgt aac ttc ttc aat cca aat atg ttg    685

Ala Ile Gln Ala Leu Ala Ser Arg Asn Phe Phe Asn Pro Asn Met Leu

190                 195                 200                 205

gaa ggt gga act gtt tac cct cac tca gat aag aag att ctt cat ctt    733

Glu Gly Gly Thr Val Tyr Pro His Ser Asp Lys Lys Ile Leu His Leu

                210                 215                 220

ggg tga tcaataatat atgatcttgg ctagcctatg gcatgtctat ccaattagcc      789

Gly

ggtggctaaa tgcattatta ttactactct tttggttgct cattaactag accatgtgat   849

ctatatacta cttatggatt atggatactt atgtatgatg attgtatgat atcataacaa   909

tcagttagaa ataataatta aaaaatagag tgtgtttgaa aaaaaaaaa               958

<210>2

<211>222

<212>PRT

<213>大豆

<400>2

Met Gly Arg Gly Lys Ile Glu Ile Lys Arg Ile Glu Asn Thr Thr Asn

1               5                   10                  15

Arg Gln Val Thr Phe Cys Lys Arg Arg Asn Gly Leu Leu Lys Lys Ala

            20                  25                  30

Tyr Glu Leu Ser Val Leu Cys Asp Ala Glu Val Ala Leu Ile Val Phe

        35                  40                  45

Ser Ser Arg Gly Arg Leu Tyr Glu Tyr Ser Asn Asn Asn Ile Arg Ser

    50                  55                   60

Thr Ile Glu Arg Tyr Lys Lys Ala Cys Ser Asp His Ser Ser Ala Ser

65                  70                  75                  80

Thr Thr Thr Glu Ile Asn Ala Gln Tyr Tyr Gln Gln Glu Ser Ala Lys

                85                  90                  95

Leu Arg Gln Gln Ile Gln Met Leu Gln Asn Ser Asn Arg His Leu Met

            100                 105                 110

Gly Asp Ala Leu Ser Thr Leu Thr Val Lys Glu Leu Lys Gln Leu Glu

        115                 120                 125

Asn Arg Leu Glu Arg Gly Ile Thr Arg Ile Arg Ser Lys Lys His Glu

    130                 135                 140

Met Leu Leu Ala Glu Ile Glu Tyr Phe Gln Lys Arg Glu Ile Glu Leu

145                 150                 155                 160

Glu Asn Glu Asn Leu Cys Leu Arg Thr Lys Ile Thr Asp Val Glu Arg

                165                 170                 175

Ile Gln Gln Val Asn Met Val Ser Gly Pro Glu Leu Asn Ala Ile Gln

            180                 185                 190

Ala Leu Ala Ser Arg Asn Phe Phe Asn Pro Asn Met Leu Glu Gly Gly

        195                 200                 205

Thr Val Tyr Pro His Ser Asp Lys Lys Ile Leu His Leu Gly

    210                 215                 220

Claims (8)

1.一种大豆开花时间调节基因，其编码具有下述氨基酸序列的蛋白：

a)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，或

b)SEQ ID NO.2所示氨基酸序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

2.如权利要求1所述的基因，其具有如SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。

3.含有权利要求1或2所述基因的表达载体。

4.含有权利要求3所述表达载体的宿主。

5.如权利要求4所述的宿主，其为植物细胞。

6.权利要求1或2所述基因在植物育种中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其中所述的植物为大豆。

8.如权利要求6所述的应用，其中所述的植物为拟南芥。

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