CN102676543A

CN102676543A - 大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白

Info

Publication number: CN102676543A
Application number: CN2012101622629A
Authority: CN
Inventors: 夏正俊; 翟红; 吴红艳; 吕世翔; 陈受宜
Original assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Current assignee: Northeast Institute of Geography and Agroecology of CAS
Priority date: 2012-05-23
Filing date: 2012-05-23
Publication date: 2012-09-19

Abstract

大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白，它涉及大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白。本发明提供了大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白。本发明的大豆生育期e1-as基因的基因序列如序列表Seq ID No：1所示。本发明的大豆生育期e1-as基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表SeqID No：2所示。本发明通过品种的相关的遗传及分子功能验证，e1-as基因与E1基因相比，具有促进开花的功能。

Description

大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白

技术领域

本发明涉及大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白。

背景技术

E1基因位于着丝点附近，自Bernard（1971）年报道以来，人们一直没有克隆出其功能基因。由于该基因位于近着丝点(pericentromeric region)，遗传重组率较低，不利于采用图位克隆法克隆出该基因，在发明专利名称：一种大豆生育期E1基因及其编码蛋白，专利申请号为：201210112662.9中，公布出E1基因序列及其相应的蛋白序列后，证明大豆生育期E1基因具有强烈抑制大豆开花的生理功能。其蛋白质序列虽然并不能鉴定出B3结构域，但是与B3结构域基因具有远缘的关系。B3结构域基因是一类较为保守的植物特有的转录因子，一般只有100-120氨基酸，常与其他结构域共同起作用。B3结构域中含有与DNA相结合的特殊位点，一般与DNA分子的大沟起作用。在含有B3结构域的蛋白质对抗逆性反应、植物的生长与发育等诸多方面起重要作用。同时，E1基因具有一个核定位信号，其特征为亲核蛋白一般都含有的能保证整个蛋白质能够通过核孔复合体被运到细胞核内的特殊的短肽氨基酸序列。在大豆栽培品种中，其E1基因的突变如何影响着大豆生育期（开花期及成熟期）是一个非常重要的科学问题，目前还没有在分子水平上的相关研究报道。

发明内容

本发明的目的是提供大豆生育期e1-as基因及其编码蛋白。

本发明的大豆生育期e1-as基因的基因序列如序列表Seq ID No：1所示。

本发明的大豆生育期e1-as基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本发明的大豆生育期e1-as基因是大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）的突变型基因。

本发明的有益效果：

本发明是在克隆出大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）的基础上，进一步对E1基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实E1基因可以代表着E1位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本发明对不同品种及近等基因系中E1基因序列进行了研究，并确定了e1-as基因，其对大豆生育期关系密切。

e1-as基因与大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）相比，两者的序列在DNA水平的仅有一个核苷酸（44号）差异，该核苷酸对核定位信号有很大的影响，e1-as基因在氨基酸序列15从精氨酸到苏氨酸的错义突变，该区域为核定位信号的第一个结构域（氨基酸序列13~16上的KKRK）上（见序列表Seq ID No：1）。

e1-as基因与大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）相比，本发明的e1-as基因在关键的核定位信号上有一个碱基差异，并改变了原来E1基因的功能，使其抑制大豆开花的功能明显减弱（见发明专利申请号：201210112662.9公开内容），因此本发明的e1-as基因较大豆生育期E1基因具有促进大豆开花的功能，即抑制开花不彻底，具有该功能的基因被称为渗漏（leaky）基因型，即该基因型尚有部分抑制开花功能，并非功能全失。本发明的e1-as基因具有对大豆光周期的不敏感性，使具有该基因的品种能在长日照条件下，开花期较为适中的特点，是我国大豆甚至世界大豆品种栽培中最为重要的一类基因，比如在Harosoy、William82及我国的合丰55等都为e1-as基因型。

附图说明

图1e1-as基因酶切后电泳结果图片，其中1号为中黄13，2号为合丰55，3号为淮豆4号，4号为徐豆14，5号为Harosoy-E1，6号为Sakamotowase，7号为中黄39；M为DNA分子量标准样品（

-HaeIII）；

图2为GFP未融合e1-as基因的瞬时表达载体结构示意图；

图3为GFP融合e1-as基因的瞬时表达载体结构示意图；

图4为GFP未融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；

图5为GFP未融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；

图6为GFP未融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定影像位图；

图7为GFP未融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；

图8为GFP融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道下的亚细胞定位影像图；

图9为GFP融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜chlorophyll通道下的亚细胞定位影像图；

图10为GFP融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜明视野下的亚细胞定位影像图；

图11为GFP融合e1-as基因的激光共聚焦显微镜GFP通道、chlorophyll通道与明视野融合后的亚细胞定位影像图；

图12：大豆品种Harosoy在长日照16小时光照/8小时黑暗条件下，出苗后55天照片，其中，箭头所指的是已开放的大豆花朵；

图13具大豆生育期E1基因的大豆品种Harosoy-E1在长日照16小时光照/8小时黑暗条件下，出苗后55天的照片。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式的大豆生育期e1-as基因的突变基因序列如序列表Seq IDNo：1所示。

本实施方式是在克隆出大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）的基础上，进一步对E1基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实E1基因可以代表着E1位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中E1基因序列进行了研究，并确定了e1-as基因，其对大豆生育期关系密切。

e1-as基因与大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）相比，两者的序列在DNA水平的仅有一个核苷酸（44号）差异，该核苷酸对核定位信号有很大的影响，在氨基酸序列15从精氨酸到苏氨酸的错义突变，该区域为核定位信号的第一个结构域（氨基酸序列13~16上的KKRK）上（见序列表Seq ID No：1）。

e1-as基因与大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）相比，本实施方式的e1-as基因在关键的核定位信号上有一个碱基差异，并影响改变了原来E1基因的功能，使其抑制大豆开花的功能明显减弱（见发明专利申请号：201210112662.9公开内容），因此本实施方式的e1-as基因较大豆生育期E1基因具有促进大豆开花的功能，即抑制开花不彻底，具有该功能的基因被称为渗漏（leaky）基因型，即该基因型尚有部分抑制开花功能，并非功能全失。本实施方式的e1-as基因具有对大豆光周期的不敏感性，使具有该基因的品种能在长日照条件下，开花期较为适中的特点，是我国大豆甚至世界大豆品种栽培中最为重要的一类基因，比如在Harosoy、William82及我国的合丰55等都为e1-as基因型。

具体实施方式二：本实施方式的大豆生育期e1-as基因的编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。

本实施方式是在克隆出大豆生育期基因E1（发明专利申请号：201210112662.9）的基础上，进一步对E1基因序列进行深入系统的研究。由于在大豆中具有典型的B3基因结构域基因，本基因是代表一类新型的基因家族，我们已证实E1基因可以代表着E1位点的功能，即具有抑制大豆开花的功能。本实施方式对不同品种及近等基因系中E1基因序列进行了研究，并确定了e1-as基因，其对大豆生育期关系密切。

通过以下试验验证本发明的效果：

（1）基因e1-as序列的获得

一、取长至三叶真叶期的待测大豆Harosoy品种的叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA；以提取的DNA为模板通过K1与K2引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTARHS扩增E1基因，PCR反应条件如下：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸1min，共30循环，再72℃延伸7min，将PCR产物在ABI3130测序仪（ABI公司）上进行测序。

测序结果表明大豆生育期e1-as基因具有序列表中Seq ID No：1的核苷酸序列，序列表中的Seq ID No：1由525个碱基组成，并编码具有序列表中Seq ID No：2的氨基酸序列的蛋白质。

（2）e1-as基因的鉴定

大豆E1基因中e1-as基因的鉴定方法：一、取长至三叶真叶期的待测品种叶片，采用CTAB法提取叶片基因组DNA；二、以步骤一提取的基因组DNA为模板，F1和F2为引物，采用购买自Takara公司的ExTaq酶进行扩增，PCR反应条件如下：95℃预变性3min；95℃变性20s，58℃退火30s，72℃延伸40s，共32个循环，再72℃延伸7min；三、取经步骤二PCR的产物8μl(浓度为300ng/μl)，稀释1倍后，经TaqI限制性内切酶（Takara公司），在65°C温度下，消化3h；四、然后将步骤三酶切后的产物，采用13%非变性PAGE胶电泳进行检测；其中，步骤一所述的待测品种为中黄13，合丰55，淮豆4号,徐豆14,Harosoy-E1，Sakamotowase和中黄39。

电泳结果如图1所示，由图1可知，图1中1、3、4、5、6和7品种仅出现A号带，即没有被TaqI消化的一条带（444bp）为大豆生育期E1基因；而2号合丰55品种出现二条带型(图1中B与C所示)，即为可以被TaqI消化成二条带（414bp与31bp）的为e1-as基因。

（3）E1基因e1-as基因的功能分析

一、在2004年，将大豆的两个近等位基因系Harosoy-E1(L68-694,E1e2E3E4e5,PI 547707)和Harosoy-e1(L58-266,e1e2E3E4e5,PI 547676)进行杂交；二、对杂交后的13761个F2:5代大豆群体通过图位克隆法对e1-as基因进行筛查，筛选出10个重组体，并采用引物C1、C2与D1、D2对获得的10个重组体自交后代进行鉴定。

自交后代开花期的分离情况如表1所示，表1中开花期为品种出苗至开花（第一朵花开放）的天数，e1-as基因与大豆的开花期提前有极显著的相关性，与大豆生育期E1基因相比，有显著促进开花的功能，含有e1-as基因的株系113和株系337其开花期的天数平均为37.1与36.4，显著地早于带有E1基因的株系177、株系268和株系427的51.6、50.2和51.3，之间存在着极显著差异。同时，在上代为杂合体的株系241、株系306、株系378和株系446，其下一代分离的群体中，含有e1-as基因的个体其开花期显著早于含有E1基因的个体。在株系378中，其后代为纯合的e1/e1基因型，其开花期为37.5，显著地早于其E1/E1基因型的50.8，同时杂合基因型（E1/e1-as）的开花期46.7，接近于E1/E1的基因型，说明E1基因对e1-as基因有部分显性作用。其中，表中株系为Harosoy-E1与Harosoy杂交筛选得到的含有10个重组体的子一代；平均值为开花的天数；E1基因型中，e1/e1为纯合的e1-as基因型，E1/e1为杂合的E1/e1-as基因型，E1/E1为纯合的E1基因型；显著性测定是用SigmaPlot (V12.1)中的ANOVA进行。

表1开花期与E1基因的关联分析

（4）大豆品种带有e1-as基因的表型分析

为进一步验证e1-as基因型的功能，将带有e1-as基因的Harosoy品种与带有大豆生育期E1基因（发明专利申请号：201210112662.9）的Harosoy-E1品种，种植在人工培养箱中（人工控制日照长度：长日照为16小时光照/8小时黑暗，中等长照为13.5小时/9.5小时，短日照条件为12小时光照/12小时黑暗），光源为荧光灯与白炽灯，其光强为235~270μmol·s^-1·m^-2，同时，在自然光照的田间种植，观察品种从出苗到开花的天数。

结果如表2所示，从表2中可以看出，大豆为短日照作物，在短日照（12小时光照/12小时黑暗）条件下，大豆生育期E1基因与e1-b3a基因的开花天数（从播种到开花）相当，大约30天左右；而在长日照条件（16小时光照/8小时黑暗）下，e1-as品种为60天以下，其中Harosoy的开花期为49天（图12），Harosoy-E1的天数为70.3天（图13）；在中等长照强度（13.5小时光照/9.5小时黑暗）及田间的效果，其开花期介于长日照与短日照之间。因而可以说E1基因与e1-as基因对大豆开花期的影响是不一致的，E1基因具的强烈的抑制开花的功能，相比而言，e1-as基因抑制大豆开花的功能弱于E1基因，而表现出一定的促进大豆开花功能。

表2.不同E1基因品种的开花期

注：n.d.(not done)没有进行相应的试验；L=Light（光照长度）；D=Dark（黑暗长度）

（5）大豆生育期e1-as基因核定位研究

一、提取大豆Harosoy品种（从日本生物资源研究所基因库中购买得到的）的DNA，并以其为模板，以K1与K2为引物，采用购买自Takara公司的高保真酶primerSTAR HS扩增e1-as基因，PCR反应条件如下：94℃预变性10min，94℃变性30s，60℃退火15s，72℃延伸1min，共30循环，再72℃延伸7min；二、将步骤一获得的PCR产物采用ClaI酶SpeI酶进行酶切，然后将酶切片段克隆到pBSK质粒中，形成一个CaMV 35S启动子驱动的e1-as与eGFP融合体质粒（即CaMV 35S：e1-as：eGFP）；三、制备拟南芥原生质体（Arabidopsisprotoplasts）；四、将步骤三得到CaMV 35S：e1-as：eGFP质粒通过氯化钙聚乙二醇法转染拟南芥原生质体(Arabidopsis protoplasts)，同时，将不含有e1-as的pBSK（CaMV 35S：eGFP）质粒作为对照组，通过氯化钙聚乙二醇法转染拟南芥原生质体，置于激光共聚焦显微镜下观察；其中，pBSK质粒购买自Stratagene公司；

拟南芥原生质体（Arabidopsis protoplasts）制备方法如下：一、配制纤维素酶消化液，消化液各组分的配比：1.25%(w/v)的纤维素酶R10，0.3%(w/v)的离析酶R10，0.4M/L的甘露醇，20mM/L的KCl，20mM/L的MES（pH=5.7），混合均匀后在55℃温度下加热10min，再加入终浓度为10mM/L CaCl₂溶液，5mM/L的β-巯基乙醇和0.1%（w/v）BSA；二、取三至四周龄未抽苔的拟南芥莲座叶片，切成约0.5mm×0.5mm的形状，然后浸没于步骤一制得的消化液中，然后在黑暗放置3h，再用200目筛网过滤，收集滤过液并置于离心管中以100g/min的速度离心2min，去上清，用预冷的W5的溶液重悬清洗，再次以100g/min的速度离心后，收集沉淀用W5重悬并于冰上放置30min，再次以100g/min的速度离心，收集沉淀，用1mL MMg溶液重悬，即得拟南芥原生质体（Arabidopsis protoplasts）；其中，W5的组成为154mM/L的NaCl，125mM/L的CaCl₂，5mM/L的KCl和2mM/L的MES缓冲液（pH=5.7）；MMg的配比为0.4M/L的甘露醇，15mM/MgCl₂溶液和4mM/L的MES。

氯化钙聚乙二醇法方法转染质粒的具体步骤如下：一、分别取10μl的质粒（CaMV35S:E1:eGFP与CaMV 35S:eGFP，质粒浓度约为1μg/μL）加入100μl的制备好的拟南芥原生质体中，再加入110μl的PEG-CaCl₂溶液，吹吸混匀，转化20min；二、转化完后，加入440μl的W5溶液混匀后，然后以100g/min的速度离心3min，去上清后加入1mL的W5溶液过夜培养16h，即完成；其中，PEG-CaCl₂是由4g的PEG4000，3mL的H₂O，2.5mL的0.8M/L甘露醇，1mL的1M/L CaCl₂溶液制成；W5的组成为154mM/L的NaCl溶液，125mM/L的CaCl₂溶液，5mM/L的KCl溶液和2mM/L的MES缓冲液（pH=5.7）。

在激光共聚焦显微镜下观察拟南芥原生质体不同器官中大豆生育期e1-as基因的分布，与主要为细胞核定位的E1基因相比，e1-as基因分布于细胞核与细胞质中。

其中，图2和图3为e1-as基因核定位研究所用载体的结构示意图，图2为对照载体的结构示意图，即eGFP（绿色荧光蛋白）未融合e1-as；图3为本试验构建的e1-as与eGFP融合蛋白载体的结构示意图。

大豆生育期e1-as基因在荧光显微镜下观察其核不同器官中的分布情况如图4至11所示。由图4至图11可知e1-as蛋白同时定位于细胞核现细胞质中，与E1基因相比其核定位信号发生了变化。

在上述试验中所述的Harosoy-E1和Harosoy-e1来源于美国农业部基因种质库（theUSDA-ARS National Plant Germplasm System）的统一入库编号，分别为PI 547707和PI547676；Harosoy-E1、Harosoy、Harosoy-e4、Harosoy-e3、Harosoy-E2、Bay、Enrei、Clark、Williams 82、Aokimame、Sakamotowase从日本生物资源研究所基因库中购买得到。其他品种淮豆4号、北京小黑豆、徐豆14、中黄39及合丰55从吉林省农业科学院大豆研究中心是"大豆国家工程研究中心购买得到。

Claims

1.大豆生育期e1-as基因，其特征在于大豆生育期e1-as基因的基因序列如序列表Seq IDNo：1所示。

2.如权利要求1所述的大豆生育期e1-as基因的编码蛋白，其特征在于大豆生育期e1-as基因编码蛋白的氨基酸序列如序列表Seq ID No：2所示。