CN105579583A - 雌性不育系的繁殖及杂交制种技术 - Google Patents

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Abstract

本发明属于植物分子生物学和育种领域，具体地涉及一种用于制备杂交水稻的方法，更具体地涉及雌性不育系的繁殖和保持及其在制备杂交水稻中的用途。

Description

雌性不育系的繁殖及杂交制种技术 技术领域
本发明属于植物分子生物学和育种领域，具体地涉及一种用于制备杂交水稻的方法，更具体地涉及雌性不育系的繁殖和保持，及其在制备杂交水稻中的用途。
背景技术
水稻雌性不育类型多样，是不同基因突变和环境条件相互作用的结果。人们对水稻雌性不育的研究有限,还有很多问题需要做进一步的探讨和研究。目前对水稻雌性不育的研究主要集中在细胞学分析上,而遗传学和分子生物学的研究还比较少。
水稻育种上的突破经常从特异性育种材料的发展开始,如洪群英、洪春利在广东发现矮脚南特,李必湖在海南发现的野败雄性不育株,石明松在湖北发现农垦58不育株。这些特殊突变体的发现为遗传育种学家提供了坚实的材料基础,掀起了我国水稻育种矮化及杂交育种的多次浪潮。但随着水稻遗传育种研究和应用的深入,育种材料发掘与创新的难度不断增加。
现有杂交水稻“三系”或“两系”法,由于亲本育性的制约，杂交制种均难以实现机械化生产,从劳动力上限制了杂交稻种子的生产规模,导致种子成本居高不下,制约着杂交水稻的推广应用。
若在杂交制种过程中使用雌性不育系作父本，雌性不育父本可以授粉雄性不育系(母本)产生杂交种子，而雌性不育系(父本)自身不能结实，不会产生自交种子而影响杂交种子纯度，所以无需在授粉后清除。因此在生产上可以将雄性不育系(母本)与雌性不育系(父本)混播，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉；授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。因此，二系三系需分行间作，授粉后父本需要割除，耗费大量人力成本的问题，通过本技术可以得到克服。
发明简述
本发明提供了一种繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法，所述方法包括：
(a)提供第一植株，所述第一植株的调控雌性器官发育的基因发生纯合隐性突变，所述植株表现为雌性不育；
(b)向第一植株中引入外源构建体，形成第二植株，所述外源构建体包含：
i)第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的正常雌性器官发育；
ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；
iii)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体；以及
(c)第二植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性核雌性不育的第一植株，另一半为含有外源构建体的第二植株。
在本发明中，上述繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法中所提到的第一核苷酸序列可以为OsFMS2或OsFMS1。更优化的，所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物雌性器官中表达。
上述繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法中所提到的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、PA的核苷酸序列构成的组。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。具体地，所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。
上述繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法中所提到的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因构成的组之一。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在种子或胚乳中特异表达的启动子。
本发明还提供了一种从雌性不育植株产生种子的方法，所述方法包括：
(a)提供第一植株，所述第一植株的调控雌性器官发育的基因发生纯合隐性突变，所述植株表现为雌性不育；
(b)向第一植株中引入外源构建体，形成第二植株，所述外源构建体包含：
i)第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的雌性生育力；
ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；
iii)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体；以及
(c)第二植株自花授粉，产生含有或不含所述外源构建体的种子。
如上所述的从雌性不育植株产生种子的方法，其中所述的第一核苷酸序列为OsFMS2或OsFMS1。其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物胚珠、心皮或其他雌性器官中表达。
如上所述的从雌性不育植株产生种子的方法，其中所述的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、PA的核苷酸序列构成的组。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。更具体的，所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。
如上所述的从雌性不育植株产生种子的方法，其中所述的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因构成的组。所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在种子或胚乳中特异表达的启动子。
本发明还提供了一种构建体，其特征在于所述构建体包含：
i)第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的雌性生育力；
ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；和
iii)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体。
在本发明中，上述构建体中所包含的第一核苷酸序列为OsFMS2或OsFMS1。所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物胚珠、心皮或其他雌性器官中表达。
在本发明中，上述构建体所包含的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶的核苷酸序列构成的组。所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。更具体的，所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。
在本发明中，上述构建体所包含的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性 基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因构成的组。其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在种子或胚乳中特异表达的启动子。
本发明还提供了一种利用隐性核雌性不育系的杂交制种方法，所述方法包括将隐性核雌性不育植株与雄性不育植株混播，以制备杂交种，其特征在于所述隐性核雌性不育植株含有如SEQ ID NO:5、19或23所示的核苷酸序列。
本发明还提供了一种核苷酸序列，其特征在于所述核苷酸序列如SEQ ID NO:5、19或23所示，这类序列突变会导致植物雌性不育。
附图说明
图1是雌性不育突变体材料osfms2。
图2是osfms2突变体和野生型黄华占小花形态。
图3是osfms2突变体和野生型黄华占花药形态。
图4是osfms2突变体和野生型黄华占花粉I2-KI染色分析。
图5是osfms2突变体和野生型黄华占雌性器官形态比较。
图6是野生型黄华占和osfms2突变体中OsFMS2基因cDNA序列比对，多态性位点用粗体标出。
图7是野生型黄华占和日本晴中OsFMS2基因cDNA序列比对，位点多态性用红色粗体显示。
图8是野生型黄华占和日本晴中OsFMS2基因氨基酸序列比对，多态性用红色粗体表示。
图9是外源构建体pFMS2的载体图。
图10是携带图9中外源构建体的荧光种子和不携带外源构建体的非荧光种子表现为1:1分离。
图11是osfms1突变体与野生型抽穗期表型，左侧为野生型；右侧为突变体，叶片倒挂。
图12是osfms1突变体与野生型穗子表型，左侧为野生型；中间为杂合子；右侧为突变体。
图13是野生型与osfms1突变体中OsFMS1的基因序列比对。
图14是野生型与osfms1突变体中OsFMS1的氨基酸序列比对。
图15是外源构建体pFMS1的载体图。
图16是携带图15中外源构建体的荧光种子和不携带外源构建体的非荧光种子表现为1:1分离。
图17是雌性不育系的繁殖方法流程图。
发明详述
本文提到的所有参考文献都通过引用并入本文。
除非有相反指明，本文所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。除非有相反指明，本文所使用的或提到的技术是本领域普通技术人员公知的标准技术。材料、方法和例子仅作阐述用，而非加以限制。
术语“第一”、“第二”仅用于描述目的，而不能理解为指示或暗示相对重要性或者隐含指明所指示的技术特征的数量。由此，限定有“第一”、“第二”的特征可以明示或者隐含地包括一个或者更多个该特征。在本发明的描述中，“多个”的含义是两个或两个以上，除非另有明确具体的限定。
本发明旨在提出一种能够有效的繁殖隐性水稻核雌性不育系的方法，和充分利用水稻种质资源开展杂交育种、降低杂交制种成本的手段。
本发明提供了一种保持雌性不育系纯合隐性等位状态的繁殖方法，所述方法以纯合隐性核雌性不育突变体为转化受体材料，转入3个目标基因，分别是突变后会导致植株雌性不育的雌性育性基因、花粉失活基因和筛选基因。其中，雌性育性基因可使雌性不育的转化受体材料恢复育性，花粉失活基因可使含有转化的外源构建体的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作雌性不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地、稳定地生产雌性不育系和雌性不育保持系。
在本发明中，所述雌性育性基因主要在雌性器官表达。更具体的，在水稻植株中，所述雌性育性基因包括但不限于OsFMS2和OsFMS1。本发明还提供了一种获得雌性不育系材料的方法，所述方法包括对上述雌性育性基因及其他调控雌性器官发育的基因，通过突变的技术手段获得雌性不育突变体材料，进而通过本发明中所公开的方法将其应用于杂交制种。所述“突变”包括但不限于以下方法，如用物理或化学的方法导致的基因突变，化学方法包括用EMS等诱变剂处理所导致的诱变，所述突变还可以是点突变，也可以是DNA缺失或 插入突变，还可以是通过RNAi、基因定点突变等基因沉默手段产生，所述基因定点突变的方法包括但不限于ZFN定点突变方法、TALEN定点突变方法或CRISPR/Cas9等定点突变方法。
在本发明中，所述花粉失活基因可以干扰花粉(雄配子)的形成或功能，更具体的包括但不限于可编码促使碳水化合物降解的酶或修饰酶、淀粉酶、脱支酶和果胶酶，更具体的如玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶(DNA(Adenosine-N6)methyltransferase)、亲和素，还可以是显性的雄性不育基因，或者可选自原核调控系统等。举例而言，Mariani,et al.,Nature Vol.347；pp.737；(1990)表明，Aspergillus oryzae RNase-T1或Bacillus amyloliquefaciens的RNase(被命名为“barnase”)在绒毡层中的表达诱导了绒毡层细胞的破裂，导致雄性不育。Quaas,et al.,Eur.J.Biochem.Vol.173:pp.617(1988)描述了RNase-T1的化学合成，而barnase基因的核苷酸序列由Hartley,J.Molec.Biol.；Vol.202:pp.913(1988)公开。Agrobacterium rhizogenes的rolB基因编码通过从吲哚酚-β-甙释放游离吲哚从而干扰茁长素代谢的酶。Estruch,et al.,EMBO J.Vol.11:pp.3125(1991)和Spena,et al.,Theor.Appl.Genet.；Vol.84:pp.520(1992)表明，烟草中rolB基因的花粉囊-特异性表达产生了花粉囊枯萎的植株，其中，花粉的产生大大减少，rolB基因是可用于控制花粉产生的基因的例子。Slightom,et al.,J.Biol.Chem.Vol.261:pp.108(1985)公开了rolB基因的核苷酸序列。编码白喉毒素基因的DNA分子可从American Type Culture Collection(Rockville,MD),ATCC No.39359或ATCC No.67011获得，关于例子和使用方法，见Fabijanski,et al.,E.P.Appl.No.90902754.2,“Molecular Methods of Hybrid Seed Production”。DAM甲基化酶基因用于在美国专利No.5,689,049和PCT/US95/15229Cigan,A.M.and Albertsen,M.C.,“Reversible Nuclear Genetic System for Male Sterility in Transgenic Plants.”讨论的方法中导致不育。还见Albertsen et al的美国专利No.5,962,769“Induction of Male Sterility in Plants by Expression of High Levels of Avidin”对亲和素基因导致不育的讨论。
本发明所述的雌性不育系的繁殖方法中还可包含筛选基因，用于筛选经转化的细胞或组织。所述筛选基因包括赋予抗生素抗性或对除草剂抗性的基因，合适的筛选标记基因包括但不限于:氯霉素抗性基因，潮霉素抗性基因，链霉素抗性基因，奇霉素抗性基因，磺胺类抗性基因，草甘磷抗性基因，草丁膦抗性基因。所述筛选基因还可以是荧光筛选基因，包括但不限于红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿 色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因。
更具体地，根据本发明的一个实施例，可以以水稻核隐性雌性不育osfms2突变体为转化受体材料，将紧密连锁的3个目标基因转化至该不育系：其中，雌性育性基因OsFMS2可使转化受体材料育性恢复；花粉失活基因PA可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力；荧光色选基因RFP用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子用作雌性不育系(父本)生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地稳定地生产雌性不育系和雌性不育保持系。该技术可生产大量雌性不育材料(父本)，杂交制种时可实现父母本混播，解决了水稻杂交制种过程中分行种植问题，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉过程中的劳动力投入；同时，授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。
本发明还提出了一种构建体，根据本发明的实施例，该构建体包括：第一表达盒，所述第一表达盒含有第一核酸分子，所述第一核酸分子为雌性育性基因；第二表达盒，所述第二表达盒含有第二核酸分子，所述第二核酸分子编码花粉失活蛋白。利用该构建体，能够有效地将水稻雌性育性基因和花粉失活基因引入到纯合隐性核雌性不育水稻突变体植株中，从而得到携带外源基因的可育株作为保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产不育系和保持系，另外，不携带外源基因的植株可以用作杂交的父本，由此，可以有效地用于水稻杂交,得到的杂交种也为非转基因。进一步的，上述构建体还可包括第三表达盒，所述第三表达盒含有第三核酸分子，所述第三核酸分子为筛选标记基因。利用该构建体，能够有效地将含有转基因的种子与不含有转基因的种子分开，非转基因种子用作雌性不育系生产杂交种，转基因种子用作保持系来源源不断地生产不育系。
在一种阐释性的实施方式中，上述保持雌性不育植株纯合隐性状态的繁殖方法中，还可进一步的包括以下核苷酸序列：可选的第四核苷酸序列，其与第一核酸分子可操作地相连，偏好于在植物雌性器官中表达，其中第一核酸分子(又称第一核苷酸序列)为雌性育性基因，具有恢复雌性不育系雌性育性的功能；可选的第五核苷酸序列，指导偏好于雄性配子的表达，其与第二核酸分子(又称第二核苷酸序列)可操作地相连，所述第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组，其中第二核酸分子为花粉失活蛋白，能抑制可育雄性配子的形成或功能；可选的第六核苷酸序列，其与第三核酸分子(又称第三核苷酸序列，为筛选标记基因)可操作地相连，偏好于在种子或胚乳中特异表达的功能，具体的所述第六核苷酸序列可以是END2、 LTP2等启动子。
由此，可以通过常规技术，例如农杆菌介导法，将前述构建体引入到植物的细胞、组织或器官中，以便得到可以后续用于研究、杂交的样本。因而，本发明还提出了一种水稻细胞、组织或器官。根据本发明的实施例，该细胞、组织或器官中含有前面所述的构建体。
本发明还提出了一种新的育种方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到第一水稻纯合隐性雌性不育植株中，以便获得携带外源基因的第二水稻植株，所述第二水稻植株能够产生可育的雌性配子，因此能够进行自体受精，可以得到携带外源基因的种子和不携带外源基因的种子，两者各占50％。其中，携带外源基因的种子可以作为水稻雌性不育保持系，从而可以方便地通过自交源源不断地生产雌性不育系和保持系；另外，不携带外源基因的植株(雌性不育)可以用作杂交亲本中的父本，为雄性不育系提供花粉。由此，可以有效地实现水稻杂交。
在本发明的第四方面，本发明提出了一种恢复水稻雌性不育植株育性的方法。根据本发明的实施例，该方法包括：将前面所述的构建体引入到水稻纯合隐性雌性不育植株中。
在本发明的第五方面，本发明提出了一种制备水稻种子的方法。根据本发明的实施例，该方法包括以下步骤：将前面所述的构建体引入到水稻植株中；以及将所述水稻植株自体受精，以获得含有前面所述的构建体的种子。
在本发明的第六方面，本发明还提供了一种水稻雌性不育突变osfms2。与野生型相比，所述突变体植株生长发育正常，同期开花。外稃和内稃大小、形态、开张尺寸、开张时间与野生型没有差别。突变体花药与野生型一致，呈黄色，花药能正常开裂，花粉散粉正常，进一步用I2-KI溶液对突变体的花粉进行染色检测，发现突变体与野生型的花粉染色正常。突变体的雌器官(包括子房，花柱，柱头)与野生型的雌器官在外观下无明显区别。突变体基因克隆分析以及与野生型基因组序列比对显示该突变体的第12号染色体上的LOC_Os12g10540等位基因发生突变。在野生型黄华占中该基因OsFMS2的编码区全长为813bp,其核苷酸序列SEQ ID NO:1所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示，共含270个氨基酸。而在该雌性不育突变体中，该基因OsFMS2编码区的第52位的碱基由C突变为T，导致相应密码子由CAG变为终止密码子TAG，导致基因提前终止，具体的该突变后的OsFMS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示。在日本晴中，所述OsFMS2的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示，其氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
本发明的附加方面和优点将在下面的描述中部分给出，部分将从下面的描述中变得明 显，或通过本发明的实践了解到。
具体实施方式
下述实施例中所用方法如无特别说明均为常规方法，所用引物均由上海英骏生物技术公司合成，测序由北京三博远志生物技术有限责任公司完成，PCR试剂盒、载体构建过程中的核酸内切酶购自宝生物工程有限公司，pEASY-Blunt-simple cloning kit购自北京全式金生物技术公司，T4DNA连接酶购自NEB公司，方法均参照试剂盒提供的方法进行。实验中所用的载体pCAMBIA2300来自于CAMBIA公司。
实施例1、雌性不育系的繁殖及杂交制种技术
该技术的核心思想是：以核隐性雌性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中，其中，雌性育性基因可使转化受体的雌性育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子即为雌性不育系，而转基因种子用作保持系。通过保持系自交结实，由此繁殖雌性不育系和保持系。在杂交制种过程中，雌性不育系授粉雄性不育系产生杂交种子，而雌性不育系自身不能结实，不会产生自交种子而影响杂交种子纯度，所以无需在授粉后清除。因此在生产上可以将雌性与雄性不育系混播，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉；授粉后无需清除父本植株，减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。所述雌性不育系的繁殖方法如图17所示，雌性不育系可与雄性不育系混播，进行杂交制种。
实施例2、水稻雌性不育突变体及基因在育种中的应用
水稻雌性突变体材料及突变后会导致植株雌性不育的雌性育性基因可以用于新一代杂交育种技术，该技术的核心思想是：以水稻核隐性雌性不育突变体为转化受体材料，通过将紧密连锁的3个目标基因转化至不育突变体中，其中，育性基因可使转化受体育性恢复，花粉失活基因可使含有外源基因的花粉失活，即失去授精能力，筛选基因可以用于转基因种子和非转基因种子的分拣，分拣出的非转基因种子即为雌性不育系，而转基因种子用作保持系。通过保持系自交结实，由此繁殖雌性不育系和保持系。在杂交制种过程中，雌性不育系授粉雄性不育系产生杂交种子，而雌性不育系自身不能结实，不会产生自交种子而影响杂交种子纯度，所以无需在授粉后清除。因此在生产上可以与雌性不育系混播，提高自然条件下的异花授粉效率(即杂交种制种效率)，减少赶粉；授粉后无需清除父本植株， 减少制种过程中的劳动力投入，有利于机械化制种。
实施例3、水稻雌性不育突变体(osfms2)筛选
该突变体的获得是通过EMS诱变籼稻黄华占种子(M0)，EMS诱变浓度是0.7％，诱变时间为20小时,来自M0代种子植株结实后混收，获得突变体库(M1)。来自M1代种子的植株在种子成熟期用于筛选，获得不育株。不育株割稻桩再生，再生株在生殖期用I2-KI染色检测花粉发育和染色反应。其中一个突变体表现为花粉可育，但植株自交完全不育。以突变体为母本,用野生型花粉授粉仍然不育,以突变体为父本授粉野生型植株，可以获得种子，说明不育是由雌性不育引起并能稳定遗传。判断该突变体为雌性不育突变体(female-sterility mutant)，命名为osfms2。
实施例4、水稻雌性不育突变体(osfms2)遗传分析
osfms2雌性突变体不育株作父本与野生型黄华占杂交，36株杂交F1材料全部表现为可育。再将F1代进行自交单株收种，种植的247株F2代植株中，65株表现为雌性不育，182棵植株表型为完全可育，不育与可育植株的分离比接近1:3，显示该突变是由隐性核基因控制。
实施例5、水稻雌性不育突变体(osfms2)育性稳定性分析
为了确定osfms2突变体育性是否受环境光照温度等条件影响，不育株与野生型黄华占杂交F1代自交产生的F2代植株在深圳、三亚、湖南、北京种植，进一步观察植株育性和表型分离比。在所有区域，不育株：可育株均表现为1:3分离比(表1)，割稻桩再生的不育株仍表现为完全不育，说明该突变体不育表型不受地理纬度、环境和季节等环境因素的影响，
表1：水稻雌性不育突变体(osfms2)杂交F2代分离比
  可育株数 不育株数 χ<sup>2</sup>(3:1)
深圳 107 37 0.037
三亚 127 40 0.098
湖南 98 29 0.318
北京 147 51 0.061
实施例6、水稻雌性不育突变体(osfms2)生殖器官表型分析
与野生型相比，突变体植株生长发育正常(图1)，同期开花。外稃和内稃大小、形态、开张尺寸、开张时间与野生型没有差别(图2)。突变体花药与野生型一致，呈黄色(图3)，花药能正常开裂，花粉散粉正常，进一步用I2-KI溶液对突变体的花粉进行染色检测，结果如图4所示，突变体与野生型的花粉染色正常。突变体的雌器官(包括子房，花柱，柱头)与野生型的雌器官在外观下无明显区别(图5)。
实施例7、水稻雌性不育突变体(osfms2)基因的克隆
突变体基因克隆采取MutMap方法，即利用突变体与原野生亲本杂交构建F2群体，通过重测序进行基因定位的方法。将不育株作父本与野生型黄华占杂交获得F1，种植F1，单株收集F2种子分株系种植，从分离比符合3:1的F2株系群体中选取30棵F2代不育植株，取叶片提取基因组DNA，等量混合后用于高通量基因组测序，共获得21Gb基因组序列数据(PE101)，相当于50x水稻基因组。
得到F2代不育株原始测序数据后，过滤掉低质量(含N≥5)的序列，然后采用SOAP2将序列比对到日本晴参考基因组上，比对率为74.87％，覆盖整个基因组88％。比对之后，采用soapsnp寻找不育株与参考基因组之间存在的SNP。同样的，将野生型黄华占重测序数据比对到日本晴参考基因组上并寻找两者之间的SNP之后，通过计算野生型黄华占在每个SNP位点处主要基因型的频率，选取cutoff≥0.8(覆盖深度≥5)，从而得到每个SNP位点处比较可靠的野生型黄华占的基因型。之后，针对不育株与野生型黄华占之间的所有SNP位点，计算不育株在这些位点的主要基因型频率和欧氏距离(ED值)，频率≥0.8，ED值越高的作为可能与突变性状相关的区域，通过查询日本晴参考基因组注释信息，寻找位于UTR(基因上游2.5kbp作为5’-UTR，下游1.5kbp作为3’-UTR)，exon或剪切位点附近并能影响到所在基因功能的SNP位点作为候选的可能与突变性状相关的突变位点，其所在基因作为候选突变基因。
与野生型黄华占基因组序列比较显示突变基因是位于第12染色体上的LOC_Os12g10540等位基因。在野生型黄华占中该基因OsFMS2的编码区全长813bp,其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示，它所编码的蛋白含270个氨基酸，其氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。在不育突变体中，该基因编码区的第52位点由C突变为T，相应密码子为CAG变为终止密码子TAG，导致基因提前终止(图6)，其突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示，突变后的核苷酸序列与野生型序列的比对结果如图6所示，下划线标示的碱基为突变位点处的碱基。。
采用SNP(Single Nucleotide Polymorphism,单核苷酸多态性)研究工具HRM(High Resolution Melt，即高分辨率熔解)分析，一共分析了280个F2植株，进一步验证所有的雌性不育突变体植株均携带纯合突变型位点，而可育植株携带纯合野生型或杂合型位点。该位点为纯合野生型的植株自交后代全部可育，该位点为杂合型的植株自交后代表现不育：可育为68:212，符合1:3分离。
该基因OsFMS2的编码区在粳稻日本晴和野生型黄华占之间存在核苷酸序列多态性，其核苷酸比对结果如图7所示，从图中可以看出共有5个碱基不同,其氨基酸序列的比对结果如图8所示。其中第81位、643位和765位的碱基差异并没有引起氨基酸的变化，而在第415位日本晴为T，黄华占为G,相应的日本晴在该处为丝氨酸，黄华占为丙氨酸；第781位日本晴为G，黄华占为A，相应的日本晴在该处为丙氨酸，黄华占为苏氨酸；进一步分析，该基因在籼稻品种9311和野生型黄华占之间没有多态性。在日本晴中该基因OsFMS2的编码区序列如SEQ ID NO:3所示，所编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。
实施例8、osfms2突变体植株与其它水稻的杂交分析
黄华占osfms2突变体植株能够与生产中常用的品种(包括不育系)杂交，产生可育种子。部分组合的杂交种子显示出明显的杂种优势，说明该黄华占突变体在杂交育种中有一定的应用价值，可以作为培育恢复系的亲本材料。
实施例9、OsFMS2基因及其突变体在育种中的应用
根据实施例1所述原理，发明人采用水稻OsFMS2基因构建了表达载体pFMS2。在构建水稻的植物表达载体之前，发明人首先分别对表达载体内的PA、OsFMS2和RFP三个表达盒单独进行了水稻转化，并进一步对各个表达盒的功能进行了验证。结果表明各个表达盒单独转化水稻时，都能够工作良好，达到预期的设计效果。
进一步发明人构建了以下水稻表达载体：通过装配PA、OsFMS2和RFP表达框各个元件，来构建如图9所示的pFMS2载体，该载体含有3个表达框。分别为，雌性育性基因表达框，启动子、终止子均为育性基因OsFMS2内源的相应调控序列；花粉致死表达框，花粉致死基因为PA,启动子为PG47，终止子为IN2-1，其中在PA基因前面还有一个导肽序列ZM-BT1，用于将PA蛋白靶向淀粉体；筛选基因表达框，筛选基因为RFP基因，启动子为Ltp2，终止子为PinII，其中，启动子Ltp2前面还有一个35S增强子序列。
进一步,发明人通过装配下述DNA元件，构建了图9所示的pFMS2载体：
1)以pCAMBIA2300载体为基础；
2)RFP基因表达盒：RFP基因(SEQ ID NO：6)的开放读码框连接于LTP2启动子(SEQ  ID NO：7)和PINII终止子(SEQ ID NO：9)之间，在LTP2启动子的上游还连有一个35S增强子序列(SEQ ID NO:8),重组成RFP的基因表达盒(LTP2：RFP：PINII)；
3)OsFMS2基因表达盒：目标基因OsFMS2及其启动子和终止子的全长核苷酸序列如SEQ ID NO：10所示，其中OsFMS2基因的启动子序列如SEQ ID NO：11所示，其终止子序列如SEQ ID NO：12所示，其核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；
4)PA基因表达盒：PG47，ZM-BT1，PA，IN2-1，目标基因PA(其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示)的开放读码框连接于启动子PG47(其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示)、转运肽ZM-BT1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)的下游，终止子IN2-1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示)的上游。
水稻转化
利用电激法将质粒pFMS2转入农杆菌Agl0菌株，利用农杆菌介导法对OsFMS2隐性纯合突变的osfms2水稻进行遗传转化，得到26株单拷贝转基因植株材料。具体的转化受体材料品种为水稻黄华占。
转基因水稻植株的花粉育性检测
对上述所得到的26株单拷贝转基因水稻(OsFMS2位点隐性纯合突变)植株进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有明显的形态差异，但是花粉育性明显不同。对pFMS2构建体转化水稻得到的转基因植株材料，进行花粉可染率检测，同时对野生型水稻进行花粉可染率检测。采用的方法为：在水稻开花期，从转基因水稻植株、及其野生型对照植株各随机抽取多个单株，各株取一朵花，每朵花取1个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1％的I2-KI溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数，可以着色为深蓝色的为可育花粉，而不能够着色的为败育花粉。分析转基因水稻植株的花粉可染率。结果显示野生型对照植株的可着色的花粉占98％～100％；而多个随机抽取的转基因植株中，正常花粉(可着色)与败育花粉(不能着色)比例接近1:1，表明所构建的转基因株系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，即构建体pFMS2使转基因株系花粉的50％失活。该结果表明本发明所提供的载体能够达到预期的花粉失活功能。
转基因水稻植株的荧光种子与非荧光种子分离分析
对上述实施例所得到的26株单拷贝转基因水稻植株(OsFMS2位点隐性纯合突变)所结T1代种子进行荧光分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比(图10)，即携带外源基因的荧光种子和不携带外源基因的非荧光种子表现为1:1分离，表明本发明所提供 的载体各元件作为整体表现良好，达到预期的目的。
实施例9、OsFMS1基因及其突变体在育种中的应用
除上述的OsFMS2基因外，另一个控制水稻雌性育性的基因OsFMS1(LOC_Os03g11600)也已经克隆完成。osfms1突变体雄蕊生长发育完全正常,而雌蕊外形除了比野生型稍小并无显著差异,进一步细胞学观察,可能是珠被发育异常增生。该突变体自交完全不育,以突变体为母本,用野生型花粉授粉仍然不育,而且该不育表型不受地理纬度、环境和季节的影响,说明不育是由雌性不育引起并能稳定遗传。从分蘖后期开始,该突变体的上位叶片(包括剑叶),主叶脉发育不全或大部分退化,导致叶片发生倒挂(图11),隐性突变材料穗子完全不育(图12)，而且该叶片倒挂表型和雌性不育表型完全连锁。
该突变体作为父本与野生型杂交，20株F1代全部可育，F1代自交单株收种，种植的1200株F2代植株中，312株表现为雌性不育，888棵植株表型为完全可育，不育与可育植株的分离比接近1:3，显示该突变是由隐性核基因控制。变体基因克隆分析以及与野生型基因组序列比对显示该突变体第3染色体上的LOC_Os03g11600等位基因发生突变。该基因的编码区全长为591bp,其核苷酸序列如SEQ ID NO:17所示，其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:18所示，共含196个氨基酸。而在该雌性不育突变体中，该基因编码区的第83位的碱基由T突变为C，导致相应密码子由GTC变为GCC，导致编码的氨基酸由缬氨酸变为丙氨酸，该基因突变后的核苷酸序列如SEQ ID NO:19所示。OsFMS1基因的野生型核苷酸序列与突变体的核苷酸序列的比对结果如图13所示，氨基酸序列的比对结果如图14所示。
该雌性不育突变体雌性完全不育,其雄性可育且育性稳定,又表现为隐性遗传,通过配种繁育,并将雌性不育特性用在杂交水稻制种上,可实现杂交水稻种子的机械化生产制备。同时，突变体在表现雌性不育的同时,中上部叶片在叶环处弯曲倒挂,这种上层叶片自然弯下又表现为隐性遗传的性状,转到杂交稻亲本上,就可减少制、繁种时传粉的阻挡,提高制种产量,并降低劳动成本。因此,该基因同样具有在杂交水稻中的应用前景。
与pFMS2相同，发明人采用水稻OsFMS1基因构建了表达载体pFMS1,pFMS1表达载体也包含了OsFMS1基因、PA和RFP三个表达盒，通过装配PA、OsFMS1和RFP表达框各个元件，来构建图15所示的pFMS1载体，该载体含有3个表达框。
1)以pCAMBIA2300载体为基础；
2)RFP基因表达盒：RFP基因(SEQ ID NO：6)的开放读码框连接于LTP2启动子(SEQ ID NO：7)和PINII终止子(SEQ ID NO：9)之间，其中LTP2启动子的上游还连有一个35s增强子序列(SEQ ID NO:8),重组成RFP的基因表达盒(LTP2：RFP：PINII)；
3)OsFMS1基因表达盒：目标基因OsFMS1及其启动子和终止子的全长核苷酸序列如SEQ ID NO：20所示，其中OsFMS1基因的启动子序列如SEQ ID NO：21所示，其终止子序列如SEQ ID NO：22所示，其核苷酸序列编码的蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO：18所示；
4)PA基因表达盒：PG47，ZM-BT1，PA，IN2-1，目标基因PA(其核苷酸序列如SEQ ID NO：13所示)的开放读码框连接于启动子PG47(其核苷酸序列如SEQ ID NO：14所示)、转运肽ZM-BT1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：15所示)的下游，终止子IN2-1(其核苷酸序列如SEQ ID NO：16所示)的上游。
水稻转化
利用电激法将质粒pFMS1转入农杆菌Agl0菌株，利用农杆菌介导法对隐性纯合的osfms1水稻突变材料进行遗传转化，得到19株单拷贝转基因植株材料。
转基因水稻植株的花粉育性检测
对上述所得到的19株单拷贝转基因水稻(OsFMS1位点隐性纯合突变)植株进行分析发现，转基因植株和非转基因对照植株之间没有明显的形态差异，但是花粉育性明显不同。对pFMS1构建体转化水稻得到的转基因植株材料，进行花粉可染率检测，同时对野生型水稻进行花粉可染率检测。采用的方法为：在水稻开花期，从转基因水稻植株、及其野生型对照植株各随机抽取多个单株，各株取一朵花，每朵花取1个花药，置于载玻片中央，滴加一滴1％的I2-KI溶液，用镊子和解剖针释放花粉后，盖上盖玻片，在显微镜下观察、计数可染色花粉数和花粉总数，可以着色为深蓝色的为可育花粉，而不能够着色的为败育花粉。分析转基因水稻植株的花粉可染率。结果显示野生型对照植株的可着色的花粉占98％～100％；而多个随机抽取的转基因植株中，正常花粉(可着色)与败育花粉(不能着色)比例接近1:1，表明所构建的转基因株系可以产生等量的携带外源基因的花粉和不携带外源基因的花粉，即构建体pFMS1使转基因株系花粉的50％失活。该结果表明本发明所提供的载体能够达到预期的花粉失活功能。
转基因水稻植株的荧光种子与非荧光种子分离分析
对上述实施例所得到的19株单拷贝转基因水稻植株(OsFMS1位点隐性纯合突变)所结T1代种子进行荧光分离比例调查，结果表明这些种子均显示1:1分离比(图16)，即携带外源基因的荧光种子和不携带外源基因的非荧光种子表现为1:1分离，表明本发明所提供的载体各元件作为整体表现良好，达到预期的目的。
实施例10、其它水稻雌性育性基因
除了以上克隆的两个水稻雌性育性基因外，对其他调控雌性器官发育的基因，我们可通过诱变筛选或CRISPR/Cas等定点突变的技术手段获得雌性不育突变体，进而通过本专利中的方法将其用于水稻杂交制种。
例如，利用诱变筛选，发明人还获得了OsFMS2的另外一个突变体植株，其中在OsFMS2的第3外显子与第4外显子之间的内含子上，剪切识别位点“GT—AG”突变为“AT--AG”，突变后的基因组DNA序列为SEQ ID NO：23，同样获得了雌性不育突变株，可利用本专利中的方法将其用于水稻杂交制种。

Claims (8)

  1. 一种繁殖纯合隐性核雌性不育系的方法，所述方法包括：
    (a)提供第一植株，所述第一植株的调控雌性器官发育的基因发生纯合隐性突变，所述植株表现为雌性不育；
    (b)向第一植株中引入外源构建体，形成第二植株，所述外源构建体包含：
    i)第一核苷酸序列，其包含突变后会导致植株雌性不育的基因的核苷酸序列，当在第一植株中表达时其将恢复所述植株的雌性生育力；
    ii)第二核苷酸序列，当其表达时，会抑制所述第二植株中可育雄性配子的形成或功能；
    iii)第三核苷酸序列，当其表达时，可区分植株中是否含有引入的构建体；以及
    (c)第二植株自花授粉，产生的后代中，一半为不含外源构建体的纯合隐性核雌性不育的第一植株，另一半为含有外源构建体的第二植株。
  2. 如权利要求1所述的方法，其中所述的第一核苷酸序列为OsFMS2或OsFMS1。
  3. 如权利要求2所述的方法，其中所述的第一核苷酸序列与第四核苷酸序列可操作的相连，所述第四核苷酸序列偏好于在植物雌性器官中表达。
  4. 如权利要求1所述的方法，其中所述的第二核苷酸序列选自玉米a淀粉酶基因、生长素(auxin),rot B、细胞毒素基因、白喉毒素、DAM甲基化酶、PA的核苷酸序列构成的组。
  5. 如权利要求4所述的方法，其中所述的第二核苷酸序列与第五核苷酸序列可操作的相连，所述第五核苷酸序列偏好于在雄性配子中表达。
  6. 如权利要求5所述的方法，其中所述的第五核苷酸序列选自聚半乳糖醛酸酶47基因、Zm13基因、果胶甲基酯酶基因、钙调蛋白结合蛋白基因、肌动蛋白解聚因子基因、prolfilin基因和硫酸化五肽phytosulphokine基因的调控区域构成的组。
  7. 如权利要求1所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列选自氯霉素抗性基因、潮霉素抗性基因、链霉素抗性基因、奇霉素抗性基因、磺胺类抗性基因、草甘膦抗性基因、草丁膦抗性基因、红色荧光基因、青色荧光蛋白基因、黄色荧光蛋白基因、荧光素酶基因、绿色荧光蛋白基因、花青苷p1或蓝色荧光蛋白等基因构成的组。
  8. 如权利要求7所述的方法，其中所述的第三核苷酸序列与第六核苷酸序列可操作的相连，所述第六核苷酸序列为END2或LTP2等在种子或胚乳中特异表达的启动子。
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