CN112575001A

CN112575001A - GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间以及提高大豆产量中的应用

Info

Publication number: CN112575001A
Application number: CN201910930856.1A
Authority: CN
Inventors: 孔凡江; 刘宝辉; 程群; 董利东; 芦思佳
Original assignee: Guangzhou University
Current assignee: Guangzhou University
Priority date: 2019-09-29
Filing date: 2019-09-29
Publication date: 2021-03-30
Anticipated expiration: 2039-09-29
Also published as: CN112575001B

Abstract

本发明公开了一种GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间以及提高大豆产量中的应用。本发明利用CRISPR/CAS9技术获得GmLCL3大豆突变体植株，发现在大豆中GmLCL3基因发生突变后可以延长大豆生育期，抑制植物开花且大豆产量提高。因此可通过构建GmLCL3大豆突变体植株的方式，改变大豆对光周期的敏感性，延迟大豆开花，延长大豆生育期，提高大豆的产量。本发明的发现对进一步揭示光周期调控大豆开花的分子机理具有非常重要的学术价值，为促进大豆高产优质品种选育提供理论依据和遗传资源。

Description

GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间以及提高大豆产量中的应用

技术领域

本发明涉及基因领域，特别涉及一种GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间以及提高大豆产量中的应用。

背景技术

大豆(Glycine max)是世界上最主要的经济和油料作物之一，是人类植物油和植物蛋白的主要来源。大豆的营养价值非常高，例如，大豆中含有独特的优质蛋白，具有明显的抑制血压上升的作用。大豆中的不饱和脂肪酸的含量很高，能够促进胆固醇代谢，降低体内胆固醇含量。大豆中还含有丰富的维生素、钙质及人体所需的微量元素，对提高人体免疫力，增加神经机能和活力具有一定的作用(张海生，2012)。近年来，随着人们对大豆的营养保健功能认识的越来越深入，对大豆的利用程度也不断加深，我国对大豆产品的消费需求不断增加，现已经成为全球最大的大豆进口国，但目前我国大豆产业面临严峻的挑战，因此提高大豆产量是大豆育种的主要目标。

在自然界中，开花期和生育期是影响作物产量的重要因素。大豆是典型的短日照作物，对光周期反应敏感，光周期调控大豆开花不仅影响大豆的种植适应性，而且决定着大豆的产量。在拟南芥中，LHY(LATE ELONGATED HYPOCOTYL)和CCA1(CIRCADIAN CLOCKASSOCIATED 1)作为生物钟系统中央震荡器重要组成成分，功能冗余的调控TOC1(TIMINGOF CAB EXPRESSION 1)和CCGs(CLOCK-CONTROLLED GENES)等基因的表达，参与调控拟南芥的光周期开花途径(Harmer 2000；Alabadi et al.,2002；Pokhilko et al.,2012)。然而在大豆中LHY/CCA1基因是如何参与调控大豆的光周期开花的分子机制却不清晰。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间、提高大豆产量中的应用。

本发明的另一目的在于提供一种GmLCL3基因大豆突变体。

本发明的再一目的在于提供所述GmLCL3基因大豆突变体的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间、提高大豆产量中的应用。

所述的GmLCL3基因为大豆生物钟基因LCL3，可通过RT-PCR技术从大豆品种Harosoy中克隆得到，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

所述的编码GmLCL3基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

所述的GmLCL3基因在调节大豆光周期开花时间、提高大豆产量中的应用，为通过构建GmLCL3基因突变体(基因突变)的方式，改变大豆对光周期的敏感性，延迟大豆开花(在长短日照下均能显著延迟大豆开花)，延长大豆生育期，以及提高大豆的产量。

所述的GmLCL3基因突变体为通过如下任一种或两种方式构建得到：

a、敲除大豆植株GmLCL3基因编码区第84位的碱基A(由于GmLCL3基因编码区第84位缺失一个碱基A，导致蛋白移码突变)；

b、将大豆植株GmLCL3基因编码区第478位的碱基A突变为T(由于氨基酸置换，使氨基酸K突变为终止子)。

所述的GmLCL3基因可通过抑制大豆开花关键基因E1的表达而延迟开花。

一种GmLCL3基因突变体，为GmLCL3基因编码区第84位缺失一个碱基A，和/或GmLCL3基因编码区第478位的碱基A突变为T；所述的GmLCL3基因如SEQ ID NO.2所示。

所述的GmLCL3基因突变体可利用CRISPR/CAS9技术获得。

含有上述GmLCL3基因突变体的表达载体、重组微生物或转基因细胞系。

所述的细胞为植物细胞。

所述的GmLCL3基因突变体在制备转基因植物中的应用。

所述的GmLCL3基因突变体在大豆改良育种、制种中的应用。

所述的GmLCL3基因突变体在调节大豆光周期和开花时间，和/或提高大豆产量中的应用。

一种培育转基因植物的方法，为将上述GmLCL3基因突变体引入目的植物以获得转基因植物，从而改变大豆对光周期的敏感性，延迟大豆开花，延长大豆生育期，以及提高大豆的产量。

所述的植物为各种作物，如蔬菜、水果、花卉，豆科植物等；优选为大豆。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明利用CRISPR/CAS9技术获得纯合GmLCL3大豆突变体植株，发现lcl3突变体在长短日照下，均能显著延迟大豆开花，说明LCL3在大豆开花途径中具有重要的作用。本发明是首次发现在大豆中敲除GmLCL3基因延长大豆生育期，抑制植物开花。由于将GmLCL3基因及其编码的蛋白可以调节花期，因此可将其用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，包括各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的问题以及光周期敏感性问题和引种问题。

(2)大豆生育期特别是开花期对大豆的产量，品质和适应性至关重要，本发明通过解析LCL3在大豆开花过程中的角色和功能，阐明其调控大豆开花的具体分子机制，最终为促进大豆高产优质品种选育提供理论依据和遗传资源。对进一步揭示光周期调控大豆开花的分子机理具有非常重要的学术价值，同时为选育大豆品系分子设计育种提供元件，该研究具有现实的指导意义，其应用前景广阔。

(3)本发明在自然群体中找到LCL3的有效自然变异，该变异导致LCL3编码蛋白提前终止，通过杂交与回交方式获得LCL3的近等基因系，并对近等基因系进行表型观察后，发现lcl3能够显著延迟大豆开花，且产量提高。对进一步选育高产大豆提供非常重要的理论依据和遗传资源。

附图说明

图1是靶点位置信息及突变体植株的编辑方式图；其中，A为靶点位置信息；B为突变体植株的编辑方式。

图2是GmLCL3大豆单突变体植株花期表型图；其中，A为短日照下GmLCL3大豆单突变体植株的表型；B为短日照下大豆GmLCL3单突变体植株开花期统计；C为长日照下大豆GmLCL3单突变体植株开花期统计。

图3是GmLCL3的近等基因系生育期性状图；其中，A为短日照近等基因系表型；B～I分别为花期、株高、分枝数、荚数、单株粒数、平均节间距、单株重量和百粒重统计图。

图4是GmLCL3基因的组织特异性表达情况图。

图5是GmLCL3基因的节律表达图；其中，A为LCL3长日照下的节律表达；B为LCL3短日照下的节律表达；C为LCL3持续光照下的节律表达。

图6是LCL3下游基因鉴定结果图；其中，A为LCL3的DAP-seq数据的韦恩图；B为LCL3结合顺式作用元件在基因上的分布；C为LCL3短日照下RNA-seq和DAP-seq的韦恩图；D为LCL3长日照下RNA-seq和DAP-seq的韦恩图；E为E1启动子上含有LCL3结合顺式作用元件的模式图。

图7是LCL3的靶标基因表达图；其中，A为长日照条件下E1的表达；B为短日照条件下E1的表达；C为EMSA；D为LCL3调控E1的表达模式图；E为LCL3抑制E1的表达。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

实施例1

1、构建大豆lcl3突变体

(1)通过大豆基因组在线查找软件Phytozome(https://phytozome.jgi.doe.gov)找到LCL3全长序列(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示)，根据大豆基因组中GmLCL3基因的外显子序列，利用CRISPRdir ect网站(http://crispr.dbcls.jp/)设计1个靶点引物(上游引物F1:5’-AAGAGAACG ATGGACAGAGG-3’；下游引物R1:5’-AAACCCTCTGTCCATCGTTCTCT-3’)(靶点位置信息及突变体植株编辑方式见图1)，所用寡核苷酸链引物均由睿博测序公司合成。

(2)突变体创制实验所用pYLgRNA载体，是由pUC18载体为骨架改造而成，大小约3kb；Cas9载体pYLCRISPR/Cas9-DB大小约15.5kb，含有一个35S启动子驱动的Bar基因、35S启动子驱动的Cas9基因、终止子、ccdB大肠杆菌致死基因；pYLgRNA载体、pYLCRISPR/Cas9-DB载体以及pYLgRNA-AtU3d/AtU3b/AtU6-1载体(gRNA载体)可参考文献(侯智红等.利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系[J].《作物学报》，2019，6：839-847页)获得。

(3)参照刘耀光研究员提供的实验指南(具体参考文献第842页1.3：侯智红等.利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系[J].《作物学报》，2019，6：839-847页)，利用上述引物F1和R1，进行载体构建，并通过农杆菌EHA101介导大豆子叶节方式，获得Harosoy(可参考文献获得：Lu S,Zhao X,Hu Y,et al.Natural variation at the soybean J locusimproves adaptation to the tropics and enhances yield[J].Nature Genetics,2017,49(5):773-779.)背景下的纯合lcl3单突变体大豆植株(突变方式为在LCL3第84位缺失一个碱基A，导致蛋白移码突变)，具体流程参见文献(侯智红等.利用CRISPR/Cas9技术创制大豆高油酸突变系[J].《作物学报》，2019，6：839-847页)。

LCL3的氨基酸序列如下(SEQ ID NO.1)所示：

MDAYSSGEEVVVKTRKPYTITKQRERWTEEEHNRFLEALKLHGRAWQRIEEHIGTKTAVQIRSHAQKFFTKLEKEALVKGVPIGQALDIDIPPPRPKRKPNNPYPRKTRIGTTSLHSGAKDGKLNLVESSHVNQALDLKKEPLPEKHDLDEGLTTVKENKDENHAKVFTLLQEVPCSSVSSANESSITMSVPLGNPCAFKEITPSVKEVIARDEKTESFVTVEPENGKLEINDGKQTNGTSKDSRLEDSDALHMKLVQNEKPDGLDCELTIDGMQGNQNYPRHVTVHVVDGNLGTNTQNPSQDMLFRDSMFQPIGGVNGQRNVFTNTAPSNTSESQNNTARSSVHQSFLPYPPFTQHNQDDYQSFLHMSSTFSNLIVSTLMQNPAAHAAASFAATFWPYANPETSANSPRCSQGGFTNRQIGSPPSVAAIAAATVAAATAWWAAHGLLPLCAPLHTSFACPASVTTVPSMNTGEAPALKAEQEKTTLQNPPLQDQMLDPEYSEAQQAQHSASKSPAAILSDSESGDAKLNTSSKVTDHETNKTISEHLDSNKTKGRKPVDRSSCGSNTASSSDVETDALEKGEKGKEEPEIPDANQLAIEFSNRRRSVSNLTDSWKEVSEEGRLAFQALFSREVLPQSFSPPHALKNTDHQMDNANDNKQNIDDKDEDLDGSKKCSSNYEAMQKNLLFVENNEGLLTIGLGQGKLKTHRTGFKPYKRCSMEAKENRVGASSNQGEEQGCKRIRLEGETST。

所述的编码LCL3基因的核苷酸序列如下(SEQ ID NO.2)所示：

ATGGACGCATACTCCTCCGGCGAAGAAGTGGTTGTTAAGACTAGAAAACCATATACAATCACTAAGCAAAGGGAACGATGGACAGAGGAGGAGCATAATAGGTTTCTAGAAGCTTTGAAACTACACGGGCGAGCATGGCAGCGCATAGAAGAGCATATAGGAACAAAGACTGCCGTGCAAATAAGGAGTCATGCACAGAAGTTCTTTACAAAGCTGGAGAAAGAGGCCCTTGTAAAGGGTGTTCCAATTGGACAGGCTCTTGATATAGACATTCCCCCTCCACGGCCCAAAAGAAAGCCAAACAATCCTTATCCTCGGAAGACCAGGATTGGTACCACATCATTACATAGTGGAGCAAAGGATGGAAAACTCAATTTAGTTGAATCTTCACATGTTAATCAAGCACTGGACTTGAAAAAAGAACCACTTCCAGAGAAACATGATTTAGACGAAGGGCTAACAACTGTAAAAGAAAATAAGGATGAGAACCACGCAAAAGTATTTACTCTTCTCCAGGAGGTACCCTGTTCCTCTGTATCTTCAGCAAATGAGAGTTCAATAACAATGTCTGTGCCACTGGGAAATCCATGTGCCTTCAAGGAGATTACACCTTCCGTGAAAGAGGTAATAGCACGAGATGAAAAAACTGAATCTTTTGTCACTGTTGAACCTGAAAATGGGAAGTTGGAGATCAATGATGGAAAACAGACTAATGGCACTAGTAAAGACTCCAGGTTAGAGGATTCTGATGCTTTACATATGAAATTGGTTCAAAATGAGAAACCAGATGGTCTTGATTGTGAATTAACAATAGATGGGATGCAAGGCAATCAGAATTACCCTAGGCATGTTACTGTGCACGTTGTTGATGGGAACCTTGGAACAAATACTCAAAATCCATCACAAGATATGTTGTTTCGAGATTCCATGTTTCAGCCAATAGGAGGGGTTAACGGGCAACGAAATGTTTTTACCAATACAGCTCCATCGAACACAAGTGAAAGTCAAAATAACACTGCACGATCTTCTGTTCATCAATCATTTCTTCCTTATCCTCCCTTCACACAACACAACCAAGACGATTACCAATCATTTCTTCACATGTCTTCAACATTTTCAAATCTTATTGTCTCTACCTTGATGCAAAACCCAGCAGCTCATGCTGCTGCAAGTTTCGCTGCTACATTTTGGCCGTATGCAAATCCAGAAACTTCAGCAAATTCTCCTAGGTGCTCCCAAGGAGGTTTTACAAATAGACAAATTGGTTCCCCTCCAAGCGTTGCAGCTATTGCAGCTGCTACTGTAGCAGCTGCAACTGCATGGTGGGCAGCTCATGGATTGCTTCCTTTGTGTGCTCCTCTTCATACTTCTTTTGCCTGTCCTGCATCAGTGACTACAGTTCCATCAATGAATACCGGTGAAGCACCGGCTCTGAAGGCAGAGCAAGAAAAAACTACTCTACAAAATCCTCCTCTTCAAGATCAGATGCTGGATCCAGAATACTCGGAAGCTCAACAAGCTCAACATTCAGCTTCAAAGTCACCAGCTGCCATTTTATCAGATTCTGAGAGTGGAGATGCCAAGTTAAATACTTCATCAAAGGTTACTGATCATGAGACGAACAAAACAATTTCTGAGCACCTTGATTCCAACAAAACAAAGGGAAGAAAACCGGTTGACCGTTCCTCATGTGGTTCCAACACGGCCTCTAGCAGCGATGTGGAAACTGATGCACTAGAGAAGGGTGAGAAAGGGAAGGAAGAGCCTGAAATACCTGATGCTAACCAATTAGCCATTGAGTTTAGTAATCGTCGTAGAAGCGTTAGCAACCTTACTGATTCTTGGAAAGAGGTTTCTGAAGAGGGGAGACTGGCCTTTCAGGCTCTGTTCTCCAGAGAGGTGTTGCCTCAAAGCTTTTCACCTCCTCATGCTTTGAAGAATACGGATCATCAAATGGACAACGCCAATGATAACAAGCAAAACATAGATGACAAAGATGAAGATCTTGACGGCAGCAAGAAATGCAGTTCTAATTATGAAGCGATGCAGAAAAACCTGCTATTTGTAGAAAATAACGAGGGACTGTTAACCATAGGGCTTGGACAAGGAAAGCTTAAGACTCATCGAACAGGTTTTAAACCCTACAAAAGATGTTCCATGGAGGCCAAGGAAAATAGGGTTGGAGCAAGCAGCAATCAAGGTGAAGAGCAAGGTTGTAAGAGAATACGTTTGGAAGGGGAGACTTCGACTTGA。

2、大豆变体植株的表型观察

分别在长短日照(长日照：光照/黑暗 16h/8h；短日照：光照/黑暗 12h/12h)下，将获得LCL3单突变体植株与对照非转基因大豆植株(Harosoy)种植于花盆中，培育相同的时间，并观察表型。结果如图2所示，通过表型观察，发现在长短日照下lcl3突变体植株能够显著延迟开花(图2A和2B)，说明LCL3是开花途径中的关键基因。

实施例2

1、LCL3近等基因系植株的表型鉴定

(1)对720份已重测序品种(测序由古奥基金公司完成，测序品种由广州大学分子遗传与进化创新研究中心从中国各地区及世界部分地区收集)中进行LCL3的遗传变异进行筛选，获得一个有效自然变异，该变异为一个氨基酸置换，造成一个终止密码子，能够导致LCL3蛋白提前终止(第478位，碱基A突变为T，氨基酸K突变为终止子)，将其命名为：大豆突变体Harosoy(LCL3)。

(2)通过将大豆品种Harosoy(LCL3)与PI 628930(参考文献获得：Fang C,Chen L,et al.Rapid identification of consistent novel QTLs underlying long-juveniletrait in soybean by multiple genetic populations and genotyping-by-sequencing[J].Mol Breeding,2019,39:1-11.)杂交并反复回交六代的方式，获得LCL的近等基因系。

(3)在短日照下，将上述获得的LCL的近等基因系种植于田间，并对突变体植株的花期，成熟期，产量等数据进行观察和测量，确定LCL3为参与调控大豆开花的关键基因。结果如图3所示(图3中：NIL-LCL3是正常型LCL3，NIL-lcl3是突变型lcl3)，从图中可以看出，大豆突变体lcl3的开花时间延迟，植株高度分枝数、单株总荚数，单株总粒数和单株重量都显著提高，而平均节间距和百粒重基本持平。

2、LCL3基因表达模式

(1)利用大豆基因表达在线分析工具(Soybean eFP browser)和qRT-PCR等对大豆植株Harosoy的根、茎、叶、花等不同组织部位的LCL3基因进行时空表达分析。大豆生物钟基因GmLCL3在大豆中不同组织器官(下胚轴、子叶、茎、生长点、根、三出复叶、初生叶、花)的表达水平如图4所示。从图中可以看出，GmLCL3在大豆的所有组织中表达，在初生叶中表达量最高。

(2)以大豆植株Harosoy为材料，将种子种于花盆中，在长(白天/黑夜 16h/8h)短(白天/黑夜 12h/12h)日照下培养20d(天)，分别在长短日照下每隔4h取一次样品，连续取样48h，利用qRT-PCR技术检测LCL3的节律表达，确定LCL3是否受光周期诱导表达。持续光照下，每隔四个小时取样，连续取样72h，确定LCL3是否为生物钟表达基因。

结果如图5所示。结果表明，LCL3在长短日照下表达模式基本相同，在开灯后表达量迅速降低，在关灯后表达逐渐积累，凌晨表达量最高，昼夜交替时表达最低(图5A和5B)。在短日照种植19天后，转至持续光照24h后，每隔4h取一次样品，连续取样72h，发现持续光照下，LCL3仍能够维持自身表达节律(图5C)，说明LCL3是生物钟基因。

3、RNA-seq，DAP-seq和qPCR分析与下游基因确定

(1)以LCL3突变体(实施例1获得的lcl3突变体)为材料，在开花前期取样，提取总RNA，逆转录cDNA进行RNA-seq分析(由百迈客公司完成)，比较LCL3突变体和野生型大豆植株Harosoy下游差异表达基因，探讨LCL3相关分子调控网络。结果如图6所示，通过高通量转录组数据分析，找到开花关键基因E1，并将其作为候选靶标基因。

(2)利用DAP-seq技术(DNA亲和纯化测序法)分析LCL3能够直接调控的下游基因和LCL3结合的顺式作用元件。具体实验步骤如下：

将LCL3(SEQ ID NO.2)连接到Halo亲和标签载体(购自广州华彬生物科技有限公司)，在麦胚芽细胞转录-翻译偶联系统中表达重组蛋白，利用Halo亲和磁珠纯化转录因子重组蛋白。超声波打断大豆基因组DNA，连接测序接头(由睿博测序公司完成)成文库，与重组转录因子蛋白结合，PCR扩增重组蛋白特异结合的DNA获得DAP-seq文库。并且以Halo亲和标签蛋白作为阴性对照，构建文库。进行两次技术重复。

LCL3下游基因鉴定结果图如图6所示。通过对两次DAP-seq技术数据进行分析，找到LCL3能够结合顺式作用元件，并对DAP-seq数据进一步分析发现，LCL3可能与25836个基因序列相结合(图6A)，主要结合在启动子区和转录区，在基因上也有少量分布(图6B)。

以Harosoy和lcl3突变体(实施例1获得)为材料，分别种于长短日照下20d，取叶片样品进行高通量转录组测序，分别将长短日照RNA-seq数据与DAP-seq数据进行分析，发现短日照条件下，328个基因可能受LCL3调控，而长日照条件下，有712个基因可能受LCL3调控(图6C)。进一步对数据进行分析后发现，短日照条件下，LCL3可能抑制大豆开花关键基因E1(其核苷酸序列基因登录号为：Glyma.06G207800)的表达，对E1的启动子进行分析后，发现E1启动子区含有两个LCL3所结合的顺式作用元件(图6D)，说明短日照条件下，LCL3可能通过抑制E1的表达而延迟开花。

(3)以Harosoy和lcl3突变体(实施例1获得)为材料，将种子种于花盆中，长(光照/黑暗 16h/8h)短(光照/黑暗 12h/12h)日照下培养20d，分别在长短日照下每隔4h取一次样品，连续取样48h。利用qRT-PCR技术检测E1的表达，并进行EMSA(凝胶迁移实验)试验和转化烟草试验，具体流程参照Lu等文献(Lu等2016，Identifi cation of additional QTLs forfl owering time by removing the effect of the maturity gene E1in soybean)。

结果如图7所示。结果表明，在长日照条件下，E1的表达在Harosoy和lcl3突变体中没有变化，而在短日照条件下，E1在lcl3突变体中的表达显著高于对照植株Harosoy中的表达(图7A，7B)，说明在长短日照条件下，LCL3调控开花的途径是不同的，LCL3在长日照下调控开花的途径，还有待进一步分析与验证。EMSA试验结果表明LCL3能够直接结合E1启动子区的顺式作用原件(图7C)；顺转试验表明，LCL3能够抑制E1的表达，说明LCL3能够直接抑制E1的表达(图7D、E)。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广州大学

<120> GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间以及提高大豆产量中的应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 750

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LCL3的氨基酸序列

<400> 1

Met Asp Ala Tyr Ser Ser Gly Glu Glu Val Val Val Lys Thr Arg Lys

1 5 10 15

Pro Tyr Thr Ile Thr Lys Gln Arg Glu Arg Trp Thr Glu Glu Glu His

20 25 30

Asn Arg Phe Leu Glu Ala Leu Lys Leu His Gly Arg Ala Trp Gln Arg

35 40 45

Ile Glu Glu His Ile Gly Thr Lys Thr Ala Val Gln Ile Arg Ser His

50 55 60

Ala Gln Lys Phe Phe Thr Lys Leu Glu Lys Glu Ala Leu Val Lys Gly

65 70 75 80

Val Pro Ile Gly Gln Ala Leu Asp Ile Asp Ile Pro Pro Pro Arg Pro

85 90 95

Lys Arg Lys Pro Asn Asn Pro Tyr Pro Arg Lys Thr Arg Ile Gly Thr

100 105 110

Thr Ser Leu His Ser Gly Ala Lys Asp Gly Lys Leu Asn Leu Val Glu

115 120 125

Ser Ser His Val Asn Gln Ala Leu Asp Leu Lys Lys Glu Pro Leu Pro

130 135 140

Glu Lys His Asp Leu Asp Glu Gly Leu Thr Thr Val Lys Glu Asn Lys

145 150 155 160

Asp Glu Asn His Ala Lys Val Phe Thr Leu Leu Gln Glu Val Pro Cys

165 170 175

Ser Ser Val Ser Ser Ala Asn Glu Ser Ser Ile Thr Met Ser Val Pro

180 185 190

Leu Gly Asn Pro Cys Ala Phe Lys Glu Ile Thr Pro Ser Val Lys Glu

195 200 205

Val Ile Ala Arg Asp Glu Lys Thr Glu Ser Phe Val Thr Val Glu Pro

210 215 220

Glu Asn Gly Lys Leu Glu Ile Asn Asp Gly Lys Gln Thr Asn Gly Thr

225 230 235 240

Ser Lys Asp Ser Arg Leu Glu Asp Ser Asp Ala Leu His Met Lys Leu

245 250 255

Val Gln Asn Glu Lys Pro Asp Gly Leu Asp Cys Glu Leu Thr Ile Asp

260 265 270

Gly Met Gln Gly Asn Gln Asn Tyr Pro Arg His Val Thr Val His Val

275 280 285

Val Asp Gly Asn Leu Gly Thr Asn Thr Gln Asn Pro Ser Gln Asp Met

290 295 300

Leu Phe Arg Asp Ser Met Phe Gln Pro Ile Gly Gly Val Asn Gly Gln

305 310 315 320

Arg Asn Val Phe Thr Asn Thr Ala Pro Ser Asn Thr Ser Glu Ser Gln

325 330 335

Asn Asn Thr Ala Arg Ser Ser Val His Gln Ser Phe Leu Pro Tyr Pro

340 345 350

Pro Phe Thr Gln His Asn Gln Asp Asp Tyr Gln Ser Phe Leu His Met

355 360 365

Ser Ser Thr Phe Ser Asn Leu Ile Val Ser Thr Leu Met Gln Asn Pro

370 375 380

Ala Ala His Ala Ala Ala Ser Phe Ala Ala Thr Phe Trp Pro Tyr Ala

385 390 395 400

Asn Pro Glu Thr Ser Ala Asn Ser Pro Arg Cys Ser Gln Gly Gly Phe

405 410 415

Thr Asn Arg Gln Ile Gly Ser Pro Pro Ser Val Ala Ala Ile Ala Ala

420 425 430

Ala Thr Val Ala Ala Ala Thr Ala Trp Trp Ala Ala His Gly Leu Leu

435 440 445

Pro Leu Cys Ala Pro Leu His Thr Ser Phe Ala Cys Pro Ala Ser Val

450 455 460

Thr Thr Val Pro Ser Met Asn Thr Gly Glu Ala Pro Ala Leu Lys Ala

465 470 475 480

Glu Gln Glu Lys Thr Thr Leu Gln Asn Pro Pro Leu Gln Asp Gln Met

485 490 495

Leu Asp Pro Glu Tyr Ser Glu Ala Gln Gln Ala Gln His Ser Ala Ser

500 505 510

Lys Ser Pro Ala Ala Ile Leu Ser Asp Ser Glu Ser Gly Asp Ala Lys

515 520 525

Leu Asn Thr Ser Ser Lys Val Thr Asp His Glu Thr Asn Lys Thr Ile

530 535 540

Ser Glu His Leu Asp Ser Asn Lys Thr Lys Gly Arg Lys Pro Val Asp

545 550 555 560

Arg Ser Ser Cys Gly Ser Asn Thr Ala Ser Ser Ser Asp Val Glu Thr

565 570 575

Asp Ala Leu Glu Lys Gly Glu Lys Gly Lys Glu Glu Pro Glu Ile Pro

580 585 590

Asp Ala Asn Gln Leu Ala Ile Glu Phe Ser Asn Arg Arg Arg Ser Val

595 600 605

Ser Asn Leu Thr Asp Ser Trp Lys Glu Val Ser Glu Glu Gly Arg Leu

610 615 620

Ala Phe Gln Ala Leu Phe Ser Arg Glu Val Leu Pro Gln Ser Phe Ser

625 630 635 640

Pro Pro His Ala Leu Lys Asn Thr Asp His Gln Met Asp Asn Ala Asn

645 650 655

Asp Asn Lys Gln Asn Ile Asp Asp Lys Asp Glu Asp Leu Asp Gly Ser

660 665 670

Lys Lys Cys Ser Ser Asn Tyr Glu Ala Met Gln Lys Asn Leu Leu Phe

675 680 685

Val Glu Asn Asn Glu Gly Leu Leu Thr Ile Gly Leu Gly Gln Gly Lys

690 695 700

Leu Lys Thr His Arg Thr Gly Phe Lys Pro Tyr Lys Arg Cys Ser Met

705 710 715 720

Glu Ala Lys Glu Asn Arg Val Gly Ala Ser Ser Asn Gln Gly Glu Glu

725 730 735

Gln Gly Cys Lys Arg Ile Arg Leu Glu Gly Glu Thr Ser Thr

740 745 750

<210> 2

<211> 2253

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> LCL3基因

<400> 2

atggacgcat actcctccgg cgaagaagtg gttgttaaga ctagaaaacc atatacaatc 60

actaagcaaa gggaacgatg gacagaggag gagcataata ggtttctaga agctttgaaa 120

ctacacgggc gagcatggca gcgcatagaa gagcatatag gaacaaagac tgccgtgcaa 180

ataaggagtc atgcacagaa gttctttaca aagctggaga aagaggccct tgtaaagggt 240

gttccaattg gacaggctct tgatatagac attccccctc cacggcccaa aagaaagcca 300

aacaatcctt atcctcggaa gaccaggatt ggtaccacat cattacatag tggagcaaag 360

gatggaaaac tcaatttagt tgaatcttca catgttaatc aagcactgga cttgaaaaaa 420

gaaccacttc cagagaaaca tgatttagac gaagggctaa caactgtaaa agaaaataag 480

gatgagaacc acgcaaaagt atttactctt ctccaggagg taccctgttc ctctgtatct 540

tcagcaaatg agagttcaat aacaatgtct gtgccactgg gaaatccatg tgccttcaag 600

gagattacac cttccgtgaa agaggtaata gcacgagatg aaaaaactga atcttttgtc 660

actgttgaac ctgaaaatgg gaagttggag atcaatgatg gaaaacagac taatggcact 720

agtaaagact ccaggttaga ggattctgat gctttacata tgaaattggt tcaaaatgag 780

aaaccagatg gtcttgattg tgaattaaca atagatggga tgcaaggcaa tcagaattac 840

cctaggcatg ttactgtgca cgttgttgat gggaaccttg gaacaaatac tcaaaatcca 900

tcacaagata tgttgtttcg agattccatg tttcagccaa taggaggggt taacgggcaa 960

cgaaatgttt ttaccaatac agctccatcg aacacaagtg aaagtcaaaa taacactgca 1020

cgatcttctg ttcatcaatc atttcttcct tatcctccct tcacacaaca caaccaagac 1080

gattaccaat catttcttca catgtcttca acattttcaa atcttattgt ctctaccttg 1140

atgcaaaacc cagcagctca tgctgctgca agtttcgctg ctacattttg gccgtatgca 1200

aatccagaaa cttcagcaaa ttctcctagg tgctcccaag gaggttttac aaatagacaa 1260

attggttccc ctccaagcgt tgcagctatt gcagctgcta ctgtagcagc tgcaactgca 1320

tggtgggcag ctcatggatt gcttcctttg tgtgctcctc ttcatacttc ttttgcctgt 1380

cctgcatcag tgactacagt tccatcaatg aataccggtg aagcaccggc tctgaaggca 1440

gagcaagaaa aaactactct acaaaatcct cctcttcaag atcagatgct ggatccagaa 1500

tactcggaag ctcaacaagc tcaacattca gcttcaaagt caccagctgc cattttatca 1560

gattctgaga gtggagatgc caagttaaat acttcatcaa aggttactga tcatgagacg 1620

aacaaaacaa tttctgagca ccttgattcc aacaaaacaa agggaagaaa accggttgac 1680

cgttcctcat gtggttccaa cacggcctct agcagcgatg tggaaactga tgcactagag 1740

aagggtgaga aagggaagga agagcctgaa atacctgatg ctaaccaatt agccattgag 1800

tttagtaatc gtcgtagaag cgttagcaac cttactgatt cttggaaaga ggtttctgaa 1860

gaggggagac tggcctttca ggctctgttc tccagagagg tgttgcctca aagcttttca 1920

cctcctcatg ctttgaagaa tacggatcat caaatggaca acgccaatga taacaagcaa 1980

aacatagatg acaaagatga agatcttgac ggcagcaaga aatgcagttc taattatgaa 2040

gcgatgcaga aaaacctgct atttgtagaa aataacgagg gactgttaac catagggctt 2100

ggacaaggaa agcttaagac tcatcgaaca ggttttaaac cctacaaaag atgttccatg 2160

gaggccaagg aaaatagggt tggagcaagc agcaatcaag gtgaagagca aggttgtaag 2220

agaatacgtt tggaagggga gacttcgact tga 2253

<210> 3

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 上游引物F1

<400> 3

aagagaacga tggacagagg 20

<210> 4

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<220>

<223> 下游引物R1

<400> 4

aaaccctctg tccatcgttc tct 23

Claims

1.一种GmLCL3基因在调节大豆光周期和开花时间、提高大豆产量中的应用，其特征在于：

所述的GmLCL3基因为大豆生物钟基因LCL3，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：编码GmLCL3基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示。

3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于：为通过构建GmLCL3基因突变体的方式，改变大豆对光周期的敏感性，延迟大豆开花，延长大豆生育期，以及提高大豆的产量。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的GmLCL3基因突变体为通过如下任一种或两种方式构建得到：

a、敲除大豆植株GmLCL3基因编码区第84位的碱基A；

b、将大豆植株GmLCL3基因编码区第478位的碱基A突变为T。

5.一种GmLCL3基因突变体，其特征在于：为GmLCL3基因编码区第84位缺失一个碱基A，和/或GmLCL3基因编码区第478位的碱基A突变为T；所述的GmLCL3基因如SEQ ID NO.2所示。

6.含有权利要求5所述的GmLCL3基因突变体的表达载体、重组微生物或转基因细胞系。

7.权利要求5所述的GmLCL3基因突变体在制备转基因植物中的应用。

8.权利要求5所述的所述的GmLCL3基因突变体在大豆改良育种、制种中的应用。

9.权利要求5所述的GmLCL3基因突变体在调节大豆光周期和开花时间，和/或提高大豆产量中的应用。

10.一种培育转基因植物的方法，其特征在于：将权利要求5所述的GmLCL3基因突变体引入目的植物以获得转基因植物。