KR20130141891A

KR20130141891A - 왜성 및 측지 발달 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물

Info

Publication number: KR20130141891A
Application number: KR1020120064984A
Authority: KR
Inventors: 김현욱; 이경렬; 김종범; 노경희; 정수진
Original assignee: 대한민국(농촌진흥청장)
Priority date: 2012-06-18
Filing date: 2012-06-18
Publication date: 2013-12-27
Also published as: KR101382402B1

Abstract

본 발명은 피마자 유래의 단백질, 상기 단백질 유전자, 상기 유전자를 포함하는 재조합 벡터, 상기 재조합 벡터로부터 형질전환되어 왜성이며 측지가 발달된 형질전환식물, 상기 형질전환식물을 제조하는 방법에 관한 것이다.

Description

왜성 및 측지 발달 촉진용 유전자 및 그 유전자를 포함하는 형질전환 식물{A gene for promoting dwarfness and branches of plants and a transgenic plant comprising the same}

본 발명은 유전자를 벡터에 재조합하고 상기 유전자를 형질전환 식물체에서 과발현시켜서 왜성이며 측지가 발달된 식물체를 제조하는 방법에 관한 것이다.

고전 육종에 있어서 육종 방법은 대부분의 경우 교배 육종법을 사용하고 있다. 그러나 이 방법으로는 1~2개의 특정 유전자만을 원하는 작물로 도입시키는 것이 불가능하다. 따라서 교배 후 원하는 유전자의 특성만을 남기기 위해 다시 필요 없는 유전자군을 제거하고 원하는 유전자를 고정시키는데, 보통 5년에서 20년 정도까지의 긴 시간과 노력이 요구되는 단점이 있다. 또한 이렇게 고정한 품종에서도 육종과정에서 고려치 않았던 병원균에 대한 감수성이나 다른 약세형질이 나타날 수 있어, 보급 후 문제를 일으키는 경우가 종종 있다.

형질전환체의 교배(sexual crossing)에 의한 유전자 집적(gene stacking)의 방법은 개개의 목적으로 이미 도입된 형질전환체의 유용 형질을 교배를 통해 한 식물체로 모을 수 있으나, 장기간이 소요되며 그 결과를 구체적으로 조절하기 어려운 단점이 있다.

20세기 중반 이후부터는 식물의 유전 현상을 분자 수준에서 이해하기 시작하였고, 이러한 기초 연구가 다음과 같은 작물육종에도 활용되고 있다.

첫째는 유전자변형기술의 활용이다. 이전까지는 교잡(交雜)이 육종에서 유전적 변이를 이끌어내는 가장 중요한 방법이었다. 이는 교배를 통해 이루어졌기 때문에 이 방법은 같은 종 내의 다른 계통 간에서만 사용이 가능했다. 즉, 오랜 진화 과정상 종간의 유전자의 자유로운 이전을 방지하기 위하여 여러 가지의 자연적인 생식 장벽이 있는데, 통상적인 인공교배로는 이 장벽을 넘을 수가 없었던 것이다. 그러나 유전자변형기술은 종 수준이 아니라 생물계의 장벽을 넘어 유전자를 활용할 수 있게 한 획기적인 기술이라 볼 수 있다.

둘째는 분자표지 기술이다. 이전의 육종가는 겉으로 드러나는 형질인 표현형(phenotype)에 전적으로 의존하여 선발을 해왔다. 하지만 표현형은 환경 변화에도 달라질 수 있어 정확하지 않으며, 또한 새로운 형질을 얻었는지 확인하기 위해서는 재배를 해야 하므로 오랜 시간이 걸린다. 하지만 이 분자표지기술은 재배 과정 없이 유전형(genotype)을 통해 확인이 가능해 선발의 효율성과 정확성, 경제성을 획기적으로 제고하여 작물육종의 과학화에 크게 기여하고 있다.

최근 종자의 발달을 조절하는 유전자를 종자 이외의 조직에 발현함으로써 생식세포가 아닌 식물체의 체세포에서 직접 배(embryo)를 유도하는 기술이 연구 되고 있다. 현재까지 피마자의 종자에만 특이적으로 발현되는 전사조절 유전자를 이용한 연구에 대한 보고가 없었다.

국내 공개특허공보 제2011-0108809호 국내 공개특허공보 제2012-0002566호

이에 본 발명은 피마자의 종자에만 특이적으로 발현되는 전사조절 유전자인 RcB3D45가 과발현되어 형질전환된 왜성이며 측지가 발달된 형질전환식물을 제공하고자 한다.

본 발명은 RcB3D45 유전자를 과발현시켜서 왜성이며 측지가 발달된 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명은 RcB3D45 유전자를 과발현시켜서 제조된 전체 식물, 식물 기관, 종자, 식물 세포 또는 이의 자손이 왜성이며 측지가 발달된 형질전환 식물체를 제공한다.

본 발명은 종자의 발달을 조절하는 전사조절유전자(transcription factor)인 RcB3D45 유전자, 상기 유전자를 포함하는 발현 벡터, 상기 발현 벡터에 의해 식물의 전체 조직에 인위적으로 RcB3D45 유전자가 과발현되어 형질전환된 왜성이며 측지가 발달되고 종자 이외의 조직에서 종자에만 축적되는 단백질(protein) 및 지방(lipid)을 생산할 수 있는 형질전환 식물체를 제공할 수 있다.

도 1은 피마자 B3 도메인 유전자, 단백질 구조 및 아미노산 서열을 나타낸다.
도 2는 피마자 B3 도메인 유전자의 피마자 조직별 발현 RT-PCR 분석을 나타낸다.
도 3은 피마자 35S-RcB3D45 과다 발현 벡터 구조를 나타낸다.
도 4는 피마자 RcB3D45 유전자 과다 발현에 의한 식물의 형태 변화를 나타낸다.
도 5는 야생형 대조구(WT)와 피마자 RcB3D45 형질전환체에서 RT-PCR 분석에 의한 RcB3D45유전자의 발현을 나타낸다.
도 6A는 피마자 RcB3D45 형질전환체 잎의 중성지방(TAG) 생성을 나타낸다.
도 6B는 피마자 RcB3D45 형질전환체 잎의 지방산 조성에서 모노-11-에이코센오인 지방산 생성을 나타낸다.

보다 구체적으로, 본 발명은 RcB3D45 유전자는 서열번호 1의 핵산염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 왜성이며 측지가 발달된 식물체를 제조하는 방법을 제공한다.

본 발명에 있어서 왜성(Dwarfness)이라는 용어는 생물의 크기가 그 종(種)의 표준 크기에 비하여 작게 자라는 형질, 또는 그런 형질을 가진 품종을 의미한다. 왜성 형질은 농업 및 원예업의 다양한 관점에서 중요하다. 예컨대 식물 높이 또는 줄기 길이를 축소함으로써 관상용 식물을 제조할 수 있고, 채소 또는 과일을 소형화함으로써 먹기에 적당한 크기(bite-sized)를 갖는 등의 새로운 상업적 가치를 갖는 농작물을 제조할 수 있다.

본 발명의 일 실시예에 있어서, 본 발명의 왜성이며 측지가 발달된 형질전환체는 야생형 대조구와 비교하여 기저부분의 잎의 수가 평균적으로 약 3배 증가하였으며, 가지의 수는 평균적으로 약 4배 증가하였다. 또한 형질전환체의 기저 직경이 야생형 대조구와 비교하여 평균적으로 약 0.5배로 감소하였고, 정단가지의 높이는 약 0.5배로 감소하였다.

본 발명에 따른 RcB3D45 유전자는 일 구체예에서, 피마자로부터 분리된 단백질 서열에서 B3 도메인을 갖는 유전자 RcB3D45(Ricinus communis B3 domain 45)일 수 있으나, 관심대상의 다른 종으로부터의 RcB3D45 유전자 또는 유사 유전자도 또한 사용할 수 있다.

상기 서열번호 1의 핵산염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열을 갖는 단백질을 암호화하는 것을 특징으로 할 수 있다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 RcB3D45 유전자는 서열번호 1에 기재된 핵산염기서열과 실질적 동일성을 가지는 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명에서 폴리뉴클레오타이드 서열의 "실질적인 동일성"이란 용어는 폴리뉴클레오타이드가 표준 매개변수를 사용하여 하기 기술한 프로그램을 사용하여 참조 서열과 비교할 때 60% 이상의 서열 동일성, 통상적으로 70% 이상, 보다 통상 적으로 80% 이상 및 가장 바람직하게는 90% 이상의 서열 동일성을 갖는 서열을 포함함을 의미한다. 당해 분야의 숙련가는, 이들 값이 코돈 축퇴성, 아미노산 유사성, 판독 프레임 위치화 등을 고려하여 2개의 뉴클레오타이드 서열에 의해 암호화된 단백질의 상응하는 동일성을 측정하도록 적절히 조절할 수 있음을 인지할 것이다.

서열 동일성 퍼센트 및 서열 유사성을 측정하는데 적합한 알고리즘의 예는 문헌(참조: Altschul et al.,J. Mol.Biol. 215:403-410, 1990)에 기술된 BLAST 알고리즘이다. BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 국립 생물학 정보 센터(National Center for Biotechnology Information)의 웹 사이트를 통해 이용 가능하다.

본 발명의 일 구체예에 있어서, 상기 유전자 발현은 프로모터 조절 하에 있을 수 있다.

본 발명의 기술된 방법을 사용하여 식물 성장 관련 유전자에 작동적으로 연결시켜 발현시키기에 적합한 프로모터는 형질전환 될 식물의 동일한 종으로부터 또는 이종으로부터의 것을 사용할 수 있다. 또한, 프로모터는 사용 될 본 발명의 유전자에 대해 동일한 종으로부터 기원할 수 있거나, 또는 이종으로부터 기원할 수 있다. 본 발명의 방법에 사용하기 위한 프로모터는 또한 하나 이상의 하기에서 기술한 것과 공통되는 발현 프로파일을 갖는 프로모터의 조합을 포함할 수 있는 키메라 프로모터를 포함할 수 있다.

상기 ‘프로모터’란 특정한 숙주 세포에서 작동 가능하게 연결된 핵산염기서열의 발현을 조절하는 DNA 서열을 의미하며, ‘작동 가능하게 연결된다(operably linked)’는 것은 하나의 핵산 단편이 다른 핵산 단편과 결합되어 그의 기능 또는 발현이 다른 핵산 단편에 의해 영향을 받는 것을 말한다. 아울러, 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합부위를 코딩하는 서열 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열을 추가로 포함할 수 있다.

식물 게놈 DNA에서 프로모터 영역을 확인하고 특성화하는 방법은 당해 분야의 숙련가에게 잘 알려져 있으며, 예를 들면, 문헌[참조: Jordano et al, Plant Cell 1: 855-866, 1989; Bustos et al., Plant Cell 1: 839-854, 1989; Green et al., EMBO J. 7:4035- 4044, 1988; Meier et al., Plant Cell 3: 309-316, 1991; 및 Zhang et al., Plant Physiol. 110: 1069-1079, 1996]에 기술되어 있다.

이러한 프로모터 서열의 예는 아미노산 퍼미아제 유전자에 대한 프로모터(AAP1)(예: Arabidopsis thaliana(아라비돕시스 탈리아나)로부터의 AAP1 프로모터)(참조: Hirner et al., Plant J. 14:535-544,1998), 올레이트 12-하이드록실라제: 데사투라제 유전자에 대한 프로모터(예: Lesquerella fendleri(레스쿠에렐라 펜들레리)로부터LFAH12로 지명된 프로모터)(참조: Broun et al.,Plant J. 13:201-210, 1998), 2S2 알부민 유전자에 대한 프로모터(예: Arabidopsis thaliana(아라비돕시스 탈리아나)로부터의 2S2 프로모터)(참조: Guerche et al., Plant cell 2:469-478, 1990),지방산 엘롱가제 유전자 프로모터(FAEl)(예: Arabidopsis thaliana(아라비돕시스 탈리아나)로부터의 FAE1 프로모터)(참조: Rossak et al., Plant Mol. Biol. 46:717-715, 2001), 및 리피 코틸레돈 유전자 프로모터(LEC2)(예: Arabidopsis thaliana(아라비돕시스 탈리아나)로부터의 LEC2 프로모터)(참조: Kroj et al., Development 130:6065-6073, 2003)를 포함한다. 또한, 본 발명의 일 실시예에서 사용된 CaMV(cauliflower mosaic virus) 35S 프로모터도 포함될 수 있다.

상기 RcB3D45유전자는 피마자 종자에서 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 한다. 본 발명의 일 실시예에서, RcB3D45 유전자는 RT-PCR 분석을 통하여 피마자의 잎, 줄기, 꽃, 암꽃, 수꽃, 종자, 유묘, 뿌리 중 종자에만 특이적으로 발현되는 것을 확인하였다.

본 발명은 또한 식물 전사조절 관련 유전자의 발현을 촉진시킬 수 있는 하나 이상의 조절 유전자에 작동적으로 연결된 RcB3D45 유전자를 암호화하는 핵산염기서열을 포함하는 왜성이며 측지가 발달된 식물체 제조용 발현 벡터를 제공할 수 있다.

상기 RcB3D45 유전자는 서열번호 1에 기재된 핵산염기서열을 가지는 왜성이며 측지가 발달된 식물체 제조용 발현 벡터일 수 있다.

본 발명에서의 상기 '벡터(vector)'란 적합한 숙주 내에서 DNA를 발현시킬 수 있는 적합한 조절 서열에 작동 가능하게 연결된 DNA 서열을 보유하는 DNA 제조물을 의미한다. 벡터는 플라스미드, 파지 입자, 또는 간단하게 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적당한 숙주로 형질전환 되면 벡터는 숙주 게놈과 무관하게 복제하고 기능할 수 있거나, 또는 일부 경우에 게놈 그 자체에 통합될 수 있다.

한편, 본 발명의 일 실시예에서는 본 발명의 재조합 벡터를 아그로박테리움 GV3101에 형질전환시킨 다음 상기 형질전환된 아그로박테리움에 의해 식물 세포 내로 본 발명의 유전자가 도입되도록 하였다.

따라서 본 발명은 또한 상기 유전자 또는 재조합 벡터에 의해 형질전환된 아그로박테리움속 미생물을 제공할 수 있다.

또한 본 발명은 RcB3D45 유전자를 과발현시켜서 제조된 전체 식물, 식물 기관, 종자, 식물 세포 또는 이의 자손이 왜성이며 측지가 발달된 형질전환 식물체를 제공한다.

형질전환 식물체의 제조는 벡터를 식물에 도입하는 당분야에 공지된 형질전환 방법을 사용할 수 있다. 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 아그로박테리움 속(Agrobacterium spp .) 미생물을 이용한 형질전환, 입자 총 충격법(particle gun bombardment), 실리콘 탄화물 위스커(Silicon carbide whiskers), 초음파 처리(sonication), 전기천공법(electroporation) 및 PEG(Polyethylenglyco l)에 의한 침전법을 사용할 수 있다. 아그로박테리움-매개 형질전환법을 이용할 수 있으며, 문헌에 예시된 방법을 사용할 수 있다(Horsch et al., Science 227: 1229-1231, 1985).

본 발명의 한 구체예에서, 상기 형질전환 식물은 애기장대일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 서열번호 1의 유전자를 포함하는 재조합 벡터 pENTR-RcB3D45와 CaMV 35S 프로모터를 갖고 있는 식물발현벡터인 pB2GW7에 LR clonase 반응을 하여, CaMV 35S 프로모터 조절하에 서열번호 1의 유전자가 발현되는 벡터 35S-RcB3D45를 제작하여, 아그로박테리움 GV3101에 형질전환 시키고, 형질전환된 세포를 선별하여 이를 개체로 분화시켜 형질전환체를 얻었다.

본 발명에서 "식물"이라는 용어는 전체 식물, 식물 기관(예: 잎, 줄기, 꽃, 뿌리 등), 종자 및 식물 세포(조직 배양 세포 포함) 및 이의 자손을 포함한다. 본 발명의 방법에 사용될 수 있는 식물의 부류는 일반적으로 단자엽 식물 및 쌍자엽 식물 둘 다를 포함하는 형질전환 기술에 적용 가능한 고등 식물의 부류, 및 조류와 같은 특정의 하등 식물과 같이 광범위하다. 이는 배수체, 이배체 및 반수체를 포함하는 각종의 배수성 수준의 식물을 포함한다.

본 발명의 RcB3D45를 과발현시키는 형질전환 식물은 예를 들면, 식물 내로 RcB3D45유전자에 작동적으로 연결된 프로모터를 암호화하는 유전자전이 벡터(예: 플라스미드, 바이러스 등)를 형질 감염시킴에 의해 수득될 수 있다.

따라서 본 발명은 또한 상기 발현벡터를 포함하고, 상응하는 야생형 식물과 비교하여 왜성이며 측지가 발달된 형질전환 식물을 제공한다.

본 발명에 따른 형질전환 식물체를 제조하는 방법으로 화훼 식물체에 RcB3D45 유전자를 과발현시켜 형질전환 식물체를 제조하여, 왜성이며 측지가 발달된 관상용 화훼 식물체를 제공할 수 있다.

상기 형질전환된 식물 또는 식물 세포는 단자엽식물 또는 쌍자엽 식물일 수 있으나, 이에 한정되지 않으며, 상기 식물체는 전체 식물, 식물 기관, 종자, 식물 세포 또는 이의 자손인 왜성이며 측지가 발달된 형질전환 식물체일 수 있다.

본 발명에 있어서 상기 형질전환 식물체는 잎에서 중성지방(triacylglycerol, TAG) 및 모노-11-에이코센오인 지방산(11-eicosenoic acid)이 생산될 수 있다. 본 발명에 따른 형질전환체의 잎에서 비형질전환체인 대조구의 잎에는 존재하지 않는, 종자에만 존재하는 탄소구조가 20:1인 모노-11-에이코센오인 지방산(11-eicosenoic acid)이 생산될 수 있다.

이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 실시예를 들어 상세하게 설명하기로 한다. 다만 하기의 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예는 당업계에서 평균적인 지식을 가진 자에게 본 발명을 보다 완전하게 설명하기 위해 제공되는 것이다.

< 실시예 >

실시예 1. 피마자에서 B3 도메인 단백질 유전자, RcB3D45 분리

농촌진흥청 유전자원센터에서 분양받은 피마자의 종자(IT196881)로부터 RNA를 분리한 후 RT-PCR(Reverse transcriptase-polymerase chain reaction) 방법을 이용하여 B3 도메인 유전자인 RcB3D45 유전자를 분리하고, cDNA 유전자의 핵산염기서열을 결정하였다. RcB3D45 유전자의 핵산염기서열은 총 1,200 bp로 구성되어 있으며, 상기 핵산염기서열로 인코딩된 399개의 아미노산으로 구성된 45 kDa 분자량의 단백질 정보로 구성되었다. RcB3D45 유전자의 단백질 서열에는 B3 DNA binding 도메인 부분을 아미노산 176부터 260까지 가지고 있다. 이 RcB3D45 유전자는 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 BlastP 단백질 상동성 결과 가장 유사한 유전자는 아미노산이 418개인 기능을 알 수 없는 hypothetical protein으로 정의되어 있다.

도 1은 분리된 피마자 B3 도메인 유전자의 단백질 구조 및 아미노산 서열로, 도 1(A)는 피마자 RcB3D45 단백질의 구조로, B3 도메인의 아미노산 176부터 260번째에 존재하며, 도 1(B)는 RcB3D45 단백질의 아미노산 서열, B3 도메인의 아미노산 서열을 적색으로 표시하였다.

실시예 2. 피마자 RcB3D45 유전자 발현분석

RcB3D45 유전자의 피마자 조직별 발현 분석을 RT-PCR 방법으로 수행하였다. 피마자의 잎, 줄기, 꽃, 암꽃, 수꽃, 종자, 유묘, 뿌리의 RNA를 분리한 후 RcB3D45 유전자 특이 프라이머를 사용하여 RT-PCR 하여 조직별 발현 양상을 분석하였다(도 2). 분석 결과 이 유전자는 종자에서만 특이적으로 발현하였다. 정확한 발현 분석 증명을 위해 피마자 모든 조직에서 발현되는 액틴 유전자 RcACT2 유전자 발현 분석을 대조구로 사용하였다.

도 2는 피마자 B3 도메인 유전자의 피마자 조직별 발현 RT-PCR 분석을 나타내는 것으로, L(잎), St(줄기), F (꽃), Fe(암꽃), M(수꽃), Sd(종자), S (유묘), R(뿌리) 조직별 발현을 나타낸다. 상기 RT-PCR 분석을 통하여 RcB3D45 유전자는 피마자 종자에만 특이적으로 발현되는 것을 알 수 있었다. 피마자 ACTIN2 (RcACT2)유전자의 발현을 대조구로 사용하였다.

실시예 3. 피마자 RcB3D45 유전자 과다발현 식물 벡터 제작

피마자 RcB3D45 유전자를 pENTR-Topo(Invitrogen)에 삽입 작성한 pENTR-RcB3D45 벡터와 VIB-Ghent 대학에서 구입한 CaMV 35S 프로모터를 갖고 있는 식물발현벡터인 pB2GW7(10.8kb)에(Karimi et al., Trend Plant Sci. 7: 193-195, 2002) LR clonase 반응을 하여, CaMV 35S 프로모터 조절하에 피마자 RcB3D45 유전자가 발현되는 식물 재조합 발현 벡터 35S-RcB3D45를 제작하였다(도 3). 이 제작된 식물발현벡터를 아그로박테리움 GV3101(Komcz and Schell. Mol. Gen. Genet. 204:383-396. 1986)에 형질전환한 후, 아그로박테리움을 애기장대 식물 형질전환에 사용하였다.

도 3은 피마자 35S-RcB3D45 과다발현 식물벡터 구조에 관한 것으로, RcB3D45 cDNA 유전자 1,200bp가 CaMV 35S 프로모터 아래 결합되었다(LB: left border, RB: right border, bar: 제초제 phosphinothricin 저항성 유전자, T35S: CaMV 35 유전자의 terminator, SpR: spectinomycin 저항성 유전자).

실시예 4. 피마자 RcB3D45 유전자 과다발현에 의한 식물의 형태 변화

RcB3D45 유전자가 포함된 아그로박테리움을 애기장대의 꽃에 접종하였다. 다음 세대 종자를 수확하여 발아시킨 후 제초제(BASTA)에 저항성을 갖는 피마자 RcB3D45 유전자가 형질전환된 애기장대를 선발하였다(도 4). RcB3D45 유전자가 형질전환된 식물체는 정상인 애기장대와 식물성장에서 차이를 보였다(도 4(A), (B)). 형질전환 애기장대 식물체는 일반적으로 잎의 초기 발달이 활발하였고, 꽃대의 정단우세현상이 없어졌으며, 측지의 발달이 왕성하여 식물의 형태를 바꾸었다 (도 4(C)). 종자 발아 후 65일째의 야생형(WT)의 밑부분 잎(Rosette leaf)의 평균 개수는 12개이며, 가장 밑부분에서 분화된 가지(branch)의 수는 평균 5개였다. 그 반면 RcB3D45 형질전환체는 밑부분 잎의 수가 평균 37개로 증가했으며, 또한 가지의 분화 수도 평균 21개로 매우 증가하였다. 식물체의 크기는 야생형의 정단 가지(apical branch)의 높이는 평균 28 cm이고, 식물의 기저 부분의 직경은 평균 6.5 cm인 반면 RcB3D45 형진전환체의 크기는 매우 작아져, 그 높이는 13 cm , 직경은 3.7 cm였다(표 1). 이 형태 변화가 단순한 형질전환체로 발생한 것이 아니라, RcB3D45 유전자의 과다 발현으로 유도되었음을 RcB3D45 유전자 특이 프라이머를 이용하여 RT-PCR 발현 분석으로 확인하였다(도 5). 도 5의 대조구(WT) 애기장대 식물체에서는 RcB3D45 유전자가 발현되지 않았으나, 형질전환체에서 RcB3D45 유전자가 강하게 발현됨을 확인하였다. 이것은 식물체의 형태 변화가 RcB3D45 유전자의 과다발현에 의해 유도되었음을 보여 주었다.

야생형 대조구(WT)와 형질전환체(RcB3D45) 성장 비교 (65일 식물체 n=5, 숫자±SEM)

측정(Measurement)	야생형 대조구(WT)	형질전환체(RcB3D45)
밑부분 잎의 수(Number of rosette leaves)	12.8±0.374	37.4±4.675
가지의 수(Number of branches)	5.2±0.200	21.0±2.864
식물체의 기저 직경(Diameter of plant(cm))	6.5±0.356	3.7±0.170
정단가지의 높이(Height of apical branch(cm))	28.2±0.735	13.6±2.421

실시예 5. 피마자 RcB3D45 유전자 과다발현에 의한 식물의 잎의 지방산 생산 변화

RcB3D45 유전자가 포함된 아그로박테리움을 애기장대의 꽃에 접종하였다. 다음 세대 종자를 수확하여 발아시킨 후 제초제(BASTA)에 저항성을 갖는 피마자 RcB3D45 유전자가 형질전환된 애기장대를 선발하였다. RcB3D45 유전자 과발현 식물체의 잎의 지방을 분리하여 얇은층 크로마토그래피(Thin Layer Chromatography: TLC) 분석 결과, 잎에서는 존재하지 않는 중성지방(triacylglycerol, TAG)이 축적 되었음을 확인하였다(도 6A). 이 중성지방은 종자에서 분리된 중성지방과 TLC상에서 유사한 이동상을 보였다. 잎의 지방산을 가스크로마토그래피(Gas Chromotography, GC) 분석한 결과 대조구에 비해 잎의 지방산 조성에서 변화가 보였다(표 2, 도 6B). 특이할 만한 것은 애기장대의 종자에만 존재하는 20:1 지방산이 RcB3D45의 과발현체 잎에서 생성되었다(그림 6 B).

도 6A는 대조구와 RcB3D45 형질전환체의 잎과 애기장대 종자의 지방을 분리하여 TLC에서 전개하여 중성지방을 분석한 것을 나타낸다. RcB3D45 잎에서는 종자의 중성지방(TAG)과 유사한 지방산 밴드가 TLC상에서 검출되었으나, 대조구(WT)의 잎에서는 검출되지 않았다.

도 6B 와 표 2은 대조구와 RcB3D45 형질전환체 잎의 지방산을 GC 분석한 결과, RcB3D45 형질전환체의 잎에서 애기장대 종자에만 존재하는 모노-11-에이코센오인(20:1) 지방산이 전체 지방산의 2% 존재하였다.

야생형 대조구(WT)와 형질전환체(RcB3D45) 잎의 지방산 조성 분석. (n=3)

지방산	WT(야생형)	RcB3D45(형질전환체)
지방산	Mol %±SEM
16:0	24.3±2.5	21.9±2.6
16:1t	3.9±0.5	2.4±0.5
16:3	8.6±1.1	8.0±1.6
18:0	1.9±0.1	1.7±0.2
18:1	4.6±0.6	6.3±0.7
18:2	18.4±0.2	15±0.1
18:3	38.5±2.4	43.1±2.0
20:1	0	2.0±0.8

<110> The Foundation of Agri. Tech. Commercialization & Transfer <120> A gene for promoting dwarfness and branches of plants and a transgenic plant comprising the same <160> 2 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1200 <212> DNA <213> Ricinus communis B3 domain 45 <400> 1 atggattctt tccagaattc ccagttctct tctatccgta gaccactgtg ctactcctca 60 acatcttcta actcatccac tcagacttac cattgtccag cagaagacaa catgccaaca 120 actccttttc agagccctca ttttcaacaa gaataccgtc cagagcaggc tggccagaac 180 tcaacatcag cattttcaat gtgtccttac tggttaagtc agaatgggac tgaaattcaa 240 acatggcttt tacaacaaaa tgggttgtcg atagatcaag gaaagaaagt tcttgatgca 300 tacaagacca agattgcaag gaataagcgg aaattggcac gccaaaggag ccttagcaga 360 aactcttctt ctagtgctaa ttcaattcaa gtggatacaa ggagattggc attcaatatg 420 caagacagcc aaagcaccag taagagagat ctctataaat tctgcacccc agataacaag 480 aaactaagag tgttgctgag gaaggactta aagaccagtg atgttggttc tcttgggagg 540 attgtccttc caaagagaga ggcagaggaa aatcttccta tcctctctga taaagaaggt 600 atcctagttg caatcagaga tgtatgctct acaaaagagt ggagcttgaa gtacaaatat 660 tggtctaaca acaaaagtag aatgtatgtt ctcgaaaaca caggagattt tgtgaagcaa 720 aatgggatga ggattggaga ttcccttaca ctttacgagg atgagagcaa gaaactctat 780 ttttccgtca agaaggttga agcactagaa gctgagccat cgtgcaaaca acacgctaca 840 aaccaaaact acatatacat accacataca taccaggcta gagatgaaga agaagcatca 900 ttagcactac ttatagaaca acttaaacat aaagaacagc aagaagaagt taacagcctt 960 gtgactttgt ctatggatat tgctccttat agacacaaag aggaagagaa gaattatggt 1020 ccattcaaca atctcaccag cataagcatc tatccccaat cgacagctgc agccatggcc 1080 atacaaccct cgtcttcagc acacagtaca atgagagttg tagatgatca ctacattgat 1140 gacttctata ctgcccttga tgttcttcct gatgtcaata ggtataattt ttctctttga 1200 1200 <210> 2 <211> 399 <212> PRT <213> Ricinus communis B3 domain 45 <400> 2 Met Asp Ser Phe Gln Asn Ser Gln Phe Ser Ser Ile Arg Arg Pro Leu 1 5 10 15 Cys Tyr Ser Ser Thr Ser Ser Asn Ser Ser Thr Gln Thr Tyr His Cys 20 25 30 Pro Ala Glu Asp Asn Met Pro Thr Thr Pro Phe Gln Ser Pro His Phe 35 40 45 Gln Gln Glu Tyr Arg Pro Glu Gln Ala Gly Gln Asn Ser Thr Ser Ala 50 55 60 Phe Ser Met Cys Pro Tyr Trp Leu Ser Gln Asn Gly Thr Glu Ile Gln 65 70 75 80 Thr Trp Leu Leu Gln Gln Asn Gly Leu Ser Ile Asp Gln Gly Lys Lys 85 90 95 Val Leu Asp Ala Tyr Lys Thr Lys Ile Ala Arg Asn Lys Arg Lys Leu 100 105 110 Ala Arg Gln Arg Ser Leu Ser Arg Asn Ser Ser Ser Ser Ala Asn Ser 115 120 125 Ile Gln Val Asp Thr Arg Arg Leu Ala Phe Asn Met Gln Asp Ser Gln 130 135 140 Ser Thr Ser Lys Arg Asp Leu Tyr Lys Phe Cys Thr Pro Asp Asn Lys 145 150 155 160 Lys Leu Arg Val Leu Leu Arg Lys Asp Leu Lys Thr Ser Asp Val Gly 165 170 175 Ser Leu Gly Arg Ile Val Leu Pro Lys Arg Glu Ala Glu Glu Asn Leu 180 185 190 Pro Ile Leu Ser Asp Lys Glu Gly Ile Leu Val Ala Ile Arg Asp Val 195 200 205 Cys Ser Thr Lys Glu Trp Ser Leu Lys Tyr Lys Tyr Trp Ser Asn Asn 210 215 220 Lys Ser Arg Met Tyr Val Leu Glu Asn Thr Gly Asp Phe Val Lys Gln 225 230 235 240 Asn Gly Met Arg Ile Gly Asp Ser Leu Thr Leu Tyr Glu Asp Glu Ser 245 250 255 Lys Lys Leu Tyr Phe Ser Val Lys Lys Val Glu Ala Leu Glu Ala Glu 260 265 270 Pro Ser Cys Lys Gln His Ala Thr Asn Gln Asn Tyr Ile Tyr Ile Pro 275 280 285 His Thr Tyr Gln Ala Arg Asp Glu Glu Glu Ala Ser Leu Ala Leu Leu 290 295 300 Ile Glu Gln Leu Lys His Lys Glu Gln Gln Glu Glu Val Asn Ser Leu 305 310 315 320 Val Thr Leu Ser Met Asp Ile Ala Pro Tyr Arg His Lys Glu Glu Glu 325 330 335 Lys Asn Tyr Gly Pro Phe Asn Asn Leu Thr Ser Ile Ser Ile Tyr Pro 340 345 350 Gln Ser Thr Ala Ala Ala Met Ala Ile Gln Pro Ser Ser Ser Ala His 355 360 365 Ser Thr Met Arg Val Val Asp Asp His Tyr Ile Asp Asp Phe Tyr Thr 370 375 380 Ala Leu Asp Val Leu Pro Asp Val Asn Arg Tyr Asn Phe Ser Leu 385 390 395

Claims

RcB3D45 유전자를 과발현시켜서 왜성이며 측지가 발달된 식물체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
RcB3D45 유전자는 서열번호 1의 핵산염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 왜성이며 측지가 발달된 식물체를 제조하는 방법.
제2항에 있어서,
상기 서열번호 1의 핵산염기서열은 서열번호 2의 아미노산 서열로 암호화되는 단백질인 것을 특징으로 하는 왜성이며 측지가 발달된 식물체를 제조하는 방법.
제1항에 있어서,
상기 RcB3D45유전자는 피마자 종자에서 특이적으로 발현되는 것을 특징으로 하는 왜성이며 측지가 발달된 식물체를 제조하는 방법.
RcB3D45 유전자를 과발현시켜서 제조된 전체 식물, 식물 기관, 종자, 식물 세포 또는 이의 자손이 왜성이며 측지가 발달된 형질전환 식물체.
제5항에 있어서,
상기 형질전환 식물체는 잎에서 중성지방 및 모노-11-에이코센오인 지방산(11-eicosenoic acid)이 생산되는 것을 특징으로 하는 형질전환 식물체.