ES2863223T3 - Composiciones y procedimientos para alterar la floración y arquitectura de las plantas para mejorar el potencial de rendimiento - Google Patents

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Abstract

Una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína FT florigénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO:2 y que está operativamente unida a un promotor que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO:21, la SEQ ID NO:22 o la SEQ ID NO:38.

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones y procedimientos para alterar la floración y arquitectura de las plantas para mejorar el potencial de rendimiento
Campo de la invención
La presente invención se refiere a composiciones y procedimientos para modular el desarrollo floral y crecimiento vegetativo por modificación genética de las plantas de cultivo para aumentar el rendimiento.
Antecedentes
La transición del crecimiento vegetativo a la floración es un proceso crucial durante el desarrollo de plantas que es necesaria para la producción de rendimiento de grano en las plantas de cultivo. Hay cuatro vías principales que controlan el tiempo de floración en las plantas terrestres que responden a señales ambientales o de desarrollo, que incluyen la fotoperiodicidad (es decir, duración del día), la vernalización (es decir, la respuesta al frío del invierno), y hormonas de plantas (por ejemplo, las giberelinas o GA), además de las vías autónomas (ambientalmente independientes). A excepción de las vías de GA y autónomas, la regulación de la floración en las plantas en general, implica dos reguladores centrales del tiempo de floración, CONSTANS (CO) y FLOWERING LOCUS C (FLC). El gen FLC es un represor floral que regula la floración en respuesta a la vernalización, mientras que el gen CO es un activador floral que responde a las condiciones del fotoperíodo. En las condiciones de fotoperíodo inductivas, la actividad de CO en las hojas fuente aumenta la expresión del LOCUS DE FLORACIÓN T (FT) que se transloca al meristemo para activar la expresión de genes de activación floral corriente abajo, que incluyen LEAFY (LFY), APETALA1 (AP1) y SUPRESOR DE SOBREEXPRESIÓN DE CO 1 (SOC1). Otros genes, tales como LOCUS DE FLORACIÓN C (FLC) y FLOWER TERMINAL 1 (TFL1), actúan para inhibir la expresión o actividad de estos genes.
A excepción de las plantas de día neutro, la mayoría de las plantas con flores responden a ciclos de fotoperiodicidad diarios y se clasifican como plantas de día corto (SD) o día largo (LD) basándose en las condiciones del fotoperíodo requerido para inducir la floración. El fotoperíodo se refiere a la longitud o duración relativa de los períodos de luz y oscuridad dentro de un ciclo de 24 horas. En general las plantas de día largo tienden a florecer cuando la duración del día es superior a un umbral de fotoperíodo (por ejemplo, cuando los días son más largos en la primavera), mientras que las plantas de días cortos tienden a florecer cuando la duración del día es inferior a un umbral de fotoperíodo (por ejemplo, cuando los días son más cortos después del solsticio de verano). En otras palabras, las plantas SD florecen a medida que los días se acortan, mientras que las plantas LD florecen a medida que los días se alargan. La soja es un ejemplo de una planta de día corto (SD) en la que se induce la floración cuando las plantas están expuestas a condiciones de luz diurna más corta.
Los cultivadores de plantas siempre están buscando nuevos procedimientos para manipular el rendimiento de una planta, especialmente para mejorar el rendimiento de las semillas de los cultivos de importancia agronómica. Por lo tanto, hay una necesidad continua en la técnica de mejores composiciones y procedimientos para aumentar los rendimientos de diferentes plantas de cultivo. Se propone actualmente que se pueden obtener mejores rendimientos mediante la mejora de los rasgos agronómicos relacionados con la floración y el desarrollo reproductivo.
Sumario
De acuerdo con un primer aspecto de la presente invención, se proporciona una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína FT florigénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO:2 y unida operativamente a un promotor que comprende una secuencia que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO: 21, la SEQ ID NO:22 o la SEQ ID NO:38.
De acuerdo con un segundo aspecto de la presente invención, también se proporciona un vector de plásmido que comprende la construcción de ADN recombinante, así como plantas transgénicas, células de planta, tejidos de planta y partes de planta que comprenden la construcción de ADN recombinante anterior de la presente invención. Una planta transgénica de la presente invención puede ser homocigota o hemicigota para una inserción de la construcción de ADN recombinante. Una planta transgénica puede ser una planta de día corto y/o una planta dicotiledónea. De acuerdo con las especies de planta, las plantas transgénicas de la presente invención pueden producir más cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos o vainas por nodo de la planta transgénica, con respecto a una planta control o de tipo silvestre que no tiene la construcción de ADN recombinante. Las plantas transgénicas de la presente invención también pueden producir más flores y/o racimos florales por nodo con respecto a una planta control o de tipo silvestre que no tiene la construcción de ADN recombinante.
De acuerdo con un tercer aspecto de la presente invención, se proporcionan procedimientos para producir una planta transgénica que tiene mejores rasgos o fenotipos relacionados con el rendimiento que comprende (a) transformar al menos una célula de un explante con una construcción de ADN recombinante que comprende la secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína FT florigénica tal como se describe anteriormente; y (b) regenerar o desarrollar la planta transgénica a partir del explante transformado. Tales procedimientos también pueden comprender (c) seleccionar una planta transgénica que tiene uno o más de los siguientes rasgos o fenotipos: floración más temprana, duración reproductiva o de floración más larga, aumento del número de flores por nodo, aumento del número de racimos florales por nodo, aumento del número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas o frutos secos por nodo, y aumento del número de semillas por nodo, en comparación con una planta control que no tiene la construcción de ADN recombinante.
Breve descripción de las figuras
FIG. 1A proporciona una tabla de matriz que muestra una comparación de secuencias de nucleótidos para cada combinación de los diversos genes FT que incluyen su porcentaje de identidad.
La FIG. 1B proporciona una tabla de matriz que muestra una comparación de secuencias de proteína para cada combinación de las diversas proteínas FT que incluye su porcentaje de identidad.
La FIG. 1C proporciona un alineamiento de secuencia múltiple CLUSTAL 2.0.9 de varias proteínas FT.
La FIG.2 muestra los niveles de transcrito FT totales en hoja de soja y tejidos de ápice recolectados a 1,3 y 5 días después de un tratamiento luminoso de día corto o día largo.
La FIG.3 y FIG.4 muestran el patrón de expresión del promotor pAt.Erecta mediante el control de la actividad GUS durante el desarrollo de soja temprana. La FIG. 3 es un conjunto de imágenes en blanco y negro de los tejidos teñidos, y las imágenes de la FIG.4 corresponden a la FIG. 3, pero están filtradas por la tinción GUS azul. Las FIG.
3A a 3C y 4A a 4C muestran la expresión en las plántulas en germinación de 3 días, las FIG. 3D a 3I y 4D a 4I muestran la expresión de un brote vegetativo de 10 días (cultivado en un fotoperíodo de 14 horas de luz/10 horas oscuridad); las FIG 3J a 3L y 4J a 4L muestran la expresión de un brote de reproducción de 16 días; y las FIG 3M a 3O y 4M a 4O muestran la expresión en las hojas maduras e inmaduras de 30 días del brote reproductivo. Las barras son 100 pm.
Las FIG. 5 y FIG. 6 muestran el patrón de expresión de GUS con el promotor pAt.Erecta durante las etapas R1 y floral del desarrollo (35-40 días después de la germinación). La FIG. 5 es un conjunto de imágenes en blanco y negro de los tejidos teñidos, y las imágenes de la FIG. 6 corresponden a las FIG. 5 pero están filtradas por la tinción GUS azul. Las FIGS. 5A y 6A muestran la expresión en los tallos o pedúnculos de la inflorescencia (flechas), y las FIGS. 5B y 6B muestran la expresión en el pedúnculo floral (flechas). La expresión también se muestra en las células de la vasculatura y parénquima (FIGS. 5C y 6C), en los filamentos del estambre (FIGS. 5D y 6D). flecha), y óvulos no polinizados (FIGs .5E, 5F, 6E y 6F; flechas). Las barras son de 1 mm.
La FIG. 7 muestra la sección de imágenes del meristemo apical (SAM) de plantas tipo silvestre frente a plantas transgénicas que expresan Gm.FT2a a los 7 días después de la siembra utilizando el análisis de microscopía electrónica de barrido (eSEM).
La FIG. 8 muestra micrografías de microscopía electrónica de barrido (eSEM) de un primordio de inflorescencia axilar de una planta de tipo silvestre (recolectada a 27 días después de la siembra), en comparación con un primordio de inflorescencia axilar de un evento transgénico que expresa Gm.FT2a (recolectado en 9 días después de la siembra).
La FIG.9 muestra los efectos de la expresión Gm.FT2a dirigida por el promotor At.Erecta en la soja. La FIG. 9A representa un segregante nulo que muestra yemas axilares normales, mientras que la FIG. 9B y la FIG. 9C (que corresponden a las plantas homocigotas o hemicigotas para el transgén Gm.FT2a, respectivamente) muestran cada uno floración temprana y el aumento de vainas por nodo con respecto al segregante nulo.
La FIG. 10 muestra una imagen de la planta entera de un segregante nulo de tipo silvestre próxima a las plantas hemocigotas y homocigotas para el transgén Gm.FT2a según se indica.
La FIG. 11 muestra imágenes del tallo principal de plantas que son homocigota o hemicigota para el transgén pAt.Erecta-Gm.FT2a en comparación con un segregante nulo según se indica.
La FIG. 12A muestra imágenes de la planta entera de un segregante nulo tipo silvestre y una planta homocigota para el transgén pEr:Zm.ZCN8 según se indica.
La FIG. 12B muestra imágenes en detalle de vainas de un tallo principal de un segregante nulo tipo silvestre y una planta homocigota para el transgén pEr:Zm.ZCN8 según se indica.
La FIG. 13A muestra imágenes de la planta entera de un segregante nulo tipo silvestre y una planta homocigota para el transgén pEr:Nt.FT-like según se indica.
La FIG. 13B muestra imágenes en detalle de las vainas de un tallo principal de un segregante nulo tipo silvestre y una planta homocigota para el transgén pEr:Nt.FT-like según se indica.
La FIG. 14 muestra imágenes de la planta entera de un segregante nulo tipo silvestre y una planta homocigota para el transgén pEr:Gm.FT2b según se indica.
La FIG. 15 muestra imágenes de la planta entera de un segregante nulo tipo silvestre y una planta homocigota para el transgén pEr.Le.SFTsegún se indica.
La FIG. 16 muestra imágenes de la planta entera de un segregante nulo tipo silvestre y una planta homocigota para el transgén pEr:FT5a según se indica.
Descripción detallada
El objetivo de mejorar el rendimiento es común a todos los cultivos a través de la agricultura. La presente invención incluye procedimientos y composiciones para mejorar el rendimiento de floración (angiospermas) o plantas portadoras de semilla mediante la modificación de los rasgos asociados con el tiempo de floración, desarrollo reproductivo, y crecimiento vegetativo para mejorar uno o más rasgos o fenotipos relacionados con la floración y/o rendimiento, tales como el número de flores, semillas y/o vainas por planta, y/o el número de flores, semillas y/o vainas por nodo (y/o por tallo principal) de la planta. Sin estar ligado a ninguna teoría, las composiciones y procedimientos de la presente invención pueden operar para mejorar el rendimiento de una planta mediante el aumento del número de meristemos florales, aumento de la sincronización de la liberación del meristemo lateral, y/o extensión del período de tiempo de desarrollo de la vaina o semilla en la planta.
Anteriormente, se descubrió que el cultivo de plantas de día corto, tales como la soja, bajo condiciones de día largo (por ejemplo, aproximadamente 14 a 16 horas de luz por día) y después se someten brevemente aquellas plantas a condiciones de crecimiento de día corto (por ejemplo, aproximadamente 9-11 horas de luz por día durante aproximadamente 3-21 días) antes de retornar las plantas a condiciones de crecimiento de día largo (no inductivas), se producen plantas que tienen un mayor número de vainas/semillas por planta (y vainas/semillas por nodo y/o por rama). Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 8.935.880 y la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° de publicación 2014/0259905.
Como se describe más adelante, se utilizó este fenotipo inducción día corto en la soja para identificar los genes que tienen expresión alterada en estas plantas a través de perfiles de transcripción. Estos estudios identificaron varios genes con expresión alterada en estas plantas de soja tratadas que incluye un gen FT endógeno, Gm.FT2a, que tiene expresión aumentada en respuesta al tratamiento de inducción de día corto. Por lo tanto, en la actualidad se propone que la expresión de FT transgénica descrita en el presente documento se puede usar en lugar de la inducción de día corto para aumentar el rendimiento de semillas, alterar los rasgos o fenotipos reproductivos en las plantas, o ambos. De acuerdo con un aspecto de la presente invención, la expresión ectópica o transgénica del gen aGm.FT2a u otra secuencia de FT, o un fragmento funcional, homólogo u ortólogo de este, en una planta de flores o semilla, que se puede usar para aumentar el rendimiento de semillas y/o alterar uno o más fenotipos o rasgos reproductivos, que pueden implicar un aumento en el número de vainas/semillas por planta (y/o el número de vainas/semillas por nodo o tallo principal de la planta). Como se explica más adelante y en función de la especie de planta particular, estos fenotipos o rasgos relacionados con el rendimiento o reproductivos también se pueden aplicar a otras estructuras botánicas análogas a las vainas de las plantas leguminosas, tales como cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, tubérculos, etc. Por lo tanto, una planta que expresa ectópicamente una secuencia FT puede en cambio tener un aumento del número de cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, tubérculos, etc., por nodo, tallo principal, y/o rama de la planta, y/o un aumento del número de cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, tubérculos, etc., por planta.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende un transgén FT tal como se describe anteriormente, que se puede usar en la transformación para generar una planta transgénica que expresa el transgén FT. La secuencia de polinucleótidos que codifica el transgén FT puede ser cualquier secuencia de polinucleótido que codifica la proteína Gm.FT2a (SEQ ID NO:2).
Las secuencias de polinucleótidos que codifican los transgenes FT que codifican proteínas FT adicionales de otras especies que tienen secuencias de aminoácidos conocidas pueden, por ejemplo, incluir las siguientes: Md.FT1 y Md.FT2 de manzana (Malus domestica); Hv.FT2 y Hv.FT3 de cebada (Hordeum vulgare); Cs.FTL3 de crisantemo; Ls.FT de lechuga (Lactuca sativa); Pn.FT1 y Pn.FT2 de álamo de Lombardía (Populus nigra); Pa.FT de árbol de plátano de sombra (Platanus acerifolia); Dl.FT1 de Longan (Dimocarpus longan); Ps.FTa1, Ps.FTa2,Ps.FTb1,Ps.FTb2, y Ps.FTc de arveja (Pisum sativum); Ac.FT de ananá (Ananas comosus); Cm-FTL1 y Cm-FTL2 de zapallo (Cucurbita maxima); Ro.FT de rosa; Cg.FT de orquídeas de barco (Cymbidium); Fv.FT1 de frutilla (Fragaria vesca); Bv.FT2 de remolacha azucarera (Beta Vulgaris); Ha.FT4 de girasol (Helianthus annuus); y Ta.FT o TaFT1 de trigo (Triticum aestivum). Véase, por ejemplo, Wickland, DP y col., “The Locus de floración T/Terminal Flower 1 Gene Family: Functional Evolution and Molecular Mechanisms”, Molecular Plant8: 983-997 (2015).
A menos que se indique lo contrario, las secuencias de ácidos nucleicos o polinucleótidos descritas en el presente documento se proporcionan (de izquierda a derecha) en la dirección 5' a 3', y se proporcionan secuencias de aminoácidos o de proteínas (de izquierda a derecha) en la dirección N-terminal a C-terminal. Los genes FT pueden ser conocidos o inferirse de sus secuencias de nucleótidos y/o proteínas, que se pueden determinar mediante inspección visual o mediante el uso de una herramienta o programa informático (y base de datos) de búsqueda e identificación basada en ordenador sobre la base de un algoritmo de comparación con secuencias, dominios estructurales, etc. de FT conocidos, y de acuerdo con cualquier técnica de alineamiento de secuencias conocida, tal como BLAST, FASTA, etc.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, un transgén FT de una molécula de ADN recombinante tal como se describe anteriormente puede comprender una secuencia de polinucleótidos que (cuando se alinean óptimamente) es al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una o más de las secuencias de polinucleótidos que codifican el FT listadas anteriormente (por ejemplo, SEQ ID NO: 1. Los porcentajes de identidad de secuencia entre las secuencias de polinucleótidos de los genes FT de longitud completa mencionados anteriormente se presentan en la FIG. 1A. Cada celda de la tabla de la FIG. 1A muestra el porcentaje de identidad para el gen FT en la fila correspondiente (secuencia incógnita) en comparación con el gen de FT en la columna correspondiente (secuencia presente) dividido por la longitud total de la secuencia incógnita, y el número entre paréntesis es el número total de bases idénticas entre la secuencias incógnita y presentes. Como se muestra en esta figura, los porcentajes de identidad en las secuencias de polinucleótidos para este rango de genes FT muestreados son de aproximadamente 60% a aproximadamente 90% de identidad. Las secuencias de polinucleótidos similares que codifican FT se pueden diseñar o seleccionar sobre la base de las secuencias de proteínas FT conocidas, restos conservados de aminoácidos y dominios, la degeneración del código genético, y todas las optimizaciones de codón conocidas para la especie particular de planta por transformar.
Como se describe a continuación, un transgén FT que comprende cualquiera de las secuencias codificadoras anteriores puede incluir además uno o más elementos de expresión y/o regulación, tales como el líder, intrón, etc. En efecto, un transgén FT puede comprender una secuencia genómica que codifica una secuencia de proteínas o aminoácidos de FT, o un fragmento o porción de esta.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, un transgén FT de una molécula de ADN recombinante puede comprender una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos o proteína que (cuando se alinea óptimamente) es al menos 80% idéntica, al menos 85% idéntica, o al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una o más de las secuencias de proteínas o aminoácidos de FT listadas anteriormente (por ejemplo, SEQ ID NOS: 2. Un "fragmento funcional" se define como una proteína que tiene una secuencia de polipéptidos que es idéntica o altamente similar a una proteína FT de longitud completa pero que carece de uno o más restos de aminoácidos, porciones, dominios de la proteína, etc., de la proteína FT de longitud completa, siempre que el fragmento mantenga activa la producción de uno o más de los efectos o cambios fenotípicos similares a los proteína de longitud completa cuando se expresa transgénicamente en una planta. Los porcentajes de identidad de secuencia entre las proteínas FT de longitud completa mencionados anteriormente se presentan en la FIG. 1B. Los porcentajes se calculan como se describió anteriormente en referencia a la FIG. 1A sobre la base del número de restos de aminoácidos idénticos (entre paréntesis) entre las secuencias de proteína FT de incógnita y presente. El alineamiento de secuencias múltiples de estas proteínas FT también se muestra en la FIG. 1C. Como se puede observar a partir de estas FIG., el porcentaje de identidad entre las secuencias de proteínas de estos genes FT varía de aproximadamente 60% a aproximadamente 90% de identidad. Por lo tanto, una secuencia de polinucleótidos que codifica una secuencia de aminoácidos o proteína que se encuentra dentro de uno o más de estos intervalos de identidad de secuencia o tiene una identidad de secuencia mayor puede inducir la floración, aumentar el rendimiento de semilla, y/o alterar uno o más rasgos reproductivos de una planta. Estas secuencias de la proteína FT codificadas por una secuencia de polinucleótidos de la presente invención se pueden diseñar o seleccionar sobre la base de las secuencias de proteínas FT conocidas y sus restos y dominios de aminoácidos conservados.
Como se usa en el presente documento, la expresión "identidad de secuencia" se refiere al grado en el que dos secuencias de ADN alineadas de manera óptima son idénticas. Varios algoritmos y programas de alineamiento de pares o de secuencias múltiples son conocidos en la técnica, tal como ClustalW, etc., que se puede usar para comparar la identidad de secuencia o semejanza entre dos o más secuencias, tales como entre dos o más secuencias de genes o proteína FT (nucleótido) o secuencia de proteínas y otra secuencia de nucleótidos o proteínas. Por ejemplo, el porcentaje de identidad de una secuencia (incógnita) con otra secuencia (presente) se puede calcular como se describió anteriormente en referencia a las FIGS. 1A y 1B (es decir, con las secuencias alineadas de manera óptima, se divide el número de bases o restos idénticos por el número total de bases o restos para la secuencia incógnita, y se multiplica por 100%). Aunque otros procedimientos de alineamiento y comparación son conocidos en la técnica, el alineamiento y el porcentaje entre dos secuencias (que incluyen los intervalos de porcentaje de identidad descritos anteriormente) se pueden determinar mediante el algoritmo ClustalW, ver por ejemplo, Chenna R. y col., “Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs”, Nucleic Acids Research31: 3497-3500 (2003); Thompson JD y col., “Clustal W: Improving the sensitivity of progressive multiple sequence alignment through sequence weighting, position-specific gap penalties and weight matrix choice”, Nucleic Acids Research22: 4673-4680 (1994); y Larkin MA y col., “Clustal W and Clustal X version 2.0”, Bioinformatics 23: 2947-48 (2007). Para los fines de la presente invención, cuando dos secuencias se alinean de forma óptima (con una previsión de lagunas en su alineación), a continuación, el "porcentaje de identidad" para la secuencia de consulta se calcula como se describió anteriormente en referencia a las FIG. 1A y 1B - es decir, porcentaje de identidad = (número de posiciones idénticas entre las secuencias de consulta y sujetos/número total de posiciones en la secuencia problema) x 100%, con cada secuencia que consiste en una serie de posiciones (bases de nucleótidos o restos de aminoácidos).
Una secuencia de la proteína FT codificada por una secuencia de polinucleótidos o transgén de la presente invención también se puede diseñar o elegir para tener una o más sustituciones de aminoácidos conocidas por ser química y/o estructuralmente conservativas (por ejemplo, la sustitución de un aminoácido con otro que tiene propiedades químicas o físicas similares, tales como hidrofobicidad, polaridad, carga, efecto estérico, química ácido/base, grupo de cadena lateral similar, tales como hidroxilo, sulfhidrilo, amino, etc.) para evitar o minimizar cambios estructurales en la proteína que podrían afectar su función. Por ejemplo, la valina es a menudo un sustituto conservador para alanina y treonina puede ser un sustituto conservador para serina. Los ejemplos adicionales de sustituciones conservativas de aminoácidos en las proteínas incluyen: valina/leucina, valina/isoleucina, fenilalanina/tirosina, lisina/arginina, ácido aspártico/ácido glutámico, y asparagina/glutamina. Una secuencia de la proteína FT codificada por una secuencia de polinucleótidos o transgén de la presente invención también puede incluir proteínas que difieren en uno o más aminoácidos de los de una proteína FT conocida o secuencia similar como resultado de la supresión y/o inserción que involucra uno o más aminoácidos.
Varios genes y proteínas de FT de diferentes especies de plantas se pueden identificar y considerar homólogos u ortólogos FT si tienen una secuencia de ácidos nucleicos y/o proteínas similar y comparten aminoácidos conservados y/o dominios estructurales con al menos un gen o proteína fT conocidos. Como se usa en el presente documento, el término "homólogo", en referencia a un gen o proteína FT se considera que incluye colectivamente todos los homólogos, análogos, ortólogos, parálogos, etc., del gen o proteína FT, y el término "homólogo", en referencia a secuencias de polinucleótidos o proteínas se considera que significa secuencias similares o idénticas. Tal homólogo FT también se puede definir como que tienen la misma o similar función biológica que los genes FT conocidos (por ejemplo, en la acción de influir de manera similar la floración y/u otros rasgos o fenotipos relacionados con la reproducción o rendimiento cuando se expresa de forma ectópica en una planta).
El análisis de secuencia y el alineamiento de secuencias de proteínas FT de diferentes especies de plantas también revela numerosos restos de aminoácidos conservados y al menos un dominio conservado estructural. Al someter las diversas secuencias de proteínas FT alineadas (Véase, por ejemplo, las FIGS. 1B y 1C) a una herramienta de identificación del dominio de la proteína utilizando una base de datos Pfam (por ejemplo, Pfam versión 26.0, liberado en noviembre de 2011, o una versión posterior), se ha hallado que estas proteínas FT contienen y comparten al menos una porción de un dominio de una proteína de unión a fosfatidil etanolamina putativa (PEBP) (Pfam nombre de dominio: PBP_N; número de referencia: PF01161). Véase, por ejemplo, Banfield, MJ y col., “The structure of Antirrhinum centroradialis protein (CEN) suggests a role as a kinase inhibitor”, Journal of Mol Biol., 297(5): 1159-1170 (2000). Se encontró que este dominio PEBP corresponde, por ejemplo, a los aminoácidos 28 a través de 162 de la proteína de longitud completa Gm.FT2a (Ver Tabla 5 a continuación). De este modo, las proteínas FT abarcadas por las realizaciones de la presente invención pueden incluir los identificados o caracterizados por tener o contener al menos un dominio PEBP (número de referencia: PF01161) de acuerdo con el análisis de Pfam. En consecuencia, la presente invención también puede incluir una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de FT que tiene al menos un dominio PEBP. Como se conoce en la técnica, la base de datos "Pfam" es una gran colección de alineamientos de secuencias múltiples y modelos ocultos de Markov que abarcan muchas familias de proteínas comunes y que contienen información acerca de varios familias de proteínas y sus estructuras de dominio. Mediante la identificación de un dominio estructural Pfam putativo ara una secuencia de proteína determinada, se pueden inferir o determinar la clasificación y la función de la proteína. Véase, por ejemplo, Finn, RD y col., “The Pfam protein families database”, Nucleic Acids Research (Database Issue), 42:D222-d 230 (2014).
Las realizaciones de la presente invención también pueden incluir secuencias de polinucleótidos que codifican proteínas FT inductivas o florigénicas. Una proteína FT codificada por una secuencia de polinucleótidos puede ser "inductiva" o "florigénica" si la proteína FT, cuando se expresa de forma ectópica en una planta, es capaz producir floración más temprana y/o un aumento de la prolificidad en el número de flores, vainas, y/o semillas por uno o más nodos de la planta. Sin estar ligado a ninguna teoría, tal aumento de la prolificidad en el número de flores, vainas y/o semillas por nodo de la planta puede resultar de un incremento en el número de meristemos en los nodos que experimentan una transición vegetativa a reproductiva y producir flores. Tal aumento de prolificidad en cada nodo debido a la expresión ectópica de una FT "florigénica" puede ser debido a un aumento de la sincronización de la liberación y el desarrollo floral de los primeros racimos y meristemos laterales en cada nodo. Aunque una proteína FT "florigénica" puede funcionar para inducir la floración más temprana cuando se expresa de forma ectópica en una planta, una proteína FT "florigénica” expresada ectópicamente puede aumentar el número de flores, vainas y/o semillas por nodo de una planta a través de una o más vías o mecanismos que son independientes de, o además de, cualquier efecto florigénico relacionado con el tiempo de floración y/o la duración de reproducción.
Los genes tipo FT florigénicos de varias especies de plantas están generalmente bien conservados. Sin embargo, muchas proteínas de la familia PEBP tienen secuencias de aminoácidos que son sustancialmente similares a las proteínas FT florigénicas pero no se comportan como florígenos. Por ejemplo, los genes Terminal Flower (TFL) de varias especies de plantas tienen secuencias de proteínas similares a los genes FT florigénicos pero en realidad retrasan la floración. Trabajos recientes han identificado restos de aminoácidos específicos que, en general no son compartidos entre las proteínas FT florigénicas y otras proteínas PEBP, tales como TFLs, y se ha demostrado que las sustituciones en muchas de estas posiciones convierten las proteínas FT florigénicas en proteínas represoras florales. Véase, por ejemplo, Ho y Weigel, Plant Cell 26: 552-564 (2014); Danilevskaya y col., Plant Physiology 146(1): 250­ 264 (2008); Harig y col., Plant Journal 72: 908-921 (2012); Hsu y col., Plant Cell18: 1846-1861 (2006); Kojima y col., Plant Cell Physiology 43(10): 1096-1105 (2002); Kong y col., Plant Physiology 154: 1220-1231 (2010); Molinero-Rosales y col., Planta 218: 427-434 (2004); Zhai y col., PLoS ONE, 9(2): e89030 (2014), y Wickland DP y col. (2015), supra. En consecuencia, estos restos de aminoácidos pueden servir como motivos distintivos para definir adicionalmente y distinguir proteínas FT florigénicas de la presente invención.
Una proteína FT “inductiva” o “florigénica” también se puede definir o caracterizar que comprende uno o más de los siguientes restos de aminoácidos (las posiciones de aminoácidos se refieren a las correspondientes posiciones de la proteína FT de Arabidopsis de longitud completa, SEQ ID NO: 14): una prolina en la posición de aminoácido 21 (P21); una arginina o lisina en la posición de aminoácido 44 (R44 o K44); una glicina en la posición de aminoácido 57 (G57); un ácido glutámico o un ácido aspártico a la posición de aminoácido 59 (E59 o D59); una tirosina en la posición de aminoácido 85 (Y85); una leucina en la posición de aminoácido 128 (L128); una glicina en la posición de aminoácido 129 (G129); una treonina en la posición de aminoácido 132 (T132); una alanina en la posición de aminoácido 135 (A135); un triptófano en la posición de aminoácido 138 (W138); un ácido glutámico o un ácido aspártico en la posición de aminoácido 146 (E146 o D146); y/o una cisteína en la posición de aminoácido 164 (C164). Las posiciones de aminoácidos correspondientes de otras proteínas FT se pueden determinar por el alineamiento con la secuencia FT de Arabidopsis (Véase, por ejemplo, FIG. 1C). Los expertos en la técnica pueden identificar las correspondientes posiciones de aminoácidos de otras proteínas FT basadas en su alineamiento de secuencia. Varios de estos restos clave se incluyen dentro de un dominio de bucle externo de las proteínas tipo FT, definidos como los aminoácidos 128 a 145 de la secuencia de FT de longitud completa de Arabidopsis (SEQ ID NO: 14) y las correspondientes secuencias de otras proteínas FT (Véase, por ejemplo, FIG. 1C). En consecuencia, los polinucleótidos de la presente invención pueden codificar las proteínas Ft florigénicas que tienen uno o más de estos restos de aminoácido conservados.
Las proteínas FT florigénicas también pueden tener uno o más de otros aminoácidos en una o más de las posiciones de resto identificadas anteriormente. Por ejemplo, en referencia a la anterior posición de aminoácidos de la secuencia de la proteína FT de Arabidopsis (At.FT) (SEQ ID NO: 14), una proteína FT florigénica alternativamente puede tener uno o más de los siguientes aminoácidos: una alanina (en lugar de prolina) en la posición correspondiente una posición 21 de la secuencia de proteína At.FT (P21A), o posiblemente otros restos no polares pequeños, tales como glicina o valina, en esta posición; una histidina (en lugar de lisina o arginina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 44 de la secuencia de proteína At.FT, o posiblemente otros aminoácidos polares en esta posición; una alanina o cisteína (en lugar de glicina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 57 de la secuencia de proteína At.FT, o posiblemente otros restos no polares pequeños, tal como prolina o valina, en esta posición; una asparagina o serina (en lugar de ácido glutámico o ácido aspártico) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 59 de la secuencia de proteína At.FT, o posiblemente otros restos polares pequeños, tal como glutamina, cisteína, o treonina, en esta posición; una variedad de restos polares y no polares no cargados (diferente de tirosina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 85 de la secuencia de proteína At.FT; un resto no polar o hidrofóbico no cargado (diferente de leucina), tal como isoleucina, valina, o metionina, en la posición de aminoácido correspondiente una posición 128 de la secuencia de proteína At.FT; una variedad de restos no polares y no cargados más pequeños (diferente de glicina), tal como alanina, valina, leucina, isoleucina, metionina, etc., en la posición de aminoácido correspondiente una posición 129 de la secuencia de proteína At.FT, aunque algunos restos polares y cargados se pueden tolerar en esta posición; un restos no cargado polar (diferente de treonina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 132 de la secuencia de proteína At.FT; una variedad de aminoácidos diferentes de prolina, tal como treonina, en la posición de aminoácido correspondiente una posición 135 de la secuencia de proteína At.FT; una variedad de otros aminoácidos no polares o hidrofóbicos voluminosos (en lugar de triptófano), tal como metionina o fenilalanina, en la posición de aminoácido correspondiente una posición 138 de la secuencia de proteína At.FT; una variedad de otros aminoácidos polares o cargados no positivamente, tal como asparagina o serina, en la posición de aminoácido correspondiente una posición 146 de la secuencia de proteína At.FT; y/o una variedad de otros aminoácidos polares o no polares (en lugar de cisteína, tal como isoleucina, en la posición de aminoácido correspondiente una posición 164 de la secuencia de proteína At.FT. Un experto en la técnica será capaz de identificar las correspondientes posiciones de aminoácidos y sustituciones de proteínas FT en función de su alineamiento de secuencia con la secuencia de la proteína FT de Arabidopsis. Además, otras sustituciones de aminoácidos químicamente conservativas también se contemplan dentro del alcance de las proteínas FT florigénicas sobre la base del conocimiento de los expertos en la técnica de bioquímica de proteínas. En consecuencia, los polinucleótidos también pueden codificar proteínas FT florigénicas que tienen una o más sustituciones conservativas de aminoácidos. En efecto, las proteínas FT florigénicas codificadas por polinucleótidos incluyen secuencias nativas y secuencias artificiales que contienen una o más sustituciones conservativas de aminoácidos, así como fragmentos funcionales de estos.
Las proteínas FT florigénicas también se pueden definir como que excluyen (es decir, no tienen) una o más sustituciones de aminoácidos que pueden ser características de, asociadas con, TFL u otras proteínas no florigénicas o antiflorigéncias. Por ejemplo, con referencia a la posición de aminoácidos de la secuencia de la proteína FT de Arabidopsis (SEQ ID NO: 14), una proteína FT florigénica puede excluir uno o más de los siguientes aminoácidos: una fenilalanina o serina en la posición correspondiente una posición 21 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de prolina o alanina); una fenilalanina en la posición correspondiente una posición 44 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de arginina o lisina); una histidina, ácido glutámico, o ácido aspártico en la posición correspondiente una posición 57 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de glicina); una glicina o alanina en la posición correspondiente una posición 59 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de ácido glutámico o ácido aspártico); una histidina en la posición correspondiente una posición 85 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de tirosina); una lisina, arginina, alanina, o metionina en la posición correspondiente una posición 109 de la secuencia de proteína At.FT; una lisina o arginina en la posición correspondiente una posición 128 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de leucina); una glutamina o asparagina en la posición correspondiente una posición 129 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de glicina); una valina o cisteína en la posición correspondiente una posición 132 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar detreonina); una lisina, arginina, o alanina en la posición correspondiente una posición 134 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de tirosina); una prolina en la posición correspondiente una posición 135 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de alanina o treonina); una serina, ácido aspártico, ácido glutámico, alanina, lisina, o arginina en la posición correspondiente una posición 138 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de triptófano o metionina); una lisina o arginina en la posición correspondiente una posición 140 de la secuencia de proteína At.FT; una lisina o arginina en la posición correspondiente una posición 146 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de restos polares ácidos o no cargados); una lisina o arginina en la posición correspondiente una posición 152 de la secuencia de proteína At.FT; y/o una alanina en la posición correspondiente a una posición 164 de la secuencia de proteína At.FT (por ejemplo, en lugar de cisteína o isoleucina). Un experto en la técnica será capaz de identificar las correspondientes posiciones de aminoácidos y sustituciones de otras proteínas FT en función de su alineamiento de secuencias.
Una proteína FT florigénica también se puede definir como similar a una proteína FT conocida además de tener uno o más de los restos de aminoácidos distintivos anteriores. Por ejemplo, una proteína florigénica se puede definir por tener al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20, o un fragmento funcional de este, además de uno o más de los siguientes restos distintivos: una tirosina u otros restos polares o no polares no cargados (por ejemplo, alanina, triptófano, metionina, leucina, treonina, cisteína, serina, o asparagina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 85 de la secuencia de proteína At.FT; una leucina u otro resto no polar o hidrofóbico (por ejemplo, isoleucina, valina, o metionina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 128 de la secuencia de proteína At.FT; y/o un triptófano u otro resto no polar o hidrofóbico grande (por ejemplo, metionina o fenilalanina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 138 de la secuencia de proteína At.FT. Tal proteína FT florigénica también se puede definir como portadora de restos de aminoácidos distintivos adicionales, tales como uno o más de los siguientes: una glicina u otro resto no polar y no cargado pequeño (por ejemplo, alanina, valina, leucina, isoleucina, o metionina) en la posición de aminoácido correspondiente una posición 129 de la secuencia de proteína At.FT; y/o a treonina en la posición de aminoácido correspondiente una posición 132 de la secuencia de proteína At.FT.
Una proteína FT florigénica también se puede definir como que tiene al menos 60%, al menos 65%, al menos 70%, al menos 75%, al menos 80%, al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% de identidad con una secuencia seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NOs: 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, y 20, o un fragmento funcional de este, pero que no tiene (es decir, que excluye) uno o más restos no florigénicos o antiflorigénicos, tal como uno o más de los siguientes: una histidina en la posición de aminoácido correspondiente una posición 85 de la secuencia de proteína At.FT; una lisina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente una posición 128 de la secuencia de proteína At.FT; y/o una serina, ácido aspártico, ácido glutámico, lisina o arginina en la posición de aminoácido correspondiente una posición 138 de la secuencia de proteína At.FT. Tal proteína FT florigénica también se puede definir por no tener (es decir, que excluye) uno o más restos adicionales, tales como uno o más de los siguientes: una glutamina o asparagina en la posición de aminoácido correspondiente una posición 129 de la secuencia de proteína At.FT; y/o a valina o cisteína en la posición de aminoácido correspondiente una posición 132 de la secuencia de proteína At.FT.
Los genes del Locus de floración T (FT) cumplen un papel clave en las plantas superiores y actúan para integrar las vías florales. Se ha demostrado que las proteínas FT actúan como una señal móvil o florígena transportada desde las hojas al ápice del brote apical donde activa el inicio del desarrollo reproductivo en diversas especies. Véase, por ejemplo, Jaeger, K.E. y col., “ Interlocking feedback loops govern the dynamic behavior of the floral transition in Arabidopsis", The Plant Cell, 25:820-833 (2013); Corbesier, L y col., “FT protein movement contributes to long distance signaling in floral induction of Arabidopsis", Science316: 1030-1033 (2007); Jaeger, KE y col., “FT protein acts as a long range signal in Arabidopsis", Curr Biol17: 1050-1054 (2007); y Amasino, R.M. y col., “The Timing of Flowering", Plant Physiology, 154(2):516-520 (2010). En Arabidopsis, la proteína FT se une a las proteínas 14-3-3 y Locus de floración D (FD) en el meristemo para formar un complejo de floración que desencadena la activación de los genes de identidad del meristemo floral, tales como APETATAL1 (AP1) y SOC1 en el ápice del brote. Véase, por ejemplo, Taoka, K. y col., “14-3-3 protein act as intracellular receptors for rice Hd3a florigen." Nature476:332-335 (2011). El gen TERMINAL FLOWER 1 (TFL1) es un represor clave de los blancos de FT que mantiene el centro del meristemo apical del brote (SAM) en un estado vegetativo. TFL1 actúa mediante la represión de los genes LEAFY (LFY) y AP1. Por lo tanto, las concentraciones relativas de FT y TFL1 en los tejidos blanco actúan competitivamente para controlar el tiempo de transición reproductiva de los meristemos de un estado vegetativo que puede terminar adicionalmente el crecimiento vegetativo. Véase, por ejemplo, Abe, M y col, Science 309: 1052-1055 (2005); Y McGarry, RC y col, Plant Science 188/189: 71-81 (2012).
Se han identificado genes FT de muy diversas especies, y se ha informado que la expresión ectópica de FT induce la floración temprana. Véase, por ejemplo,., Kong, F. y col., “Two Coordinately Regulated Homologs of Flowering Locus T Are Involved in the Control of Photoperiodic Flowering in Soybean", Plant Phvsiologv154: 1220-1231 (2010); Turck, F. y col., “Regulation and identity of florigen: Flowering Locus T moves center stage", Ann Rev Plant Biol59: 573-594 (2008); Blackman, BK y col., “The role of recently derived FT paralogs in sunflower domestication", C urrBiol20: 629635 (2010); Lifschitz, E. y col., “The tomato FT orthologs triggers systemic signals that regúlate growth and flowering and substitute for diverse environmental stimuli”, PNAS103: 6398-6403 (2006); Trankner, C. y col., “Over-expression of an FT-homologous gene of apple induces early flowering in annual and perennial plants”, Planta232: 1309-1324 (2010); and Xiang, L. y col., “Functional analysis of Flowering Locus T orthologs from spring orchid (Cymbidium goeringii Rchb. f.) that regulates the vegetative to reproductive transition”, Plant Cell & Biochem 58: 98-105 (2012). Sin embargo, estudios previos de la expresión de transgenes FT utilizaron promotores constitutivos o específicos de tejidos que producen fenotipos muy graves, fenotipos no de células autónomas (sistémicos), o fenotipos específicos de hoja autónomas con floración de plantas o plántulas más temprana que en los controles y que termina en las primeras etapas de desarrollo. Debido a estos hallazgos, la expresión ectópica FT generalmente no se consideró como un enfoque viable para aumentar el rendimiento de las plantas mediante la inducción de flores o alteración del tiempo de floración.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se proporciona una molécula de ADN o polinucleótido recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos codificadora que codifica una proteína FT que está unida operativamente a uno o más promotores y/u otros elementos reguladores que pueden operar en una célula de planta para controlar o sesgar el tiempo y/o ubicación de la expresión de FT cuando se transforma en una planta. Tal como se entiende comúnmente en la técnica, el término "promotor" en general se puede referir a una secuencia de ADN que contiene un sitio de unión de ARN polimerasa, sitio de inicio de la transcripción, y/o caja TATA y asiste o promueve la transcripción y la expresión de una secuencia de polinucleótido transcribible asociada y/o gen (o transgén). Un promotor se puede producir sintéticamente, variar o derivar de una secuencia de promotor conocida o de origen natural u otra secuencia de promotor (por ejemplo, como se proporciona en el presente documento). Un promotor también puede incluir un promotor quimérico que comprende una combinación de dos o más secuencias heterólogas. Un promotor de la presente invención, de este modo puede incluir las variantes de secuencias de promotor que son similares en composición, pero no idénticas, a otras secuencias promotoras conocidas o proporcionadas en el presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresión "unido operativamente" se refiere a una unión funcional entre un promotor u otro elemento regulador y una secuencia de polinucleótidos transcribible asociada o secuencia codificante de un gen (o transgén), de manera que el promotor, etc., opera para iniciar, asistir, afectar, causa, y/o promover la transcripción y expresión de la secuencia codificante o transcribible asociada, al menos, en tejidos, etapas de desarrollo, y/o bajo ciertas condiciones particulares.
Un promotor se puede clasificar de acuerdo a una variedad de criterios relativos al patrón de expresión de una secuencia codificante o gen (que incluye un transgén) unida operativamente al promotor, tal como constitutivo, de desarrollo, específico de tejido, inducible, etc. Los promotores que inician la transcripción en todos o la mayoría de los tejidos de la planta se denominan como promotores "constitutivos". Los promotores que inician la transcripción durante ciertos períodos o etapas de desarrollo se denominan como promotores "de desarrollo". Los promotores cuya expresión está potenciada en ciertos tejidos de la planta en relación con otros tejidos de la planta se denominan como promotores "potenciados en tejido" o "preferidos de tejido”. Por lo tanto, un promotor "preferido de tejido" produce una expresión relativamente más alta o preferencial en un tejido específico de la planta, pero con niveles de expresión más bajos en otros tejidos de la planta. Los promotores que expresan dentro de un tejido específico de la planta, con poca o ninguna expresión en otros tejidos de la planta, se conocen como promotores "específicos de tejido". Un promotor que se expresa en un determinado tipo de célula de la planta se denomina como promotor "específico del tipo celular". Un promotor "inducible" es un promotor que inicia la transcripción en respuesta a un estímulo ambiental, tales como el frío, sequía o luz, u otros estímulos, tales como lesiones o aplicación de productos químicos. Un promotor también se puede clasificar en términos de su origen, tales como ser heterólogo, homólogo, quimérico, sintético, etc. Un promotor "heterólogo" es una secuencia de promotor que tiene un origen diferente con respecto a su secuencia transcribible asociada, secuencia codificante o gen (o transgén), y/o no se producen de forma natural en la especie de planta para transformar. El término "heterólogo" se puede referir en términos más generales a una combinación de dos o más moléculas o secuencias de ADN cuando tal combinación no se encuentra normalmente en la naturaleza.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se proporciona una molécula de ADN o polinucleótido recombinante que comprende un transgén FT florigénico o secuencia codificante unida operativamente a un promotor que funciona en una planta, que se puede introducir o transformar en una planta para provocar que la planta tenga alteración de la floración, rasgo o fenotipo relacionados con la reproducción y/ o rendimiento. Debido a que se considera que las proteínas FT operan en los meristemos de una planta, que incluyen los meristemos apicales y/o axilares, para desencadenar la transición floral de estos meristemos e inducir la floración, las realizaciones de la presente invención proporcionan una molécula de ADN recombinante que comprende un transgén FT o secuencia codificante unida operativamente a un promotor de "etapa vegetativa" para provocar, cuando se introduce o se transforma en una planta, la expresión del transgén FT más temprano en el desarrollo de la planta (es decir, durante la fase de crecimiento vegetativo de la planta) para producir un mayor nivel de FT en los tejidos diana que de otro modo se pueden producir en una planta de tipo silvestre en la misma etapa de desarrollo. El tiempo de la expresión del transgén FT durante la etapa vegetativa de desarrollo puede ser importante para afectar uno o más rasgos o fenotipos reproductivos, floración y/o relacionados con el rendimiento mediante la provisión de una señal inductiva oportuna para la producción de un aumento del número de meristemos florales y flores exitosas en uno o más nodo de la planta. Sin estar ligado por ninguna teoría, la expresión de la etapa vegetativa de un transgén FT en una planta puede operar para sincronizar y/o aumentar la floración temprana en uno o más nodos para producir más flores por nodo de la planta. Los promotores que se describen a continuación como parte de la presente invención proporcionan opciones para la expresión de FT óptima.
Como se usa en el presente documento, un promotor de "estado vegetativo" incluye cualquier promotor que inicia, causa, dirige, etc., la transcripción o expresión de su gen asociado (o transgén) durante una o más etapas vegetativas de desarrollo de la planta, tal como, durante una o más de VE, Vc, V1, V2, V3, V4, etc., y/o cualquiera o todas las etapas de desarrollo vegetativo posteriores (por ejemplo, hasta la etapa Vn). Tal promotor de la "etapa vegetativa" también se puede definir como un promotor de "estado vegetativo preferido" que inicia, causa, dirige, etc., la transcripción o expresión de su gen (o transgén) asociado al menos con preferencia o principalmente, si no exclusivamente, durante una o más etapas vegetativas del desarrollo de la planta (en oposición a las etapas reproductivas). Sin embargo, un promotor del "estado vegetativo" y del "estado vegetativo preferido" también puede permitir, causar, etc., la transcripción o expresión de su gen asociado (o transgén) durante la fase de reproducción del desarrollo en una o más células o tejidos de la planta. Los rasgos y características de estas etapas vegetativas para una especie vegetal dada son conocidos en la técnica. Para las plantas dicotiledóneas, las características y rasgos morfológicos vegetativos de la planta durante las etapas vegetativas de desarrollo puede incluir la forma de cotiledones, meristemos vegetativos (apical, lateral/axilar, y raíz), disposición de las hojas, forma de la hoja, borde de la hoja, nervaduras de la hoja, pecíolos, estípulas, ócrea, hipocotilo y raíces. De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, un promotor del "estado vegetativo" también se puede definir adicionalmente por la etapa vegetativa particular durante la cual se inicia primero la transcripción o la expresión de su gen asociado (o transgén) observable o pronunciada. Por ejemplo, un promotor etapa vegetativa puede ser un promotor de la etapa Vc, un promotor de la etapa V1, un promotor de la etapa V2, un promotor de la etapa V3, etc. Como tal, un promotor de la "etapa de Vc" se define como un promotor etapa vegetativa que los primeros iniciados la transcripción de su gen asociado (o transgén) durante la etapa de Vc de desarrollo de la planta, un promotor "etapa V1" se define como un promotor de la etapa vegetativa que primero inicia la transcripción de su gen asociado (o transgén) durante la etapa V1 de desarrollo de la planta, un promotor de la "etapa V2" se define como un promotor de la etapa vegetativa que primero inicia la transcripción de su gen asociado (o transgén) durante la etapa V2 del desarrollo de la planta, y así sucesivamente, aunque la expresión del gen asociado (o transgén) pueden estar presentes en forma continua o discontinua en uno o más tejidos durante el estado vegetativo después del desarrollo. Los expertos en la técnica pueden determinar el momento de la expresión de un gen dado (o transgén) durante el desarrollo de la planta usando diversos ensayos moleculares y técnicas conocidas en la materia.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, un promotor de la “etapa vegetativa” puede incluir un promotor constitutivo, preferido de tejido o específico de tejido. Por ejemplo, un promotor de la etapa vegetativa puede dirigir la expresión de FT en uno o más tejidos de planta, tal como en uno o más de raíz, tallo, hoja/hojas, meristemos, etc., durante una etapa vegetativa del desarrollo de la planta. Sin embargo, tal promotor de etapa vegetativa puede dirigir con la preferencia la expresión de su transgén fT asociado o secuencia codificante en uno o más meristemos de la planta. De acuerdo con muchas realizaciones, un promotor de la "etapa vegetativa" puede ser con preferencia un promotor "específico del meristemo" o "promotor preferido del meristemo” para producir la expresión del transgén FT o secuencia codificante en el tejido meristemático. Se sabe que las proteínas FT operan en los meristemos de una planta para ayudar a desencadenar la transición de crecimiento vegetativo al reproductor después de la translocación de la proteína FT desde las hojas. En contraste, las realizaciones de la presente invención proporcionan la expresión selectiva de un transgén FT directamente en el meristemo de una planta para inducir la floración y causar que la planta adopte un rasgo o fenotipo de reproducción y/o relacionados con el rendimiento alterado. En consecuencia, de acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende un transgén FT o una secuencia codificante unida operativamente a un promotor "específico de meristemo" o "preferido de meristemo" que dirige la expresión del transgén FT al menos con preferencia en uno o más tejidos meristemáticos de una planta cuando se transforma en la planta. Como se usa en el presente documento, "promotor preferido de meristemo" se refiere a promotores que con preferencia causan la expresión de un gen o transgén asociado en al menos un tejido meristemático de una planta con relación a otros tejidos de la planta, mientras que un "promotor específico de meristemo" se refiere a promotores que causan la expresión de un gen o transgén asociado exclusivamente (o casi exclusivamente) en al menos un meristemo de una planta.
Un trabajo reciente que usa tratamientos de luz de “día corto" temprano artificial durante la etapas vegetativas de desarrollo reveló que el tiempo de la floración se puede alterar uno o más rasgos o fenotipos relacionados con el rendimiento (por ejemplo, causar un aumento del número de vainas o semillas por nodo en una planta) y que el efecto de estos tratamientos era dependiente de la dosis con el número de flores, semillas y/o las vainas por planta (y/o por nodo de la planta) en función de (i) la duración de la exposición de día corto (es decir, la dosis de la señal de inducción floral) y (ii) la longitud de los fotoperíodos post-día corto bajo condiciones de día largo (es decir, la dosis o la duración del crecimiento vegetativo que induce la señal después de la señal de inducción de día corto). Véase, por ejemplo, la Patente de EE.UU. N.° 8.935.880 y la publicación de la Solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2014/0259905, presentada anteriormente. Las plantas de soja que experimentan un tratamiento de inducción de día corto temprano (ESDI) menor o menos prolongado (antes de regresar a las condiciones de crecimiento de día largo) presentaron más flores, vainas y semillas por planta con altura y madurez de la planta más normal, mientras que las plantas de soja expuestas a un tratamiento eSDI mayor o más prolongado producen plantas de terminación más temprana, más cortas con un menos vainas y semillas por planta (aunque tal vez con un aumento del número de vainas y/o semillas por nodo).
Sin estar ligado a teoría alguna, se propone que una señal florigénica temprana (por ejemplo, días cortos para la soja y otras plantas SD) desencadena una transición vegetativa a reproductiva temprana de las plantas e incluso la terminación de un subconjunto de sus meristemos primarios. Sin embargo, mediante el retorno de estas plantas a condiciones de crecimiento no inductivas (por ejemplo, días largos para plantas SD) después de la señal Sd inicial, se pueden conservar las reservas meristemáticas restantes de la planta y se pueden extender o mantener la duración reproductiva y/o de floración, de este modo se permite el desarrollo exitoso de un número mayor de flores, vainas y/o semillas por nodo productivas (y/o por planta) durante la fase reproductiva. Con la inducción floral temprana, también se puede crear una mayor superposición entre el desarrollo reproductivo y el crecimiento vegetativo de la planta, que puede promover aún más o coincidir con una duración de reproducción y/o de floración prolongada. Para los fines de la presente invención, "duración reproductiva" se refiere a la longitud de tiempo desde el inicio de la floración hasta el final del desarrollo y/o de llenado de semillas/vaina, mientras que "duración de floración" se refiere la longitud de tiempo desde la aparición de la primera flor abierta hasta que se cierra la última flor abierta. Mediante el retorno a las condiciones de crecimiento no inductivas después de la inducción floral temprana, se puede disponer de recursos más abundantes y dirigirse hacia la producción de un mayor número de flores, vainas y/o semillas por planta exitosas (es decir, sin abortar), a diferencia del desarrollo floral normal en las plantas de día corto, que puede coincidir con la disminución de los recursos vegetales debido a la terminación del crecimiento meristemático y la maduración de la planta.
Sin embargo, además de floración temprana, una señal de inducción floral (por ejemplo, condiciones de día corto temprano) también causa la terminación temprana de la planta. Por lo tanto, se propone que se pueden necesitar una dosis y tiempo de la señal de inducción floral óptimos para maximizar el rendimiento mediante el equilibrio de (i) la transición temprana de vegetativo a reproductivo y/o sincronización de la floración con la señal de inducción floral temprana (que conduce a potenciales aumentos de rendimiento en cada nodo de la planta) en contra de (ii) la terminación de crecimiento temprana (que lleva a plantas más pequeñas con menos internodos, menos ramificación, y menos nodos y/o flores por planta). Se cree que las dosis más bajas de una señal de inducción floral pueden ser suficientes para inducir la floración mientras que disminuye o se minimiza la terminación temprana de la planta, de manera que las plantas más grandes se producen con un mayor número de flores, vainas y/o semillas por nodo (y/o por planta). Por otra parte, las dosis más altas de una señal de inducción floral pueden causar la terminación temprana de la planta (además de floración temprana) para producir plantas más pequeñas con un número relativamente menor número de flores, vainas y/o semillas por planta debido al tamaño de planta más pequeña con un menor número de internodos y/o ramas por planta, a pesar de tener tal vez un mayor número de flores, vainas y/o semillas por nodo (y/o por planta) con respecto a las plantas de tipo silvestre o control en condiciones de crecimiento normales. Como se ha indicado anteriormente, estos efectos de la expresión ectópica de FT también pueden incluir un aumento del número de cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, tubérculos, etc., por nodo (y/o por planta), de acuerdo con las especies de plantas particulares.
Como se mencionó antes, el fenotipo de inducción de día corto en soja se usó para la detección de genes que tienen expresión alterada en esas plantas a través de perfiles de transcripción. Estos estudios llevaron a la identificación de un gen FT endógeno, Gm.FT2a, que tiene un aumento de expresión en respuesta al tratamiento de inducción de día corto. De acuerdo con ello, actualmente se propone que la expresión de un transgén FT florigénico se puede utilizar como una señal de inducción floral para provocar la floración temprana y el aumento de flores, vainas y/o semillas por nodo (y/o por planta) con respecto a la planta tipo silvestre o control que no tiene el transgén FT. De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, el control apropiado del tiempo, ubicación y dosis de la expresión de FT florigénico durante las etapas vegetativas de desarrollo se puede utilizar para inducir la floración y producir plantas que tienen un aumento de flores, vainas y/o semillas por nodo con respecto a una planta tipo silvestre o control que no tiene el transgén FT. En lugar de intentar expresar transitoriamente FT y recapitular el tiempo de los tratamientos eSDI, se propone que FT se puede expresar débilmente en el meristemo vegetativo para proporcionar la señal de inducción floral temprana. De acuerdo con ello, se seleccionó un promotor del gen Erecta (pErecta o pEr) que tiene expresión meristemática débil durante las etapas vegetativas de desarrollo para la prueba inicial con un transgén Gm.FT2a. Sin embargo, debido a que los estudios previos mostraron que la expresión constitutiva de FT produjo plantas que tiene un fenotipo de terminación temprana fuerte y, además, que el sitio de acción del FT producido periféricamente y translocado de las hojas está en el meristemo, era posible que la expresión meristemática directa de FT podría producir fenotipos aún más potentes y fuertes (y/o plantas no viables) con respecto a la expresión de FT constitutiva.
Los efectos de la sobreexpresión de Gm.FT2a se observaron inmediatamente en plantas de soja transformadas R0, que tenían floración temprana, rendimiento de semilla reducida (por ejemplo, solo aproximadamente 8 semillas/planta), y terminación muy temprana, lo que sugiere que el equilibrio entre la inducción floral y la represión floral/crecimiento vegetativo era fuertemente a favor de la floración y la terminación temprana. Sin embargo, se rescató suficiente semilla R1 a partir de estas plantas para permitir la realización de experimentos adicionales. Se propuso que el crecimiento de la semilla de soja R1 bajo condiciones de fotoperíodo de día largo (represivo floral) en el invernadero podría retrasar los fenotipos de floración y terminación temprana observados en las plantas R0. Tomando en cuenta la dosis teorizada, se propone, además, que las plantas de soja homocigotas, hemicigotas y nulas segregantes de FT2a se pueden analizar juntas en el invernadero para evaluar la respuesta de dosis resultante de la sobreexpresión de FT. En estos experimentos (como se describe más adelante), se observó que las plantas segregantes tenían diferentes fenotipos: las plantas nulas eran similares a las plantas de tipo silvestre en términos de arquitectura de la planta y las vainas por nodo (y por planta), mientras que las plantas homocigotas terminaron temprano con un fenotipo de atrofia grave (aunque posiblemente con un aumento del número de vainas por nodo). Sin embargo, las plantas hemicigotas eran casi tan grandes como las plantas nulas o de tipo silvestre, pero exhibieron el fenotipo de hiper-floración con un aumento del número de vainas por nodo (y/o por planta) Estos hallazgos muestran que la etapa vegetativa y/o la expresión meristemática de un transgén FT florigénico se puede utilizar para producir una planta de alto rendimiento (similar al tratamiento eSDI), y que el efecto de la expresión de FT es dependiente de la dosis ya que las plantas de soja hemicigotas para el transgén FT2a bajo el control de un promotor meristemático débil presentaron el fenotipo de alto rendimiento de aumento de vainas por nodo sin los fenotipos más graves de terminación temprana y altura de planta baja observados con las plantas FT2a homocigotas cuando se cultivan bajo condiciones de día largo (vegetativas).
De modo interesante, sin embargo, se observó a menudo un mayor número de vainas por nodo de manera independiente de la duración de la reproducción (R1-R7) en condiciones de invernadero y no estaba perfectamente correlacionado con la floración temprana entre los transgenes FT analizados, aunque es posible que la duración de la floración todavía se pueda prolongar en algunos casos (por lo menos durante una o más etapas reproductivas), incluso si la duración total reproductiva no cambia significativamente en relación con las plantas de control. Sin estar ligado por ninguna teoría, se considera que el aumento del número de vainas por nodo en las plantas FT transgénicos puede provenir al menos en parte de un incremento en el número de inflorescencia y los meristemos florales inducidos del brote apical vegetativo y meristemos axilares en cada uno de los nodos afectados, lo que puede dar origen a un mayor número de flores y/o racimos florales liberados en los nodo. Tal aumento en el número de meristemos florales inducidos en cada nodo de la planta en respuesta a la sobreexpresión de FT puede operar a través de uno o más mecanismos o vías, que pueden ser independientes del tiempo de floración y/o la duración reproductiva. Sin embargo, los cambios meristemáticas pueden ser microscópicos al principio, y por lo tanto no se ha observado que causan "floración temprana" en dicha etapa por simple inspección visual a pesar de que los cambios reproductivos en los meristemos ya pueden haberse comenzado a producir.
Sin estar limitado por teoría alguna, la expresión de FT vegetativa temprana puede causar que se formen meristemos más reproductivos y se desarrollen antes de lo normal en uno o más nodos de la planta transgénica. Estos meristemos reproductivos luego pueden permitir o producir que se forme un mayor número de racimos florales y se alargue con flores en cada nodo. Por otro lado, también se teoriza que la expresión tardía de FT durante las etapas reproductivas puede actuar para reprimir el desarrollo floral adicional en cada nodo. Por lo tanto, el desarrollo tardío de las flores del respectivo racimo puede terminar, y por lo tanto más recursos de la planta se pueden dirigir a las flores de desarrollo temprano dentro del racimo para producir de manera más efectivamente las vainas de tamaño completo. Por consiguiente, se contempla que mediante (i) la formación de un mayor número de inflorescencias y meristemos florales en cada nodo por inducción temprana FT, y luego (ii) la dirección de más recursos de la planta a las flores desarrolladas en más forma temprana dentro de cada uno de los racimos mediante la terminación de las flores de desarrollo más tardío, se puede producir el aumento de la sincronización del desarrollo floral con la formación de un mayor número de vainas maduras por nodo de la planta.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, se proporciona una molécula de ADN recombinante que comprende una secuencia codificante de FT unida operativamente a un promotor de la etapa vegetativa, que también puede ser un promotor preferido del meristemo y/o específico del meristemo. Por ejemplo, el promotor puede incluir el promotor pAt.Erecta de Arabidopsis (SEQ ID NO: 21), o un fragmento funcional o porción de este. Dos ejemplos de una porción truncada del promotor pAt.Erecta de acuerdo con las realizaciones de la presente invención se proporcionan como la SEQ ID NO: 22 y SEQ ID NO: 38. Véase, por ejemplo, Yokoyama, R. y col., “The Arabidopsis ERECTA gene is expressed in the shoot apical meristem and organ primordia”, The Plant Journal15(3): 301-310 (1998). pAt.Erecta es un ejemplo de un promotor de la etapa vegetativa que también es preferido del meristemo. Otros promotores de la etapa vegetativa, preferido del meristemo o específico del meristemo se han identificado sobre la base de su perfil de expresión característico (Véase, por ejemplo, los siguientes Ejemplos 4 y 7) que también se pueden usar para dirigir la expresión de FT de acuerdo con las realizaciones de la presente invención. Por ejemplo, se identificaron los genes del receptor tipo quinasa de soja (RLK) que se pueden usar como promotores de la etapa vegetativa, preferidos del meristemo: Glyma10g38730 (SEQ ID NO: 23), Glyma09g27950 (SEQ ID NO: 24), Glyma06g05900 (SEQ ID NO: 25), y Glyma17g34380 (SEQ ID NO: 26). Los promotores de la etapa vegetativa, preferidos del meristemo de acuerdo con las realizaciones de la presente invención también pueden incluir los promotores del gen del receptor de tipo quinasa (RLK) de patata: PGSC0003DMP400032802 (SeQ ID NO: 27) y PGSC0003DMP400054040 (SEQ ID NO: 28). Debido a la caracterización provista en el presente documento, el promotor de pAt.Erecta que dirige la expresión de FT y los perfiles de expresión similares identificados para otros genes RLK, Erecta o Erecta-like(Erl), los promotores de la etapa vegetativa, preferido del meristemo o específico del meristemo de la presente invención también pueden comprender cualquiera de las secuencias promotoras conocidas o identificadas posteriormente de los genes RLK, Erecta y Erecta-like de otras especies de dicotiledóneas que tienen patrón de expresión de la etapa vegetativa en los meristemos de las plantas.
Los ejemplos adicionales de promotores de etapa vegetativa, preferido del meristemo o específico del meristemo pueden incluir los de los siguientes genes de Arabidopsis: Pinhead (At.PNH) (SEQ ID NO: 29), Angustifolia 3or At.AN3 (SEQ ID NO: 30), At.MYB17 (At.LMI2 o Identidad del meristemo tardío 2; At3g61250) (SEQ ID NO: 31), gen tipo quinesina (At5g55520) (SEQ ID NO: 32), genes tipo AP2/B3, que incluyen los genes At.REM17 (SEQ ID NO: 33) o At.REM19, y Erecta-like 1 y 2, At.Erl1 (SEQ ID NO: 34) y At.Erl2 (SEQ ID NO: 35), y porciones funcionales de estos. La secuencia de polinucleótidos de estos promotores (o un fragmento funcional de este) también puede tener una identidad de secuencia relajada mientras que aún mantienen un patrón de expresión similar o idéntico de un gen o transgén asociado unido operativamente al promotor. Por ejemplo, el promotor puede comprender una secuencia de polinucleótidos que es al menos 85%, al menos 90%, al menos 91%, al menos 92%, al menos 93%, al menos 94%, al menos 95%, al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, o al menos 99% idéntica a una secuencia de polinucleótidos seleccionada de la anterior SEQ ID NO: 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34 o 35, o una porción funcional de este. Una "porción funcional" de una secuencia promotora conocida o provista se define como una o más porciones continuas o discontinuas de la secuencia promotora conocida, o provista que puede dirigir funcionalmente, causar, promover, etc., la expresión de su gen asociado (o transgén) de una manera que es idéntica o similar a la secuencia promotora conocida o provista. Sobre la base de la presente descripción, los expertos en la técnica pueden determinar si un promotor que comprende una o más porciones de una secuencia promotora conocida o provista, y/o que tiene una secuencia más corta y/o una identidad de secuencia más relajada a una secuencia promotora conocida o provista, produce un patrón de expresión similar y/o fenotipos o efectos similares cuando su transgén FT asociado se expresa en una planta en comparación con la secuencia promotora conocida o provista.
Como se indica anteriormente, una molécula de ADN recombinante de la presente invención generalmente puede comprender un transgén o casete de expresión FT que incluye una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína de FT que se une operativamente a un promotor de la etapa vegetativa, que también puede ser un promotor preferido del meristemo o específico del meristemo. La secuencia de polinucleótidos que codifica el transgén o casete de expresión FT también puede estar unido operativamente a uno o más de uno o más elementos reguladores, tal como un potenciador, líder, sitio de inicio de transcripción (TSS), enlazador, regiones no traducidas 5' y 3', intrón, señal de poliadenilación, región o secuencia de terminación, etc., que son adecuados o necesarios para regular o permitir la expresión del transgén FT o casete para producir eficazmente una proteína FT en una célula de planta. Tal elemento regulador adicional puede ser opcional y se usa para mejorar u optimizar la expresión del transgén. Para los fines de la presente invención, un "potenciador" se puede distinguir de un "promotor" en que un promotor típicamente carece de un sitio de transcripción de inicio, caja TATA, o una secuencia equivalente y es por lo tanto insuficiente por sí solo para impulsar la transcripción. Como se usa en este documento, un "líder" puede ser definido generalmente como la secuencia de ADN de la región 5' no traducida (5' UTR) de un gen (o transgén) entre el sitio de inicio de transcripción (TSS) y el sitio de inicio de la secuencia codificante de proteína.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, el término "recombinante" en referencia a una molécula, construcción de ADN, vector, etc., se refiere a una molécula o secuencia de ADN que no se encuentra en la naturaleza y/o está presente en un contexto en el que no se encuentra en la naturaleza, que incluye una molécula, construcción de ADN, etc., que comprende una combinación de secuencias de ADN que no se producen naturalmente de forma continua o en estrecha proximidad entre sí sin la intervención humana, y/o una molécula, construcción de ADN, etc., que comprende al menos dos secuencias de ADN que son heterólogas con respecto a otra. Una molécula, construcción de ADN recombinante, etc., puede comprender las secuencias de ADN que están separadas de otras secuencias de polinucleótidos que existen en la proximidad de dicha secuencia de ADN en la naturaleza, y/o una secuencia de a Dn que es adyacente a (o contigua con) otras secuencias de polinucleótidos que no están naturalmente en proximidad entre sí. Una molécula, construcción de ADN recombinante, etc., también se puede referir a una molécula o secuencia de ADN que se ha manipulado genéticamente y construido fuera de una célula. Por ejemplo, una molécula de ADN recombinante puede comprender cualquier plásmido, vector, etc., adecuado y puede incluir una molécula de ADN lineal o circular. Tales plásmidos, vectores, etc., pueden contener diversos elementos de mantenimiento que incluyen un origen de replicación procariótico y un marcador seleccionable, así como un transgén que expresa FT o casete de expresión tal vez además de un gen marcador seleccionable de la planta, etc.
Como se introdujo anteriormente, los efectos florigénicos de la expresión FT pueden ser resistidos por la actividad de diversas otras proteínas antiflorigénicas (o no florigénicas), tal como los genes de tal como Terminal Flower (TFL), en el meristemo de una planta. El tiempo y duración de la floración se pueden observar en consecuencia como un equilibrio entre las señales florigénica y antiflorigénica presentes en el meristemo de una planta. Por consiguiente, también se propone que el tiempo de floración en una planta puede ser alterado o inducido por la supresión de uno o más genes antiflorigénicos durante las etapas vegetativas de desarrollo para hacer que el meristemo vegetativo sea más receptivo a una señal florigénica. En la soja, por ejemplo, los genes relacionados con TFL1 de Arabidopsis se expresan principalmente en los meristemos florales en los que estos oponen las funciones de las señales florigénicas para regular las decisiones de desarrollo como el hábito de crecimiento del tallo. En particular, los genes tipo TFL1, TFL1a y TFL1b, en la soja se expresan en el meristemo apical del brote, y la diversidad alélica en TFL1b en gran parte puede ser responsable de los cambios de hábito de crecimiento del tallo de la soja que producen un crecimiento determinado o indeterminado. Véase, por ejemplo, Liu, B. y col., “The soybean stem growth habit gene Dt1 is an ortholog of Arabidopsis TERMINAL FlOw e R1.” Plant Physio/153(1):198-210 (2010). Por consiguiente, la supresión de la expresión de TFL u otra proteína antiflorigénica en el meristemo de una planta dicotiledónea puede producir un aumento de la sensibilidad de estos tejidos meristemáticos a las señales florigénicas, tales como FT, lo que da como resultado la floración temprana y el aumento de vainas por nodo, de manera similar a la sobreexpresión de FT en estos tejidos.
En consecuencia, se contempla que una molécula de ADN recombinante de la presente invención también puede comprender una construcción de supresión que tiene una secuencia de ADN transcribible unida operativamente a un promotor de la etapa vegetativa, que también puede ser un promotor preferido del meristemo o específico del meristemo, donde la secuencia de ADN transcribible codifica una molécula de ARN que causa la supresión específica de un gen antiflorigénico endógeno, tal como un gen TFL. Varios procedimientos para la supresión de la expresión de un gen endógeno son conocidos en la técnica.
De acuerdo con otro aspecto amplio de la presente invención, se proporcionan procedimientos para transformar una célula, tejido o explante de planta con una molécula o construcción de ADN recombinante o que comprende un transgén o casete de expresión FT para producir una planta transgénica. Numerosos procedimientos para la transformación de los cromosomas en una célula de planta con una molécula de ADN recombinante se conocen en la técnica, que se pueden usar de acuerdo con los procedimientos de la presente invención para producir una célula de planta y una planta transgénica. Cualquier procedimiento o técnica adecuados para la transformación de una célula de planta conocido en la técnica se puede usar de acuerdo con los procedimientos presentes. Los procedimientos eficaces para la transformación de plantas incluyen la transformación mediada por bacterias, tal como mediada por Agrobacterium o la transformación mediada por Rhizobium, y transformación mediada por bombardeo con microproyectiles. Una variedad de procedimientos se conocen en la técnica para la transformación de explantes con un vector de transformación a través de la transformación mediada por bacterias o bombardeo con microproyectiles y, posteriormente, el cultivo, etc., los explantes para regenerar o desarrollar plantas transgénicas. Otros procedimientos para la transformación de plantas, tales como microinyección, electroporación, infiltración al vacío, presión, sonicación, agitación con fibra de carburo de silicio, transformación mediada por PEG, etc., también son conocidos en la técnica. Las plantas transgénicas producidas por estos procedimientos de transformación pueden ser quiméricos o no quiméricos para el evento de transformación, en función de los procedimientos y explantes usados. Los procedimientos también se proporcionan para expresar un transgén FT en una o más células o tejidos de la planta bajo el control de un promotor de la etapa vegetativa, que también puede ser un promotor preferido del meristemo o específico del meristemo. Tales procedimientos se pueden usar para alterar el tiempo de floración de una planta y/o el número de flores, frutas, vainas y/o semillas por nodo de las plantas productivas o exitosas con relación a una planta tipo silvestre o control que no tienen el transgén FT. En efecto, los procedimientos de la presente invención se pueden usar para alterar los fenotipos o rasgos relacionados con la reproducción o rendimiento de la planta transgénica.
La transformación de un material de planta o explante deseado se puede practicar en cultivo de tejidos en medios de nutrientes, por ejemplo una mezcla de nutrientes que permiten que las células crezcan in vitro. Los blancos o explantes de células receptoras pueden incluir, pero sin limitación, meristemos, puntas de los brotes, protoplastos, hipocotilos, callos, embriones inmaduros o maduros, brotes, yemas, secciones nodales, hojas, células de gametos tales como microesporas, polen, esperma y células del huevo, etc., o cualquiera de sus porciones adecuadas. Se contempla que se puede usar cualquier célula o tejido transformable del cual se puede regenerar o cultivar/desarrollar una planta fértil como diana para la transformación. Los explantes, células o tejidos transformados se pueden someter a etapas de cultivo adicionales, tales como la inducción, selección, regeneración, etc. del callo, como se conoce en la técnica. Las células, tejidos o explantes transformados que contienen una inserción de ADN recombinante se pueden cultivar, desarrollar o regenerar en plantas transgénicas en cultivo, tapones o el suelo de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica. Las plantas transgénicas también se pueden cruzar a sí mismas u otras plantas para producir semillas transgénicas y progenie. Una planta transgénica también se puede preparar mediante el cruzamiento de una primera planta que comprende la secuencia de ADN recombinante o el evento de transformación con una segunda planta que carece de la inserción. Por ejemplo, una secuencia de ADN recombinante se puede introducir en una primera línea de plantas que es susceptible de transformación, que luego se puede cruzar con una segunda línea de plantas para introgresar la secuencia de ADN recombinante en la segunda línea de plantas. La progenie de estos cruzamientos también se puede retrocruzar en la línea más deseable varias veces, tal como a través de 6 a 8 generaciones o retrocruzamientos, para producir una planta de progenie con sustancialmente el mismo genotipo que la línea parental original, pero para la introducción de la secuencia de ADN recombinante.
Una molécula o construcción de ADN recombinante de la presente invención se puede incluir dentro de un vector de transformación de ADN para su uso en la transformación de una célula, tejido o explante de planta diana. Tal vector de transformación de la presente invención generalmente puede comprender secuencias o elementos necesarios o beneficiosos para la transformación efectiva además del transgén o casete de expresión que expresa FT. Para la transformación mediada por Agrobacterium, el vector de transformación puede comprender un segmento o región de ADN de transferencia manipulado genéticamente (o T-ADN) que tiene dos secuencias límite, un límite izquierdo (LB) y un límite derecho (RB), que flanquean al menos el transgén o casete de expresión que expresa FT, de tal manera que la inserción del T-ADN en el genoma de la planta creará un evento de transformación para el transgén o casete de expresión de FT. En otras palabras, el transgén o casete de expresión de FT se puede ubicar entre los límites izquierdo y derecho del T-ADN, tal vez junto con un transgén o casete de expresión adicional, tal como un transgén del marcador seleccionable de planta y/u otros genes de interés agronómico que pueden conferir un rasgo o fenotipo de interés agronómico a una planta. Además de las secuencias codificadoras de proteínas, un gen de interés agronómico puede comprender además una secuencia de polinucleótido que codifica un elemento de supresión de ARN. De acuerdo con realizaciones alternativas, el transgén o casete de expresión FT y el transgén del marcador seleccionable de planta (u otro gen de interés agronómico) pueden estar presentes en los segmentos de ADN-T separados en la misma o diferente molécula de ADN recombinante, tal como para la co-transformación. Un vector de transformación o construcción también puede comprender elementos de mantenimiento de procariotas, que para la transformación mediada por Agrobacterium pueden estar ubicados en la estructura principal del vector fuera de la región de T-ADN.
Un transgén del marcador seleccionable de planta en un vector de transformación o construcción de la presente invención se pueden usar para ayudar en la selección de células o tejidos transformados debido a la presencia de un agente de selección, tal como un antibiótico o herbicida, donde el transgén del marcador seleccionable de la planta proporciona tolerancia o resistencia al agente de selección. Por lo tanto, el agente de selección puede sesgar o favorecer la supervivencia, desarrollo, crecimiento, proliferación, etc., de las células transformadas que expresan el gen marcador seleccionable de la planta, tales como para aumentar la proporción de células o tejidos transformados en la planta R0. Los genes del marcador seleccionable de planta comúnmente usados incluyen, por ejemplo, los que confieren tolerancia o resistencia a los antibióticos, tales como kanamicina y paromomicina (nptII), higromicina B (aph IV), estreptomicina o espectinomicina (aadA) y gentamicina (aac3 y AACC 4), o los que confieren tolerancia o resistencia a herbicidas tales como glufosinato (bar o pat), dicamba (DMO) y el glifosato (aroA o EPSPS). También se pueden usar genes del marcador detectable de la planta, que proporcionan una capacidad de detectar visualmente los transformantes, tales como la luciferasa o la proteína verde fluorescente (GFP), o un gen que expresa una beta glucuronidasa o gen uidA (GUS) para los que se conocen diversos sustratos cromogénicos.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, los procedimientos para transformar una célula, tejido o explante de planta con una molécula o construcción de ADN recombinante también pueden incluir la integración dirigida al sitio o dirigida. De acuerdo con estos procedimientos, una porción de una molécula de molde donante de ADN recombinante (es decir, una secuencia de inserción) se puede insertar o integrar en un sitio o locus deseado en el genoma de la planta. La secuencia de inserción del molde donante puede comprender un transgén o construcción, tal como un transgén o construcción de FT que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína FT florigénica operativamente unida a un promotor de la etapa vegetativa, que también puede ser un promotor preferido del meristemo o específico del meristemo. El molde donante también puede tener uno o dos brazos de homología que flanquean la secuencia de inserción para promover el evento de inserción específico a través de recombinación homóloga y/o reparación dirigida por homología. Por lo tanto, una molécula de a Dn recombinante de la presente invención puede incluir además un molde donante para la integración dirigida al sitio o dirigida de un transgén o construcción, tal como un transgén o construcción de FT, en el genoma de una planta.
Se puede elegir cualquier sitio o locus en el genoma de una planta para la integración dirigida al sitio de un transgén o construcción de la presente invención. Para la integración dirigida al sitio, una ruptura de doble cadena (DSB) o la mella se puede realizar primero en un locus genómico seleccionado con una nucleasa específica del sitio, tal como, por ejemplo, una nucleasa dedo de zinc, una meganucleasa manipulada genéticamente o natural, una endonucleasa TALE, o una endonucleasa guiada por ARN (por ejemplo, Cas9 o CPF1). Se puede usar cualquier procedimiento conocido en la técnica para la integración dirigida al sitio. En presencia de una molécula molde donante, el DSB o mella luego se puede reparar mediante la recombinación homóloga entre las ramas de homología del molde donante y el genoma de la planta, o por la unión de extremos no homólogos (NHEJ), lo que produce la integración dirigida al sitio de la secuencia de la inserción en el genoma de la planta para crear el evento de inserción dirigida en el sitio del DSB o mella. Por lo tanto, se puede obtener la inserción o la integración específica de sitio de un transgén o construcción.
De acuerdo con las realizaciones de la presente invención, una planta que puede ser transformada con una molécula de ADN recombinante o vector de transformación que comprende un transgén FT puede incluir una variedad de plantas con flores o angiospermas, que también se puede definir como que incluye varias especies de plantas dicotiledóneas (dicotiledónea), tales como soja, algodón, alfalfa, canola, remolacha azucarera, alfalfa y otras plantas leguminosas. Una planta dicotiledónea podría ser un miembro de la Brassica sp. (por ejemplo, B. napus, B. rapa, B. júncea), particularmente aquellas especies de Brassica útiles como fuentes de semillas oleaginosas, alfalfa (Medicago sativa), girasol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), palma de aceite (Elaeis spp), sésamo (Sesamum spp.), coco (Cocos spp.), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), patata (Solanum tuberosum), maníes (Arachis hypogaea), algodón (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), batata (Ipomoea batatas), yuca (Manihot esculenta), café (Coffea spp.), té (Camela spp.), árboles frutales, tales como manzana (Malus spp.), Prunus spp., tales como ciruela, damasco, durazno, cereza, etc., pera (Pyrus spp.), higo (Ficus casica), banana (Musa spp.), etc., árboles de cítricos (Citrus spp.), cacao (Theobroma cacao), palta (Persea americana), oliva (Olea europaea), almendro (Prunus amygdalus), nogal (Juglans spp.), frutilla (Fragaria spp.), sandía (Citrullus lanatus), pimiento (Capsicum spp.), remolacha azucarera (Beta vulgaris), uva (Vitis, Muscadinia ), tomate (Lycopersicon esculentum, Solanum lycopersicum) y pepino (Cucumis sativis). Las plantas leguminosas incluyen porotos y arvejas. Los porotos incluyen, por ejemplo, guar, algarroba, fenogreco, soja, alubias, caupí, poroto mungo, poroto lima, habas, lentejas y garbanzos. Debido a que la presente invención se puede aplicar a una amplia variedad de especies de plantas, la presente invención se aplica además a otras estructuras botánicas análogas a las vainas de leguminosas, tales como cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, tubérculos, etc. De acuerdo con las realizaciones de la presente invención y en función de la especie de planta transformada particular, una planta que expresa ectópicamente una secuencia FT florigénica puede tener un número alterado o mayor de cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, tubérculos, etc., por nodo, tallo principal, y/o ramas de la planta, y/o un número alterado o mayor de las cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, tubérculos, etc., por planta, en relación con una planta tipo silvestre o control que no tiene el transgén FT.
De acuerdo con otro aspecto amplio de la presente invención, se proporcionan una planta, célula de planta, semilla y parte de planta transgénica que comprende un evento de transformación o inserción en el genoma de al menos una célula de planta de este, el evento de transformación o inserción que comprende una secuencia de ADN, construcción o polinucleótido recombinante que incluye un transgén o casete de expresión de locus de floración T (FT), en el que el transgén o casete de expresión FT comprende además una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína FT unida operativamente a un promotor de la etapa vegetativa, que también puede ser un promotor preferido del meristemo o específico del meristemo. La proteína FT codificada por la secuencia de polinucleótidos puede ser natural para la planta transgénica transformada con la secuencia de polinucleótidos u homóloga o de otro modo similar a una proteína natural FT a la planta transgénica (es decir, no es natural para la planta transgénica). Tal planta transgénica puede ser producida por cualquier procedimiento de transformación adecuado, que puede ser seguido por la selección, cultivo, regeneración, desarrollo, etc., según sea deseado o necesario para producir una planta transgénica R0, que luego se puede autofecundar o cruzar con otras plantas para generar semillas R1 y las posteriores generaciones de la progenie y las semillas a través de cruzamientos adicionales, etc. Del mismo modo, las realizaciones de la presente invención incluyen además una célula de planta, tejido, explante, etc., que comprende una o más células transgénicas que tienen un evento de transformación o inserción genómica de un ADN recombinante o secuencia de polinucleótidos que comprende un transgén FT.
Las plantas, células de plantas, semillas y partes de plantas transgénicas de la presente invención pueden ser homocigotas o hemicigotas para un evento transgénico o la inserción de un transgén o casete de expresión FT en el genoma de al menos una célula de la planta de este o pueden contener cualquier número de copias de un evento transgénico o inserción que comprende un transgén o casete de expresión FT. La dosis o cantidad de expresión de un transgén o casete de expresión FT se pueden alterar por su cigosidad y/o número de copias, lo que puede afectar al grado o extensión de los cambios fenotípicos en la planta transgénica, etc. De acuerdo con algunas realizaciones, una planta transgénica que comprende un transgén fT se puede caracterizar además por tener uno o más de rasgos o fenotipos de floración o reproductivos alterados, que pueden incluir los fenotipos o rasgos relacionados con el rendimiento alterados, tales como un aumento en el número de flores, vainas, etc. y/o semillas por planta (y/o por nodo de la planta) con respecto a una planta tipo silvestre o control que no tiene el transgén FT. Tal planta transgénica puede estar caracterizada además por tener una estructura, morfología y/o arquitectura alterada debido a la alteración de la altura de la planta, patrones de ramificación, número de nodos florales, etc., en relación con una planta tipo silvestre o control. En efecto, los fenotipos o rasgos relacionados con el rendimiento alterados por la sobreexpresión de FT en una planta transgénica pueden incluir: tiempo de floración, duración reproductiva, duración de la floración, dosis o frecuencia de la abscisión de flores, vainas, silicuas, cápsulas, frutas, frutos secos, etc., número de flores por nodo, número de racimos por nodo, número de ramas, número de nodos por planta, número de nodos en el tallo principal, el número de nodos en las ramas, número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, etc., por planta, número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, etc., por nodo, número de vainas en el tallo principal, número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, etc., en las ramas, peso de 1000 semillas, número de semillas por planta, número de semillas por nodo, y arquitectura de la planta/o arquitectura alterada, en comparación con una planta tipo silvestre o control que no tiene el transgén FT.
Para los fines de la presente invención, una "planta" puede incluir un explante, plántula, platines o planta entera en cualquier etapa de la regeneración o desarrollo. Como se usa en el presente documento, una "planta transgénica" se refiere a una planta cuyo genoma ha sido alterado por la integración o la inserción de una molécula, construcción o secuencia de ADN recombinante. Una planta transgénica que incluye una planta R0 desarrollada o regenerada a partir de una célula de planta transformada originalmente, así como las plantas transgénicas de progenie en generaciones o cruzamientos posteriores de la planta transgénica R0. Como se usa en el presente documento, una "parte de planta" se puede referir a cualquier órgano o tejido intacto de una planta, tal como un meristemo, órgano/estructura del brote (por ejemplo, hoja, tallo y tubérculos), raíces, flores u órganos/estructura floral (por ejemplo, brácteas, sépalos, pétalos, estambres, carpelos, anteras y óvulos), semillas (por ejemplo, embriones, endospermo y cubierta de la semilla), fruta (por ejemplo, el ovario maduro), propágulos, u otros tejidos de planta (por ejemplo, tejido vascular, tejido fundamental, y similares), o cualquier porción de este. Las partes de la planta de la presente invención pueden ser viables, no viables, regenerables, y/o no regenerables. Un "propágulo" puede incluir cualquier parte de la planta que es capaz de crecer en una planta entera. Para los fines de la presente invención, una célula de planta transformada con un transgén FT de acuerdo con las realizaciones de la presente invención pueden incluir cualquier célula de la planta que es competente para la transformación como se entiende en la técnica sobre la base del procedimiento de transformación, tal como una célula de meristemo, una célula embrionaria, una célula de callo, etc. Como se usa en el presente documento, una "célula de planta transgénica" se refiere simplemente a cualquier célula de la planta que se transforma con una molécula o secuencia de ADN recombinante integrada de forma estable. Una célula de planta transgénica puede incluir una célula de planta transformada originalmente, una célula de planta transgénica de una planta R0 regenerada o desarrollada, o una célula de planta transgénica proveniente de cualquier planta de progenie o descendencia de la planta R0 transformada, que incluye las células de una semilla o embrión de planta, o una planta cultivada o de células de callo, etc.
Las realizaciones de la presente invención pueden incluir, además, procedimientos para la fabricación o la producción de plantas transgénicas que tienen rasgos o fenotipos reproductivos y/o relacionados con el rendimiento alterados, tales como por transformación, cruzamiento, etc., en el que el procedimiento comprende la introducción de una molécula o una secuencia de ADN recombinante que comprende un transgén FT en una célula de planta y, luego la regeneración o el desarrollo de la planta transgénica a partir de la célula de planta transformada, que se puede realizar bajo presión de selección que favorece el evento transgénico. Tales procedimientos pueden comprender la transformación de una célula de planta con una molécula o secuencia de ADN recombinante que comprende un transgén de FT, y seleccionar una planta que tiene uno o más fenotipos o rasgos alterados, tales como uno o más de los siguientes: tiempo de floración, duración reproductiva, duración de floración, dosis o frecuencia de la abscisión de flores, vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, etc., número de flores por nodo, número de racimos de cada nodo, número de ramas, número de nodo por planta, número de nodos en la tallo principal, número de nodo en las ramas, número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos por planta, número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, etc., por nodo, número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, etc., en el tallo principal, número de vainas, cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos, etc., en las ramas, peso de 1000 semillas, número de semillas por planta, número de semillas por nodo, y una alteración de la arquitectura de planta, en comparación con una planta tipo silvestre o control que no tiene el transgén FT. Por ejemplo, las realizaciones de la presente invención pueden comprender procedimientos para producir una planta transgénica que tiene un aumento del número de flores, vainas, y/o semillas por planta (y/o un aumento del número de flores, vainas, y/o semillas por nodo de la planta), donde el procedimiento comprende introducir una molécula de ADN recombinante que comprende un transgén FT en una células de planta y luego regenerar o desarrollar la planta transgénica de la célula de planta.
De acuerdo con otro amplio aspecto de la presente invención, se proporcionan procedimientos para plantar una planta transgénica de la presente invención a una densidad normal o alta en el campo. De acuerdo con algunas realizaciones, el rendimiento de una planta de cultivo por acre (o por área de tierra) se puede aumentar mediante la plantación de una planta transgénica de la presente invención a una densidad mayor en el campo. Como se describe en el presente documento, las plantas transgénicas de la presente invención que expresan una proteína FT florigénica durante las etapas vegetativas de desarrollo pueden presentar vainas por nodo aumentadas (en particular en el tallo principal), pero también pueden tener una arquitectura de la planta alterada con la reducción de la ramificación y menos nodos por rama. Por lo tanto, se propone que las plantas transgénicas de la presente invención se pueden sembrar a una densidad más alta para aumentar el rendimiento por acre en el campo. Para los cultivos en surcos, se puede obtener una mayor densidad mediante la plantación de un mayor número de semillas/plantas por longitud del surco y/o por la disminución de la separación entre filas. De acuerdo con algunas realizaciones, una planta de cultivo transgénica de la presente invención se puede plantar a una densidad en el campo (plantas por área de tierra/campo) que es al menos 5%, 10%, 15%, 20%, 25%, 50 %, 75%, 100%, 125%, 150%, 175%, 200%, 225%, o 250% mayor que una densidad de plantación normal para estas plantas de cultivo de acuerdo con las prácticas agronómicas estándares.
Para la soja, la densidad de plantación típica está en un intervalo de aproximadamente 100.000 a 150.000 semillas por acre, y la separación típica del surco está en un intervalo de aproximadamente 26 a aproximadamente 40 pulgadas, tal como 30 pulgadas o 36 pulgadas de separación entre surcos. En un surco determinado, normalmente se pueden plantar aproximadamente 6-8 semillas de soja por pie. En contraste, la plantación de alta densidad para soja puede incluir un intervalo de aproximadamente 150.000 a 250.000 semillas por acre, y la separación entre surcos puede estar dentro de un intervalo de aproximadamente 10 pulgadas o menos a aproximadamente 25 pulgadas, tal como 10 pulgadas, 15 pulgadas o 20 pulgadas de separación entre surcos. Para la plantación de alta densidad, se pueden plantar aproximadamente 9-12 semillas de soja por pie dentro de cada surco, tal vez en combinación con una separación entre surcos más estrecha. Sin embargo, la alta densidad de cultivo se puede lograr mediante la separación entre surcos estrecha sin un aumento en la densidad de plantación dentro de cada surco.
Para el algodón, la densidad de plantación típica está en un intervalo de aproximadamente 28.000 a 45.000 semillas por acre, y la separación típica del surco está en un intervalo de aproximadamente 38 a aproximadamente 40 pulgadas, tal como 38 pulgadas o 40 pulgadas de separación entre surcos. En un surco determinado, normalmente se pueden plantar aproximadamente 2-3 semillas de algodón por pie. En contraste, la plantación de alta densidad para soja puede incluir un intervalo de aproximadamente 48.000 a 60.000 semillas por acre, y la separación entre surcos puede estar dentro de un intervalo de aproximadamente 30 pulgadas o menos a aproximadamente 36 pulgadas. Para la plantación de alta densidad, se pueden plantar aproximadamente 3-5 semillas de algodón por pie dentro de cada surco, tal vez en combinación con una separación entre surcos más estrecha. Sin embargo, la alta densidad de cultivo se puede lograr mediante la separación entre surcos estrecha sin un aumento en la densidad de plantación dentro de cada surco.
Para canola, la densidad de plantación típica está en un intervalo de aproximadamente 360.000 a 550.000 semillas por acre, y la separación entre surcos típica entre los abridores está en el intervalo de aproximadamente 6 pulgadas a aproximadamente 16 pulgadas. En un surco determinado, se pueden plantar aproximadamente 8-12 semillas de canola normalmente por pie. En contraste, la plantación de alta densidad para soja puede incluir un intervalo de aproximadamente 450.000 a 680.000 semillas por acre, y la separación entre surcos puede estar dentro de un intervalo de aproximadamente 5 pulgadas o menos a aproximadamente 10 pulgadas. Para la plantación de alta densidad, aproximadamente 10-16 semillas de canola por pie dentro de cada surco, tal vez en combinación con una separación entre surcos más estrecha. Sin embargo, la alta densidad de cultivo se puede lograr mediante la separación entre surcos estrecha sin un aumento en la densidad de plantación dentro de cada surco.
Ejemplos
Ejemplo 1. Tratamiento de inducción de día corto de soja e identificación de los genes del locus de floración T (FT) por perfiles de transcripción.
Los procedimientos para el tratamiento de luz fotoperiódica (es decir, la inducción de día corto de la floración en las plantas) se describen en la Patente de EE.UU. N.° 8.935.880 y la publicación de solicitud de Patente de EE.UU. N.° 2014/0259905. Como se describe adicionalmente en estas, el tratamiento de inducción temprana de día corto produjo plantas de soja que tienen rasgos reproductivos alterados, que incluyen un aumento del número de vainas/semillas por planta. Los experimentos de perfiles de transcripción se realizaron utilizando micromatrices de expresión génica para determinar si los transcritos particulares estaban regulados por aumento en estas plantas inducidos por la luz para identificar los genes que pueden ser responsables de mediar los fenotipos de inducción de día corto. En estos experimentos, el análisis de los transcritos se llevó a cabo en hoja de soja y tejidos de ápices florales recolectados después de 1, 3 y 5 días a partir de plantas que recibieron un tratamiento de luz inductivo de día corto (día corto) en comparación con los tejidos de las plantas que no recibieron el tratamiento inductivo (día largo).
Como se muestra en la FIG. 2, se observó un aumento de la acumulación de transcritos de un gen del Locus de floración T particular, Gm.FT2a (SEQ ID NO: 1) en tejido de hojas recolectado a los 3 y 5 días después de la inducción temprana de día corto (eSDI) en comparación con las muestras tomadas de (i) tejidos del ápice floral de las mismas plantas de inducción de día corto, o (ii) tejidos de las hojas y los tejidos del ápice floral de las plantas de soja que en cambio recibieron el tratamiento de día largo. Estos datos apoyan la conclusión de que la expresión de Gm.FT2a se induce en el tejido foliar de las plantas que experimentan el tratamiento eSDi, que no se observó en las plantas cultivadas bajo condiciones de día largo. La expresión de Gm.FT2a tampoco se observó en el ápice floral de las plantas tratadas con eSDI, lo que es compatible con el modelo de expresión de la proteína FT que se induce en los tejidos de hoja periféricos en respuesta a condiciones de fotoperíodo inductivo y después de migrar a su sitio de acción en los meristemos para inducir la floración. Sin embargo, los experimentos adicionales que usan un análisis de secuenciación de ARN más sensible de los transcritos mostró cierta inducción de Gm.FT2a en el ápice del brote y las yemas axilares en respuesta al tratamiento eSDi (datos no mostrados).
Ejemplo 2. Caracterización de los patrones de expresión del promotor de pAt.Erecta en soja.
La obtención de los rasgos o fenotipos deseables por procedimientos transgénicos puede requerir el control de los patrones temporales y espaciales de la expresión del gen FT ectópico. Los experimentos fisiológicos de la soja que identifican la expresión de Gm.FT2a en tejidos vegetativos después del tratamiento de inducción de día corto (ver FIG 2) indican que la obtención de rasgos de rendimiento positivo puede depender de la expresión de FT anterior durante la etapa vegetativa. Por otra parte, aun cuando no se detectan los transcritos de FT en el ápice vegetativo, se ha demostrado que la proteína fT se mueve una distancia larga desde las hojas al tejido apical donde desencadena una transición vegetativa a reproductiva. Véase, por ejemplo, Lifschitz, E. y col., (2006), supra; y Corbeiser, L. y col., “FT Protein Movement Contributes to Long-Distance Signaling in Floral Induction of Arabidopsis", Science316: 1030-1033 (2007). Por lo tanto, a la luz de las propias observaciones de los presentes inventores, se ha propuesto el uso de un promotor de la etapa vegetativa que está activo en el meristemo para controlar la expresión de FT ectópica en una planta. Mediante la expresión de la señal de FT morfogenética directamente en el meristemo en la etapa de desarrollo deseada, múltiples vías endógenas y retroalimentaciones regulatorias (por ejemplo, el control de la transducción de FT en la hoja y translocación de larga distancia de la señal FT) se pueden desviar o evitar. Los experimentos previos con el tratamiento de inducción de día corto (descrito anteriormente en el Ejemplo 1) revelaron la regulación por aumento del gen Gm.Erecta en los meristemos de plantas de soja. Se ha demostrado que el promotor pErecta (SEQ ID NO: 21) de Arabidopsis tiene expresión débil en los meristemos de las plantas durante las etapas vegetativas de desarrollo. Por consiguiente, se seleccionó el promotor pAt.Erecta para los experimentos iniciales de expresión de FT.
Se llevaron a cabo experimentos adicionales para caracterizar adicionalmente los patrones de expresión de pAt.Erecta fusionado a un gen indicador GUS en tejidos vegetativos y meristemáticos florales. El análisis de los patrones de expresión de GUS durante el desarrollo de las plántulas de soja indicaron que el promotor pAt.Erecta exhibe un patrón temporal y espacial de expresión, con preferencia en los tejidos meristemáticos durante la etapa vegetativa del desarrollo. Las FIGS. 3 y 4 y FIGS. 5 y 6 incluyen dos conjuntos de imágenes para mostrar el patrón de tinción GUS. Las FIGS. 3 y 5 proporcionan imágenes en blanco y negro de los tejidos teñidos, y las FIG. 4 y 6 proporcionan imágenes en blanco y negro que se corresponden con las FIGS. 3 y 5, respectivamente, pero filtrado por color para mostrar el patrón y la intensidad de la tinción de GUS azul. Por lo tanto, el patrón de tinción GUS de expresión se puede ver con estas imágenes en blanco y negro mediante la comparación de las imágenes correspondientes de las FIGS. 3 y 4 o las FIGS. 5 y 6. Como se muestra en las FIG. 3 y 4, se detectó la tinción GUS en la lámina unifoliada y pecíolo inmaduros de soja (FIG. 4A y 4B) a los tres días después de la siembra/germinación. La expresión de pAt.Erecta.GUS se detectó también ampliamente en primordios trifoliados, meristemo apical del brote (SAM) y sitios de meristemos axilares en esta etapa vegetativa temprana (FIG. 4C.). La actividad de g Us no se detectó en las hojas unifoliadas y trifoliadas completamente expandidas a los diez días después de la germinación o plantación (FIG. 4D y 4E). Sin embargo, se detectó actividad de GUS en la parte proximal de la lámina trifoliada no expandida, pero completamente desarrollada inmadura y en el lado adaxial del pecíolo (FIG. 4F). La observación detallada del tejido apical mostró que se conservó una amplia expresión en los primordios foliares inmaduros en desarrollo, meristemos axilares y meristemos apicales del brote (FIG. 4G-I).
En la etapa reproductiva temprana, la actividad del promotor pAt.Erecta no se detectó en la lámina madura y se redujo en los primordios foliares en desarrollo. La señal de GUS no se detectó en el ápice vegetativo indeterminado en el meristemo apical de brote (SAM) o en el meristema axilar (AM) una vez que estos tejidos comenzaron a formar inflorescencias (FIG. 4J-4L). En todas las etapas posteriores, no se pudo detectar actividad meristemática adicional, no puede ser detectada en el ápice o en los primordios axilares o florales. Sin embargo, la expresión de GUS continuó en el lado adaxial del pecíolo y la parte proximal de la lámina de la hoja inmadura (FIG. 4M y 4N), pero no en la lámina de la hoja completamente expandida (FIG. 4O) Los patrones de expresión GUS con el promotor pAt.Erecta también se analizaron en las etapas R1 posteriores del desarrollo R1 (35-40 días después de la germinación). De modo similar a las etapas de desarrollo más tempranas, no se detectó expresión en las hojas maduras o tallos. Sin embargo, se detectó una fuerte actividad promotora en los tallos de la inflorescencias (FIG. 5A y 6A; ver la flecha) y pedúnculos florales (FIG. 5B y 6B; ver la flecha.). En ambos tejidos, se detectó expresión en las células del parénquima y vasculatura (FIG. 5c y 6C). En esta etapa, también se detectó expresión en los filamentos de estambre (FIG. 5D y 6D; ver las flechas) y en los óvulos no polinizados (FIG. 5E, 5F, 6E y 6F; ver las flechas en 6F).
Previamente, el promotor pAt.Erecta se caracterizó en Arabidopsis. Curiosamente, los patrones de expresión de pAt.Erecta en Arabidopsis fueron comparables a los patrones observados en la soja durante la etapa vegetativa, pero no durante las etapas reproductivas finales. En contraste, el patrón de expresión pAt.Erecta en la soja está reducido en los tejidos reproductivos tempranos, pero reaparece en algunos órganos reproductivos y tejidos más tarde, que incluyen tallos de la inflorescencia y pedúnculos florales. Véase, por ejemplo, Chen, M-K y col., FEBS Letters 588: 3912-17 (2014); Yokoyama, R y col.; Shpak, ED y col., Science309: 290-293 (2005); y Yokoyama, R y col., Plant J 15(3): 301-310 (1998). En consecuencia, el promotor pAt.Erecta proporciona un nuevo patrón de expresión en soja.
Ejemplo 3. La expresión del gen del Locus de floración T Gm.FT2a, bajo el control de un promotor pAt.Erecta altera el tiempo de floración y las vainas por nodo en la soja.
Las plantas de soja transgénicas se produjeron mediante la transformación de explantes de soja con una molécula de ADN recombinante (es decir, un vector de transformación de T-ADN) que comprende el promotor pAt.Erecta unido operativamente al gen Gm.FT2a por medio de la transformación mediada por Agrobacterium para generar cuatro eventos de pErecta:Gm.FT2a que se llevaron para su análisis posterior. El efecto de la sobreexpresión FT2a se observa inmediatamente en las plantas R0, que tenían la floración y terminación muy temprana con un rendimiento de semilla reducido (por ejemplo, solo aproximadamente 8 semillas/planta). Estas plantas transgénicas Gm.FT2a también tenían una altura de planta corta y muy pocas, si hubiera, ramas. Las plantas R1 segregante y su progenie se cultivaron posteriormente en el invernadero bajo condiciones de día largo para el estudio y caracterización inicial. Con el cultivo de estas plantas bajo condiciones de día largo, se mejoraron los fenotipos de atrofia grave observados con las plantas R0 transgénicas Gm.FT2a. En estos experimentos, las plantas homocigotas y hemicigotas cultivadas en el invernadero bajo condiciones de día largo de 16 horas (es decir, 16/8 horas de fotoperíodo de día/noche) florecieron mucho antes que las segregantes nulas tipo silvestre. Las plantas transgénicas Gm.FT2a florecieron aproximadamente 19-22 días después de la plantación o siembra). (Véase, por ejemplo, la FIG. 9). Bajo estas condiciones de crecimiento, las plantas de soja transgénicas que expresan GmFT2a también presentaron un aumento del número de vainas por nodo en tallo principal en comparación con los controles de tipo silvestre (Véase, por ejemplo, las FIG. 10 y 11, que se discute más adelante).
Las plantas que contienen uno de los eventos transgénicos pEr::Gm.FT2a (Evento 1) cultivadas en condiciones de ambiente controlado también se analizaron mediante análisis de microscopía electrónica de barrido (eSEM). El análisis del meristemo apical del brote (SAM) de estas plantas transgénicas (recolectadas a 7 días después de la plantación) reveló una transición temprana del SAM en un meristemo de la inflorescencia (IM) y meristemo floral (FM) (FIG. 7). Por el contrario, los SAM de las plantas de soja tipo silvestre no se diferenciaron en IM en esta etapa de crecimiento. Del mismo modo, las imágenes de los meristemos axilares de los transformantes FT2a (recolectados 9 días después de la plantación) indican el desarrollo de meristemos de inflorescencia latentes (dIMS) (o racimos de primordios laterales) en IM y FM (FIG. 8), que llevan a más ramas florales de desarrollo temprano (racimos) por nodo en estas plantas transgénicas. La caracterización fenotípica adicional reveló la floración temprana en la etapa V1 en plantas de soja que expresan Gm.FT2a, que fue bien antes de que ocurriera la transición floral en las plantas segregantes nulas (FIG. 9). Estos datos en combinación con el patrón de expresión de pAt.Erecta.GUS descrito anteriormente indican que la floración temprana, y más particularmente la formación de la inflorescencia y meristemos, florales se indujeron por la expresión ectópica de Gm.FT2a durante la etapa vegetativa en los primordios de la hoja y los meristemos apicales de brote y axilares de plántulas. La formación de un mayor número de inflorescencias y meristemos florales se considera que también causa la liberación más temprana y el alargamiento de los racimos secundarios y terciarios, que produce un mayor número de flores y vainas productivas que se forman por nodo.
No solo las plantas de soja transgénica Gm.FT2a experimentaron una floración temprana y produjeron más vainas por nodo en el tallo principal (con respecto a las plantas nulas segregantes), también se halló que los efectos de la expresión ectópica de Gm.FT2a en plantas transgénicas son dependientes de la dosificación. Si bien tanto las plantas homocigotas como las hemicigotas tuvieron una altura reducida y menos ramificación, las plantas homocigotas para el transgén Gm.FT2a fueron afectadas más gravemente que las plantas hemicigotas, presumiblemente porque las plantas homocigotas contienen dos copias del transgén (es decir, una dosis más alta), en oposición a una sola copia (es decir, una dosis menor) en las plantas hemicigotas. En condiciones de crecimiento de día largo, las plantas homocigotas terminaron antes y tenían una altura total menor con menos nodos y ramas en el tallo principal en comparación con las plantas hemicigotas para el transgén (FIG. 10). A diferencia de las plantas homocigotas, que exhibieron un número de fenotipos enanos subóptimos que incluyen muy pocas (si hubiera) ramas en el tallo principal, las plantas hemicigotas tenían un fenotipo intermedio en términos de su crecimiento vegetativo, altura de la planta, y el número de nodos presentes en el tallo principal con respecto a las plantas tipo silvestre y homocigotas. Bajo condiciones de día largo de 16 horas, las plantas hemicigotas tenían una altura de la planta más normal con algún grado de ramificación y una duración más prolongada de la floración, en relación con las plantas homocigotas (FIG.
10). Las plantas hemicigotas también florecieron durante 40-64 días después del inicio de R1, mientras que las plantas homocigotas florecieron durante solo 16-24 días debido a su terminación más temprana.
Los experimentos adicionales se llevaron a cabo con las plantas transformadas con la construcción Gm.FT2a (3 eventos) en las condiciones de ambiente controlado de día largo (16 horas) para caracterizar adicionalmente la respuesta de dosis entre plantas hemicigotas y homocigotas. Las diferencias en el número de nodos y las vainas en el tallo principal y las ramas, así como el número promedio de vainas por nodo y la altura promedio por planta se muestran en la Tabla 1 para los tres eventos homocigotas (Evento-homo 2, Evento-homo 3 Evento-homo 4) y tres eventos hemicigotas (Evento-hemi 2, Evento-hemi 3, Evento Hemi-4). Estos eventos se distinguen del Evento 1 anterior.
Tabla 1. Datos del nivel de evento para las plantas transgénicas Gm.FT2a homocigotas y hemicigotas.
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Como se muestra en la Tabla 1, las plantas hemicigotas tuvieron consistentemente un mayor número de nodos en el tallo principal (MS) y ramas (BR) y una altura de la planta mayor que las plantas homocigotas. En consecuencia, las plantas hemicigotas fueron generalmente menos afectadas que las plantas homocigotas y más que las plantas de tipo silvestre. Las plantas hemicigotas también tenían un aumento del número de vainas por nodo y un aumento del número de vainas en el tallo principal y las ramas, con relación a las plantas homocigotas. Por lo tanto, las plantas hemicigotas generalmente tenían una arquitectura de planta más cercana a la normal con un mayor número de vainas por nodo (y por planta), presumiblemente debido a su menor dosis de transgén Gm.FT2a. El nivel de dosis relativa de Gm.FT2a basado en la cigosidad del transgén fue confirmado por experimentos adicionales que muestran que los niveles de transcrito de Gm.FT2a fueron más altos en los tejidos de las plantas homocigotas, que en los tejidos de las plantas hemicigotas (datos no mostrados).
La inducción de la floración temprana en estas plantas transgénicas Gm.FT2a se asoció con más vainas (y semillas) por nodo en el tallo principal en las plantas hemicigotas y homocigotas. Las plantas homocigotas y hemicigotas que contienen el transgén Gm.FT2a, cada uno tenía un aumento del número de vainas/semillas por nodo en el tallo principal de la planta en comparación con los segregantes de tipo silvestre (FIG. 11). También se descubrió que la distribución de las vainas en el tallo principal es diferente entre las plantas FT2a transgénicas y nulas tipo. Se descubrió que las plantas homocigotas y hemicigotas cultivadas bajo condiciones de día largo tienen más vainas en los nodos en al menos los nodos inferiores del tallo principal y más vainas por nodo, en promedio, en comparación con las plantas de tipo silvestre nulas (datos no mostrados). Las plantas hemicigotas para el transgén Gm.FT2a contenían el mayor número de vainas por nodo en la longitud del tallo principal. Sin embargo, estos efectos fueron dependientes de las condiciones de crecimiento particulares, que incluyen duración del día, etc. En general, los experimentos realizados con soja en condiciones de día más largo tendían a producir mayores diferencias entre las plantas transgénicas y nulas.
También se observaron los efectos dependientes de la dosis de la expresión transgénica Gm.FT2a en experimentos de ensayos de campo. En un ensayo de campo de 2014, las plantas hemicigotas de soja para dos eventos Gm.FT2a (Eventos 1 y 2 anteriores) mostraron un promedio de aproximadamente 2,68 vainas por nodo en el tallo principal, y plantas homocigotas para estos eventos tenían aproximadamente 1,40 vainas por nodo en promedio, mientras que las plantas segregantes nulas tenían aproximadamente 1,63 vainas por nodo. En un ensayo de campo de 2013, sin embargo, se halló que las plantas hemicigotas para Gm.FT2a transgénico (Evento 2) tienen un número promedio de aproximadamente 3,21 vainas por nodo, en comparación con un promedio de aproximadamente 3,05 vainas por nodo en las plantas homocigotas y aproximadamente 2,19 vainas por nodo en plantas segregantes nulas. En otro experimento de microparcela de 2013 realizado en una ubicación de campo diferente, se descubrió que las plantas hemicigotas para el transgén Gm.FT2a (Evento 1) tienen aproximadamente 2,17 vainas por nodo en promedio, en comparación con un promedio de aproximadamente 2,05 vainas por nodo en plantas homocigotas para el transgén Gm.FT2a (Evento 2) y aproximadamente 1,30 vainas por nodo en plantas segregantes nulas. En consecuencia, el número de vainas por nodo sobre las plantas que comprende el transgén Gm.FT2a puede depender de una variedad de factores que incluyen la dosis del transgén FT, condiciones ambientales y de campo, y tal vez las diferencias en las prácticas agronómicas. Sin embargo, al igual que las plantas transgénicas Gm.FT2a cultivadas en el invernadero, las plantas transgénicas Gm.FT2a homocigotas y hemicigotas cultivadas en condiciones de campo a menudo tenían menos nodos en el tallo principal, altura de planta total más corta, y/o ramificación reducida en plantas transgénicas. En efecto, las plantas de tipo silvestre tenían típicamente más ramificación y un mayor número de nodos total por planta que las plantas GmFT2a hemicigotas y homocigotas.
Los datos fisiológicos adicionales se recopilaron de las plantas transgénicas homocigotas Gm.FT2a y plantas de control de tipo silvestre (WT) cultivadas en el invernadero bajo condiciones de día largo de 14 horas (véase la Tabla 2). Estos datos proporcionan un promedio de mediciones tomadas de seis plantas transgénicas Gm.FT2a para cada evento, o de ocho plantas de tipo silvestre. Las siguientes matrices se recolectaron para la caracterización fenotípica de estas plantas: Días a la floración en R1 (DOFR1); Días hasta R7 (DOR7); duración reproductiva en días de R1 a R7 (PDR1R7); número de ramas por planta (BRPP); nodos fértiles totales en las ramas (FNBR); nodos fértiles totales por planta (FNLP); nodos fértiles totales en el tallo principal (FNST); número de nodos en las ramas (NDBR); número de nodos en el tallo principal (NDMS); número de nodos/planta (NDPL); porcentaje de los nodos fértiles en las ramas (PFNB); porcentaje de nodos fértiles totales (PFNN); porcentaje de los nodos fértiles en el tallo principal (PFN); número de vainas por planta (PDPP); número de vainas en el tallo principal (PODMS); número de vainas en las ramas (PODBR); número de vainas/nodo; semillas por planta en R8 (SUPER8); y peso de 1000 semillas (SW1000). Cada una de estas mediciones se tomó en la cosecha a menos que se especifique otro punto de tiempo.
Tabla 2. Datos fenotípicos del nivel de construcción para plantas transgénicas homocigota Gm.FT2a y WT.
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En consonancia con las observaciones indicadas anteriormente, las plantas transgénicas Gm.FT2a homocigotas experimentaron inducción floral más temprana que las plantas WT (DOFR1 aproximadamente 21 días después de la plantación, en lugar de aproximadamente 33-34 días en plantas de tipo silvestre). Estas mediciones mostraron, además, que el número de ramas (y otras medidas relacionadas con la ramificación, tales como el número de nodos 0 vainas en las ramas) se redujo mucho. Debido a que las plantas transgénicas tienen una estatura más corta con muy poca ramificación, el número total de nodos o vainas por planta también se redujo en gran medida. Sin embargo, el número de vainas por nodo en el tallo principal aumentó en las plantas transgénicas (por ejemplo, aproximadamente 3,8 vainas promedio/nodo) en relación con las plantas nulas de tipo silvestre (por ejemplo, aproximadamente 2,4 vainas/nodo).
Sin estar limitado por ninguna teoría, el mayor número de vainas por nodo que se observa en las plantas de soja transgénicas que expresan FT2a en el meristemo durante las etapas vegetativas de desarrollo puede ser causado al menos en parte por la sincronización de la floración temprana con la liberación temprana de racimos secundarios y/o terciarios y/o una mejor utilización de los recursos para producir más flores productoras de vainas por nodo. La expresión de FT temprana en el meristemo (Véase, por ejemplo, las FIG. 3 y 4) puede causar la liberación temprana de los meristemos de inflorescencia latentes para producir un mayor número de racimos por nodo de la planta, de manera que un mayor número de racimos producen flores maduras y vainas completamente desarrolladas en cada nodo. Sin embargo, la posterior expresión de FT en los tejidos reproductivos (Véase, por ejemplo, las FIG. 5 y 6) puede terminar el desarrollo floral de flores de desarrollo tardío en cada nodo, lo que lleva a una asignación de recursos más eficiente a los racimos, flores y vainas de desarrollo temprano. En las plantas de soja de tipo silvestre, un porcentaje mucho más bajo de racimos secundarios y terciarios producen flores y vainas completamente desarrolladas con respecto a los racimos primarios, y las flores de desarrollo tardío del racimo primario normalmente no producen flores maduras y/o vainas de tamaño completo antes de la abscisión. Por lo tanto, se teoriza que se pueden generar más vainas por nodo en las plantas que expresan proteínas de FT en el meristemo vegetativo mediante la sincronización del desarrollo floral temprano con la liberación temprana de los racimos laterales en uno o más nodos de la planta. Con al menos el promotor pAt.Erecta que dirige la expresión de FT, las flores de desarrollo tardío (que pueden no producir de otra manera vainas totalmente desarrolladas o de tamaño completo) también se pueden terminar por la expresión de FT en la etapa reproductiva tardía para dirigir los recursos a las flores de desarrollo temprano.
Ejemplo 4. Expresión del gen del Locus de floración T, Gm.FT2a, bajo el control de un promotor de las etapas vegetativas en soja.
Sobre la base de los fenotipos observados en el ejemplo 3 anterior, también se propusieron dos promotores para dirigir la expresión del transgén Gm.FT2a que se consideraron promotores de etapa vegetativa, preferidos de hoja: pAt.BLS (SeQ ID NO: 36) y pAt.ALMT6 (SEQ ID NO: 37). Como se usa en el presente documento, un promotor "preferido de hojas" se refiere a un promotor que inicia preferentemente la transcripción de su gen asociado en los tejidos de hoja en relación con otros tejidos de la planta. Debido a que se considera que FT funciona como un florígeno móvil, la expresión de FT temprana durante las etapas vegetativas en los tejidos periféricos, tales como en la hoja con un promotor preferido de hoja o específico de las hojas, puede dar lugar a fenotipos similares a la expresión de pAt.Erecta:Gm.FT2a preferido del meristemo. También se teorizó que la expresión de FT con un promotor de la hoja vegetativa también puede atenuar la señal de inducción floral, y de este modo mitigar los fenotipos de terminación temprana observados con la expresión de FT homocigota en el meristemo, y aumento de altura y ramificación de la planta.
En estos experimentos, los vectores de transformación para pAt.ALMT6::Gm.FT2aand pAt.BLS::Gm.FT2a se construyeron y usaron para transformar una línea de soja por transformación mediada por Agrobacterium. Se ha demostrado que la expresión con el promotor pAt.BLS comienza en el primordio de hoja 5 (P5) y se expresa en las venas de las hojas fuente solo hasta la transición a la floración, y el promotor pAt.ALMT6 es también un promotor de hoja vegetativa con la expresión en las etapas de desarrollo tardío con respecto a pAt.BLS. Véase, por ejemplo, Efroni y col., “A Protracted and Dynamic Maturation Schedule Underlies Arabidopsis Leaf Development”, The Plant Cell 20(9):2293-2306 (2008); y Shani y col., “Stage-Specific Regulation of Solanum lycopersicum Leaf Maturation by Class 1 KNOTTED1-LIKE HOMEOBOX Proteins”, The Plant Cell 21(10): 3078-3092 (2009). Las plantas transgénicas de soja se produjeron para cada una de estas construcciones del vector y se caracterizaron por fenotipos en cámaras de crecimiento bajo condiciones de fotoperíodo de 14 horas en comparación con las plantas de tipo silvestre. Para cada uno de la construcción pAt.BLSc, se analizaron seis eventos transgénicos (5 plantas por evento), y para el promotor pAt.ALMT6, se analizaron siete eventos transgénicos (5 plantas por evento). Para cada una de estas construcciones, se recolectaron los datos de control de cinco plantas de tipo silvestre.
Se recolectaron las siguientes matrices para la caracterización fenotípica de estas plantas transgénicas (Tablas 3 y 4). Las mediciones individuales son las que se definieron anteriormente, y la caracterización fenotípica se realizó en las plantas homocigotas para el transgén.
Tabla 3. Datos fenotípicos del nivel de la construcción para las plantas pALMT6::Gm.FT2a y WT.
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Tabla 4. Datos fenotípicos del nivel de la construcción para las plantas pBLS::Gm.FT2a y WT.
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Las plantas transgénicas que expresan Gm.FT2a bajo el control de los promotores alternativos pAt.ALMT6 y pAt.BLS fueron fenotípicamente más similares a las plantas de tipo silvestre (WT) que las plantas transgénicas pAt.Erecta..Gm.FT2a. Las plantas transformadas con las construcciones pAt.ALMT6::Gm.FT2a y pAt.BLS::Gm.FT2a tenían tiempos de floración y rasgos de crecimiento vegetativo similares a las plantas control de tipo silvestre, tal vez con un ligero aumento del número de nodos en las ramas en comparación con plantas de tipo silvestre (Tablas 3 y 4). Estos datos se pueden interpretar para indicar que tanto el tiempo como el lugar de la expresión de FT transgénico son importantes para la producción de los rasgos o fenotipos reproductivos y relacionados con el rendimiento que difieren de las plantas de tipo silvestre. La simple expresión de un transgén FT durante las etapas vegetativas tempranas del desarrollo (por ejemplo, en los tejidos de las hojas) puede no ser suficiente para alterar los fenotipos reproductivos o relacionados con el rendimiento de una planta (por ejemplo, vainas por nodo). En consecuencia, de acuerdo con las realizaciones de la presente invención, un promotor unido operativamente a un transgén FT florigénico con preferencia puede ser un promotor específico de meristemo o preferido de meristemo además de dirigir la expresión durante las etapas vegetativas de desarrollo de la planta. Sin embargo, cuando los perfiles de expresión de los dos promotores preferidos de hoja anteriores se analizaron en plantas de soja, no se observó tinción de GUS en la hoja en desarrollo con el promotor pAt.BLS, y el promotor pAt.ALMT6 no produjo la expresión de GUS detectable en la hoja hasta las etapas vegetativas finales con mucha mayor expresión durante las etapas reproductivas tempranas. Por lo tanto, sigue siendo posible que la expresión de transgenes de FT en los tejidos periféricos (hoja) durante las etapas vegetativas tempranas usando diferentes promotores específicos de tejido pueda ser suficiente en algunos casos para inducir la floración temprana y/o causar otros rasgos o fenotipos reproductivos o relacionados con el rendimiento, que también puede depender de las especies de plantas particulares analizadas.
Ejemplo 5. Identificación de dominios de proteína de homólogos de FT por análisis Pfam.
Los ortólogos Gm.FT2a se identificaron mediante análisis de secuencias y revisión de la bibliografía, y algunos ejemplos de estos homólogos de FT se enumeran en la Tabla 5, junto con Gm.FT2a. Estos incluyeron otros genes de soja FT, así como unos pocos genes FT de otras especies de plantas. Se analizaron las secuencias de aminoácidos de estas proteínas FT para identificar cualquier dominios de la proteína Pfam utilizando el software HMMER y bases de datos Pfam (versión 27.0). Se descubrió que estas secuencias de proteína FT (SEQ ID NOs. 2, 4, 6, 8, 10 y 12) tienen el mismo dominio Pfam identificado como una proteína de dominio de unión a fosfatidil etanolamina (PEBP) y un número de referencia Pfam PF01161. La ubicación de los dominios PBP_N en cada una de estas secuencias de la proteína FT también se enumeran en la Tabla 5. La ubicación del dominio PBP_N en otras proteínas FT se puede determinar mediante el alineamiento de secuencias. Por tanto, se contempla que cualquier secuencia de ADN que codifica al menos una proteína FT que comprende el dominio PBP_N se puede usar en una molécula de ADN recombinante de la presente invención, siempre que la proteína FT correspondiente tenga actividad florigénica cuando se expresa de forma ectópica en el meristemo de una planta.
Tabla 5. Ubicación del dominio PBP_N(Pfam) en las secuencias de la proteína FT.
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Ejemplo 6. Expresión de los homólogos de FT bajo el control del promotor pAt.Erecta en soja.
Los vectores de transformación adicionales que contienen otros homólogos de FT (Tabla 6) bajo el control del promotor pAt.Erecta se construyeron y utilizaron para transformar la soja a través de la transformación mediada por Agrobacterium. Las plantas transgénicas generadas a partir de estos eventos se caracterizaron por sus fenotipos en el invernadero con un fotoperíodo de luz diurna natural de 14 a 14,5 horas. Para cada construcción, se ensayaron seis eventos (6 plantas por evento). Seis plantas también se ensayaron y se promediaron para las plantas de control de tipo silvestre (WT). Se llevaron a cabo diferentes grupos de experimentos (A-E) como se muestra en la Tabla 6 con controles de tipo silvestre separadas.
Tabla 6. Lista de construcciones para algunas Gm.FT2a y sus homólogos con sus secuencias de proteína.
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Se recolectaron las siguientes matrices para la caracterización fenotípica de las plantas transformadas con cada una de las construcciones enumeradas en la Tabla 6 para expresar otros homólogos FT con el promotor pAt.Erecta, además de los datos recolectados para la construcción Gm.FT2a que se describió anteriormente. Las mediciones individuales son como se definieron anteriormente y la caracterización fenotípica de los transformantes se realizó en las plantas homocigotas para el transgén.
Se recolectaron los datos fenotípicos para las plantas que expresan los transgenes Zm.ZCN8 y Nt.FT-like bajo el control del promotor pAt.Erecta (ver las Tablas 7 y 8). Los valores del rasgo para cada evento en las Tablas 7 y 8 son un promedio de todas las plantas analizadas que contiene el evento. Una columna proporciona también un promedio de los valores de eventos para cada rasgo.
Tabla 7. Construcción y datos fenotípicos del nivel del evento para las plantas Zm.ZCN8 y WT.
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Tabla 8. Construcción y datos fenotípicos del nivel del evento para las plantas Nt.FT-like y WT.
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Las plantas de soja transgénicas que expresan las proteínas Zm.ZCN8 y Nt.FT-like florecieron más temprano que las plantas de control de tipo silvestre y tenían un mayor número de vainas por nodo (similar a las plantas que expresan el transgén Gm.FT2a). En efecto, las plantas de soja que expresan los transgenes Zm.ZCN8 y Nt.FT-like tenían varios fenotipos similares a las plantas transgénicas GmFT2a, que incluyen reducción del número de días a floración (DOFR1), reducción del número de ramas (BRPP), menos nodos por planta (NDPL), menos nodos en las ramas (NDBR), reducción del número de vainas por planta (PDPP), y menos vainas en las ramas (PODBR), junto con un aumento en el número de vainas por nodo y una disminución en el número de semillas por planta (Tablas 7 y 8), en relación con los controles de tipo silvestre. Sin embargo, varios de los fenotipos negativos observados en las plantas Gm.FT2a homocigotas fueron menos pronunciados en las plantas transgénicas que expresan Zm.ZCN8 y Nt.FT-like. En general, las plantas que expresan el transgén Zm.ZCN8 tenían altura de la planta más corta y menos ramificación pero más vainas por nodo en el tallo principal (FIG. 12A y 12B). Del mismo modo, las plantas que expresan el transgén Nt.FT-like tenían altura de la planta más corta, reducción de la ramificación y aumento de vainas por nodo en el tallo principal (FIG. 13A y 13B), en relación con las plantas de control de tipo silvestre.
Dos eventos transgénicos Zm.ZCN8 y cuatro eventos Nt.FT-like de los anteriores también analizaron en campos de ensayo de 2015 en dos emplazamientos diferentes. Se recolectaron los datos fenotípicos para las plantas que expresan los transgenes Zm.ZCN8 y Nt.FT-like bajo el control del promotor pAt.Erecta (Tablas 9 y 10). Los eventos 1 y 2 de la Tabla 9 se corresponden con los eventos 2 y 3 en la Tabla 7, y los eventos 1-4 de la Tabla 10 se corresponden con los eventos 1-4 de la Tabla 8, respectivamente. A excepción de días a la floración en R1 (DOFR1) y la duración reproductiva en días de R1 a R8 (PDR1R8), todas las mediciones fenotípicas se obtuvieron a partir de datos recogidos de los dos emplazamientos. De modo similar a las observaciones en el invernadero, las plantas de soja transgénicas que expresan proteínas Zm.ZCN8 y Nt.FT-like también florecieron antes que las plantas de control de tipo silvestre en el campo. Las plantas transgénicas Zm.ZCN8 tenían un aumento del número de vainas por nodo, mientras que las plantas Nt.FT-like no mostraron claramente un aumento de vainas por nodo en el ensayo de campo.
Tabla 9. Datos fenotípicos del ensayo de campo 2015 para las plantas Zm.ZCN8 y WT.
Figure imgf000027_0002
Tabla 10. Datos fenotípicos del ensayo de campo 2015 para las plantas Nt.FT-like y WT
Figure imgf000027_0001
Figure imgf000028_0002
Los datos fenotípicos adicionales se recolectaron para las plantas que expresan el transgén Gm.FT2b bajo el control del promotor de pAt.Erecta (Tabla 11).
Tabla 11. Construcción y datos fenotípicos del nivel del evento para las plantas Gm.FT2b y WT.
Figure imgf000028_0001
Las plantas de soja transgénicas que expresan el transgén Gm.FT2b florecieron antes y tenían menos ramificación que las plantas control tipo silvestre. Las plantas de soja que expresan Gm.FT2b presentaron reducción del número de días para la floración (DOFR1), reducción del número de ramas (BRPP), menos nodos por planta (NDPL), menos nodos en las ramas (NDBR), reducción del número de vainas por planta (PDPP), y menos vainas en las ramas (PODBR) (Tabla 9). Sin embargo, las plantas transgénicas Gm.FT2b no mostraron un aumento en el número de vainas por nodo. En general, las plantas que expresan el transgén Gm.FT2b tenían una altura menor de la planta y menos ramificación en relación con las plantas de control de tipo silvestre (FIG. 14). Las plantas de soja transgénicas que expresan cuatro eventos diferentes del transgén Gm.FT2b también se analizaron en pruebas de campo en 2015. Se recolectaron los datos fenotípicos de las plantas que expresan el transgén Gm.FT2b bajo el control del promotor pAt.Erecta (Tabla 12). Los Eventos 1-4 en la Tabla 11 corresponden a los Eventos 3, 2, 1, y 4 en la Tabla 12, respectivamente. De manera similar a las observaciones en el invernadero, las plantas de soja que expresan Gm.FT2b mostraron una reducción del número de días hasta la floración (DOFR1) en el campo. Las otras mediciones fenotípicas también mostraron rasgos similares a los observados en el invernadero en relación con las plantas de control de tipo silvestre.
Tabla 12. Datos fenotípicos del ensayo de campo 2015 para las plantas Gm.FT2 y WT.
Figure imgf000029_0002
Los datos fenotípicos adicionales se recolectaron de las plantas que expresan el transgén Le.SFT bajo el control del promotor pAt.Erecta (Tabla 13).
Tabla 13. Construcción y datos fenotípicos del nivel del evento para las plantas Le.SFT y WT.
Figure imgf000029_0001
Figure imgf000030_0002
En general, las plantas de soja que expresan el transgén Le.SFT tenían una altura menor de la planta con menos ramificación (FIG. 15) y un aumento del número de vainas por nodo en promedio con respecto a plantas de tipo silvestre (Tabla 13). Sin embargo, estos efectos fueron variables y específicos del evento. Por ejemplo, los Eventos 1, 3 y 4 muestran floración temprana (DDR1), mientras que otros eventos fueron neutros o realmente habían retrasado la floración. Además, algunos de los eventos transgénicos Le.SFT mostraron un aumento de vainas por nodo, en promedio, en diversos grados, mientras que un par de los eventos fueron neutros en términos del número promedio de vainas por nodo. Curiosamente, dos de los eventos (Eventos 5 y 6) tenían el mayor número de vainas por nodo, en promedio, a pesar de tener un retraso en la floración.
Los datos fenotípicos adicionales se recolectaron de las plantas que expresan el transgén Gm.FT5a bajo el control del promotor pAt.Erecta (Tabla 14).
Tabla 14. Construcción y datos fenotípicos del nivel del evento para las plantas Gm.FT5a y WT.
Figure imgf000030_0001
Las plantas de soja transgénicas que expresan el transgén Gm.FT5a florecieron significativamente más temprano que las plantas de control de tipo silvestre y presentaron un aumento del número de vainas por nodo (similar a las plantas que expresan el transgén Gm.FT2a). En efecto, las plantas de soja que expresan el transgén Gm.FT5a presentaron varios fenotipos (similares a las plantas transgénicas Gm.FT2a), que incluyen la reducción del número de días a la floración (DOFR1), reducción del número de ramas (BRPP), menos nodos por planta (NDPL), menos nodos en las ramas (NDBR), reducción del número de vainas por planta (PDpp), y un menor número de vainas en las ramas (PODBR), junto con un aumento en el número de vainas por nodo y una disminución en el número de semillas por planta (Tabla 14). En general, las plantas que expresan el transgén Gm.FT2a tenían una altura menor de la planta y menos ramificación, pero más vainas por nodo (en particular en el tallo principal) en relación con las plantas de control de tipo silvestre (FIG. 16).
Sin estar limitado a ninguna teoría, estos datos apoyan un modelo de sobreexpresión FT que actúa de manera dependiente de la dosis con el grado o extensión de los fenotipos asociados (por ejemplo, floración temprana, aumento de vainas por nodo, y una alteración de la arquitectura de la planta) que depende de (i) el nivel y tiempo de expresión de FT, (ii) la especificidad tisular de la expresión de FT, y (iii) la actividad relativa y la especificidad deseada de la proteína FT particular que se está expresando. Por ejemplo, la expresión de los ortólogos de la proteína FT de otras especies de plantas en soja puede producir un efecto más atenuado con respecto a la sobreexpresión de una proteína endógena fT (Gm.FT2a) en la soja, que puede ser resultado de los homólogos de la proteína FT no naturales que tiene una menor actividad en la soja. Sin embargo, la expresión de algunas proteínas fT naturales no puede producir efectos fenotípicos significativos si tienen un papel diferente o especializado en su estado natural o contexto. Diferentes proteínas FT también pueden actuar en diferentes dianas y receptores tisulares y por lo tanto tienen efectos diferenciales en la diversa arquitectura de planta y rasgos y fenotipos de floración.
Independientemente del nivel de actividad del homólogo de FT particular, los fenotipos reproductivos y la arquitectura de planta alterados parecen estar correlacionados con el tiempo y el lugar de la expresión de FT. La expresión de la etapa vegetativa de los transgenes FT puede ser necesaria para inducir la floración temprana y/o causar aumento del número de meristemos florales, flores, vainas, etc., por nodo de la planta. En efecto, la expresión de FT en los tejidos meristemáticos durante las etapas vegetativas de desarrollo se muestra con una dosis apropiada del transgén FT para causar cambios reproductivos en las plantas que llevan a un mayor número de flores, vainas y/o semillas por nodo. En contraste, la expresión de un transgén Gm.FT2a bajo el control de promotores preferidos de la hoja produjo muy pocos, si hubiera, cambios fenotípicos, en relación con las plantas de tipo silvestre. Estos datos indican que tanto el tiempo como la especificidad de tejido (o la preferencia de tejido), de la expresión de FT son factores importantes que afectan a los cambios fenotípicos reproductivos y/o relacionados con el rendimiento en las plantas transgénicas.
Los datos actuales sugieren que diferentes proteínas FT pueden tener diferentes niveles de actividad y/o especificidades deseadas a pesar de ser expresados usando el mismo promotor pErecta. Si bien varias construcciones que expresan Gm.FT2a, Zm.ZCN8, Nt.FT-like, y Gm.FT5a produjeron floración y terminación temprana, además de un aumento del número de vainas por nodo, otras construcciones que expresan Gm.FT2b y Le.SFT presentaron diferentes efectos correlativos en la floración. La expresión de Gm.FT2b causó floración temprana y la terminación de las plantas, pero sin un aumento significativo en el número de vainas por nodo. Por otra parte, la expresión de Le.SFT mostró aumento de las vainas por nodo y terminación temprana a pesar de un retraso en la floración. Curiosamente, el aumento del número de vainas por nodo en las plantas transgénicas FT no se correlacionó con un aumento de la duración prolongada de la reproducción (PDR1R7) y no siempre coincide con la floración temprana (DOFR1) tal como se señaló anteriormente. Estos datos sugieren que los cambios reproductivos en la respuesta a la expresión de la etapa vegetativa de las proteínas FT en el meristemo pueden operar a través de uno o varios mecanismos o vías independientes. El aumento del número de vainas por nodo en plantas transgénicas FT puede depender del número de meristemos de inflorescencia y florales inducido a partir de meristemos vegetativos en cada nodo, que puede ocurrir de forma independiente del tiempo de floración y/o duración reproductiva. Como se señaló anteriormente, sin embargo, la duración reproductiva no puede correlacionarse necesariamente con la duración de la floración.
Ejemplo 7. Identificación de promotores de meristemo de la etapa vegetativa adicionales.
Después de haber observado los efectos fenotípicos con la expresión de Gm.FT2a bajo el control de un promotor de etapa vegetativa, preferido del meristemo, pAt.Erecta, se contempla que se pueden usar otros promotores de etapa vegetativa, preferidos del meristemo (o específicos del meristemo) para dirigir la expresión de las proteínas FT para producir los rasgos o fenotipos reproductivos o relacionados con el rendimiento en las plantas, tal como el aumento del número de vainas por nodo (y/o por planta o tallo principal). Utilizando el patrón de expresión caracterizado del promotor pAt.Erecta (ver el Ejemplo 2), se identificaron otros promotores de etapa vegetativa, preferidos del meristemo (o específicos del meristemo) a partir de soja, patata y Arabidopsis. Se utilizaron dos enfoques bioinformáticos para identificar genes candidatos de otras especies dicotiledóneas que incluyen, por ejemplo, Arabidopsis, soja, Medicago, patata y tomate, que tienen perfiles de expresión similares a pAt.Erecta: BAR Espressolog y Expression Angler. Véase, por ejemplo, BAR expressolog identification: expression profile similarity ranking of homologous genes in plant species”, Plant J71(6): 1038-50 (2012); y Toufighi, K y col., “The Botany Array Resource: e-Northerns, Expression Angling, and promoter analyses”, Plant J43(1): 153-163 (2005). Las secuencias promotoras de estos genes en consecuencia se proponen para usar en la expresión de transgenes FT de acuerdo con las realizaciones de la presente invención.
Los ejemplos de promotores de genes identificados por este análisis incluyen los siguientes: cuatro genes del receptor tipo quinasa (RLK) de soja, que incluyen Glyma10g38730 (SEQ ID n O: 23), Glyma09g27950 (SEQ ID NO: 24), Glyma06g05900 (Se Q ID NO : 25), y Glyma17g34380 (SEQ ID NO: 26). Los ejemplos adicionales incluyen los promotores del gen del receptor tipo quinasa (RLK) de patata, PGSC0003DMP400032802 (SEQ ID NO: 27) y PGSC0003DMP400054040 (SEQ ID NO: 28). Es posible que estos genes RLK pueden estar relacionados estructural y/o funcionalmente con los genes Erecta y Erecta-like de Arabidopsis y de otras especies, ya que también son genes RLK. Otros promotores de la etapa vegetativa, preferidos de meristemo de los genes de Arabidopsis incluyen los siguientes: At.MYB17 (At.LMI2; At3g61250) (SEQ ID NO: 31), el gen Kinesin-like (At5g55520) (SEQ ID NO: 32), genes tipo AP2/B3 que incluyen At.REM17 (SEQ ID NO: 33) o At.REM19, y genes Erecta-like 1 y 2, At.Erll (SEQ ID NO: 34) y At.Erl2 (SEQ ID NO: 35). Cada uno de estos promotores y secuencias funcionales similares pueden estar unidos operativamente a un gen FT para provocar la expresión ectópica de genes FT en uno o más meristemos de las plantas, al menos durante la etapa de desarrollo.
Con respecto al gen At.MYB17 (At.LMI2), véase Pastore, JL y col., “LATE MERISTEM IDENTITY 2 acts together with LEAFY to activate APETALA1’’, Development138: 3189-3198 (2011). Con respecto al gen Kinesin-like, véase Fleury, D y col., “The Arabidopsis thaliana Homolog of Yeast BRE1 Has a Function in Cell Cycle Regulation during Early Leaf y Root Growth”, Plant Cell, 19(2): 417-432 (2007). Con respecto a los genes REM17 y REM19 Arabidopsis, véase Mantegazza, O y col., “Analysis of the Arabidopsis REM gene family predicts functions during flower development”, Ann Bot114(7): 1507-1515 (2014). Además, con respecto al gen At.Erl2, véase “Special Issue: Receptor-like Kinases”,JIPB55(12): 1181-1286 (2013), y particularly Shpak, E., “Diverse Roles of ERECTA Family Genes in Plant Development”, JIPB 55(12): 1251-1263 (2013), cuyos contenidos y descripciones se incorporan en el presente documento por referencia.
Ejemplo 8. Expresión del gen del Locus de floración T, Gm.FT2a, bajo el control de un promotor pA t.E rll altera el tiempo de floración y vainas por nodo en soja.
Un vector de transformación que contiene Gm.FT2a bajo el control de la fase vegetativa, el promotor pAt.Erl1 de la etapa vegetativa, preferido del meristemo (SEQ ID NO: 34) se construyó y usó para transformar la soja a través de transformación mediada por Agrobacterium. Las plantas transgénicas generadas a partir de estos eventos se caracterizaron por sus fenotipos en el invernadero con un fotoperíodo de luz natural a 14 a 14,5 horas. Para cada construcción de pAt.Erl1: Gm.FT2a, se analizaron seis eventos (6 plantas por evento). También se analizaron seis plantas y se promediaron para las plantas de control de tipo silvestre (WT). Las siguientes matrices se recolectaron para la caracterización fenotípica de estas plantas y se expresaron como un promedio para cada evento, así como las plantas de tipo silvestre (véase la Tabla 15). También se proporciona una columna que proporciona un promedio para todos los eventos cada rasgo.
Tabla 15. Datos fenotípicos para las plantas pAt.Erl1:Gm.FT2a y WT
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Las plantas de soja transgénicas que expresan la construcción pAt.Erl1::Gm.FT2a florecieron antes que las plantas de control de tipo silvestre y presentaron un aumento del número de vainas por nodo (similar a las plantas que expresan el transgén Gm.FT2a bajo el control del promotor pAt.Erecta). En efecto, las plantas de soja que expresan pAt.Erl1:Gm.FT2a tenían varios fenotipos similares a las plantas transgénicas At.Erecta:Gm.FT2, que incluyen reducción del número de días hasta la floración (DOFR1), reducción del número de días a R7 (DOR7), reducción del

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Una construcción de ADN recombinante que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica una proteína FT florigénica que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 80 % de identidad con la SEQ ID NO:2 y que está operativamente unida a un promotor que comprende una secuencia de polinucleótidos que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO:21, la SEQ ID NO:22 o la SEQ ID NO:38.
2. La construcción de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que la proteína FT florigénica comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO:2.
3. La construcción de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha proteína florigénica está codificada por un polinucleótido que comprende al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO:1.
4. Un vector de plásmido que comprende la construcción de ADN recombinante de una cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 y 8.
5. Una planta transgénica o parte de la planta que comprende la construcción de ADN recombinante de cualquiera de las reivindicaciones 1, 2, 3 y 8.
6. La planta transgénica de la reivindicación 5, en la que la planta transgénica o la parte de la planta es homocigota o hemicigota para la inserción de la construcción de ADN recombinante.
7. Un procedimiento para producir una planta transgénica que comprende
(a) transformar al menos una célula de un explante con una construcción de ADN recombinante de la reivindicación 1; y
(b) regenerar o desarrollar la planta transgénica del explante transformado.
8. La construcción de ADN recombinante de la reivindicación 1, en donde dicha proteína FT florigénica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 90 % de identidad con la SEQ ID NO:2.
9. La construcción de ADN recombinante de la reivindicación 1, en la que dicha proteína FT florigénica comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos el 95 % de identidad con la SEQ ID NO:2.
10. La planta transgénica, o parte de la misma, de la reivindicación 5 o 6, en la que la planta es una planta de día corto.
11. La planta transgénica, o parte de la misma, de la reivindicación 5 o 6, en la que la planta transgénica o una planta crecida a partir de parte de la misma produce más flores por nodo que una planta de control que no tiene la construcción de ADN recombinante.
12. La planta transgénica o parte de la misma de una cualquiera de las reivindicaciones 5, 6 y 11, en la que la planta transgénica o una planta crecida a partir de la parte de la misma produce más cápsulas, silicuas, frutas, frutos secos o vainas por nodo de la planta transgénica que una planta de control que no tiene la construcción de ADN recombinante.
13. La planta transgénica o parte de la misma, de la reivindicación 5 o 6, en la que la planta transgénica o una planta crecida a partir de la parte de la misma es una planta leguminosa.
14. La planta transgénica o parte de la misma, de la reivindicación 13, en la que la planta transgénica o una planta crecida a partir de parte de la misma es soja.
15. La planta transgénica o parte de la misma, de la reivindicación 13 o 14, en la que la planta de soja transgénica o la planta de soja transgénica crecida a partir de la misma produce más vainas por nodo que una planta de control que no tiene la construcción de ADN recombinante.
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