CN102146124B - 大豆GmFTL3蛋白和GmFTL5蛋白及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种大豆GmFTL3蛋白和GmFTL5蛋白，其具有如SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。过表达大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5可明显促进植物(拟南芥)开花，使开花时间缩短，生育期缩短。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题、各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题、光周期敏感性问题和引种问题。

Description

大豆GmFTL3蛋白和GmFTL5蛋白及其应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及两个大豆开花基因、其编码蛋白及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。

背景技术

大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源。因为大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区域间的优异品种不能相互引种、生育期也受环境光周期的制约(Zhang等.，2008)。如果能降低大豆对光周期的敏感性，突破大豆开花对光周期的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种育种方法具有对亲本的依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应性品种。

对拟南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受极其复杂的调节网络控制的(Mouradov等.，2002；Turck等，2008)。但是，其中一个关键蛋白对开花时间的调节起着至关重要的作用，它就是FloweringLocusT(简称FT)，它在叶片中产生，通过维管组织系统运输到生长点并诱导生长点形成花(Blazquez and Weigel，2000；Lee等.，2000；Samach等，2000；Turck等，2008)。因而，FT蛋白被称为成花素(Corbesier等，2007；Jaeger and Wigge，2007；Mathieu等，2007)。该成花素的表达可以降低植物对光周期的敏感性，促进植物开花。FT基因的功能在不同的植物中有报道(Bohlenius等，2006；Hsu等，2006；Yan等，2006；Corbesier等，2007；Jaeger and Wigge，2007；Lin等.，2007；Mathieu等，2007；Tamaki等，2007；Li and Dubcovsky，2008)，但在大豆FT基因的功能及其应用未见报道。通过调节大豆开花基因表达来改变植物对光周期的敏感性和开花时间也没有报道。

发明内容

本发明的目的是提供两个大豆开花基因、其编码蛋白及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。包括(1)克隆两个大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5；(2)提供基因及其编码蛋白的序列；(3)提供这两个基因在育种中的应用，尤其是在调节植物光周期以及开花时间中的应用。

为了实现本发明目的，本发明提供一种大豆GmFTL3蛋白，其具有如SEQ ID No.1所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列，以及大豆GmFTL5蛋白，其具有如SEQ ID No.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的氨基酸序列。

本发明还提供编码上述的大豆GmFTL3蛋白和大豆GmFTL5蛋白的基因。编码大豆GmFTL3蛋白的基因具有如SEQ ID No.3所示的核苷酸序列。编码大豆GmFTL5蛋白的基因具有如SEQ ID No.4所示的核苷酸序列。

本发明的GmFTL3和GmFTL5(全称为Glycine max FloweringLocus T Like 3和5)是从大豆垦农18(Glycine max L. Kennong 18)中克隆到的两个基因，它们编码蛋白的氨基酸序列之间的同源性为90.9％，与拟南芥FT蛋白的氨基酸序列之间的同源性分别为72.2％和71.6％。并且GmFTL3和GmFTL5蛋白与拟南芥FT具有相同的保守域。因此，GmFTL3和GmFTL5与拟南芥FT基因具有类似促进开花的功能。但是，GmFTL3和GmFTL5的蛋白质序列与拟南芥FT蛋白有重要不同。在重要功能域中，大豆GmFTL3和GmFTL5的蛋白质第131位氨基酸残基为谷氨酸(E)，第150位氨基酸残基是亮氨酸(L)，而拟南芥相应部位是谷胺酰胺(Q)和异亮氨酸(I)。这些差异导致GmFTL3和GmFTL5的活性比拟南芥FT高。大豆GmFTL3和GmFTL5基因主要在开花前期和开花期的叶中表达。

本发明包括通过各种方法获得的、如SEQ ID No.1和SEQ IDNo.2所示的氨基酸序列或该序列经替换、缺失或添加一个或几个氨基酸形成的具有同等功能的衍生蛋白质以及编码这些衍生蛋白质的基因。

本发明将GmFTL3和GmFTL5基因构建到表达载体p35S-GW上，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将p35S-GW携带的GmFTL3和GmFTL5基因转入拟南芥，获得拟南芥转化植株。结果表明，GmFTL3和GmFTL5具有降低植物对光周期的敏感性并促进拟南芥开花的作用。

本发明还包括含有GmFTL3和GmFTL5核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其片段的转化植物细胞和转基因植物。

本发明的优点在于：(1)提供了大豆GmFTL3和GmFTL5基因及其编码的蛋白本身；(2)通过在植物中过表达GmFTL3和GmFTL5基因缩短植物生育期，促进植物开花。因此，GmFTL3和GmFTL5基因及其编码的蛋白可以调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的问题以及光周期敏感性问题和引种问题；(3)大豆GmFTL3和GmFTL5基因调节花期的效应明显比拟南芥FT基因的效应强。

附图说明

图1为本发明大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5编码蛋白的氨基酸序列与FT基因编码蛋白的氨基酸序列的比较；

图2为本发明实施例3的植物表达载体p35S-GW的结构示意图；

图3为本发明实施例4的克隆中间载体pGWCm的结构示意图；

图4显示大豆开花基因GmFTL3转化拟南芥，导致拟南芥早开花；

图5显示大豆开花基因GmFTL5转化拟南芥，导致拟南芥早开花；

图6A为本发明实施例7的大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5在转基因植物中的表达水平；

图6B为本发明实施例7的大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5在转基因植物中的表达水平；

图7A为本发明实施例8的大豆开花基因GmFTL3在转基因植物细胞核中的定位；

图7B为本发明实施例8的大豆开花基因GmFTL3在转基因植物细胞核中的定位；

图7C为本发明实施例8的大豆开花基因GmFTL5在转基因植物细胞核中的定位；

其中，在图6A和图6B中，短线前面的字母表示植株的发育时期，短线后面的字母表示器官，U代表单叶；T代表复叶(T后面的数字为复叶的顺序)；F代表花；Pd代表荚；Pt代表叶柄(其后数字表示不同时期的荚)；R代表根；HH代表上胚轴；EH代表下胚轴；SAM代表生长点；St代表茎；L代表侧生叶；C代表子叶。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1  大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5的克隆

分别利用正向引物5’-ATGCCTAGTGGAAGTAGGGAT-3’和反向引物5’-TTAGTATAACCTCCTTCCACC-3’以及正向引物5’-AACCAATTGTAAAGTAGTTTCCA-3’和反向引物5’-GTCCCTTATTTTATAAAGATCAAAA-3’从大豆垦农18(Glycine max L.Kennong 18)中克隆并测序获得GmFTL3和GmFTL5基因，其基因序列如SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ IDNO.1和SEQ ID NO.2所示。

PCR反应程序为：95℃5min预变性，95℃30S，55℃35S，72℃1min，25个循环，72℃10min延伸。

实施例2  大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5编码蛋白的氨基酸序列分析

大豆开花基因的GmFTL3和GmFTL5蛋白序列之间的同源性大于90.9％，C端的功能域与拟南芥高度同源，但存在重要区别，如图1所示。大豆GmFTL3和GmFTL5的蛋白质第131位氨基酸残基为谷氨酸(E)，第150位氨基酸残基是亮氨酸(L)，而拟南芥相应部位是谷胺酰胺(Q)和异亮氨酸(I)。这些差异导致GmFTL3和GmFTL5的活性比拟南芥FT高。

实施例3  大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5的克隆载体

从实施例1中扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图3所示的pGWCm载体上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16℃进行连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆并测序。

实施例4  大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5的植物表达载体

分别将从实施例3中得到的大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5的克隆载体与如图2所示的植物表达载体p35S-GW等比例混合后通过LR反应(两种质粒各50ng，LR酶1μl，补H₂O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上)，将GmFTL3和GmFTL5构建在p35S-GW上，用于在植物中过表达大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行。植物中的筛选标记为Bar。

实施例5  大豆开花基因GmFTL3促进拟南芥开花

从实施例4获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型Col对照)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时培育，直至转化植株开花(约20天)。图4显示大豆开花基因GmFTL3转化拟南芥，导致拟南芥早开花，对光周期不敏感。如图4所示，其中右侧代表对照野生型Col，左侧代表转基因植株。说明大GmFTL3蛋白具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例6  大豆开花基因GmFTL5促进拟南芥开花

从实施例4获得的拟南芥转化植株与其亲本(野生型Col对照)在长日植株生长室中的条件(16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1)下同时培育，直至转化植株开花(约20天)。图5显示大豆开花基因GmFTL5转化拟南芥，导致拟南芥极早开花，对光周期不敏感。如图5所示，其中右侧代表转基因植株，左侧代表对照野生型Col。说明大GmFTL5蛋白具有开花活性，可以促进植物开花。

实施例7  大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5在转基因植物中的表达水平

利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5在转基因植物中的表达。实时荧光定量PCR采用ABI StepOne进行，用SYBR Green I检测荧光信号。反应体系为：

SYBR Primix Ex Taq(2×)(TaKaRa)  7.5μl

上游引物(10μM)                  0.3μl

下游引物(10μM)                  0.3μl

ROX Reference Dye(50x)           0.3μl

cDNA                             1.0μl

ddH₂O(灭菌双蒸水)            5.6μl

反应参数为两步法：95℃10S，热启动；95℃5S，60℃1min，40个循环。用基因芯片数据分析软件Genesis对基因的表达进行标准化并作图。

大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5主要在开花前期和开花期的叶片中表达，GmFTL3在开花期的第二复叶中高水平表达，GmFTL5在叶柄中高水平表达，如图6所示。

实施例8  大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5编码蛋白在转基因植物中的定位

将大豆开花基因GmFTL3与GFP的融合基因转化至拟南芥原生质体中。具体方法如下：

1、原生质体提取：

1)将生长4周左右的拟南芥叶片切成细条，放入甘露醇溶液中；

2)配制酶解液：将上述溶液55℃加热10min，室温放置后，加入CaCl₂10mM，β-巯基乙醇5mM，BSA 0.1％(W/V)，0.45μM滤头过滤，避光4℃保存备用；

3)将步骤1)中的细条捞出，放入酶解液中(1％纤维素酶R-10，0.4％离析酶R-10，0.4M甘露醇，20mM KCl，20mM MES，pH5.7)，23℃避光，40～60rpm酶解3h；

4)金属筛过滤(200目)至小烧杯中(冰上操作)，滤液吸至10ml塑料离心管中，100×g离心1min，弃上清。

2、转化：

1)向10ml离心管中加入预冷的等体积W5溶液(154mM NaCl，125mM CaCl₂，5mM KCl，2mM MES pH5.7)冲洗原生质体，轻轻颠倒混匀，100×g离心1min，弃上清，再加入预冷的1/2体积W5溶液，轻弹使沉淀悬浮起来，冰上放置30min；

2)100×g离心1min，拿出时放冰上，弃上清，加适量预冷的MMg溶液(0.4M甘露醇，15mM MgCl₂，4mM MES pH5.7)冲洗原生质体，100×g离心1min，弃上清，加适量预冷的MMg溶液悬浮原生质体；

3)取10μl融合表达载体的质粒DNA(10μg)于1.5ml离心管中，用去掉尖端的平头枪头加入100μl原生质体提取液，轻轻吸打混匀，再加入110μl的PEG/Ca²⁺溶液，混匀，23℃避光温浴30min，进行转化；

4)向离心管中加入440μl W5溶液，23℃，100×g离心1min，去除上清，向沉淀中加入100μl W5溶液，混匀，23℃，100×g离心1min，吸弃上清，加100μl W5溶液，重复1次，23℃，100×g离心1min，吸弃上清，再加入1ml W5溶液将沉淀混匀；

5)将悬浮液倒入六孔板中(先用5％的BSA溶液充分润洗)，避光，平放于23℃暗培养12～16h；

6)100×g离心1min，直接吸取一定量的原生质体沉淀在Confoal显微镜下观察。

采用基因枪轰击的方法，将大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5与YFP的融合基因，转化至大豆叶片中。具体方法如下：

1)微粒子弹的制备：将10μg重组质粒DNA与6μl 50mg/ml的金粉悬液(直径为1.0μm)、4μl 0.1mol/L亚精胺(抽滤灭菌)和6μl 2.5mol/LCaCl₂，涡旋振荡混匀，冰上静置15min，12,000rpm离心10s，收集金粉沉淀，用20μl无水乙醇重悬。

2)轰击受体材料：将幼嫩的洋葱表皮或大豆幼嫩叶片摆放在MS培养基上，22℃预培养4h。选用1100psi的压力膜，将20μl金粉-DNA混合物点在轰击膜中央，采用PDS 1000/He型基因枪(Bio-Rad)进行轰击，轰击距离6cm，真空度为25In.Hg。轰击后的洋葱表皮细胞22℃暗培养24h后，在激光共聚焦显微镜(Leica TCS SP2)下观察。

转化细胞中的GFP/YFP荧光信号表示大豆开花基因GmFTL3和GmFTL5编码蛋白的定位，如图7所示。图7显示大豆开花基因GmFTL3(图7A和图7B)和GmFTL5(图7C)编码的蛋白在拟南芥原生质体(图7A)和大豆叶片(图7B和图7C)中主要定位于核。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

<120>大豆GmFTL3蛋白和GmFTL5蛋白及其应用

<130>KHP10112011.7

<160>8

<170>PatentIn version 3.5

<210>1

<211>176

<212>PRT

<213>GmFTL3

<400>1

Met Pro Ser Gly Ser Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Gly Val Ile Gly

1               5                   10                  15

Asp Val Leu Asp Pro Phe Glu Tyr Ser Ile Pro Met Arg Val Thr Tyr

            20                  25                  30

Asn Asn Arg Asp Val Ser Asn Gly Cys Glu Phe Lys Pro Ser Gln Val

        35                  40                  45

Val Asn Gln Pro Arg Val Asn Ile Gly Gly Asp Asp Leu Arg Asn Phe

    50                  55                  60

Tyr Thr Leu Ile Ala Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp Pro

65                  70                  75                  80

Asn Leu Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Ala Thr

                85                  90                  95

Thr Gly Ala Ser Phe Gly His Glu Val Val Thr Tyr Glu Ser Pro Arg

            100                 105                 110

Pro Met Met Gly Ile His Arg Leu Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Leu

        115                 120                 125

Gly Arg Glu Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Asn Thr

    130                 135                 140

Lys Glu Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val

145                 150                 155                 160

Tyr Phe Asn Ile Gln Arg Glu Ser Gly Ser Gly Gly Arg Arg Leu Tyr

                165                 170                 175

<210>2

<211>176

<212>PRT

<213>GmFTL5

<400>2

Met Pro Arg Gly Ser Arg Asp Pro Leu Val Val Gly Arg Val Ile Gly

1               5                   10                  15

Asp Val Leu Asp Pro Phe Glu Cys Ser Ile Pro Met Arg Val Thr Tyr

            20                  25                  30

Asn Asn Lys Asp Val Ser Asn Gly Cys Glu Phe Lys Pro Ser Gln Val

        35                  40                  45

Val Asn Gln Pro Arg Ile Asn Ile Gly Gly Asp Asp Phe Arg Asn Phe

    50                  55                  60

Tyr Thr Leu Ile Ala Val Asp Pro Asp Ala Pro Ser Pro Ser Asp Pro

65                  70                  75                  80

Asn Phe Arg Glu Tyr Leu His Trp Leu Val Thr Asp Ile Pro Ala Thr

                85                  90                  95

Thr Gly Pro Thr Phe Gly His Glu Val Val Thr Tyr Glu Asn Pro Arg

            100                 105                 110

Pro Met Met Gly Ile His Arg Ile Val Phe Val Leu Phe Arg Gln Gln

        115                 120                 125

Gly Arg Glu Thr Val Tyr Ala Pro Gly Trp Arg Gln Asn Phe Ile Thr

    130                 135                 140

Arg Glu Phe Ala Glu Leu Tyr Asn Leu Gly Leu Pro Val Ala Ala Val

145                 150                 155                 160

Tyr Phe Asn Ile Gln Arg Glu Ser Gly Cys Gly Gly Arg Arg Leu Cys

                165                 170                 175

<210>3

<211>531

<212>DNA

<213>GmFTL3

<400>3

ATGCCTAGTG GAAGTAGGGA TCCTCTCGTT GTTGGGGGAG TAATTGGGGA TGTATTGGAT    60

CCTTTTGAAT ATTCTATTCC TATGAGGGTT ACCTACAATA ACAGAGATGT CAGCAATGGA   120

TGTGAATTCA AACCCTCACA AGTTGTCAAC CAACCAAGGG TAAATATCGG TGGTGATGAC   180

CTCAGGAACT TCTATACTTT GATTGCGGTT GATCCCGATG CACCTAGCCC AAGTGACCCC   240

AATTTGAGAG AATACCTCCA TTGGTTGGTG ACTGATATCC CAGCAACAAC AGGGGCTAGT   300

TTCGGCCATG AGGTTGTAAC ATATGAAAGT CCAAGACCAA TGATGGGGAT TCATCGTTTG   360

GTGTTTGTGT TATTTCGTCA ACTGGGTAGG GAGACCGTGT ATGCACCAGG ATGGCGCCAG   420

AATTTCAACA CTAAAGAATT TGCTGAACTT TACAACCTTG GATTGCCAGT TGCTGCTGTC   480

TATTTCAACA TTCAGAGGGA ATCTGGTTCT GGTGGAAGGA GGTTATACTA A            531

<210>4

<211>528

<212>DNA

<213>GmFTL5

<400>4

ATGCCTCGTG GAAGTAGGGA CCCTCTAGTT GTTGGGCGTG TGATTGGGGA TGTATTGGAC    60

CCTTTTGAAT GTTCTATTCC TATGAGGGTC ACCTACAATA ACAAAGATGT CAGCAATGGA   120

TGTGAATTCA AACCCTCACA AGTTGTCAAC CAACCAAGAA TAAATATCGG TGGTGATGAT   180

TTCAGGAACT TCTACACTTT GATCGCGGTT GATCCTGATG CACCTAGCCC AAGTGATCCC   240

AATTTCAGAG AATACCTCCA TTGGTTAGTA ACTGACATTC CAGCAACAAC GGGGCCTACT   300

TTCGGTCATG AGGTTGTAAC ATATGAAAAT CCACGACCCA TGATGGGGAT CCATCGTATA   360

GTCTTTGTGT TATTTCGTCA ACAGGGTAGA GAGACAGTGT ATGCACCAGG ATGGCGCCAA   420

AATTTCATTA CTAGAGAATT TGCTGAACTT TACAATCTTG GATTGCCAGT TGCTGCTGTC   480

TATTTTAACA TCCAGAGAGA ATCTGGTTGT GGTGGAAGAA GGCTATGTTA A            531

<210>5

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

ATGCCTAGTG GAAGTAGGGA T                                              21

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

TTAGTATAAC CTCCTTCCAC C                                              21

<210>7

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<400>7

AACCAATTGT AAAGTAGTTT CCA                                            23

<210>8

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

GTCCCTTATT TTATAAAGAT CAAAA                                          25

Claims (8)

1.大豆GmFTL3蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

2.大豆GmFTL5蛋白，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。

3.编码权利要求1所述的大豆GmFTL3蛋白的基因。

4.编码权利要求2所述的大豆GmFTL5蛋白的基因。

5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.3所示。

6.如权利要求4所述的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID No.4所示。

7.含有权利要求3-6任一项所述基因的载体。

8.权利要求3-6任一项所述的基因在调节植物光周期和开花时间中的应用。

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