CN102731636B - 大豆生物钟基因GmLCL1及其编码蛋白与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种大豆GmLCL1蛋白，其为：1）由SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质，或2）在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白质。本发明同时提供了编码上述蛋白的基因GmLCL1，过表达所述基因可明显抑制植物开花，延长生育期。可用于解决杂交育种中的花期不遇问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制问题，光周期敏感性问题和引种问题。

Description

大豆生物钟基因GmLCL1及其编码蛋白与应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，特别是涉及一个大豆生物钟基因、其编码蛋白及其在植物光周期和开花时间调节中的应用。

背景技术

大豆是重要的农作物之一，是植物蛋白质、食用油、生物柴油以及异黄酮和卵磷脂等次生代谢产物的重要来源。大豆是短日植物，开花受光周期的严格控制，因而不同区域间的优异品种不能相互引种，生育期也受环境光周期的制约(Zhang等，2008)。如果能降低大豆对光周期的敏感性，突破光周期对大豆开花的限制，就能解决大豆的引种问题，从而实现各区域间优质品种的相互交换，丰富各地优异种质资源，调节大豆生育期，提高大豆产量和品质。以往解决大豆光周期敏感性主要是通过杂交的方法获得新品种，但是，这种育种方法具有对亲本依赖性强和周期长等缺点，到目前为止尚未获得大豆光周期广适应性品种。

对拟南芥等植物的研究表明，植物的光周期是受极其复杂的调节网络控制的(Mouradov等，2002；Turck等，2008)。其中重要的一个调控途径是生物钟调控系统。拟南芥生物钟系统的中央振荡器主要有三个重要组分：即CCA1(Circadian Clock Associated 1)，LHY(LateElongated Hypocotyl)和TOC1(Timing Of CAB Expression 1)。CCA1和LHY各编码MYB相关的转录因子，TOC1是一个伪反应调节因子（Pseudo-response regulator）。凌晨时，CCA1和LHY的转录达到高峰，其蛋白结合在TOC1启动子的夜晚元件（Evening element，EE）上协同抑制TOC1的转录。而在暗中，TOC1表达逐渐升高并在深夜达到高峰，高表达的TOC1通过一种未知的机制促进CCA1和LHY的表达并使其在凌晨达到高峰，三者形成一个反馈抑制环（Feedback loop），并有节律的振荡（Gould等，2006；Barak等，1998；Alabadi等，2002；Mizoguchi等，2002；Staiger等，2002）。

大豆是典型的短日植物，又是古四倍体，因此，研究大豆生物钟成分LHY/CCA1/TOC1，阐明其功能，对揭示大豆光周期调节及植物生物钟系统的进化和多样性具有重要意义。截止目前为止，通过调节大豆生物钟来改变植物对光周期的敏感性和开花时间尚未见报道。

发明内容

为解决通过对大豆生物钟的调节来改变植物对光周期的敏感性和开花时间的问题，本发明的目的是提供一种大豆GmLCL1蛋白。

大豆GmLCL1蛋白为：1）由SEQ ID No.1所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或2）在SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中经取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有同等活性的由1）衍生的蛋白质。

本发明的另一目的是提供编码上述的大豆GmLCL1蛋白的GmLCL1基因。

GmLCL1（全称为Glycine max L.LHYand CCAA1 Like）基因具有SEQ ID No.2所示的核苷酸序列。本发明的大豆GmLCL1基因是从大豆垦农18（Gycine max L.Kennong 18）中通过RT-PCR克隆到的一个基因。

应当理解，本领域技术人员可根据本发明公开的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失和/或增加一个或几个氨基酸，得到所述蛋白的突变序列。例如在非活性区段，将第（4）位酪氨酸（Y）替换为天冬氨酸（D），或是将第（12）位的缬氨酸（V）替换为异亮氨酸（I），或是将第（42）位的组氨酸（H）替换为酪氨酸（Y）。

因此，本发明的大豆GmLCL1蛋白还包括SEQ ID No.1所示氨基酸序列经取代、替换和/或增加一个或几个氨基酸，具有大豆GmLCL1蛋白同等活性的由大豆GmLCL1蛋白衍生得到的蛋白质。本发明基因包括编码所述蛋白的核酸序列。此外，应理解，考虑到密码子的简并性以及不同物种密码子的偏爱性，本领域技术人员可以根据需要使用适合特定物种表达的密码子。

本发明的另一个目的是提供携带GmLCL1基因的植物表达载体，所述的植物表达载体为p35S-GW。

本发明的GmLCL1基因，它的蛋白序列与拟南芥LHY蛋白的氨基酸序列之间的相似性为55.8%，在保守功能域（MYB DNA-bindingdomain）更与LHY蛋白高度相似，因此推测与拟南芥LHY基因功能类似，GmLCL1也具有抑制开花的功能。GmLCL1主要在大豆的叶片中表达，在开花期的第二复叶中表达量最高。

本发明将GmLCL1基因构建到表达载体p35S-GW上，并在大肠杆菌DH5α中扩繁。通过农杆菌介导转化方法，将p35S-GW携带的GmLCL1基因转入模式植物拟南芥中，获得拟南芥转化植株。结果表明，GmLCL1具有降低植物对光周期的敏感性并抑制拟南芥开花的作用。

本发明还提供含有GmLCL1核苷酸序列或其片段的克隆载体或各类表达载体、含有所述载体的宿主细胞、含有所述核苷酸序列或其特异片段的转化植物细胞和转基因植物。

本发明的另一个目的是提供GmLCL1基因及其编码蛋白GmLCL1在调节植物光周期以及开花时间中的应用。

本发明的有益效果在于：

（1）提供了大豆GmLCL1基因及其编码蛋白GmLCL1；

（2）通过在植物中过表达GmLCL1基因延长植物生育期，抑制植物开花。

因此，GmLCL1基因及其编码的蛋白可以调节花期，可用于解决杂交育种中的花期不遇的问题，各种作物、蔬菜、水果、花卉的生育期控制的问题以及光周期敏感性问题和引种问题。

附图说明

图1为本发明大豆生物钟基因GmLCL1编码蛋白的氨基酸序列与LHY、CCA1基因编码蛋白的氨基酸序列的比较。

图2为克隆中间载体pGWCm的结构示意图。

图3A为大豆生物钟基因GmLCL1在大豆中不同组织器官的表达水平。

图3B为大豆生物钟基因GmLCL1在大豆中不同发育时期的表达水平。

图4为植物表达载体p35S-GW的结构示意图。

图5为大豆生物钟基因GmLCL1在转基因植物细胞核中的定位。

图6为大豆生物钟基因GmLCL1转化拟南芥，导致拟南芥晚开花。

图7为大豆生物钟基因GmLCL1蛋白的Western检测。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1大豆生物钟基因GmLCL1的克隆

分别利用正向引物5'-ATGGACGCATACTCCTCCGGC-3'和反向引物5'-TCAAGTCGAAGTCTCCCCTTCCA-3'通过RT-PCR的方法从大豆垦农18（Glycine max L.Kennong 18）中扩增基因。

PCR反应程序为：95℃5min预变性，95℃30S，50℃35S，72℃2min30S，30个循环，72℃10min延伸。

GmLCL1克隆载体的获得：将扩增获得的PCR产物直接按照TA克隆方法克隆到如图2所示的pGWCm载体上。先将pGWCm载体用Ahd I内切酶水解后用凝胶回收试剂盒回收酶切产物以获得T载体。然后PCR产物和T载体于16℃进行12小时连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α，并在其中扩增，筛选阳性克隆，并测序。

获得的GmLCL1基因，其基因序列如SEQ ID No.2所示；由其编码的蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

实施例2大豆生物钟基因GmLCL1编码蛋白的氨基酸序列分析

大豆生物钟基因的GmLCL1蛋白序列与拟南芥LHY蛋白之间的相似性为55.8%，且在保守功能域（MYB DAN-binding domain）高度相似，如图1所示。因此推测GmLCL1与拟南芥LHY的功能类似，具有抑制植物开花的活性。

实施例3大豆生物钟基因GmLCL1在大豆中不同组织器官及不同发育时期的表达水平

利用实时定量荧光PCR(quantitative real time RT-PCR)测定大豆生物钟基因GmLCL1在大豆中的表达。实时荧光定量PCR采用ABIStepOne进行，用SYBR Green I检测荧光信号。

上游引物：5’-TATCATTTCTTTATCCCTCCAACGG-3’

下游引物：5’-ACACACATCTACACGACAAGTTTC-3’

反应体系为：

反应参数为两步法：95°C 10S，热启动；95°C 5S，60°C 1min，40个循环。用基因芯片数据分析软件Genesis对基因的表达进行标准化并作图。

大豆生物钟基因GmLCL1在大豆子叶、茎、叶、花、叶柄中均有表达，在开花期的第二复叶中表达量最高，如图3所示。

实施例4大豆生物钟基因GmLCL1的植物表达载体

将从实施例1中得到的大豆生物钟基因GmLCL1的克隆载体与如图4所示的植物表达载体p35S-GW（购自Invitrogen）等比例混合后通过LR反应（两种质粒各50ng，LR酶1μl，补ddH₂O至终体积5μl，混匀后25℃反应6小时以上），将GmLCL1构建在p35S-GW上，用于在植物中过表达大豆生物钟基因GmLCL1，研究其功能。植物的转化方法采用农杆菌介导法进行，参见《拟南芥实验手册》，2004。植物中的筛选标记为Bar。

实施例5大豆生物钟基因GmLCL1编码蛋白在转基因植物中的定位

将大豆生物钟基因GmLCL1与YFP的融合基因，转化至拟南芥原生质体中。具体方法如下：

1）原生质体提取：

将生长四周左右的拟南芥叶片切成细条，放入甘露醇溶液中；配制酶解液：将上述溶液55℃加热10min，室温放置后，加入CaCl₂10mM，β-巯基乙醇5mM，BSA 0.1%(W/V)，0.45μM滤头过滤，避光4℃保存备用；将拟南芥叶片细条捞出，放入酶解液中（1%纤维素酶R-10，0.4%离析酶R-10，0.4M甘露醇，20mM KCl，20mM MES，pH值5.7），23℃避光，40～60rpm酶解3h；金属筛过滤（200目）至小烧杯中（冰上操作），滤液吸至10mL塑料离心管中，100×g离心1min，弃上清；向10mL离心管中加入预冷的等体积W5溶液冲洗原生质体，轻轻颠倒混匀，100×g离心1min，弃上清，再加入预冷的1/2体积W5溶液，轻弹使沉淀悬浮起来，冰上放置30min；100×g离心1min，拿出时放冰上，弃上清，加适量预冷的MMg溶液冲洗原生质体，100×g离心1min，弃上清，加适量预冷的MMg溶液悬浮原生质体。

2）PEG转化

取10μL融合表达载体的质粒DNA（10μg）于1.5mL离心管中，用剪掉头的黄枪头加入100μL原生质体提取液，轻轻吸打混匀，再加入110μL的PEG/Ca²⁺溶液，混匀，23℃避光温浴30min，进行转化；向离心管中加入440μL W5溶液，23℃，100×g离心1min，去除上清，向沉淀中加入100μL W5溶液，混匀，23℃，100×g离心1min，吸弃上清，加100μL W5溶液，重复1次，23℃，100×g离心1min，吸弃上清，再加入1mL W5溶液将沉淀混匀；将悬浮液倒入六孔板中（先用5%的BSA溶液充分润洗），避光，平放于23℃暗培养12～16h；100×g离心1min，直接吸取一定量的原生质体沉淀在激光共聚焦显微镜（Laser Scanning Confocal Microscope）下观察。

转化细胞中的YFP荧光信号表示大豆生物钟基因GmLCL1编码蛋白的定位，如图5所示。图5显示大豆生物钟基因GmLCL1编码的蛋白在拟南芥原生质体中主要定位于核。

实施例6大豆生物钟基因GmLCL1抑制拟南芥开花

从实施例4获得的拟南芥转化植株与其亲本（野生型Col对照）在长日植株生长室中的条件（16小时光照/8小时黑暗的光周期，光强80μmol·m^-2·s^-1）下同时培育。对27株GmLCL1的T₁代过表达转基因植株进行花期观测。大豆生物钟基因GmLCL1转化拟南芥的转化株系从播种到开花为48~57天，平均为53天，而其对照的开花时间为47~50天左右，平均为48天。结果表明，大豆生物钟基因GmLCL1转化拟南芥，抑制拟南芥开花，对光周期不敏感。如图6所示，其中右侧代表对照野生型Col，左侧代表转基因植株。说明大豆GmLCL1蛋白具有抑制开花的活性。

实施例7大豆生物钟基因GmLCL1编码蛋白的诱导表达及检测

参照实施例4中的方法将GmLCL1构建在表达载体pDEST17上，并转化至大肠杆菌BL21Star中并诱导表达融合His标签的重组蛋白，经镍柱纯化后（Qiagen Ni-NTA Spin Kit Handbook，2008）用His抗体经Western杂交检测确定纯化蛋白的特异性。

检测结果如图7所示，GmLCL1蛋白具有很好的特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

序列说明：

SEQ ID No.1所示为大豆GmLCL1的氨基酸序列；SEQ ID No.2所示为大豆GmLCL1的核苷酸序列；SEQ ID No.3和SEQ ID No.4所示为克隆大豆GmLCL1的引物对；SEQ ID No.5和SEQ ID No.6所示为大豆GmLCL1 Real-time PCR的引物对。

Claims (2)

1.一种大豆GmLCL1蛋白在抑制植物开花、延长植物生育期中的应用，所述大豆GmLCL1蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的应用是在植物体内过量表达大豆GmLCL1基因，抑制植物开花，延长植物生育期。