CN107417782A

CN107417782A - 甘蔗开花调控蛋白ScFT‑3及其编码基因

Info

Publication number: CN107417782A
Application number: CN201710819047.4A
Authority: CN
Inventors: 林秀琴; 刘新龙; 字秋艳; 毛钧; 陆鑫; 刘洪博; 李旭娟; 李纯佳; 徐超华; 吴转娣
Original assignee: Sugarcane Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Current assignee: Sugarcane Research Institute of Yunnan Academy of Agricultural Sciences
Priority date: 2017-09-12
Filing date: 2017-09-12
Publication date: 2017-12-01

Abstract

本发明涉及甘蔗开花调控蛋白ScFT‑3及其编码基因，属于植物基因工程技术领域。所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT‑3为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成，编码基因及基因组DNA核苷酸序列如SEQ ID No.2和SEQ ID No.3。本发明是从甘蔗品种粤糖93‑159成熟期叶片提取总RNA和基因组DNA，用PCR扩增和RACE技术得到ScFT‑3 cDNA全长和基因组DNA。所述ScFT‑3基因作用部位在甘蔗成熟叶，ScFT‑3基因在甘蔗成花转变时期成熟叶中表达量显著下调，说明ScFT‑3抑制甘蔗开花。通过抑制ScFT‑3基因的表达可以使甘蔗花期提前。

Description

甘蔗开花调控蛋白ScFT-3及其编码基因

技术领域

本发明涉及分子生物学中的基因技术领域，属于植物基因工程技术领域，具体涉及甘蔗开花调控蛋白ScFT-3及其编码基因。

背景技术

从营养生长向生殖生长的转变是高等植物发育中的一个重大事件。在营养组织上出现生殖过程的转变是由内在的因素和环境因子共同调控的。茎尖分生组织(SAM)是一群未分化细胞，在营养生长期间发育成叶和枝。在受到环境和内因的影响下，SAM茎尖分生组织经历了一个特定的改变产生了花(芽)原基。通过对拟南芥成花诱导的分子生物学分析，鉴定出了许多包括自身调节途径、赤霉素途径、光周期途径和春化途径等4个在响应网络中起关键调控作用的花期基因。

FT-like亚家族属于FT/TFL1基因家族成员，均具有保守的PEBP结构域，它们编码的蛋白均含有保守的Tyr85和Gln140残基，在第4个外显子中含有对FT活性起关键作用的11个保守氨基酸残基和高度保守的LYN三联体模块，主要发挥促进开花的作用；FT是花发育途径中的汇集点，它可以整合来自光周期途径、春化途径和自主途径等不同花发育途径的信号，在植物花发育中发挥着重要作用。2007年，世界各地先后有不同的科学家在不同的植物材料中证实了FT蛋白就是人们苦苦寻找的“成花素”，它可以通过韧皮部从叶片运输到茎端分生组织，FT蛋白与bZIP转录因子FLOWERING LOCUS D(FD)互作，共同激活花分生组织基因APETALA 1(AP1)表达，从而促进成花转换并启动花发育过程。

甘蔗属于单子叶植物，是蔗糖生产的重要原料，占世界糖产量的三分之二。甘蔗是短日照植物，深入的认识甘蔗开花过程是很重要的，原因一，在热带地区甘蔗品种容易开花，甘蔗生殖生长的转变导致一些糖分运输到正在发育的花序中，从而使存储的蔗糖离开茎秆，因此逐渐减少了原料的糖产量。原因二，在中国内陆及其它非热带地区植蔗国，甘蔗亲本开花难且花期不遇成为甘蔗杂交育种和新亲本创制的主要“瓶颈”，限制了野生种质资源的杂交利用，阻碍了育种效率的提高。目前，常规杂交育种主要采用人工光周期调控技术诱导甘蔗亲本开花进行杂交利用，但还存在不同亲本诱导开花的难度不一，且花期不遇的问题，这导致很多甘蔗优良亲本及组合因花期不遇，甚至难开花而难以被杂交利用。甘蔗生长周期较长，亲本从种植到诱导开花需时一年到一年半，如何有效提高甘蔗诱导开花的效率，精准控制花期，缩短甘蔗育种年限，提升育种效率等都是目前甘蔗杂交育种需要解决的关键问题。

最近，巴西Coelho等从甘蔗EST数据库中鉴定了5个不完全的甘蔗FT基因序列，命名为ScFT1、ScFT2、ScFT3、ScFt4和ScFT5，其中ScFT2与玉米的ZCN8和ScFT1的关系最近。ScFT3和ScFT4与促进开花的Hd3a、FT和BvFT1基因聚在一起。对这些候选基因进行更进一步的功能分析将有助于了解这些基因在甘蔗花期调控中的作用。

人工光周期调控诱导甘蔗亲本开花技术体系的建立，实现了甘蔗有性杂交育种，让资源间的优异血缘得到交流，拓宽了品种的遗传基础，改良了品种的抗逆性、适应力、活力，极大推动了甘蔗遗传育种的发展，但依然存在一些问题，如有些亲本(特别是甘蔗原始亲本热带种)难被诱导开花，杂交组合亲本花期不遇以及花粉育性低等问题。解决以上问题，就需要研究者了解甘蔗开花的分子调控机制，找到影响甘蔗成花转变的关键调控节点，通过调控内源和外源因子控制甘蔗的开花时间，从而为甘蔗亲本花期的精准调控奠定重要的理论基础。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有人工光周期调控技术的不足，提供甘蔗开花调控蛋白ScFT-3及其编码基因，生物信息学分析表明ScFT-3基因具有FT类蛋白的PEBP euk保守结构域。用实时荧光定量PCR技术分析了ScFT-3mRNA的时空表达模式，结果本发明所述甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3在甘蔗营养生长时期成熟叶和幼叶中表达量均较高，在成花转变时期成熟叶和幼叶中表达量均降低，在孕穗早期ScFT-3基因转移到主要在幼叶中表达；对ScFT-3基因在甘蔗成花转变时期成熟叶中1天8个不同时间点基因相对表达量进行分析，结果表明ScFT-3表达量具有昼夜节律变化的规律，ScFT-3基因在15：00的表达量最高，21:00表达量最低。本发明说明甘蔗ScFT-3基因在早期具有维持甘蔗营养生长的功能(抑制甘蔗开花)，是甘蔗开花抑制物。现有许多植物的开花调节子，它们中大多数是开花时间激活物，只有少数几个是开花抑制物，因此开花抑制物的发现是很有价值的。在激活开花的过程中，开花抑制物被抑制的突变株比开花激活物过表达的突变株在遗传上更稳定。研究甘蔗ScFT-3基因对探究甘蔗开花机制、促进甘蔗亲本开花和甘蔗花期调控技术的研发具有较大的实用价值。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

甘蔗开花调控蛋白ScFT-3，所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成。

编码权利要求上述甘蔗开花调控蛋白ScFT-3的核苷酸序列。

所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3，其cDNA全长为如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列。

扩增上述cDNA全长序列的引物为：

上游引物：5’-ttcgtaggtctcagctactacc-3’

下游引物：5’-gtttattgccaaggcgtgac-3’

本发明还公开了甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3在人工光周期调控诱导开花和非诱导条件下的时空表达模式。在诱导开花条件下，ScFT-3基因在甘蔗成花转变时期表达量下调明显，在孕穗早期转移到主要在幼叶中表达。ScFT-3在甘蔗成花转变时期成熟叶中昼夜1天8个不同时间点的表达情况：ScFT-3在下午15:00的表达量最高，其次是早上9:00，21:00最低。说明ScFT-3基因可以感应光周期的变化。ScFT-3基因在早期主要起维持甘蔗营养生长的作用，成花转变时期ScFT-3基因表达量下调，在孕穗早期ScFT-3基因转移到主要在幼叶中表达，其在甘蔗幼叶中与甘蔗开花刺激物起相互平衡的作用。

在非诱导条件下(对照)，ScFT-3基因的表达量均较高，在不同时期不同组织部位变化不明显。

所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3，其开放读码框如SEQ ID NO.2中第50～577位所示。与甘蔗(登录号：KJ496327.1)相似度为99％，与高粱(登录号：XM-002438506.2)相似度为98％，与玉米ZCN26(登录号：EU241916.1)相似度为95％。所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3，其氨基酸序列SEQ ID NO.1，与甘蔗(登录号：AHZ46121.1)相似度为99％，与高粱(登录号：XP-002438551.1)相似度为98％，与玉米(登录号：NP-001106265.1)相似度为94％。

本发明同时提供所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3在调控植物花期中的应用。优选的是，所述的植物为甘蔗，但不限于此。

本发明还提供所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3在缩短植物育种年限中的应用。优选的是，所述的植物为甘蔗，但不限于此。

本发明是用PCR扩增结合RACE技术从甘蔗品种粤糖93-159成熟期叶片中获得甘蔗ScFT-3cDNA全长和基因组DNA序列。甘蔗ScFT-3开放读码框为528bp，编码175个氨基酸。在人工光周期调控诱导开花条件下，ScFT-3时空表达模式：甘蔗ScFT-3基因在甘蔗营养生长时期成熟叶和幼叶中的表达量均较高，在成花转变时期成熟叶和幼叶中表达量均降低，在孕穗早期转移到主要在幼叶中表达。ScFT-3在甘蔗成花转变时期成熟叶中昼夜1天8个不同时间点的表达情况：ScFT-3在下午15:00的表达量最高，其次是早上9:00，21:00最低。说明ScFT-3基因可以感应光周期的变化，基因表达量具有昼夜节律变化规律。ScFT-3基因是甘蔗开花的抑制物(抑制甘蔗开花)，研究利用该基因对诱导促进甘蔗开花、缩短甘蔗育种年限、提高甘蔗花粉育性和杂交效率等方面，具有较好的应用前景。申请人将该基因命名为ScFT-3。其氨基酸序列如序列表中SEQ ID No.1所述；编码基因核苷酸序列如序列表中SEQID No.2(cDNA序列)和SEQ ID No.3(DNA序列)所述。

所说甘蔗开花调控蛋白ScFT-3还包括SEQ ID No.1所示的氨基酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个氨基酸生成的植物衍生物。

所说核苷酸序列还包括在SEQ ID No.2或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列中添加、取代、插入和缺失一个或多个核苷酸生成的植物衍生物。

1.甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3的同源克隆

①总RNA的提取

以甘蔗品种粤糖93-159为材料，在成熟期取新鲜+1叶叶片，使用Trans Zol^TMPlant试剂盒(ET121)，按照使用说明书提取甘蔗总RNA。

②cDNA第一链的合成

以甘蔗总RNA作为模板，利用TransOne-Step gDNA Removal and cDNASynthesis Super MIX反转录试剂盒(AE311)合成cDNA第一链。

③引物设计合成

从GenBank中下载近缘物种(高粱、玉米、水稻等)FT-like同源基因CDS序列，利用DNA man软件进行多序列比对，确定保守区，使用Primer Premier 5并以高粱FT同源基因为模板，在保守区序列设计引物，引物设计后交给上海生物工程公司合成。并使用合成的引物扩增目标基因中间片段。

扩基因中间片段的引物

上游引物ScFT-3 23F：5’-ggggacacataatcggg-3’；(SEQ ID NO.5)

下游引物ScFT-3 445R：5’-tgaaacggcgtgcaaaa-3’。(SEQ ID NO.6)

④连接转化、单克隆培养及测序分析

PCR扩增产物用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，从凝胶中纯化回收目标产物，将纯化的PCR产物克隆到Trans-T5Zero载体中，转化大肠杆菌Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell感受态细胞中，在含有氨苄的固体培养基上培养过夜，挑取阳性克隆进行继代培养。以M13F和M13R引物PCR检测，将有目的条带的单克隆送华大基因科技有限公司(广州)进行双向测序。

M13F和M13R引物

上游引物M13F：5’-gtaaaacgacggccagt-3’；(SEQ ID NO.7)

下游引物M13R：5’-caggaaacagctatgac-3’。(SEQ ID NO.8)

2.甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3 3’和5’UTR的获得

根据已测定的目标基因中间片段序列设计3’RACE和5’RACE的基因特异性引物(Gene Specific Primer，简称GSP)，均使用RACE 5’/3’Kit(ClontechLaboratories,Inc)试剂盒对目的基因的3’和5’末端进行扩增，具体操作步骤参照RACE试剂盒说明书。

以甘蔗成熟叶总RNA为模板，利用RACE试剂盒中自带的反转录接头引物及试剂，反转录合成带有接头的cDNA第一链。

在3’RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用3’RACE外侧基因特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM Long primer进行第一次PCR反应，所得的产物稀释50倍后作为第二次PCR反应的模板，3’RACE内侧基因特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物UPM Short primer进行第二次巢式PCR反应。

3’RACE外侧基因特异引物

RACE ScFT-3 25F：5’-tagacccgtttactggctcagtgc-3’；(SEQ ID NO.9)

3’RACE内侧基因特异引物

RACE ScFT-3 81F：5’-tttgaagggatggagtttcgggc-3’。(SEQ ID NO.10)

在5’RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用5’RACE外侧基因特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM Long primer进行第一次PCR反应，所得的产物稀释50倍后作为第二次PCR反应的模板，5’RACE内侧基因特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物UPM Short primer进行第二次巢式的PCR反应。

5’RACE外侧基因特异引物

RACE ScFT-3 403R：5’-cgcaagttgaagttctgacggac-3’；(SEQ ID NO.11)

5’RACE内侧基因特异引物

RACE ScFT-3 337R：5’-accaagacaatacggtggatgcc-3’。(SEQ ID NO.12)

试剂盒中的通用引物

UPM Long primer：5’-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3’；(SEQ ID NO.13)

UPM Short primer：5’-ctaatacgactcactatagggc-3’。(SEQ ID NO.14)

PCR扩增产物用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，从凝胶中纯化回收3’RACE目标产物和5’RACE目标产物，将纯化的PCR产物克隆到Trans-T5Zero载体中，转化大肠杆菌Trans1-T1Phage Resistant Chemically Competent Cell感受态细胞中，在含有氨苄的固体培养基上培养过夜，挑取阳性克隆进行继代培养。以M13F和M13R引物PCR检测，将有目的条带的单克隆送华大基因科技有限公司(广州)进行双向测序。利用DNAman 6.0对测序结果与保守区序列设计引物扩增所得序列(基因中间片段)进行拼接。

3.甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3cDNA全长及基因组DNA克隆测序

根据3’RACE、5’RACE和基因中间片段拼接的序列设计cDNA全长引物和基因组DNA引物，通过PCR扩增获得包含起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)的cDNA全长产物(序列表SEQ ID No.2)和基因组DNA产物(序列表SEQ ID No.3)，PCR扩增产物用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，从凝胶中纯化回收目标产物，将纯化的PCR产物克隆到Trans-T5Zero载体中，转化大肠杆菌Trans1-T1Phage Resistant ChemicallyCompetent Cell感受态细胞中，在含有氨苄的固体培养基上培养过夜，挑取阳性克隆进行继代培养。以M13F和M13R引物PCR检测，将有目的条带的单克隆送华大基因科技有限公司(广州)进行双向测序。扩cDNA全长和基因组DNA的引物

上游引物ScFT-3 57F：5’-ttcgtaggtctcagctactacc-3’；(SEQ ID NO.15)

下游引物ScFT-3 914R：5’-gtttattgccaaggcgtgac-3’。(SEQ ID NO.16)

4.甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3同源性比对分析

将测序得到的完整编码区序列(528bp，SEQ ID No.2中50bp～577bp)用NCBIblastn在线软件进行同源性比对测定，确定其是甘蔗ScFT-3同源序列。比对结果如图11所示。

将测序得到的cDNA全长序列用ORF Finder在线软件检测其编码的氨基酸序列，将编码的氨基酸序列用NCBI blastp在线软件进行同源性比对测定，也确定其是甘蔗ScFT-3同源序列。比对结果如图10所示。

5.甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3表达模式分析

采集人工光周期调控诱导开花和对照(非诱导)的甘蔗品种粤糖93-159不同生育期不同组织部位样品，使用Trans Zol^TM Plant试剂盒(ET121)提取总RNA(按照使用说明书进行操作)。用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的浓度和质量，取1μg RNA用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMixfor qPCR(One-Step gDNA Removal)反转录试剂盒(AT341-01)合成cDNA第一链。然后用罗氏FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)定量试剂盒(参考说明书进行)和ABIVii7Real time PCR System(Applied Biosystems，USA)检测ScFT-3的表达量。以甘蔗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参基因，内参基因引物：

q-PCR GAPDH F：5’-cacggccactggaagca-3’；(SEQ ID NO.17)

q-PCR GAPDH R：5’-tcctcagggttcctgatgcc-3’。(SEQ ID NO.18)

ScFT-3荧光定量PCR特异性引物

q-PCR ScFT-3 201F：5’-ggatcctgatgcgcctaatc-3’；(SEQ ID NO.19)

q-PCR ScFT-3 306R：5’-gagctctcggccaaagctat-3’。(SEQ ID NO.20)

本发明与现有技术相比，其有益效果为：

本发明用PCR扩增结合RACE技术从甘蔗品种粤糖93-159成熟期叶片中获得ScFT-3cDNA全长和基因组DNA序列。实时荧光定量PCR分析结果表明ScFT-3的功能作用部位在甘蔗的成熟叶和幼叶，甘蔗ScFT-3基因在甘蔗营养生长时期成熟叶和幼叶中的表达量均较高，在成花转变时期成熟叶和幼叶中表达量降低，在孕穗早期转移到主要在幼叶中表达。ScFT-3基因在甘蔗成花转变时期成熟叶中昼夜1天8个不同时间点的表达情况：ScFT-3在下午15:00的表达量最高，其次是早上9:00，21:00最低。说明ScFT-3基因可以感应光周期的变化，ScFT-3基因是甘蔗开花的抑制物。本发明对甘蔗FT家族基因进行研究，有助于了解甘蔗成花机理，可为利用基因工程技术等诱导促进甘蔗开花、缩短甘蔗育种年限、提高甘蔗花粉育性(早期开花能避开年底的低温，低温不利于甘蔗花穗发育及影响花粉育性等)和杂交效率等方面提供基因资源与理论依据。

附图说明

图1为甘蔗ScFT-3基因中间片段PCR扩增结果；其中泳道0为DNA分子量Marker，泳道1为中间片段PCR扩增结果(白色箭头指向目标条带)。

图2为甘蔗ScFT-3 3’RACE PCR扩增结果；其中泳道0为DNA分子量Marker，泳道1为第一轮PCR扩增结果，泳道2为第二轮巢式PCR扩增结果(白色箭头指向目标条带)。

图3为甘蔗ScFT-3 5’RACE PCR扩增结果；其中泳道0为DNA分子量Marker，泳道1为第一轮PCR扩增结果，泳道2为第二轮巢式PCR扩增结果。

图4为甘蔗ScFT-3cDNA全长PCR扩增结果；其中泳道0为DNA分子量Marker，泳道1为cDNA全长PCR扩增结果。

图5为甘蔗ScFT-3基因组DNA序列PCR扩增结果；其中泳道0为DNA分子量Marker，泳道1为基因组DNA序列PCR扩增结果。

图6为甘蔗ScFT-3基因在光周期调控诱导开花条件下组织表达特异性研究结果。其中，A示营养生长时期成熟叶、幼叶和茎尖中的表达分析；B示成花转变时期成熟叶、幼叶和茎尖中的表达分析；C示孕穗早期成熟叶、幼叶和茎尖中的表达分析；D示孕穗晚期旗叶下+2叶成熟叶和旗叶下+4叶成熟叶的表达分析；横坐标1代表成熟叶，2代表幼叶，3代表茎尖，4代表旗叶下+2叶成熟叶，5代表旗叶下+4叶成熟叶。图中a、b、c分别表示不同样品相对表达量的差异显著性分析结果，p<0.05。

图7为甘蔗ScFT-3基因在光周期调控诱导开花条件下不同生育期同一组织部位的相对表达量分析结果。A示不同生育期成熟叶中的表达分析；B示不同生育期幼叶中的表达分析；C示不同生育期茎尖中的表达分析；横坐标1代表营养生长(采样日期为2016年6月3日)，2代表成花转变(采样日期为2016年8月4日)，3代表孕穗早期(采样日期为2016年8月25日)。图中a、b、c分别表示不同样品相对表达量的差异显著性分析结果，p<0.05。

图8为甘蔗ScFT-3基因在光周期调控诱导开花条件下成花转变时期成熟叶中1天8个不同时间点的相对表达量分析结果(采样日期为2016年8月3日下午15:00至2016年8月4日中午12:00，每3个小时取一次样品)。图中a、b、c、d分别表示不同样品相对表达量的差异显著性分析结果，p<0.05。

图9为甘蔗ScFT-3基因在非诱导条件下(对照)不同采样时期同一组织部位的相对表达量分析结果。A示不同采样时期成熟叶中的相对表达量分析；B示不同采样时期幼叶中的表达分析；C示不同采样时期茎尖中的表达分析。横坐标代表采样日期，其中1代表采样日期为2016年6月3日，2代表采样日期为2016年8月4日，3代表采样日期为2016年8月25日；对照与诱导开花的采样日期相一致。图中a、b、c分别表示不同样品相对表达量的差异显著性分析结果，p<0.05。

图10为甘蔗ScFT-3氨基酸序列同源性比对结果。

图11为甘蔗ScFT-3核苷酸序列同源性比对结果。

图12为甘蔗ScFT-3蛋白质保守区分析结果。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。

本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。

实施例1甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3的同源克隆

1.总RNA的提取

以甘蔗品种粤糖93-159为材料，在成熟期(2015年10月)取梢头芯叶部位外的第一片完全展开的成熟叶(即+1叶叶片，下同)，剪0.1～0.2g中部叶片，用液氮研磨成粉末，使用Trans Zol^TM Plant试剂盒(ET121)，按照使用说明书提取甘蔗总RNA。

2.cDNA第一链的合成

以甘蔗总RNA作为模板，利用TransOne-Step gDNA Removal and cDNASynthesis Super MIX反转录试剂盒(AE311)合成cDNA第一链。体系成份：取甘蔗总RNA 1μg与Anchored Oligo(dT)18Primer(0.5μg/μl)1μl，2×ES Reaction Mix 10μl，RT/RI Enzyme Mix 1μl，gDNA Remover 1μl，RNase-free Water补足至20μl。42℃孵育反转录30min，85℃加热5s失活RT/RI和gDNA Remover。

3.引物设计合成

从GenBank中下载近缘物种(高粱、玉米、水稻等)FT同源基因CDS序列，利用DNAman软件进行多序列比对，确定保守区，使用Primer Premier 5并以高粱FT同源基因为模板，在保守区序列设计引物，引物设计后交给上海生物工程公司合成。PCR扩增体系(共25μl)：10×TransHiFi buffer Ⅱ2.5μl，10×GC Enhancer 2.5μl，2.5Mm dNTPs 2.0μl，Primer-F(10μM)1.0μl，Primer-R(10μM)1.0μl，TransHiFi DNA Polymerase(5Units/μl)0.5μl，cDNA模板2.5μl，ddH₂O 13μl。扩增程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，40s，72℃，40s，32个循环；72℃，10min。所设计引物PCR扩增片段大小为424bp(如图1)。

引物为：

上游引物ScFT-3 23F：5’-ggggacacataatcggg-3’；(SEQ ID NO.5)

下游引物ScFT-3 445R：5’-tgaaacggcgtgcaaaa-3’。(SEQ ID NO.6)

4.连接转化、单克隆培养及测序分析

PCR扩增产物用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，用QuickGel Extraction Kit回收424bp目标产物，取4μl回收纯化后的PCR产物与1μl轻轻混匀，室温反应5min，用PCR仪25℃连接8min，将连接产物于50μl Trans-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴25min，42℃热激40s，立即置于冰上2min，加200μl平衡至室温的LB培养基(不含氨苄)，200rpm、37℃培养1h，将200μl菌液均匀加在固体培养基上，向每个培养皿倒入约10颗灭菌过的玻璃珠，盖上盖子后用手左右摇动培养皿进行涂板，用封口膜封口，室温正置30min，然后将培养皿倒扣着放入培养箱中37℃培养过夜[含氨苄的固体培养基配置方法：称3.6g LB琼脂粉末(含蛋白胨1g，酵母膏粉0.5g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.1g，琼脂1.5g)加入100ml ddH₂O，用含有透气孔的封口膜封口，121℃灭菌30min，取出溶液，当溶液温度降到50℃左右时加100μl浓度为100mg/ml的氨苄溶液。将溶液混匀后倒入放置在生物安全柜中的玻璃培养皿中，每个培养皿约倒入25ml溶液，等溶液凝固吹干后可以使用，氨苄的工作浓度为100μg/ml]。挑选白色单克隆至10μl无菌水中，涡旋混合，取2μl菌液于25μl PCR体系，用M13F和M13R引物PCR检测鉴定阳性克隆。菌液PCR体系(共25μl)：M13F(10μM)0.5μl，M13R(10μM)0.5μl，2×PCR SuperMix 10μl，菌液2μl，ddH₂O 12μl。PCR扩增程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃，10min。剩余的8μl菌液加1ml含氨苄的LB液体培养基，以摇床200rpmin，37℃培养4～5h[含氨苄的液体LB培养基配置方法：称2.1g LB肉汤粉末(含蛋白胨1g，酵母膏粉0.5g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.1g)加入100ml ddH₂O，用含有透气孔的封口膜封口，121℃灭菌30min，取出溶液，当溶液温度降到室温时加100μl浓度为100mg/ml的氨苄溶液。将溶液混匀后可以使用，氨苄的工作浓度为100μg/ml]。将有目的条带的单克隆送华大基因科技有限公司(广州)进行双向测序。测序结果经BLAST在线软件分析表明，获得的424bp目的片段是甘蔗ScFT-3的片段。

M13F和M13R引物

上游引物M13F：5’-gtaaaacgacggccagt-3’；(SEQ ID NO.7)

下游引物M13R：5’-caggaaacagctatgac-3’。(SEQ ID NO.8)

实施例2甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3 3’和5’UTR的获得

根据已测定的目标基因片段设计3’RACE外侧基因特异引物、3’RACE内侧基因特异引物、5’RACE外侧基因特异引物和5’RACE内侧基因特异引物，均使用RACE 5’/3’Kit(Clontech Laboratories,Inc)试剂盒对目的基因的3’和5’末端进行扩增，具体操作步骤参照RACE试剂盒说明书。方法如下：

总RNA的提取方法同实施例1所述。cDNA第一链的合成参照RACE试剂盒说明书进行操作，具体步骤如下：

3’cDNA第一链合成

①配制3’反转录合成cDNA反应液A(5.5μl)：5×First-Strand Buffer 4.0μl，DTT(100mM)0.5μl，dNTPs(20mM)1.0μl。

②配制3’RACE用的反转录合成cDNA反应液B(12μl)：根据RNA的浓度加入1.5μl甘蔗总RNA(总量为1μg)，3’CDS Primer A 1.0μl，水8.5μl；将反应液B轻轻混匀，离心数秒，72℃温育3min；42℃温育2min；14000g离心10s收集反应液至管底。

③往第①步中的3’反转录合成cDNA反应液A中分别顺序加入RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，SMART Scribe Reverse Transcriptase(100U)2.0μl，总体积达8.0μl，得到反应液A’。

④将第③步的3’反转录合成cDNA反应液A’加入到第②步的3’RACE用的反转录合成cDNA反应液B中，这时终体积均达到20μl。轻轻混匀，离心数秒，42℃温育90min；70℃温育10min，最后以90μl Tricine-EDTA Buffer稀释，-20℃保存。

5’cDNA第一链合成

①配制5’反转录合成cDNA反应液A(5.5μl)：5×First-Strand Buffer 4.0μl，DTT(100mM)0.5μl，dNTPs(20mM)1.0μl。

②配制5’RACE用的反转录合成cDNA反应液B(11μl)：根据RNA的浓度加入1.5μl甘蔗总RNA(总量为1μg)，5’CDS Primer A 1.0μl，水7.5μl；将反应液B轻轻混匀，离心数秒，72℃温育3min；42℃温育2min；14000g离心10s收集反应液至管底。往5’RACE用的反转录合成cDNA反应液B中加入SMARTer II A Oligonucleotide 1.0μl，终体积达到12μl。

③往第①步中的5’反转录合成cDNA反应液A中分别顺序加入RNase Inhibitor(40U/μl)0.5μl，SMART Scribe Reverse Transcriptase(100U)2.0μl，总体积达8.0μl，得到反应液A’。

④将第③步的5’反转录合成cDNA反应液A’加入到第②步的5’RACE用的反转录合成cDNA反应液B中，这时终体积均达到20μl。轻轻混匀，离心数秒，42℃温育90min；70℃温育10min，最后以90μl Tricine-EDTA Buffer稀释，-20℃保存。

在3’RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用3’RACE外侧基因特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM Long primer进行第一次PCR反应，所得的产物稀释50倍后作为第二次PCR反应的模板，3’RACE内侧基因特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物UPM Short primer进行第二次巢式PCR反应，片段大小650bp(图2泳道2，白色箭头为目标条带)。

3’RACE第一轮PCR反应体系(25μl体系)：10×HiFibuffer Ⅱ2.5μl，2.5mM dNTPs2μl，10×GC Enhancer 2.5μl，HiFi DNA Polymerase 0.5μl，3’RACE cDNA模板1.5μl，10×UPM Long primer接头引物(10μM)2.5μl，3’RACE外侧基因特异引物(10μM)1μl，水12.5μl，总体积为25μl。第一轮PCR扩增程序：94℃，3min；94℃，30s，62℃，30s，72℃，1min，25个循环；72℃，10min；12℃，∞。PCR产物为3’RACE第一轮PCR产物(图2泳道1)。

3’RACE第二轮PCR(巢式PCR)反应体系(25μl体系)：10×HiFibuffer Ⅱ2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10×GC Enhancer 2.5μl，HiFi DNA Polymerase 0.5μl，3’RACE巢式PCR模板(为3’RACE第一轮PCR产物稀释50倍)1.5μl，巢式PCR接头引物10×UPM Short primer(10μM)2.5μl，3’RACE巢式PCR内侧基因特异引物(10μM)1μl，水12.5μl，总体积为25μl。第二轮PCR扩增程序：94℃，3min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，40s，20个循环；72℃，10min；12℃，∞。

3’RACE外侧基因特异引物

RACE ScFT-3 25F：5’-tagacccgtttactggctcagtgc-3’；(SEQ ID NO.9)

3’RACE内侧基因特异引物

RACE ScFT-3 81F：5’-tttgaagggatggagtttcgggc-3’。(SEQ ID NO.10)

在5’RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用5’RACE外侧基因特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM Long primer进行第一次PCR反应，所得的产物稀释50倍后作为第二次PCR反应的模板，5’RACE内侧基因特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物UPM Short primer进行第二次巢式的PCR反应，片段大小235bp(图3泳道2)。

5’RACE第一轮PCR反应体系(25μl体系)：10×HiFi buffer Ⅱ2.5μl，2.5mM dNTPs2μl，10×GC Enhancer 2.5μl，HiFi DNA Polymerase 0.5μl，5’RACE cDNA模板1.5μl，10×UPM Long primer接头引物(10μM)2.5μl，5’RACE外侧基因特异引物(10μM)1μl，水12.5μl，总体积为25μl。第一轮PCR扩增程序：94℃，5min；94℃，40s，58℃，40s，72℃，2min，25个循环；72℃，10min；12℃，∞。PCR产物为5’RACE第一轮PCR产物(图3泳道1)。

5’RACE第二轮PCR(巢式PCR)反应体系(25μl体系)：10×HiFi bufferⅡ2.5μl，2.5mM dNTPs 2μl，10×GC Enhancer 2.5μl，HiFi DNA Polymerase0.5μl，5’RACE巢式PCR模板(为5’RACE第一轮PCR产物稀释50倍)1.5μl，巢式PCR接头引物10×UPM Short primer(10μM)2.5μl，5’RACE巢式PCR内侧基因特异引物(10μM)1μl，水12.5μl，总体积为25μl。第二轮PCR扩增程序：94℃，5min；94℃，40s，53℃，40s，72℃，2min，20个循环；72℃，10min；12℃，∞。

5’RACE外侧基因特异引物

RACE ScFT-3 403R：5’-cgcaagttgaagttctgacggac-3’；(SEQ ID NO.11)

5’RACE内侧基因特异引物

RACE ScFT-3 337R：5’-accaagacaatacggtggatgcc-3’。(SEQ ID NO.12)

试剂盒中的通用引物

UPM Short primer：5’-ctaatacgactcactatagggc-3’。(SEQ ID NO.14)

PCR扩增产物用质量百分比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，从凝胶中纯化回收3’RACE 650bp目标产物和5’RACE 235bp目标产物，分别取4μl 3’RACE和5’RACE回收纯化后的PCR产物，各自与1μl轻轻混匀，室温反应5min，用PCR仪25℃连接10min，将连接产物于50μl Trans-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴25min，42℃热激40s，立即置于冰上2min，加200μl平衡至室温的LB培养基(不含氨苄)，200rpm、37℃培养1h，将200μl菌液均匀加在固体培养基上，向每个培养皿倒入约10颗灭菌过的玻璃珠，盖上盖子后用手左右摇动培养皿进行涂板，用封口膜封口，室温正置30min，然后将培养皿倒扣着放入培养箱中37℃培养过夜[含氨苄的固体培养基配置方法：称3.6g LB琼脂粉末(含蛋白胨1g，酵母膏粉0.5g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.1g，琼脂1.5g)加入100mlddH₂O，用含有透气孔的封口膜封口，121℃灭菌30min，取出溶液，当溶液温度降到50℃左右时加100μl浓度为100mg/ml的氨苄溶液。将溶液混匀后倒入放置在生物安全柜中的玻璃培养皿中，每个培养皿约倒入25ml溶液，等溶液凝固吹干后可以使用，氨苄的工作浓度为100μg/ml]。挑选白色单克隆至10μl无菌水中，涡旋混合，取2μl菌液于25μl PCR体系，用M13F和M13R引物PCR检测鉴定阳性克隆。菌液PCR体系(共25μl)：M13F(10μM)0.5μl，M13R(10μM)0.5μl，2×PCR SuperMix 10μl，菌液2μl，ddH₂O12μl。PCR扩增程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃，10min。剩余的8μl菌液加1ml含氨苄的LB液体培养基，以摇床200rpmin，37℃培养4～5h[含氨苄的液体LB培养基配置方法：称2.1g LB肉汤粉末(含蛋白胨1g，酵母膏粉0.5g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.1g)加入100ml ddH₂O，用含有透气孔的封口膜封口，121℃灭菌30min，取出溶液，当溶液温度降到室温时加100μl浓度为100mg/ml的氨苄溶液。将溶液混匀后可以使用，氨苄的工作浓度为100μg/ml]。将有目的条带的单克隆送华大基因科技有限公司(广州)进行双向测序。利用DNA man 6.0对3’RACE、5’RACE测序结果与保守区序列设计引物扩增所得基因中间片段进行拼接，拼接结果为SEQ IDNO.4的序列，大小905bp。

实施例3甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3cDNA全长及基因组DNA的获得

根据拼接的序列设计全长cDNA及基因组DNA引物，通过PCR扩增获得包含起始密码子(ATG)和终止密码子(TGA)858bp的cDNA产物(序列表SEQ ID No.2)和2924bp基因组DNA序列(序列表SEQ ID No.3)，PCR扩增产物用质量百分比浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳检测，从凝胶中纯化回收目标产物，取4μl回收纯化后的PCR产物与1μl轻轻混匀，室温反应5min，用PCR仪25℃连接30min，将连接产物于50μl Trans-T1感受态细胞中(在感受态细胞刚刚解冻时加入连接产物)，轻弹混匀，冰浴25min，42℃热激40s，立即置于冰上2min，加200μl平衡至室温的LB培养基(不含氨苄)，200rpm、37℃培养1h，将200μl菌液均匀加在固体培养基上，向每个培养皿倒入约10颗灭菌过的玻璃珠，盖上盖子后用手左右摇动培养皿进行涂板，用封口膜封口，室温正置30min，然后将培养皿倒扣着放入培养箱中37℃培养过夜[含氨苄的固体培养基配置方法：称3.6g LB琼脂粉末(含蛋白胨1g，酵母膏粉0.5g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.1g，琼脂1.5g)加入100ml ddH₂O，用含有透气孔的封口膜封口，121℃灭菌30min，取出溶液，当溶液温度降到50℃左右时加100μl浓度为100mg/ml的氨苄溶液。将溶液混匀后倒入放置在生物安全柜中的玻璃培养皿中，每个培养皿约倒入25ml溶液，等溶液凝固吹干后可以使用，氨苄的工作浓度为100μg/ml]。挑选白色单克隆至10μl无菌水中，涡旋混合，取2μl菌液于25μl PCR体系，用M13F和M13R引物PCR检测鉴定阳性克隆。菌液PCR体系(共25μl)：M13F(10μM)0.5μl，M13R(10μM)0.5μl，2×PCR SuperMix10μl，菌液2μl，ddH₂O 12μl。PCR扩增程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，30s，72℃，1min，32个循环；72℃，10min。剩余的8μl菌液加1ml含氨苄的LB液体培养基，以摇床200rpmin，37℃培养4～5h[含氨苄的液体LB培养基配置方法：称2.1g LB肉汤粉末(含蛋白胨1g，酵母膏粉0.5g，氯化钠0.5g，葡萄糖0.1g)加入100ml ddH₂O，用含有透气孔的封口膜封口，121℃灭菌30min，取出溶液，当溶液温度降到室温时加100μl浓度为100mg/ml的氨苄溶液。将溶液混匀后可以使用，氨苄的工作浓度为100μg/ml]。将有目的条带的单克隆送华大基因科技有限公司(广州)进行双向测序。

扩cDNA全长和基因组DNA的引物：

上游引物ScFT-3 57F：5’-ttcgtaggtctcagctactacc-3’；(SEQ ID NO.15)

下游引物ScFT-3 914R：5’-gtttattgccaaggcgtgac-3’。(SEQ ID NO.16)

ScFT-3cDNA全长PCR扩增体系(共25μl)：10×TransHiFi buffer Ⅱ2.5μl，10×GC Enhancer 2.5μl，2.5Mm dNTPs 2.0μl，上游引物ScFT-3 57F(10μM)1.0μl，下游引物ScFT-3914R(10μM)1.0μl，TransHiFi DNA Polymerase(5Units/μl)0.5μl，cDNA模板2.5μl，ddH₂O 13μl。PCR扩增程序：94℃，3min；94℃，30s，55℃，40s，72℃，40s，32个循环；72℃，10min。所设计引物PCR扩增片段大小为858bp(如图4泳道1)，序列表如SEQ ID NO.2。

ScFT-3基因组DNA PCR扩增体系(共25μl)：10×TransHiFi buffer Ⅰ2.5μl，10×GC Enhancer 2.5μl，2.5Mm dNTPs 2.0μl，上游引物ScFT-3 57F(10μM)1.0μl，下游引物ScFT-3914R(10μM)1.0μl，TransHiFi DNA Polymerase(5Units/μl)0.5μl，DNA模板(30ng/μl)2.5μl，ddH₂O 13μl。PCR扩增程序：94℃，5min；94℃，30s，58℃，30s，72℃，2min，32个循环；72℃，10min。所设计引物PCR扩增结果如图5泳道1，序列表如SEQ ID NO.3，从ATG开始到TGA结束共2702bp。

实施例4甘蔗开花调控蛋白基因ScFT-3同源性比对分析

将测序得到的完整编码区序列(528bp，SEQ ID No.2中50bp～577bp)用NCBIblastn在线软件进行同源性比对测定，确定其是甘蔗ScFT-3同源序列。比对结果如图11所示。与甘蔗(登录号：KJ496327.1)相似度为99％，与高粱(登录号：XM-002438506.2)相似度为98％，与玉米ZCN26(登录号：EU241916.1)相似度为95％。

将获得的cDNA全长序列测序结果用ORF Finder检测其编码的氨基酸序列，将编码的氨基酸序列用NCBI blastp在线软件进行同源性比对测定，也确定其是甘蔗ScFT-3同源序列。比对结果如图10所示。甘蔗开花调控蛋白ScFT-3氨基酸序与甘蔗(登录号：AHZ46121.1)相似度为99％，与高粱(登录号：XP-002438551.1)相似度为98％，与玉米(登录号：NP-001106265.1)相似度为94％。图12为甘蔗ScFT-3蛋白质保守区分析结果。

实施例甘蔗开花调控蛋白基因5ScFT-3表达模式分析

以甘蔗品种粤糖93-159为材料，设置人工光周期诱导开花和对照(非诱导)两种处理，在营养生长时期(2016年6月3日)、成花转变时期(2016年8月4日)、孕穗时期[早期2016年8月25日(穗长约10cm)和晚期2016年10月27日(穗长约80cm)]，采集成熟叶、幼叶和茎尖3个不同部位样品(含3个生物学重复)，使用Trans Zol^TM Plant试剂盒(ET121)提取总RNA(操作步骤同实施例1所述)。

用质量百分浓度为1.2％的琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度计检测RNA的浓度和质量，然后用All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR(One-Step gDNA Removal)反转录试剂盒(AT341-01)合成cDNA第一链。取甘蔗总RNA 1μg，5×ⅡAll-in-One SuperMix for qPCR 4μl，gDNA Removal 1μl，用RNase-freeWater补足至20μl。轻轻混匀，55℃孵育15min，85℃加热5s失活Ⅱ RT/RI和gDNARemover。

选用罗氏FastStart Universal SYBR Green Master(ROX)定量试剂盒(参考说明书进行)和ABI Vii7Real time PCR System(Applied Biosystems，USA)检测ScFT-3的时空表达情况。以甘蔗甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)作为内参基因，内参基因引物：

q-PCR GAPDH F：5’-cacggccactggaagca-3’；(SEQ ID NO.17)

q-PCR GAPDH R：5’-tcctcagggttcctgatgcc-3’。(SEQ ID NO.18)

ScFT-3荧光定量PCR特异性引物：

q-PCR ScFT-3 201F：5’-ggatcctgatgcgcctaatc-3’；(SEQ ID NO.19)

q-PCR ScFT-3 306R：5’-gagctctcggccaaagctat-3’。(SEQ ID NO.20)

目标基因ScFT-3荧光定量PCR体系(25μl)：FastStart Universal SYBR GreenMaster(ROX)12.5μl，q-PCR ScFT-3 201F(120nM)0.25μl，q-PCR ScFT-3 306R(120nM)0.25μl，ddH₂O 9.5μl，cDNA 2.5μl。荧光定量PCR扩增程序：采用两步法PCR扩增，50℃，2min，95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环；95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s。

内参基因GAPDH荧光定量PCR体系(25μl)：FastStart Universal SYBR GreenMaster(ROX)12.5μl，q-PCR GAPDH F(220nM)0.25μl，q-PCR GAPDH R(220nM)0.25μl，ddH₂O9.5μl，cDNA 2.5μl。荧光定量PCR扩增程序：采用两步法PCR扩增，50℃，2min，95℃，10min；95℃，15s，60℃，1min，40个循环；95℃，15s，60℃，1min，95℃，15s。

在人工光周期调控诱导开花条件下，ScFT-3组织特异性表达分析结果(均为表达量相对比值)：营养生长时期成熟叶：幼叶：茎尖＝17.829：10.354：1.055(图6-A)；成花转变(花芽分化)时期成熟叶：幼叶：茎尖＝4.855：0.865：1.840(图6-B)；孕穗早期成熟叶：幼叶：茎尖＝1.419：24.976：3.462(图6-C)；孕穗晚期旗叶下+2叶成熟叶：旗叶下+4叶成熟叶＝1.263：7.094(图6-D)。

在人工光周期调控诱导开花条件下，ScFT-3在同一组织部位不同时期的相对表达量比值结果为：营养生长时期成熟叶(+1叶)：成花转变时期成熟叶(+1叶)：孕穗早期成熟叶(+1叶)＝80.009：3.328：1.024(图7-A)；营养生长时期幼叶：成花转变时期幼叶：孕穗早期幼叶＝133.488：1.502：59.875(图7-B)；营养生长时期茎尖：成花转变时期茎尖：孕穗早期茎尖＝1.927：1.019：1.200(图7-C)。

在人工光周期调控诱导开花条件下，ScFT-3在成花转变时期成熟叶中1天8个不同时间点的相对表达量比值结果为：15:00：18:00：21:0：24:00：03:00：06:00：09:00：12:00＝13.000：3.872：1.353：4.167：1.800：8.307：10.220：3.033(图8)。ScFT-3在下午15:00的表达量最高，其次是早上9:00，21:00最低。

小结：甘蔗ScFT-3基因在人工光周期调控诱导开花条件下，在3个不同生育期成熟叶、幼叶和茎尖中均有表达，但表达量存在差异。ScFT-3基因在营养生长时期成熟叶和幼叶中表达量均较高，在不同组织部位的分布情况为成熟叶>幼叶>茎尖；ScFT-3基因在成花转变时期成熟叶和幼叶中表达量降低，表达量的分布情况为成熟叶>茎尖>幼叶；在孕穗早期ScFT-3基因在成熟叶中表达量很低，转移到主要在幼叶中表达，分布情况为幼叶>茎尖>成熟叶；在孕穗晚期旗叶下+2叶成熟叶和+4叶成熟叶中表达量差异不明显。甘蔗ScFT-3基因具有感应光周期变化的功能，ScFT-3基因在甘蔗成花转变时期成熟叶中表达量降低明显，说明ScFT-3是甘蔗开花的抑制基因，其在早期维持甘蔗的营养生长，在孕穗早期ScFT-3基因在幼叶中与甘蔗开花的刺激物“成花素”等相互平衡。

在非人工光周期光周期诱导(对照)样品中，ScFT-3基因的表达量均较高，且在营养生长早期高于营养生长后期，虽然ScFT-3基因在营养生长后期成熟叶和幼叶表达量也呈降低的趋势，但是降低倍数没有诱导开花甘蔗的明显，ScFT-3基因在不同时期茎尖中变化不大。图9-A是3个不同采样时期成熟叶中的相对表达量分析结果2016年6月3日成熟叶：2016年8月4日成熟叶：2016年8月25日成熟叶＝10.385:7.129:1.097；3个不同采样时期幼叶中的相对表达量分析结果(图9-B)，2016年6月3日幼叶：2016年8月4日幼叶：2016年8月25日幼叶＝15.201:1.441:3.432；3个不同采样时期茎尖中的相对表达量分析结果(图9-C)，2016年6月3日茎尖：2016年8月4日茎尖：2016年8月25日茎尖＝7.733:2.383:1.278。

本发明核苷酸如序列表中SEQ ID NO.2所述，并且为了清楚的表达，在SEQ IDNO.1提供了对应的氨基酸序列。

通过本发明氨基酸序列获得具有生物活性的纯化蛋白，研究甘蔗开花调控蛋白的生物学功能属于本专利的保护范围。对本发明核苷酸序列进行基因工程改造及应用也属于本专利的保护范围。使用外源植物生长调节剂、光温、水分、营养、蔗糖、剪叶和嫁接等处理方法诱导或抑制ScFT-3的表达从而实现调控甘蔗和其它植物花期的技术同样属于本专利的保护范围。

以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

序列表

SEQ ID NO.1

SEQ ID No.2

SEQ ID No.3

SEQ ID No.4

SEQ ID No.5

ggggacacat aatcggg 17

SEQ ID No.6

tgaaacggcg tgcaaaa 17

SEQ ID No.7

gtaaaacgac ggccagt 17

SEQ ID No.8

caggaaacag ctatgac 17

SEQ ID No.9

tagacccgtt tactggctca gtgc 24

SEQ ID No.10

tttgaaggga tggagtttcg ggc 23

SEQ ID No.11

cgcaagttga agttctgacg gac 23

SEQ ID No.12

accaagacaa tacggtggat gcc 23

SEQ ID No.13

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

SEQ ID No.14

ctaatacgac tcactatagg gc 22

SEQ ID No.15

ttcgtaggtc tcagctacta cc 22

SEQ ID No.16

gtttattgcc aaggcgtgac 20

SEQ ID No.17

cacggccact ggaagca 17

SEQ ID No.18

tcctcagggt tcctgatgcc 20

SEQ ID No.19

ggatcctgat gcgcctaatc 20

SEQ ID No.20

gagctctcgg ccaaagctat 20

序列表

<120> 甘蔗开花调控蛋白ScFT-3及其编码基因

<160> 20

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 2

<211> 174

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Ala Asn Asp Ser Leu Thr Arg Gly His Ile Ile Gly Asp Val Leu

1 5 10 15

Asp Pro Phe Thr Gly Ser Val Pro Leu Thr Val Met Tyr Asp Gly Arg

20 25 30

Pro Val Phe Glu Gly Met Glu Phe Arg Ala Ser Gly Val Ser Val Lys

35 40 45

Pro Arg Val Glu Ile Gly Gly Asp Asp Phe Arg Val Ala Thr Leu Val

50 55 60

Met Val Asp Pro Asp Ala Pro Asn Pro Ser Asn Pro Thr Leu Arg Glu

65 70 75 80

Tyr Leu His Trp Met Val Thr Asp Ile Pro Ala Ser Thr Asp Asp Ser

85 90 95

Phe Gly Arg Glu Leu Ile Pro Tyr Glu Asn Pro Ser Pro Thr Met Gly

100 105 110

Ile His Arg Ile Val Leu Val Leu Tyr Gln Gln Leu Gly Arg Gly Thr

115 120 125

Val Phe Ala Pro Gln Val Arg Gln Asn Phe Asn Leu Arg Asn Phe Ala

130 135 140

Arg Arg Phe Asn Leu Gly Lys Pro Val Ala Ala Met Tyr Phe Asn Cys

145 150 155 160

Gln Arg Gln Thr Gly Thr Gly Gly Arg Arg Phe Thr Glu Tyr

165 170

<210> 2

<211> 849

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

ttcgtaggtc tcagctacta ccatatactc tcacactaaa atatagcata tggctaatga 60

ctccctgacg aggggacaca taatcgggga tgtcttagac ccgtttactg gctcagtgcc 120

tctaactgtc atgtatgatg gcagaccagt gtttgaaggg atggagtttc gggcgtcggg 180

ggtgtcggtg aaacctagag ttgagattgg aggtgatgat tttcgagtgg cctataccct 240

agttatggtg gatcctgatg cgcctaatcc cagcaaccct accctacggg aatacttgca 300

ttggatggtg accgacatcc cagcatcaac cgatgatagc tttggccgag agctcatacc 360

atatgagaac ccaagcccca ccatgggcat ccaccgtatt gtcttggtgc tctaccagca 420

actggggcgg ggcacggtgt ttgcaccgca agtccgtcag aacttcaact tgcgcaattt 480

tgcacgccgt ttcaacctcg gcaagcctgt ggccgcgatg tacttcaact gccagcggca 540

aacgggcaca ggtgggagaa ggttcactga gtattgagta atttacctac ccctcatgtc 600

caaggtgaag gcaagcttga gcctactagt tacgtatgtg tgcttaccta cgtatggtcg 660

tatcgtcatc atacagtacc tatagcacaa aagctaggaa taagatgctg tgtatttctt 720

gcgcatgtag gctctcatat atagagcgta cctccctgag ggtatgatgt tcaccttcta 780

aataatggca tgacaagaga ggttattact gagtgtactg atgtgctgtg atatttttgt 840

cacgccttg 849

<210> 3

<211> 2702

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 3

atggctaatg actccctgac gaggggacac ataatcgggg atgtcttaga ctcgtttact 60

ggctcagtgc ctctaactgt catgtatgat ggcagaccag tgtttgaagg gatggagttt 120

cgggcgtcgg gggtgtcggt gaaacctaga gttgagattg gaggtgatga ttttcgagtg 180

gcctataccc tagtaagcca tcactccgca gatccgatcg agtccatttg gcggtaggcc 240

atatatatgg ccaaggtgtc gactcctttt cttaatccag gggactacac caaatgatgc 300

tcaggagcca cattccaaac tcttgccgaa gtttgaaatc gatggcttgg ctcgttgtga 360

aggctaaaac agtctcctgg tgcatgccca gctcggttga ctagatagat tggccctaat 420

aaatagtatt tacgtacagt gagagagaca ctaacaaaaa aaatgcagga tttctcatca 480

cagcccagcc caaaaatgct caggtttatt tttaattccc taacatgttg accatgtgct 540

tgtgttaatg tacatatatt aggttatggt ggatcctgat gcgcctaatc ccagcaaccc 600

taccctacgg gaatacttgc attggtaagt tcttgttctt gcacataata ctatttgatc 660

aaactacata tacagtctgc agaactgaaa atgaatctca ctgccttatc ttttgatagg 720

atggtgactg acatcccagc atcaaccgat gatagctttg gtgagcatca acaacttgca 780

ttgtatatat atgcattata atatccctct ttttcaaaat ctcacctaaa agtcccctag 840

aactaatgct ccttgcattg tgaagtgtaa ccttaggacc agcccctttc ggagggctct 900

cctgcttcgg ctccaccaca cactccattg tacaactact gtagcataga gtcgatacca 960

ttcatagcag cctaaaaaac aacatggagt cggtgaagcc atattttttt ttttacttct 1020

ctggctccta gaagcatgtg ctatagtgcc aaaaaggcgg agaagcccaa tctgcatgag 1080

gacgtgccaa agaggccctt agtcttttcc ttgaagcttc atatatatta agaaatattt 1140

gtagaacgta atgctaatgt gccagtgcaa actcttgtca ttattagtat ttttttagta 1200

aattcttcat tattaatata ttagtacgta tgtagtgcat atcttctata tgactgcaaa 1260

atacgtagtc cccttctctt aaaacctaaa caaaagaatt cttttttgga tagtttagtg 1320

taatgcaatg ttcatgtttt ctatcggttc gagaatctgg tcaataaaag taatttaatt 1380

agatttagtc atatatatgt ttgcacattc ctgatttata tagaaaaata ttattaaagg 1440

aagtgaacac ttataagcta gtgtatatac ttcaacacac acacacacac acacacacac 1500

acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac acacacacac 1560

acacacatat atatatataa tgtaagattt ttgttatcga caattcaatc atatagtaca 1620

tatttgtatc aattaagtga aaatattgca aaggatcgga atttgcaatt tgattaactt 1680

atatcacatt tatgtccgat cctagtcttt tgttagtgaa cttttacatt catatataga 1740

aatttataag ggtatatttt ttttactttc ttgtcatatt tgtctattat gcgactttat 1800

tacatccctt tgcaagaaca ttattcatct agatgcaaca tattttatga ttaaaataaa 1860

ataggctaca tgtgcttagt cagtggcgga gggagggggt gccaaacctt ctcccctaag 1920

tcagtgtaat ttccattgaa aatttttaaa cttgattgaa ttttgataaa atttgtcctg 1980

ctggccaatt cacatttctg actctgccac cgtgcttagt tatatatgtg aaaagagtaa 2040

agatactggg gacatatata agtattttat aatgttatgt aattgtgtgt gccttaacat 2100

atatatgcaa tgtaagattt tttatccata gttctatcac ataaataata atatacactg 2160

tatcaattaa atggaaatat tattgcaaag gaactagatg ttttatatcc tatcttacaa 2220

aacatttatt ctgtgttttg gcattatagc cagctctagt tttttattag taaattgaac 2280

tttcctaaaa atgtcagaag aatatgtatt ttctttaatt tatactctcc tttgtcacac 2340

tcgtcctaca catgacttga gtggagcctt tgcaagaata ctctctctct ctctctcctc 2400

tatttatata tgcaagaata taactatcaa gattgtgttt ctcatgattt tttttgaatt 2460

aaatggcagg ccgagagctc ataccatatg agaacccaag ccccaccatg ggcatccacc 2520

gtattgtctt ggtgctctac cagcaactgg ggcggggcac ggtgtttgca ccgcaagtcc 2580

gtcagaactt caacttgcgc aattttgcac gccgtttcaa cctcggcaag cctgtggccg 2640

cgatgtactt caactgccag cggcaaacgg gcacaggtgg gagaaggttc actgagcatt 2700

ga 2702

<210> 4

<211> 905

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

acatggggaa gcccattgga aggcctgata gctttcgtag gtctcagcta ctaccatata 60

ttctcacact aaaatatagc ttatggctaa tgactccctg acgagcggac acataatcgg 120

ggatgtctta gacccgttta ctggctcagt gcctctaact gtcatgtatg atggcagacc 180

agtgtttgaa gggatggagt ttcgggcgtc gggggtgtcg gtgaaaccta gagttgagat 240

tggaggtgat gattttcgag tggcctatac cctagttatg gtggatcctg atgcgcctaa 300

tcccagcaac cctaccctac gggaatactt gcattggatg gtgaccgaca tcccagcatc 360

aaccgatgat agctttggcc gagagctcat accatatgag aacccaagcc ccaccatggg 420

catccaccgt attgtcttgg tgctctacca gcaactgggg cggggcacgg tgtttgcacc 480

gcaagtccgt cagaacttca acttgcgcaa ttttgcacgc cgtttcaacc tcggcaagcc 540

tgtggccgcg atgtacttca actgccagcg gcaaacgggc acaggtggga gaaggttcac 600

tgagtattga gtaatttacc tacccctcat gtccaaggtg aaggcaagct tgagcctact 660

agttacgtat gtgtgcttac ctacgtatgg tcgtatcgtc atcatacagt acctatagca 720

caaaagctag aaataagatg ctgtgtattt cttgcgcatg taggctctca tatatagagc 780

gtacctccct gagggtatga tgttcacctt ctaaataatg gcatgacaag agaggttatt 840

actgagtgta ctgatgtgct gtgatatttt tgtcacgcct tggcaataaa catatatatt 900

ggctc 905

<210> 5

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 5

ggggacacat aatcggg 17

<210> 6

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 6

tgaaacggcg tgcaaaa 17

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 7

gtaaaacgac ggccagt 17

<210> 8

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 8

caggaaacag ctatgac 17

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 9

tagacccgtt tactggctca gtgc 24

<210> 10

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 10

tttgaaggga tggagtttcg ggc 23

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 11

cgcaagttga agttctgacg gac 23

<210> 12

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 12

accaagacaa tacggtggat gcc 23

<210> 13

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 13

ctaatacgac tcactatagg gcaagcagtg gtatcaacgc agagt 45

<210> 14

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 14

ctaatacgac tcactatagg gc 22

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 15

ttcgtaggtc tcagctacta cc 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 16

gtttattgcc aaggcgtgac 20

<210> 17

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 17

cacggccact ggaagca 17

<210> 18

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 18

tcctcagggt tcctgatgcc 20

<210> 19

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 19

ggatcctgat gcgcctaatc 20

<210> 20

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 20

gagctctcgg ccaaagctat 20

Claims

1.甘蔗开花调控蛋白ScFT-3，其特征在于，所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3为由SEQID NO.1所示氨基酸序列组成。

2.编码权利要求1所述甘蔗开花调控蛋白ScFT-3的核苷酸序列。

3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

4.根据权利要求1所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3，其特征在于，其cDNA为如SEQ IDNO.2所示的核苷酸序列。

5.根据权利要求1所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3，其特征在于，其开放读码框如SEQID NO.2中第50～577位所示。

6.权利要求1所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3在调控植物花期中的应用。

7.根据权利要求6所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3在调控植物花期中的应用，其特征在于，所述的植物为甘蔗。

8.权利要求1所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3在缩短植物育种年限中的应用。

9.根据权利要求8所述的甘蔗开花调控蛋白ScFT-3在缩短植物育种年限中的应用，其特征在于，所述的植物为甘蔗。