CN104630198A - 甘蔗分蘖关键基因ScD27基因序列 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一个调控甘蔗分蘖关键基因β-胡萝卜素异构酶基因ScD27的序列，属于植物基因工程技术领域，是以近源物种β-胡萝卜素异构酶基因的CDS序列的保守区设计引物，从甘蔗茎尖提取总RNA，用PCR法扩增，结合RACE技术克隆到ScD27基因的全长序列。ScD27基因是独脚金内酯合成途径―MAX/RMS/D路径的上游的一个关键基因，通过基因工程技术研究ScD27基因与甘蔗分蘖和产量之间的关系，具有重要的实践与理论意义，同时ScD27基因的克隆与分离是研究甘蔗分蘖调控网络和分子机制的必要保障。本发明基因ScD27及其编码蛋白对于甘蔗分蘖机制和培育高产优质的甘蔗品种均具有广泛的应用和市场前景。
Description
技术领域
本发明涉及分子生物学中的基因技术领域，属于植物基因工程技术领域，具体涉及一个调控甘蔗分蘖关键基因β-胡萝卜素异构酶基因ScD27的序列。
背景技术
甘蔗的分蘖是决定其产量的最重要的农艺性状之一，甘蔗作为世界上最重要的糖料作物，研究甘蔗分蘖具有重要的实践与理论意义。植物激素是植物生长和发育的重要调控因子，植物独脚金内酯(Strigolactones.,SLs)是一种在根部产生的类胡萝卜素衍生物，是最近才被发现的一种抑制植物分枝和分蘖的新激素，参与植物发育的调节。研究表明，在植物营养受到限制时，独脚金内酯会在植物的根部生成并促进侧根和根毛的生长，同时独脚金内酯被运输至植物的出芽位置，抑制侧芽或刺激分枝的生长，从而增加植物根部对无机营养物质的捕获，减少分蘖对资源的需求。然而SLs的合成和信号传导途径目前还是不完全清楚，其信号途径更是知之甚少，在甘蔗中还未见相关报道。
对多分蘖水稻突变体的研究发现，在单子叶和双子叶植物中独脚金内酯调控分枝的机制具有共同的合成和信号传导途径MAX/RMS/D路径，其中D17、D10、D27分别编码类胡萝卜素裂解双加氧酶CDD7、CCD8以及含铁蛋白D27，它们均定位于细胞质体中，主要参与SL的合成，且相应的突变体对SL类似物GR24敏感。因此，D27在植物的独脚金内酯合成中起重要作用，是研究植物分蘖和株型调控的重要基因，但是ScD27基因的功能仍不十分清楚，在甘蔗中ScD27基因还未见相关报道。
发明内容
本发明的目的是为了解决现有技术的不足，提供一个甘蔗分蘖关键基因及基编码的蛋白，所提供调控甘蔗分蘖关键基因β-胡萝卜素异构酶基因ScD27的序列，是通过以近源物β-胡萝卜素异构酶基因的CDS序列的保守区设计简并引物，并用PCR法扩增，结合RACE技术克隆甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因ScD27的全长序列。其核苷酸如序列表中SEQ ID NO.2所述，其氨基酸序列如序列表中SEQ ID NO.1所述。
本发明的目的是通过以下技术措施实现：
β-胡萝卜素异构酶，所述β-胡萝卜素异构酶为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列编码的蛋白。
编码权利要求1所述的β-胡萝卜素异构酶的核苷酸序列。
以上核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
甘蔗分蘖关键基因ScD27基因序列，所述ScD27基因为编码β-胡萝卜素异构酶基因。
所述甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因编码SEQ ID NO.1所示氨基酸序列。
所述甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
1.利用同源克隆的方法，PCR扩增甘蔗中的ScD27目的片段。
①总RNA的提取
以甘蔗品种ROC22为材料，取新鲜甘蔗茎尖生长点，使用Trizol试剂，按照使用说明提取甘蔗总RNA。
②cDNA第一链的合成
甘蔗总RNA作为模板，利用天根反转录试剂盒合成cDNA第一链。
③引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(高粱、玉米、水稻等)β-胡萝卜素异构酶基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计引物，扩增片段大小约为480bp。引物设计后交给上海生物工程公司合成。
引物序列为：s-d27-431F：CTGGGATGAAGAACGGAAA SEQ ID NO.3
s-d27-886R：TGATCCAGCACTGAAGCAGC SEQ ID NO.4
扩增的产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收480bp目标产物，将纯化的PCR产物克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。以s-d27-431F和s-d27-886R引物PCR检测，有约480bp大小目的条带的单克隆送上海生物工程生物公司进行双向测序。
2.ScD27基因cDNA全长序列的克隆
3’RACE和5’RACE均使用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒完成，均按其说明书进行操作。根据已得到的cDNA片段序列设计特异性引物，扩增目的基因的3’和5’末端。方法如下：
以甘蔗茎尖总RNA为模板，利用SMARTTM RACE试剂盒中自带的反转录接头引物及试剂，反转录合成带有接头的cDNA第一链。
在3’RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用3’RACE外侧特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM进行第一次PCR反应，所得的产物稀释5倍后作为第二次PCR反应的模板，3’RACE内侧特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物NUP进行第二次巢式的PCR反应。
3’RACE外侧特异引物：5’-GCCGCCTTCACCACGATATTCTTCCCTT-3’(SEQ ID NO.5)
3’RACE内侧特异引物：5’-GGAATCCGAAGTTGATGGAAGGAAAGAG-3’(SEQ ID NO.6)
在5’RACE中，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用5’RACE外侧特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM进行第一次PCR反应，所得的产物稀释5倍后作为第二次PCR反应的模板，5’RACE内侧特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物NUP进行第二次巢式的PCR反应。
5’RACE外侧特异引物：5’-CGAGCCAAGGGAAGAATATCGTGGTGAA-3’(SEQ ID NO.7)
5’RACE内侧特异引物：5’-CGTAGCCGTCCTTTCCGTTCTTCATCCCAG-3’(SEQ ID NO.8)
扩增的产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收480bp目标产物，将纯化的PCR产物克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。以PMD-18T载体的自带引物PCR检测，有480bp大小目的条带的单克隆送上海生物工程生物公司进行双向测序。利用DNA man 6.0对测序结果与保守区序列设计引物扩增所得序列进行拼接。
3.对β-胡萝卜素异构酶基因ScD27的测定
将拼接结果用BLAST在线软件进行同源性测定，已确定为甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因ScD27同源序列。比对结果如图1所示。
将拼接结果用ORF阅读框在线分析软件进行蛋白质同源性测定，也确定其为甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因ScD27同源序列。比对结果如图2所示。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
甘蔗是一种重要的糖料作物，同时也是我国南方沿海地区和边疆民族地区的重要农业支柱产业之一，从基因工程和分子水平上研究其产量相关农艺性状，培育高产甘蔗新品种，提高甘蔗产量具有重大的现实意义。通过分离与克隆甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因ScD27，我们发现其基因序列与同源植物的相似度最高只有65％，但是其编码的蛋白序列与同源作物的相似度则高达98％，这对于在不同植物和甘蔗近源属之间研究其遗传进化规律具有重要的意义。同时β-胡萝卜素异构酶基因ScD27是独脚金内酯合成的上游调控基因，是影响甘蔗分蘖形成的重要调控因子，因此该基因的获得，不仅有利于揭示甘蔗中独脚金内酯合成的机制，还可以为提高作物的产量和改变甘蔗株型提供重要参考。
附图说明
图1为ScD27基因序列比对结果；
图2为ScD27蛋白序列比对结果。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
1.利用同源克隆的方法，PCR扩增甘蔗中的ScD27目的片段。
①总RNA的提取
以甘蔗品种ROC22为材料，剥开甘蔗顶端叶鞘和幼叶，以手术刀剥取新鲜甘蔗茎尖生长点约0.1g，在液氮中研磨成粉末，使用Trizol试剂，按照使用说明提取甘蔗总RNA。
②cDNA第一链的合成
以甘蔗总RNA作为模板，按天根反转录试剂盒说明书操作合成cDNA第一链。取甘蔗总RNA 5μg与反转录引物1μL混合，70℃温育5min后，立即放置冰上，然后加入5×Buffer，2.5mmol/L dNTP混合液，RNA酶Inhibitor 1.0μL，M-MLV反转录酶1.0μL，反应体系加水补足10μL。
③引物设计依据，引物合成的方法
从GenBank中下载近源物种(高粱、玉米、水稻等)β-胡萝卜素异构酶基因CDS序列，利用Clustal W软件进行多序列比对，确定保守区，根据保守区序列设计引物，扩增片段大小约为480bp。引物设计后交给上海生物工程公司合成。
引物序列为：s-d27-431F：CTGGGATGAAGAACGGAAA
s-d27-886R：TGATCCAGCACTGAAGCAGC
扩增的产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收480bp目标产物，将纯化的PCR产物克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。以相应引物PCR检测，有相应大小目的条带的单克隆送上海生物工程生物公司进行双向测序。
测序结果经BLAST在线软件分析表明，获得的477bp目的片段是甘蔗中β-胡萝卜素异构酶基因ScD27的片段。
2.ScD27基因cDNA全长序列的克隆
3’RACE和5’RACE均使用SMARTTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒完成，均按其说明书进行操作。根据已得到的477bp的目的片段序列设计特异性引物，扩增目的基因的3’和5’末端。方法如下：
以甘蔗茎尖总RNA为模板，利用SMARTTM RACE试剂盒中自带的反转录接头引物及试剂，反转录合成带有接头的cDNA第一链。方法如下：
①配制5’和3’反转录合成cDNA反应液A：5×First-Strand Buffer 2.0μL，DTT(20mM)1.0μL，dNTP Mix(10mM)1.0μL，共4μL。
②配制5’RACE用的反转录合成cDNA反应液B：根据甘蔗总RNA的浓度加入1.0-2.75μL(总量为1μg总RNA)，5’CDs Primer A 1.0μL；
配制3’RACE用的反转录合成cDNA反应液B：甘蔗总RNA 1.0-3.75μL(总量为1μg总RNA)，3’CDS Primer A 1.0μL；
加水使5’RACE用的反转录合成cDNA反应液B终体积达到3.75，33’RACE用的反转录合成cDNA反应液B终体积达到4.75μL。
然后将两种反应液B分别轻轻混合均匀，离心收集反应液至管底。72℃温育3min；42℃温育2min；14000g离心10s收集反应液至管底。
最后再往5’RACE用的反转录合成cDNA反应液B中加入SMARTer IIA oligo 1.0μL，终体积达到4.75μL。
③往第①步中的5’和3’反转录合成cDNA反应液A中分别顺序加入RNase Inhibitor(40U/μL)0.25μL，SMART Scribe Reverse Transcriptase(100U)1.0μL，总体积达5.25μL，得到反应液A。
④将第③步的3’反转录合成cDNA反应液A加入到第②步的3’RACE用的反转录合成cDNA反应液B中，另外将5’反转录合成cDNA反应液A加入到第②步的5’RACE用的反转录合成cDNA反应液B中，这时两份的终体积均达到10μL。然后分别轻轻混合均匀，离心收集反应液至管底，42℃温育90min；70℃温育10min，以100μL Tricine-EDTA Buffer稀释，-20℃保存。
在3’RACE中，以3’RACE反转录合成的cDNA为模板，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用3’RACE外侧特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM进行第一次PCR反应，反应体系：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/L MgCl22μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，10nmol/L接头引物UPM和3’RACE外侧特异引物各2μL，3’RACE cDNA模板2μL，Taq酶1μL，用ddH2O补足体积至50μL。反应条件：94℃，3min；94℃，30s，68℃，30s，72℃，1min，5个循环；94℃，30s，66℃，30s，72℃，1min，25个循环；72℃，10min；4℃保存。
所得的产物稀释5倍后作为第二次PCR反应的模板，3’RACE内侧特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物NUP进行第二次巢式的PCR反应。反应体系：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，10nmol/L接头引物NUP和3’RACE外侧特异引物各2μL，3’RACE cDNA模板2μL，Taq酶1μL，用ddH2O补足体积至50μL。反应条件：94℃，3min；94℃，30s，64℃，30s，72℃，1min，5个循环；94℃，30s，62℃，30s，72℃，1min，5个循环；94℃，30s，60℃，30s，72℃，1min，20个循环；72℃，10min；4℃保存。
3’RACE外侧特异引物：5’-GCCGCCTTCACCACGATATTCTTCCCTT-3’
3’RACE内侧特异引物：5’-GGAATCCGAAGTTGATGGAAGGAAAGAG-3’
在5’RACE中，以5’RACE反转录合成的cDNA为模板，利用巢式PCR的方法，提高PCR反应的特异性，首先利用5’RACE外侧特异引物和试剂盒中提供的外侧接头引物UPM进行第一次PCR反应。反应体系：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/L MgCl2 2μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，10nmol/L接头引物UPM和5’RACE外侧特异引物各2μL，5’RACE cDNA模板2μL，Taq酶1μL，用ddH2O补足体积至50μL。反应条件：94℃，3min；94℃，30s，68℃，30s，72℃，1min，25个循环；72℃，10min；4℃保存。
所得的产物稀释5倍后作为第二次PCR反应的模板，5’RACE内侧特异引物和试剂盒中提供的内侧接头引物NUP进行第二次巢式的PCR反应。反应体系：10×PCR Buffer 5μL，25mmol/L MgCl22μL，2.5mmol/L dNTP 4μL，10nmol/L接头引物NUP和5’RACE外侧特异引物各2μL，5’RACE cDNA模板2μL，Taq酶1μL，用ddH2O补足体积至50μL。反应条件：94℃，3min；94℃，30s，68℃，30s，72℃，1min，5个循环；94℃，30s，66℃，30s，72℃，1min，5个循环；94℃，30s，64℃，30s，72℃，1min，20个循环；72℃，10min；4℃保存。
5’RACE外侧特异引物：5’-CGAGCCAAGGGAAGAATATCGTGGTGAA-3’
5’RACE内侧特异引物：5’-CGTAGCCGTCCTTTCCGTTCTTCATCCCAG-3’
扩增的产物用1.2％的琼脂糖凝胶进行检测，从凝胶中纯化回收480bp目标产物，将纯化的PCR产物克隆到PMD-18T载体中，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞中，挑取阳性克隆，提取质粒DNA。以PMD-18T载体的自带引物PCR检测，有480bp大小目的条带的单克隆送上海生物工程生物公司进行双向测序。利用DNA man 6.0对测序结果与保守区序列设计引物扩增所得序列进行拼接。
3.对β-胡萝卜素异构酶基因ScD27的测定
将拼接结果用BLAST在线软件进行同源性测定，已确定为甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因ScD27同源序列。比对结果如图1所示
将拼接结果用ORF阅读框在线分析软件进行蛋白质同源性测定，也确定其为甘蔗β-胡萝卜素异构酶基因ScD27同源序列。比对结果如图2所示。
本发明核苷酸如序列表中SEQ ID NO.2所述，并且为了清楚的表达，在SEQ ID NO.2本发明提供了对应的氨基酸序列。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
本发明中引物的序列表如表1所示。
表1
SEQ ID NO.1：
SEQ ID NO.2：
本发明核苷酸如序列表中SEQ ID NO.2所述，并且为了清楚的表达，本发明提供了SEQ ID NO.2与之对应的氨基酸序列：
〈221〉3’UTR
〈222〉(995)…(1379)
〈220〉
〈221〉5’UTR
〈222〉(1)…(127)
〈220〉
〈221〉CDS
〈222〉(128)…(994)
〈220〉
〈221〉PolyA site
〈222〉(1348)…(1379)
〈400〉2
Claims (3)
1.β-胡萝卜素异构酶，其特征在于，所述β-胡萝卜素异构酶为由SEQ ID NO.1所示氨基酸序列组成的蛋白。
2.编码权利要求1所述的β-胡萝卜素异构酶的核苷酸序列。
3.根据权利要求2所述的核苷酸序列，其特征在于，所述核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |
Application publication date: 20150520 |
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| RJ01 | Rejection of invention patent application after publication |