CN113832171A

CN113832171A - 桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS及其编码产物与应用

Info

Publication number: CN113832171A
Application number: CN202111200009.3A
Authority: CN
Inventors: 桂双英; 余函纹; 查良平; 彭华胜; 刘梦丽; 李景
Original assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Current assignee: Anhui University of Traditional Chinese Medicine AHUTCM
Priority date: 2021-10-14
Filing date: 2021-10-14
Publication date: 2021-12-24
Anticipated expiration: 2041-10-14
Also published as: CN113832171B

Abstract

本发明涉及桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS及其编码产物与应用，从桔梗根中克隆出桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶的编码基因(PgGGPPS)，该酶可以应用于以二甲烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)为底物制备香叶基香叶基焦磷酸的通路。该技术可以用于后续通过菌体系大量产生香叶基香叶基焦磷酸，对于满足萜类成分面临的巨大市场需求提供有效方法。利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高桔梗萜类物质的含量。

Description

桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS及其编码产物与应用

技术领域

本发明属于药用植物基因工程领域，特别涉及桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS及其编码产物与应用。

背景技术

桔梗是桔梗科植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.的干燥根，主治咳嗽痰多、胸闷不畅、咽痛音哑和肺痈吐脓。《本草纲目》中释其名曰：“此草之根结实而梗直，故名桔梗”。桔梗是常用大宗药材品种之一，属“药食同源”品种，在医药领域中有重要的开发价值。

萜类化合物在植物中广泛存在，是植物代谢物中数量最多的一类化合物，具有抗炎、抗菌等广泛的生物活性，但其生产主要是通过直接从植物中提取进行。其合成的起始阶段有两个途径，即位于质体中的甲基赤鲜糖醇磷酸途径(MEP)和位于细胞质中的甲羟戊酸途径(MVA)。这两个途径生成中间体二甲烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)。1分子DMAPP和3分子IPP在香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)的催化下生成香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)。GGPP是二萜、四萜、叶绿素、赤霉素等众多物质的共同前体。香叶基香叶基焦磷酸合酶(GGPPS)在植物生长发育过程中起着重要的作用，是植物多条重要次生代谢通路的节点。

目前，桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶还未见报道，桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因还未被分离和鉴定。

发明内容

针对上述问题，本发明旨在通过研究桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(PgGGPPS)在桔梗萜类物质合成过程中的功能，提供一种参与香叶基香叶基焦磷酸合成的香叶基香叶基焦磷酸合酶基因及其编码的蛋白质，其重组表达载体、宿主细胞及应用。

本发明的第一个目的是提供桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS及其核苷酸序列。

为达到本发明的第一个目的，本发明的发明人通过对桔梗的转录组进行测序分析和功能研究提供了一种桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS，该基因具有如下(1)或(2)所示的核苷酸序列：

(1)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；

(2)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列经取代、缺失或添加一个或几个核苷酸且表达相同功能蛋白质的核苷酸序列；

其中，当基因PgGGPPS具有(1)所示的核苷酸序列时，该基因cDNA的开放阅读框长度为1098bp。

同时，本发明还提供了基因PgGGPPS所编码的产物，该产物可以为RNA、多肽或蛋白质。该产物的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明的另一目的是提供含有基因PgGGPPS的重组表达载体。该重组表达载体以PgGGPPS表达载体为出发载体，将上述桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS插入PgGGPPS表达载体的BamHI酶切位点间所得。

进一步地，重组表达载体以基因PgGGPPS的cDNA为模板，如SEQ ID NO：3-4所示的引物，进行PCR扩增；将PCR产物和PgGGPPS表达载体进行单酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌获得重组表达载体pET-PgGGPPS。

本发明所提供的基因PgGGPPS，连接于可以引导外源基因在植物表达中的表达载体制备得到基因PgGGPPS的重组表达载体。优选的情况下，所述表达载体为质粒pET-32a。本发明的基因PgGGPPS在构建到表达载体中时，在其转录起始核苷酸前加上任何一种强启动子或诱导性启动子均可，同时必须与编码序列的阅读框相同，要保证整个序列的翻译。为了便于对转基因植物细胞或植株进行鉴定和筛选，可以在构建载体时对载体进行加工，例如加入可选择标记，通常可使用的标记是对抗生素抗性酶的基因和生物安全标记，也可以是GUS、GFP等可以产生颜色变化的酶或发光化合物的基因等。

本发明的另一个方面还提供了含有上述基因PgGGPPS的宿主细胞。其中，宿主细胞含有桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS或其重组表达载体。

进一步地，宿主细胞的物种为桔梗科桔梗属植物桔梗Platycodon grandiflorum(Jacq.)A.DC.。宿主细胞为有价值的活体材料，包括组培获得的桔梗愈伤组织或桔梗植株的细胞。

进一步地，宿主细胞为E.coli transetta(DE3)细胞。

本发明还提供了基因PgGGPPS、载体或宿主细胞在制备萜类化合物前体物质香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)中的应用。

进一步地，该应用包括在宿主细胞中转入基因PgGGPPS，在宿主细胞中表达桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶，利用桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶促进香叶基香叶基焦磷酸(GGPP)的合成。

本发明的有益效果如下：

本发明从桔梗根中克隆出了一种桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶的编码基因(PgGGPPS)，该酶可以应用于以二甲烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)为底物制备香叶基香叶基焦磷酸的通路。该技术可以用于后续通过菌体系大量产生香叶基香叶基焦磷酸，对于满足萜类成分面临的巨大市场需求提供有效方法。由此，利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高桔梗萜类物质的含量。

本发明的其它特征和优点将在随后的说明书中阐述，并且，部分地从说明书中变得显而易见，或者通过实施本发明而了解。本发明的目的和其他优点可通过在说明书、权利要求书以及附图中所指出的结构来实现和获得。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作一简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例。

图1示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS的琼脂糖凝胶电泳图；

图2示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS结构功能域预测分析；

图3示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS二级结构；

图4示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS跨膜结构域预测；

图5示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS三级结构；

图6示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS的系统进化树；

图7示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果；

图8示出了本发明实施例中香叶基香叶醇的标准品离子流图；

图9示出了本发明实施例中香叶基香叶醇的标准品质谱图；

图10示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶催化二甲烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)产物的总离子流图；

图11示出了本发明实施例中桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶催化DMAPP和IPP在保留时间16.441min峰的质谱图；

图12示出了本发明实施例中空载pET-32a标准品离子流图；

图13示出了本发明实施例中空载pET-32a在保留时间16.441min峰的质谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地说明，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例1桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因(PgGGPPS)的克隆

PgGGPPS的克隆利用正向引物：上游引物：P1：

5’ATGAGTATGGTAAATCTAAGCACAT 3’；下游引物：P2：5’

TCAATTGTCTCTATAAGCAATGTAA 3'。以桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶PgGGPPS编码基因全长序列为模板进行PCR扩增。PCR反应体系为(50μL)：模板cDNA 1μL，引物primer-F和primer-R各2.5μL，高保真酶Phusion 25μL，其余反应体积用无菌双蒸水补足。PCR反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸2min，40个循环后72℃延伸5min，4℃下保存。通过测试得到桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS的琼脂糖凝胶电泳图，如图1所示，通过琼脂糖凝胶电泳确定PCR扩增产物大小在1000bp-2000bp之间，与目的基因长度相符，至此获得了桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS克隆。

本实施例中，模板cDNA采用反转录试剂盒PrimeScript^TM II 1st Strand cDNASynthesis Kit。

实施例2 PgGGPPS基因的生物信息学分析

本发明所获得的桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因全长cDNA，PgGGPPS基因的开放阅读框(ORF)的长度为1098bp，详细序列如序列表中SEQ ID NO.1所示。将PgGGPPS基因序列用NCBI数据库中的BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDS translation+PDB+Swissprot+Superdate+PIR数据库中进行核苷酸同源性检索，该基因在氨基酸水平上与其他物种中的GGPPS有较高的同源性，同时具有典型的IspA结构域，如图2所示；通过在线软件NPS进行蛋白质二级结构分析，PgGGPPS蛋白的二级结构由α螺旋、延伸链和无规则卷曲构成(如图3所示)；通过在线软件TMHMM进行蛋白序列的跨膜结构域分析，PgGGPPS没有跨膜结构域(如图4所示)；通过在线软件Swiss Model预测PgGGPPS蛋白的三级结构，如图5所示，PgGGPPS蛋白模型3krp.3.B，得分为0.65，蛋白序列的相似性为80.95％。通过软件MEGA7构建Neighbor-joining系统进化树，bootstrap重复次数为1000次，如图6所示。从图6中示出的桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS的系统进化树可知，PgGGPPS与五加科人参属植物三七位于同一分支点，其亲缘关系最高。

实施例3 PgGGPPS基因原核表达载体的构建

以PgGGPPS基因的cDNA为模板，选择BamHI为单酶切位点，设计特异性上游引物和下游引物(如表1所示)，进行PCR扩增反应，引物中划线部分为酶切位点。

表1特异性上游引物和下游引物碱基序列

PCR反应体系为(50μL)：模板cDNA 1μL，引物primer-F和primer-R各2.5μL，高保真酶Phusion 25μL，其余反应体积用无菌双蒸水补足。

PCR反应条件：98℃预变性2min，98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸2min，40个循环后72℃延伸5min，4℃保存。

将扩增后的产物进行1％的琼脂糖凝胶电泳检测，并对其进行切胶回收。对表达载体pET-32a分别进行BamH I酶切处理，并进行切胶回收。将切胶回收后的目的片段与表达载体pET-32a用无缝拼接试剂盒在50℃连接30min，将连接产物转化至大肠杆菌Trans1-T1感受态细胞中，挑取单克隆进行菌液PCR阳性检验、测序及提取重组表达载体。保存具有正确目标序列的重组表达载体pET-PgGGPPS用于表达转化。

本实施例中，切胶回收试剂盒采用EasyPure Quick Gel Extraction Kit；模板cDNA采用反转录试剂盒PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA Synthesis Kit。

实施例4工程菌株的诱导表达

用目标重组表达载体pET-PgGGPPS转化E.coli transetta(DE3)感受态细胞，培养筛选含有pET-PgGGPPS的阳性菌株E.coli transetta(DE3)-PgGGPPS。该菌株含有可诱导PgGGPPS重组基因的高效表达。

将阳性克隆E.coli transetta(DE3)-PgGGPPS按照1:100的比例接种于含Amp抗性的LB培养液中，37℃下以200rpm的转速振荡培养至OD₆₀₀＝0.4～0.6，加入终浓度为0.8mMIPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)于20℃低温诱导过夜，以相同条件处理pET-28a空载作为空白对照。

取1mL菌液离心获取沉淀作为全菌，剩余菌液离心去上清以获得菌体，加3-5mLBuffer A(20mM Na₃PO₄·12H₂O、500mM NaCl、20mM咪唑)，重悬，转移至15mL离心管置于超声破碎仪中超声破碎10min(其中超声功率比25％，超声破碎过程超声开5s，关5s，间断超声)。超声破碎裂解液在4℃下离心15min后获得上清与沉淀，进行12％SDS-PAGE电泳(聚丙烯酰胺凝胶电泳，其中丙烯酰胺浓度为12％)分析。

桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS蛋白的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果如图7所示。电泳结果表明，在分子量约为60kDa处，出现一条明显的特异蛋白质表达条带，与理论值一致，如图7中划线处所示。图7中，泳道1为含有pET-32a空载体的E.colitransetta(DE3)全菌；泳道M为Protein Ruler Marker；泳道2为未诱导的PgGGPPS全菌；泳道3为诱导的PgGGPPS全菌；泳道4为诱导的PgGGPPS上清。

实施例5体外酶功能验证

1.纯化蛋白的制备：在实施例4得到PgGGPPS上清中，吸取1mL上清与已清洗的500μL Ni-NTA树脂混合于2mL离心管中；随后将离心管放入冰盒中，固定于定轨振荡器上以120rpm的转速摇1h以上；4℃下500×g转速离心5min弃上清；加入1mL Buffer A(20mMNa₃PO₄·12H₂O、500mM NaCl、20mM咪唑)重悬，4℃下500×g转速离心5min弃上清，重复三次；加入200μL Buffer B(20mM Na₃PO₄·12H₂O、500mM NaCl、100mM咪唑)洗脱，4℃下500×g转速离心5min，存于-80℃冰箱。

如图8所示，香叶基香叶醇标准品在GC中保留时间为16.457min，同时，根据如图9所示的香叶基香叶醇的标准品质谱图可以看出，香叶基香叶醇的标准品具有m/z69[CH₃(CH₃)＝CHCH₂-]⁺、290[M]⁺等特征离子峰(如图9所示)。

2.PgGGPPS酶功能验证：以DMAPP和IPP为反应底物进行体外酶功能验证，反应体系为：50mM Tris HCl(pH 7.5)，40μM IPP，40μM DMAPP，10mM MgCl₂，2mM DTT(二硫苏糖醇)，10％甘油和392μL酶液。混匀，30℃孵育过夜，氮吹仪吹干。加2U小牛肠碱性磷酸酶和2U马铃薯腺苷三磷酸双磷酸酶的buffer(100mM Tris HCl,pH 9.5)，30℃孵育10h。用等体积的正己烷涡悬提取3次。合并提取液，真空浓缩至干，加150μL正己烷复溶，取1μL进样，以香叶基香叶醇作为标准品，进行GC-MS检测反应。GC-MS分析条件为：先升温至50℃，保温2min，之后以20C/min的升温速度升温至300℃，在300℃下保温20min。

如图10所示，图10示出了桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶催化二甲烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)产物的总离子流图；从图10中可以看出，样品在保留时间16.441min存在特征峰，如图11所示，样品特征峰也具有m/z69[CH₃(CH₃)＝CHCH₂-]⁺、290[M]⁺等特征离子峰，同样被定性为香叶基香叶醇。而从图12所示的空载pET-32a标准品离子流图以及图13所示的空载pET-32a在保留时间16.441min峰的质谱图中，没有检测到相应的特征峰。因此可以认定桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶具有催化DMAPP和IPP生成香叶基香叶基焦磷酸的活性，而香叶基香叶基焦磷酸在磷酸酶的作用下水解成香叶基香叶醇被检测到。

本发明实施例中，反转录试剂盒PrimeScript^TM II 1st Strand cDNA SynthesisKit购自Takara Bio公司；切胶回收试剂盒EasyPure Quick Gel Extraction Kit、E.coliTransetta(DE3)购自北京全式金生物技术有限公司；高保真酶Phusion、BamH I等限制性内切酶购自纽英伦(NEB)生物技术北京有限公司；引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；其他试剂均为进口或国产分析纯试剂。

应当理解，在本发明实施例中，本领域技术人员可根据本发明公开的基因PgGGPPS编码产物的氨基酸序列，在不影响其活性的前提下，取代、缺失或增加一个或几个氨基酸，得到编码产物的突变序列，该突变序列也属于本发明的保护范围。

综上所述，本发明从桔梗根中克隆出了一种桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶的编码基因(PgGGPPS)，该酶可以应用于以二甲烯丙基焦磷酸酯(DMAPP)和异戊烯基焦磷酸(IPP)为底物制备香叶基香叶基焦磷酸的通路。该技术可以用于后续通过菌体系大量产生香叶基香叶基焦磷酸，对于满足萜类成分面临的巨大市场需求提供有效方法。由此，利用本发明所提供的基因可以通过基因工程技术提高桔梗萜类物质的含量。

尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。

序列表

<110> 安徽中医药大学

<120> 桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS及其编码产物与应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1098

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtatgg taaatctaag cacatcatca acatgggttc attctcaatc caagtccttc 60

atctctcatc tccaacccat acccaaaccc agatcatctt cttcacccag ctacttaaat 120

tactataatt cccgttattc tctctccatc tcttcattcc tcaccaaaca acaagacgac 180

aaaacccaat cccaatccca atcaaagccc tcgttcaatt tcaagtctta catgctcgac 240

aaggctaact ccgtcaattc cgccttagac gccgccgtcc aacttaaaca ccccctcaag 300

atccacgagt ccatgcgcta ctccctcctc gccggcggca agcgcgtccg ccccatgctc 360

tgcatcgccg cctgcgaact cgtcggcggc acccagtcca tcgccatgcc agccgcctgc 420

gccgtcgaga tgatccacac catgtcctta atgcacgacg acctgccctg tctggacaac 480

gacgacctcc gccgcggcaa acccacaaac cacaaggtgt tcggggagaa cgtcgccgtt 540

ttggcaggcg acgcgctcct agccttttcg tttgagcact tagtgatggc aactaaaggg 600

acgtcggcgg ataaaattgt gaaggtcatt ggggaattag cgaagtgtat agggtcagaa 660

ggtttagttg ctggccaagt ggtggatata tgttctgaag gagctactga tattggcgtt 720

gagcaactgg aattcatcca cgtgcacaaa acagctgctc ttctagaagg ttctgtggtt 780

ctgggagcaa tcttgggagg tgggtcagat gaagaagtgg agaaactgag gaaatttgct 840

aggtgcattg ggttgttgtt tcaggttgtg gatgacattc ttgatgttac aaagtcttcg 900

gaagaattgg ggaagacggc tgggaaagat ttggtggctg ataaaactac ttacccaaaa 960

ttgattggga ttgaaaagtc gagggagttt gctgaaaagt tgaataagga agctcaagag 1020

cagcttgctg attttgatca agaaaaggct gctcctttga ttgctctagc taattacatt 1080

gcttatagag acaattga 1098

<210> 1

<211> 365

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<400> 1

Met Ser Met Val Ala Leu Ser Thr Ser Ser Thr Thr Val His Ser Gly

1 5 10 15

Ser Leu Ser Pro Ile Ser His Leu Gly Pro Ile Pro Leu Pro Ala Ser

20 25 30

Ser Ser Ser Pro Ser Thr Leu Ala Thr Thr Ala Ser Ala Thr Ser Leu

35 40 45

Ser Ile Ser Ser Pro Leu Thr Leu Gly Gly Ala Ala Leu Thr Gly Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Leu Pro Ser Pro Ala Pro Leu Ser Thr Met Leu Ala

65 70 75 80

Leu Ala Ala Ser Val Ala Ser Ala Leu Ala Ala Ala Val Gly Leu Leu

85 90 95

His Pro Leu Leu Ile His Gly Ser Met Ala Thr Ser Leu Leu Ala Gly

100 105 110

Gly Leu Ala Val Ala Pro Met Leu Cys Ile Ala Ala Cys Gly Leu Val

115 120 125

Gly Gly Thr Gly Ser Ile Ala Met Pro Ala Ala Cys Ala Val Gly Met

130 135 140

Ile His Thr Met Ser Leu Met His Ala Ala Leu Pro Cys Leu Ala Ala

145 150 155 160

Ala Ala Leu Ala Ala Gly Leu Pro Thr Ala His Leu Val Pro Gly Gly

165 170 175

Ala Val Ala Val Leu Ala Gly Ala Ala Leu Leu Ala Pro Ser Pro Gly

180 185 190

His Leu Val Met Ala Thr Leu Gly Thr Ser Ala Ala Leu Ile Val Leu

195 200 205

Val Ile Gly Gly Leu Ala Leu Cys Ile Gly Ser Gly Gly Leu Val Ala

210 215 220

Gly Gly Val Val Ala Ile Cys Ser Gly Gly Ala Thr Ala Ile Gly Val

225 230 235 240

Gly Gly Leu Gly Pro Ile His Val His Leu Thr Ala Ala Leu Leu Gly

245 250 255

Gly Ser Val Val Leu Gly Ala Ile Leu Gly Gly Gly Ser Ala Gly Gly

260 265 270

Val Gly Leu Leu Ala Leu Pro Ala Ala Cys Ile Gly Leu Leu Pro Gly

275 280 285

Val Val Ala Ala Ile Leu Ala Val Thr Leu Ser Ser Gly Gly Leu Gly

290 295 300

Leu Thr Ala Gly Leu Ala Leu Val Ala Ala Leu Thr Thr Thr Pro Leu

305 310 315 320

Leu Ile Gly Ile Gly Leu Ser Ala Gly Pro Ala Gly Leu Leu Ala Leu

325 330 335

Gly Ala Gly Gly Gly Leu Ala Ala Pro Ala Gly Gly Leu Ala Ala Pro

340 345 350

Leu Ile Ala Leu Ala Ala Thr Ile Ala Thr Ala Ala Ala

355 360 365

Claims

1.一种桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。

2.一种由权利要求1所述的桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS编码的产物，其特征在于，该产物氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

3.根据权利要求2所述的产物，其特征在于，该产物为RNA、多肽或蛋白质。

4.含有权利要求1所述基因的重组表达载体。

5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以PgGGPPS表达载体为出发载体，将权利要求1所述的桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS插入PgGGPPS表达载体的BamHI酶切位点间所得。

6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体以基因PgGGPPS的cDNA为模板，如SEQ ID NO：3-4所示的引物，进行PCR扩增；将PCR产物和PgGGPPS表达载体进行单酶切，回收纯化，连接转化大肠杆菌获得重组表达载体pET-PgGGPPS。

7.含有权利要求1所述基因或含有权利要求4-5任一项所述重组表达载体的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括组培获得的桔梗愈伤组织或桔梗植株的细胞。

8.根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为E.coli transetta(DE3)细胞。

9.权利要求1所述的基因PgGGPPS、权利要求4-6任一项所述的重组表达载体或权利要求8所述的宿主细胞在制备萜类化合物前体物质香叶基香叶基焦磷酸中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述应用为在宿主细胞中转入桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶基因PgGGPPS、在宿主细胞中表达桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶或利用桔梗香叶基香叶基焦磷酸合酶促进香叶基香叶基焦磷酸的合成。