CN101426900B - 新的微生物及使用该新的微生物制造十二氢-3a,6,6,9a-四甲基萘并[2,1-b]呋喃中间体的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种新的微生物，该微生物使用香紫苏醇作为底物有效产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。作为集中研究的结果，分离并鉴别出多种具有所关注特性并且没有被分类为常规微生物的新的微生物。本发明的新的微生物属于子囊菌纲，并且具有使用香紫苏醇作为底物产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力。这些子囊菌纲的微生物代表了新的发现，其可以有效产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃及其中间体。
Description
发明领域
本发明涉及一种新的微生物，该微生物使用香紫苏醇(sclareol)作为底物产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。进一步，本发明涉及使用该新的微生物制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法。
背景技术
十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃(有时称作“Ambroxan(商标)”)是一种具有令人满意地持久的特性的芳香化合物，该化合物主要从提取自硬膜鼠尾草(Salvia sclarea)的香紫苏醇经由化学转化制造。
图1显示了从香紫苏醇制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的方法。如图1所示，已知十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇和香紫苏内酯(sclareolide)(十氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃-2(1H)-酮)是十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。另外，尽管图1中没有显示，已知环醚化合物(8α，13-环氧-12，13-脱氢-15，16-二去甲半日花烷(dinorlabdane))也是十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。
通过微生物将香紫苏醇转化成十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体描述于，例如，日本专利第2547713号、日本专利第2802588号、日本专利第3002654号和日本专利第2063550号。日本专利第2547713号描述了通过Hyphozyma roseoniger ATCC20624制造十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇。日本专利第2802588号描述了通过罗伦隐球酵母(Cryptococcus laurentii)ATCC20920制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。日本专利第3002654号描述了通过Bensingtonia cilliata ATCC20919制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。日本专利第2063550号描述了通过浅白隐球酵母(Cryptococcus albidus)ATCC20918和浅白隐球酵母ATCC20921制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。
因此，如日本专利第2547713号、日本专利第2802588号、日本专利第3002654号和日本专利第2063550号中所公开，已知仅担子菌纲(Basidiomycetes)或Hyphozyma微生物是具有使用香紫苏醇作为底物产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力的微生物。
发明内容
在上述情形下，本发明意在提供一种新的微生物，该微生物可以有效地使用香紫苏醇作为底物产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。而且，本发明意在提供一种使用该微生物制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法。
为了解决上述问题，为了分离并鉴别出具有所关注特性的微生物，本发明者对作为微生物源的土壤样品进行了集中研究，上述样品获自日本枥木县芳贺郡和日本枥木县宇都宫市。结果，他们成功地分离并鉴别出三种新的微生物菌株，该微生物没有作为传统微生物而被分类并具备所关注特性。基于这些发现完成了本发明，以实现可以使用香紫苏醇作为底物制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的效果，该同样的效果可以由上述新的微生物来实现。
根据本发明的新的微生物属于子囊菌纲(Ascomycetes)，并且具有能够使用香紫苏醇作为底物产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力。具有这种能力的子囊菌纲微生物代表了新的发现，这些微生物可以用于制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃及其中间体。关于由本发明者分离并鉴别的新的微生物，编码28S rRNA的基因的核苷酸序列(下文中称作“28S rDNA”)被鉴别。这些核苷酸序列如SEQ ID NO：1-3所显示。关于新的微生物，编码18S rRNA的基因的核苷酸序列(下文中称作“18S rDNA”)被鉴别。这些核苷酸序列如SEQ ID NO：4-6所显示。而且，发现新的微生物具有表1所示的真菌学特性。
表1
| 碳源同化性试验 | KSM-JL2842 | KSM-J3571 | KSM-JL4651 |
| D-葡萄糖 | + | + | + |
| D-半乳糖 | + | + | + |
| L-山梨糖 | + | + | w |
| D-核糖 | W | w | w |
| D-木糖 | + | + | + |
| L-阿拉伯糖 | + | + | + |
| D-阿拉伯糖 | + | w | w |
| L-鼠李糖 | + | + | + |
| 蔗糖 | + | + | + |
| 麦芽糖 | + | + | + |
| α，α-海藻糖 | + | + | + |
| Meα-D-葡糖苷 | + | + | w |
| D-纤维二糖 | + | + | + |
| 水杨苷 | - | w | w |
| 蜜二糖 | + | + | + |
| 乳糖 | + | + | w |
| D-密三糖 | + | + | + |
| 松三糖 | + | + | + |
| 菊糖 | - | w | - |
| 可溶性淀粉 | W | + | + |
| 甘油 | + | + | w |
| 内消旋赤藓糖醇 | + | + | w |
| 核糖醇 | W | - | w |
| D-山梨糖醇 | + | + | w |
| D-甘露醇 | + | + | w |
| D-半乳糖醇 | - | - | - |
| 肌醇 | + | w | w |
| 葡糖酸-1，5-内酯 | W | w | - |
| Ca2-酮-葡糖酸 | - | - | w |
| Ca5-酮-葡糖酸 | - | - | w |
| DL-乳酸盐 | + | + | w |
| 琥珀酸盐 | + | + | + |
| 柠檬酸盐 | - | w | w |
| 甲醇 | - | - | - |
| 糖发酵性试验 | KSM-JL2842 | KSM-J3571 | KSM-JL4651 |
| D-葡萄糖 | - | - | - |
| 氮源同化性试验 | KSM-JL2842 | KSM-J3571 | KSM-JL4651 |
| 硝酸钾 | + | + | + |
本发明者试图基于如SEQ ID No：1-3所示的28S rDNA的核苷酸序列、如SEQ ID No：4-6所示的18S rDNA的核苷酸序列和如表1所示的真菌学特性来鉴别新型微生物。结果，他们仅能够辨明属于子囊菌纲的新的微生物。具体地，新的微生物没有被分类至子囊菌纲的已知属或种。因此，推断这些新的微生物属于新的属。真菌学特性方面的分类根据以下文献进行：Barnett，J.A.，Payne，R.W.，and Yarrow，D.，2000，Yeasts：Characteristics and identification，3rdedition，Cambridge UniversityPress，Cambridge，U.K.；和Kurtzman，C.P.and Fell，J.W.，1998，TheYeasts，a taxonomic study，4th edition，Elsevier，Amsterdam，Netherlands。
新的微生物保藏在独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心(the International Patent Organism Depositary of the NationalInstitute of Advanced Industrial Science and Technology)(IPOD：日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6，邮编305-8566)，于2006年1月12日保藏的保藏号为FERM BP-10713和FERM BP-10712，于2006年7月13日保藏的保藏号为FERM BP-10714。
具体地，本发明的微生物属于子囊菌纲，并且具有在使用香紫苏醇作为底物合成十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的过程中制造中间体的能力。另外，优选地，本发明的微生物包括由与SEQ ID NO：1-3中任意一个所示的核苷酸序列的同源性为95％或更高的核苷酸序列组成的28S rDNA，或者由与SEQ ID NO：4-6中任意一个所示的核苷酸序列的同源性为95％或更高的核苷酸序列组成的18S rDNA。而且，本发明的微生物优选地具有表1所示的真菌学特性。而且，本发明的微生物优选地属于由保藏号FERM BP-10713、FERM BP-10712或FERM BP-10714识别的子囊菌纲酵母菌株。本发明的微生物可以属于子囊菌纲酵母菌株所属的属，优选种，更优选菌株。
本发明的中间体的例子包括十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇和/或香紫苏内酯(十氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃-2(1H)-酮)。
本发明可以提供使用本发明的新的微生物制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法。具体地，根据本发明的制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法包括在含有香紫苏醇的培养基中培养新的微生物，并在使用香紫苏醇作为底物合成十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的过程中产生中间体。
本发明可以提供一种新的微生物，该微生物属于子囊菌纲，并且具有在使用香紫苏醇作为底物合成十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的过程中产生中间体的能力。十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃作为芳香化合物或类似物的起始原料，可以由这些中间体制造。
因此，使用本发明的新的微生物能够低成本地制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃。
本发明还可以提供制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法，该中间体是作为芳香化合物或类似物的起始原料的十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的起始原料。根据本发明的制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法，可以低成本地制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃。
本发明书包括作为本申请的优先权文件的日本专利申请第2006-048550号的说明书和/或附图中所公开的部分或全部内容。
附图说明
图1显示了从香紫苏醇制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的过程。
具体实施方式
以下，对本发明进行详细说明。
新的微生物
本发明的新的微生物属于子囊菌纲，并在使用香紫苏醇作为底物合成十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的过程中产生中间体，即，十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。本文所用的术语“十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体”是指十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇和香紫苏内酯(十氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃-2(1H)-酮)。
利用产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力作为指标，可以从土壤中分离出本发明的新的微生物。通过在含有香紫苏醇的培养基中培养试验微生物，并检测培养基中的十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体，可以对产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力进行评价。通过使用有机溶剂从已经除去试验微生物的培养基中提取十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体，然后进行例如气相色谱(GC)，可以检测培养基中的十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。
检测十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法并不限于GC。例如，可以采用常规的分析方法，例如气液色谱(GLC)、薄层色谱(TLC)、高效液相色谱(HPLC)、红外光谱(IR)、或核磁共振(NMR)。
本发明者已经通过这些方式从日本枥木县芳贺郡和日本枥木县宇都宫市的土壤样品中分离出新的子囊菌纲微生物。分离出的新的微生物在含有香紫苏醇的培养基中培养，使得这些微生物可以在培养基中产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。本发明者将这些新的微生物命名为子囊菌(Ascomycete sp.)KSM-JL2842、子囊菌KSM-J3571和子囊菌KSM-JL4651，并将其保藏在独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心(IPOD：日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6，邮编305-8566)，保藏号为FERM BP-10713、FERM
BP-10712和FERM BP-10714。
本发明的新的微生物包括通过保藏号FERM BP-10713、FERMBP-10712或FERM BP-10714识别的属于子囊菌纲的酵母菌株的微生物，以及被分类至与酵母菌株相同的属、优选被分类至与酵母菌株相同的种、更优选相同菌株的微生物。另外，这些微生物具有产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力。
通过保藏号FERM BP-10713、FERM BP-10712和FERM BP-10714识别的子囊菌纲酵母菌株具有分别包括SEQ ID NO：1、2和3中任意一个所示的核苷酸序列的28S rDNA。因此，本发明的新的微生物包括子囊菌纲酵母菌株，该子囊菌纲酵母菌株具有28S rDNA并且具有产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力，该28S rDNA包括与SEQ ID NO：1-3中任意一个所示的任一核苷酸序列的同源性为95％或更高、优选98％或更高、更优选99％或更高的核苷酸序列。
而且，通过保藏号FERM BP-10713、FERM BP-10712和FERMBP-10714识别的子囊菌纲酵母菌株具有分别包括SEQ ID NO：4、5和6所示的核苷酸序列的18S rDNA。因此，本发明的新的微生物包括子囊菌纲酵母菌株，该子囊菌纲酵母菌株具有18S rDNA并且具有产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力，该18S rDNA包括与SEQ ID NO：4-6中任意一个所示的任一核苷酸序列的同源性为95％或更高、优选98％或更高、更优选99％或更高的核苷酸序列。
通过新的微生物产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体
使用上述本发明的新的微生物，可以产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。产生的十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体可以用作制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃-一种新的具有令人满意地持久的特性的高价值的芳香化合物的起始原料。
当使用本发明的新的微生物产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体时，首先将本发明的新的微生物在含有香紫苏醇的培养基中培养。可以使用任何组成的培养基，其条件是其中可以生长子囊菌纲微生物。可以使用的培养基的例子包括含有碳源、氮源、矿物质和维生素的固体培养基和液体培养基。根据培养条件等，用于培养本发明的新的微生物的培养基可以含有表面活性剂或消泡剂。
添加到培养基中的碳源的例子包括单糖、二糖、寡糖和多糖。它们可以两种或更多种组合使用。糖以外的碳源的例子包括有机酸盐，例如醋酸盐。根据需要，这些碳源可以独立使用，或者可以两种或更多种组合使用。
氮源的例子包括无机和有机铵盐，例如氨、氯化铵、硫酸铵、硝酸铵、碳酸铵、磷酸铵和醋酸铵；含氮有机物质，例如尿素、胨、肉汁、酵母提取物、和酪蛋白水解物；以及氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、丙氨酸和蛋氨酸。根据需要，这些氮源可以独立使用，或者可以两种或更多种组合使用。
而且，矿物质的例子包括氯化钠、硫酸亚铁、硫酸镁、硫酸锰、硫酸锌和碳酸钙。根据需要，各种矿物质可以独立使用，或者可以两种或更多种组合使用。
本发明的新的微生物的培养条件不受特别限制，培养可以在最理想的pH水平和温度下进行。具体地，最理想的pH水平为3至8，优选4至8，更优选5至7。最理想的温度为10℃至35℃，优选15℃至30℃，更优选20℃至30℃。培养可以经由，例如震荡培养、厌氧培养、静止培养或在发酵罐中培养进行。此外，还可以采用静止细胞反应和固定化细胞反应。
向具有这些组成的培养基中添加的香紫苏醇的浓度不受特别限制，该浓度优选为0.1％至50％。香紫苏醇可以在培养之前或者在培养过程中(即流加培养(feeding culture))被添加至培养基。另外，可以同时补料香紫苏醇以外的组分，例如碳源、氮源、维生素、矿物质、表面活性剂或消泡剂。
如上所述对新的微生物进行培养之后，可以从培养基中回收十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。可以根据常规技术从培养基中回收十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体，不受特别限制。例如，使用离心、超滤、离子交换色谱、反渗透膜过滤、电渗析、盐析、结晶和其它方式的组合，可以将细胞从培养基中分离并除去，以及分离并提纯十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。
使用生成的十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体制造十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的方法不受特别限制，可以采用合适的常规技术。具体地，将香紫苏内酯用，例如，氢化铝锂、硼氢化钠或硼氢化钾/氯化锂混合物还原，得到十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇。在各种类型的溶剂中使用酸性催化剂，例如，对甲苯磺酸、对甲苯磺酰氯(p-toluenesulfonic acid chloride)或催化量的硫酸和酸性离子交换剂对十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇进行环化脱水，得到十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃。
实施例
以下，参考实施例对本发明进行更详细的说明，但本发明的技术范围不限于以下实施例。
[实施例1]分离新的微生物
新的微生物以以下方式自日本枥木县芳贺郡和日本枥木县宇都宫市的土壤样品中分离。
首先，将100μl土壤悬浮液应用于含有0.2％酵母提取物、0.2％硝酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.05％七水硫酸镁、2.0％琼脂、1.0％香紫苏醇(分别灭菌)和0.5％Tween 80(分别灭菌)的琼脂培养基。培养在25℃下进行7至14天，将生长的菌落接种到含有0.2％酵母提取物、0.2％硝酸铵、0.1％磷酸二氢钾和0.05％七水硫酸镁的液体培养基中，培养在25℃下进行1天，得到引子(starter)菌株。随后，将引子菌株接种到含有0.2％酵母提取物、0.2％硝酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.05％七水硫酸镁、1.0％香紫苏醇(分别灭菌)和0.5％Tween 80(分别灭菌)的培养基中至浓度为1％，培养在25℃下进行1周。
培养完成之后，将目标物质用0.6ml乙酸乙酯从0.1ml培养液中提取出来，加以充分稀释，然后进行气相色谱(GC)分析。使用Agilenttechnologies 6890N作为GC分析仪在以下条件下进行分析。使用火焰离子化检测器(FID)作为检测器，入口温度设定在250℃，使用分流比为100∶1的分流注射模式，总的流速为200ml/min，柱流速为0.4ml/min，使用DB-WAX(
0.1mm×10m，J&W)柱作为柱子，炉温为250℃。在这些条件下，环醚化合物，即，十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体在大约0.8分钟处出峰，香紫苏内酯在大约2.4分钟处出峰，香紫苏醇在大约2.7分钟处出峰，十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇在大约3分钟处出峰。
在这些条件下，对6,950引子菌株进行产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力方面的评价。结果，分离出具有主要产生十氢2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇的能力的新的微生物。分离出的新的微生物命名为KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JLA651。
[实施例2]新的微生物的分类
对实施例1中分离出的KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651的真菌学特性进行鉴别，并分析其rDNA，以期对这些菌株进行分类。
首先，以如下方式鉴别KSM-JL2842的真菌学特性。在YM琼脂(Becton Dickinson)平板培养基上观察湿的浅红色菌落，菌落外周部分的形状相对平滑。观察其微观特征。结果，观察到卵形至椭圆形的圆柱状滋养细胞的形成，发现滋养细胞因出芽生殖而增殖。作为生化特性试验的结果，得到了表2所示的结果。在表2中，符号“+”表示阳性结果，符号“-”表示阴性结果，符号“w”表示弱阳性结果。另外，KSM-JL2842在25℃下生长，但在30℃或更高温度下不生长。
以如下方式鉴别KSM-J3571的真菌学特性。在YM琼脂(BectonDickinson)平板培养基上观察湿的浅红色至浅黄红色菌落，菌落外周部分的形状是平滑的。观察其微观特征。结果，观察到卵形至椭圆形的纺锤状滋养细胞的形成，发现滋养细胞因出芽生殖而增殖。作为生化特性试验的结果，得到了表2所示的结果。另外，KSM-J3571在25℃下生长，在30℃下微弱生长，但在35℃或更高温度下不生长。
以如下方式鉴别KSM-JL4651的真菌学特性。在YM琼脂(BectonDickinson)平板培养基上观察湿的浅红色菌落，菌落外周部分的形状相对平滑。观察其微观特征。结果，观察到卵形至椭圆形的圆柱状滋养细胞的形成，发现滋养细胞因出芽生殖而增殖。作为生化特性试验的结果，得到了表2所示的结果。另外，KSM-JL4651在30℃下生长，但在35℃或更高温度下不生长。
表2
| 碳源同化性试验 | KSM-JL2842 | KSM-J3571 | KSM-JL4651 |
| D-葡萄糖 | + | + | + |
| D-半乳糖 | + | + | + |
| L-山梨糖 | + | + | w |
| D-核糖 | W | w | w |
| D-木糖 | + | + | + |
| L-阿拉伯糖 | + | + | + |
| D-阿拉伯糖 | + | w | w |
| L-鼠李糖 | + | + | + |
| 蔗糖 | + | + | + |
| 麦芽糖 | + | + | + |
| α，α-海藻糖 | + | + | + |
| Meα-D-葡糖苷 | + | + | w |
| D-纤维二糖 | + | + | + |
| 水杨苷 | - | w | w |
| 蜜二糖 | + | + | + |
| 乳糖 | + | + | w |
| D-密三糖 | + | + | + |
| 松三糖 | + | + | + |
| 菊糖 | - | w | - |
| 可溶性淀粉 | W | + | + |
| 甘油 | + | + | w |
| 内消旋赤藓糖醇 | + | + | w |
| 核糖醇 | W | - | w |
| D-山梨糖醇 | + | + | w |
| D-甘露醇 | + | + | w |
| D-半乳糖醇 | - | - | - |
| 肌醇 | + | w | w |
| 葡糖酸-1，5-内酯 | W | w | - |
| Ca2-酮-葡糖酸 | - | - | w |
| Ca5-酮-葡糖酸 | - | - | w |
| DL-乳酸盐 | + | + | w |
| 琥珀酸盐 | + | + | + |
| 柠檬酸盐 | - | w | w |
| 甲醇 | - | - | - |
| 糖发酵性试验 | KSM-JL2842 | KSM-J3571 | KSM-JL4651 |
| D-葡萄糖 | - | - | - |
| 氮源同化性试验 | KSM-JL2842 | KSM-J3571 | KSM-JL4651 |
| 硝酸钾 | + | + | + |
随后，以下列方式分析KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651的rDNA。具体地，根据O’Donnell方法(O’Donnell，K.1993，Fusariumand its near relatives，in Reynolds，D.R.and Taylor，J.W.(Eds)TheFungal Holomorph：Mitotic，Meiotic and Pleomorphic Speciation in FungalSystematics，CAB International，Wallingford)分析28S rDNA的D1/D2区和18S rDNA，以推导其分类群。确定了28S rRNA的D1/D2区的核苷酸序列，结果显示于SEQ ID NO：1-3。另外，确定了18S rDNA的核苷酸序列，结果显示于SEQ ID NO：4-6。通过BLAST进行同源性检索。
获自KSM-JL2842的28S rDNA的D1/D2区的核苷酸序列表现出与Pseudourotium zonatum(AF096198)的核苷酸序列的同源性为94.9％，与Crinula caliciiformis(AY544680)的核苷酸序列的同源性为94.6％，其中，上述Pseudourotium zonatum是子囊菌纲菌株。另外，18S rDNA的核苷酸序列表现出高度同源性：即，与Bulgaria inquinans(AJ224362)的核苷酸序列的同源性为98.8％，与ascomycete sp.BBA71218(AJ301960)的同源性为98.9％，与Cryptosporiopsis radicicola(DQ002903)的核苷酸序列的同源性为98.9％，其中，上述Bulgariainquinans是子囊菌纲菌株。但是，很难推导KSM-JL2842的分类学组别分到比“纲(class)”级别更小的分类中。因此，推断所关注的菌株是子囊菌纲的新的属的酵母菌株，其分类在子囊菌纲中。该实施例的结果能够将所关注的菌株鉴别为子囊菌KSM-JL2842。
获自KSM-J3571的28S rDNA的D1/D2区的核苷酸序列表现出与Pseudourotium zonatum(AF096198)的核苷酸序列的同源性为94.9％，与Leuconeurospora pulcherrima(AF096193)的核苷酸序列的同源性为94.8％，与Crinula caliciiformis(AY544680)的核苷酸序列的同源性为94.6％，其中，上述Pseudourotium zonatum是子囊菌纲菌株。18S rDNA的核苷酸序列表现出与ascomycete sp.BBA71218(AJ301960)的同源性为99.0％，与Bulgaria inquinans(AJ224362)的核苷酸序列的同源性为98.8％，其中，上述ascomycete sp.是子囊菌纲菌株。但是，难以将KSM-J3571的分类群推导到比“纲”级别更小的分类中。因此，推断所关注的菌株是构成子囊菌纲的新的属的酵母菌株，其分类在子囊菌纲中。该实施例的结果能够将所关注的菌株鉴别为子囊菌KSM-J3571。
获自KSM-JL4651的28S rDNA的D1/D2区的核苷酸序列表现出与Pseudourotium zonatum(AF096198)的核苷酸序列的同源性为94.6％，与Leuconeurospora pulcherrima(AF096193)的核苷酸序列的同源性为94.4％，其中，上述Pseudourotium zonatum是子囊菌纲菌株。18S rDNA的核苷酸序列表现出与ascomycete sp.BBA71218(AJ301960)的同源性为99.0％，与Bulgaria inquinans(AJ224362)的核苷酸序列的同源性为98.8％，其中，上述ascomycete sp.是子囊菌纲菌株。但是，难以将KSM-JL4651的分类群推导到比“纲(class)”级别更小的分类中。因此，推断所关注的菌株是构成子囊菌纲的新的属的酵母菌株，其分类在子囊菌纲中。该实施例的结果能够将所关注的菌株鉴别为子囊菌KSM-JL4651。
子囊菌KSM-JL2842和KSM-J3571于2006年1月12日，以FERMBP-10713和FERM BP-10712的保藏号，子囊菌KSM-JL4651于2006年7月13日，以FERM BP-10714的保藏号，保藏在独立行政法人产业技术综合研究所的专利生物保藏中心(IPOD：日本茨城县筑波市东1-1-1中央第6，邮编305-8566)。
[实施例3]考察产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力
在该实施例中，考察子囊菌KSM-JL2842产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力。首先，将铂环量的子囊菌KSM-JL2842接种到2.1％YM肉汤(Becton Dickinson)中，在25℃下震荡培养2天，生成物称为引子菌株。随后，将引子菌株接种到含有2.1％YM肉汤、0.1％七水硫酸镁、1％Tween 80和2％香紫苏醇的培养基中至浓度为2％，在25℃下进行震荡培养。通过实施例1的方法对培养液进行提取和GC分析，确定产生的十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的量。结果显示在表3中。表3中所显示的数值的单位为“g/l”。
表3
表3中的结果表明，子囊菌KSM-JL2842主要可以产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体当中的十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇。
[实施例4]考察产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力
在该实施例中，考察子囊菌KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的能力。首先，将铂环量的这些菌株接种到含有0.2％酵母提取物(BectonDickinson)、0.2％硝酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.05％七水硫酸镁和1.0％葡萄糖的培养基中，在25℃下进行2天震荡培养，生成物称为引子菌株。随后，将引子菌株接种到含有0.2％酵母提取物(Becton Dickinson)、0.2％硝酸铵、0.1％磷酸二氢钾、0.05％七水硫酸镁、1.0％葡萄糖、0.5％Tween 80和1.0％香紫苏醇的培养基中至浓度为1％，在25℃下进行6天震荡培养。通过实施例1的方法对培养液进行提取和GC分析，确定产生的十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的量。结果显示在表4中。表4中所显示的数值的单位为“g/l”。
表4
| KSM-JL2842 | KSM-J3571 | KSM-JL4651 | |
| 香紫苏内酯 | 0.4 | 3.1 | 0.4 |
| 十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇 | 2.0 | 0.2 | 0.7 |
| 环醚 | 痕量 | 0.1 | 痕量 |
表4中的结果表明，子囊菌纲细菌KSM-JL2842、KSM-J3571和KSM-JL4651均产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体。
在此将本文引用的所有出版物、专利和专利申请全部并入作为参考。
Claims (2)
1.一种微生物，其特征在于，所述微生物属于子囊菌纲，并且具有在使用香紫苏醇作为底物合成十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的步骤中产生作为中间体的十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇和/或香紫苏内酯的能力，所述微生物为由保藏号FERM BP-10713、FERMBP-10712或FERM BP-10714识别的子囊菌纲酵母菌株。
2.一种产生十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃中间体的方法，其特征在于，所述方法包括：在含有香紫苏醇的培养基中培养权利要求1所述的微生物，并且在使用香紫苏醇作为底物合成十二氢-3a，6，6，9a-四甲基萘并[2，1-b]呋喃的过程中产生中间体，并且回收作为所述中间体的十氢-2-羟基-2，5，5，8a-四甲基萘乙醇和/或香紫苏内酯的步骤。
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