DE2915108C2 - Verfahren zur Epoxydation von C↓2↓-C↓4↓-n-Alkenen, Butadien oder deren Gemischen - Google Patents
Verfahren zur Epoxydation von C↓2↓-C↓4↓-n-Alkenen, Butadien oder deren GemischenInfo
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Description
Die Erfindung bezieht sich auf die Umwandlung von C;-Cj-n-Alkcncn, Butadien oder deren Gemische in
Epoxide. Insbesondere bezieht sie sich auf die Bildung von Propylenoxld aus Propylen und dieses enthaltenden
Strömen durch die Einwirkung von Sauerstoff und melhylolrophcn Mikroorganismen oder aus diesen stammenden
Enzympräparaten.
Epoxide sind aufgrund Ihrer Fähigkeit, /ahlrelcbc chemische Reaktionen, wie die Addition mit den aktiven
Wasserstoffatomen nuklcophller Reagenticn (z. B. Ammoniak, organischer Säuren, Alkohole, Wasser usw.), einzugehen,
äußerst wertvolle Produkte geworden. Die Produkte der Epoxydation (das heißt die 1,2-Epoxlde, auch
als 3-Epoxlde und Oxlran-Verblndungcn bekannt) erfreuen sich aufgrund Ihres Polymerisationsvermögens unter
thermischer. Ionischer und frelradlkallschcr Katalyse zur Bildung von Epoxyhomo- und -copolymerisaten auch
Industrieller Bedeutung. Älhylenoxld und Propylenoxld stellen die beiden gewerblich wichtigsten Epoxide dar.
Ein verbreitet angewandtes Verfahren Ist das süberkatalyslerte »Dlrektoxydatlonsw-Verfahrcn von Lefort [US-PS
19 98 878 (1935) und die Relssue-PS 20 370 und 22 241].
In der NL-PS 2 91 163 Offengelegt am 25. 6. 1965) ist ein Verfahren zur Herstellung von 1,2-Epoxlden durch
Kontaktleren von ^-Olefinen mit Sauerstoff und Mikroorganismen offenbart, die auf einem Kohlenwasssrstoff
wachsen und aus diesem Kohlenstoff assimilieren können. Diese Patentschrift lehrt, daß der Mikroorganismus
vorzugsweise auf einem Kohlenwasserstoff mit praktisch der gleichen Zahl der Kohlenstoffatom wie das a-Olefln
gezüchtet wird, das der Epoxydalion unterworfen wird. Während die allgemeine Beschreibung dieses
to Patents >Oleflne mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen umfaßt, zeigt das einzige Beispiel in dieser Patentschrift die
Epoxydation von 1-Octen In Gegenwart von Luft und Pseudomonas acruglnosa (Stamm 473), der auf n-Heptan
gezüchtet worden war.
Whlitenbury, Dallon, Ecclcston und Reed [Mlcroblal Growth on C1 Compounds: Proceedings of the lntcrruilional
Symposium on Mlcroblal Growth on C, Compounds, Society of Fermentation Technology, pp. 1-11
■»5 (1975)] berichteten, daß Methan-oxydlcrcndc Bakterien das Interessante Mcrknial besitzen, Substrate zu oxydieren,
aber nicht verbrauchen zu können, sie wachsen beispielsweise nicht auf Äthan, oxydieren es aber, wenn sie
auf Methan wachsen oder zuvor mit Methan gc/.üchict worden sind.
DeBont [Antonio van Leeuwcnhock. 42, 59-71 (1976)] berichteten, daß Äthylen durch bestimmte Gram-positive
Bakterien oxydiert wurde, die vermutlich zur Art Mycobaclcrlum gehörten. DeBont berichtete, daß seine
5» Isolierten Stämme nicht in Gegenwart von Methan wuchsen, und leitete daraus her, daß diese im Boden befindlichen
Bakterien keine Mcthan-oxydlercnden Bakterien waren. DeBont und Albers [Antonio van Leeuwenhoek,
42. 73-80 (1976)] nahmen an. daß das Oxydationsprodukt der !Ithylcnoxydlcrendcn Stamme von DeBont (1976)
Äthylenoxid war.
Hutchlnson, Whittcnbury and Dalton [J. Theor. Blol., 58. 325-335 (1976) »A Possible Role of Free Radicals
In the Oxidation of Methane by Methylococcus capsulatus«] und Colby und Dalton [J. Biochem., 157, 495-597
(1976) »Some Properties of a Soluble Methane Mono-Oxygcnase from Meihylococcus capsulatus Strain Bath»]
berichteten, daß Äthylen durch lösliche Methan-monooxygcnasc aus Methylococcus capsulatus. Stamm Bath,
oxydiert wird. Diese letzteren Forscher berichteten, daß die »besonderen Membran-Präparate« von Methylococcus
capsulatus. Stamm Bath, keine Methan-oxygcnasc-Akilvliiti besaßen, bestimmt nach dem Test des Brommeihan-Verschwlndens.
Auf der Grundlage des '"O-Elnbaus aus "O3 In die Zcllbcsiandlcllc von Pseudomonas methanlca vermuteten
1 cjdbetter und Foster !Nature. 184. 1428- 1429 (145'))), daß an dem anfänglichen oxydallvcn Angriff auf das
Methan eine Oxygenase beteiligt Ist. lllgglns und Quaylc [J. Biochem.. 118, 201-208 (1970)1 isolierten CH1 11OH
als Produkt der Mcihanoxydalion. wenn Suspensionen von Pseudomonas mcthanica oder Methanomonas n-,e-
^ thano-oxldans Methan In "Ό.-angereleherien Atmosphären oxydieren konnten. Die folgende Beobachtung einer
Meihan-silmullcrten NADH-Oxydation, katalysiert durch Fxirakie von Methylococcus capsulatus. durch
Ribbons [J. Bacerlol.. 122. 1351-1363 (1975)] und Ribbons und Mlclialovcr. FFBS Leu. II, 41 -44 (1970) oder
Methylomonas capsulatus durch Fcrenel. FFBS Lett. 41. 94-98 (1974) ließ vermuten, daß i'.as für diese Oxyda-
tion verantwortliche Enzym eine Monooxygenase ist. Diese Forscher stützten sich auf indirekte Enzymtests oder
spektrophotometrischer Messung Methan-stimuJierten NADH-Verschwindens oder polarographlscher Messung
Methan-stimulierten O.-Verschwindens. In jüngerer Zeit wurden Methan-monooxygenase-Sys'.eme teilweise
gereinigt aus Methylosinus trichosporium OB3b [Tonge, Harrison und Higgins. J. Blochem. 161. 333-344 (1977)
und Tonge. Harrison. Knowles und Higgins. FEBS Leu.. 58. 293-299 (1975) und Methylococcus capsulatus
(Bath) (Colby und Dalton, J. Blochem.. 171. 461-468 (1978) und Colby, Stirling und Dalton, J. Biochem 165
395—»02 (1977)].
Es wurde nun gefunden, daß Epoxide von C.-G-n-Alkcnen. Butadien oder deren Gemische, insbesondere
Propylenoxid, nach einem energiearmen Intensivverfahren hergestellt werden können, bei dem C-G-n-Alkene
oder Butadien oder deren Gemische mit Sauerstoff in Gegenwart von Mikroorganismen oder aus diesen starrtmenden
Enzympräparaten In Berührung gebracht werden. Das erfindungsgemäße Verfahren ist dadurch gekennzeichnet,
daß das Alken oder Butadien oder Gemisch der Olefine mit den Zellen von obligaten oder fakultativen,
methylotrophen Mikroorganismen, die In einem Methan und Sauerstoff enthallenden mineralischen Nährmedium
kultiviert worden sind, oder daraus stammenden Enzympräparaten, die gegebenenfalls in immobilisierter
Form verwendet werden, in Berührung gebracht wird. Die bei dem Verfahren verwendeten Mikroorganismen
stammen vorzugsweise aus den Arten Methylosinus, Methylocystls, Methylomonas. Methylobacier, Methylococcus
und Methylobacterium.
Anders als beim silberkaialysierten »Direkloxydatlons-«Verfahren zur Herstellung von Äthylenoxid wurde
ferner gefunden, daß die mit Methan gezüchteten methylotrophen Mikroorganismen oder ein daraus stammendes
Enzympräparat :r-Olefine mit zwei bis vier Kohlenstoffatomen und Butadiene zu epoxydieren vermögen,
nicht aber C5 + -^-Olefine (zumindest In Mengen, die durch gewöhnliche analytische Methoden leicht nachzuweisen sind). Als bevorzugte Ausführungsform werden die Methan-Induzlerten methylotrophen Mikroorganismen
oder die daraus stammenden Enzympräparat zur oxydativen Umwandlung von Propylen in Propylenoxid
verwendet.
Der Ausdruck »Mikroorganismus« wird hler in seinem breitesten Sinne verwendet und umfaßt nicht nur
Bakterien, sondern auch Hefen, fadenförmige Fungi. Actinomyceten und Protozoen. Vorzugsweise umfassen die
Mikroorganismen Bakterien und Insbesondere bevorzugt die zur Methan-Oxydation befähigten Bakterien.
Der Begriff »Enzympräparat« soll sich auf jedes Mittel beziehen, das die gewünschte cnzymatische Oxygenase-Aktivltät
zeigt. Der Begriff soll sich zum Beispiel auf ganze lebende Zellen, getrocknete Zellen, Zellenextrakte
und gereinigte und konzentrierte, aus diesen Zellen stammende Präparate beziehen. Enzympräparate
können entweder in trockner oder flüssiger Form vorliegen. Der Begriff umfaßt auch die immobilisierte Form
des Enzyms, zum Beispiel die ganzen Zellen des mit Methan gezüchteten Mikroorganismus oder Enzymextrakte,
die an eine unlösliche Matrix durch kovalente chemische Bindungen, Sorption und Einschluß des
Enzyms in einem Gelgitter mit genügend großen Poren für freien Durchgang der Moleküle des Substrats und
des Produkts, aber genügend kleinen Poren /.um Zurückhalten des Enzyms unbeweglich gemacht oder gebun- tf
den sind. Der Begriff »Enzympräparat« schließt auch Enzyme ein, die In Hohlfasermembranen zurückgehalten
sind (Rony-Blotechnology and Bloenglnecring, Juni 1971).
Der Begriff »Teilchenfraktion« bezieht sich aiii die Oxygcnasccnzym-Akilvitat in dem ausgefällten oder sedimenüerten
Material, wenn die überstehende Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren aufgebrochener Zellen bei
10 000 g für 30 min 1 h bei 10 000 g oder darüber zentrifugiert wird.
Zur Erfindung gehören die folgenden Merkmale:
Die Isolate Methan-verbrauchender Mikroben gemäß der Erfindung umfassen notwendige (Typ I und Typ H)
und fakultative Bakterien sowie neue, Methan-verbrauchcnde Hefen.
Neben Ihrer Fähigkeit zur Oxydation von Methan zu Methanol oxydleren Ruhezell-Suspenslonen mehrerer
unterschiedlicher Typen von mit Methan gezüchteten Bakterien (zum Beispiel Typ I, notwendig; Typ II,
notwendig) und fakultativ C2-C4-n-Alkene und Butadien zu Ihren entsprechenden 1.2-Epoxlden.
Die Produkt-1,2-Epoxide werden Im Stoffwechsel nicht weiter umgesetzt und sammeln sich extrazellulär an.
Mit Methanol gezüchtete Zellen zeigen weder Epoxydatlons- noch HydroxyllcrungsakUvität. Unter den gasförmigen
Substrat-Alkenen wird Propylen mit der höchsten Rate oxydiert.
Methan hemmt die Epoxydation von Propylen.
Die Stöchlometrle des Verbrauchs von Propylen und Sauerstoff und die Produktion von Propylenoxid ist
Ergebnisse aus Hemmstudien zeigen an, daß das gleiche Monooxygenase-System sowohl die Hydroxyliemngsals
auch die Epoxydatlonsreaktlonen katalysiert.
Sowohl die Hydroxyllerungs- als auch die Epoxydatlonsaktivltät sitzt in der zeilfreien (Enzymextrakt) Teilchenfraktlon,
die zwischen 10 000 und 80 000 g für 1 h ausgefällt oder sedimentlerl wurde.
Zellfreie Teilchenfraktionen aus den obligaten und fakultativen methylotrophen Mikroorganismen katalysieren
die Hydroxylierung von Methan zu Methanol und die Epoxydation von C2-C4-n-Alkenen und Dienen (zum
Beispiel Äthylen, Propylen, 1-Buten und Butadien) In Gegenwart von Sauerstoff und reduziertem Nicotinamidadenin-dinucleotid
(NADH) und die Hydroxylierung von C-CVn-Alkanen (zum Beispiel Methan. Äthan ω
Propan und Butan).
Die Hydroxyllerungs- und die Epoxydalionsaktivllät von mil Methan gezüchteten Methylotrophen gehen bei
Lagerung gleichzeitig verloren und werden durch verschiedene nieiallblndende Mittel stark gehemmt.
Die Slöchlometrle des Verbrauchs des Substrats (Propylen oder Methan), von Sauerstoff NADH und die
Produktblldung erwies sich als annähernd 1:1:1:1. ' <,s
Das von R. Whlttenbury, K. C. Phillips und J. F. Wilkinson |J. Gen. Microbiology. 61, 205-218 (1970)!
(nachfolgend Whittenbury et al.) vorgeschlagene Klasslflkatlonssystcm Methan-oxydierender Bakterien Ist das
derzeit angewandte und am meisten verbreitete und anerkannte System. In diesem Klassifikatlonssvstem sind
die morphologischen Eigenschaften Methan-verbrauchender Bakterien In fünf Gruppen unterteilt. Diese sind
Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas. Methylobacter und Methylococcus. Bakterien dieser fünf von
Whittenbury et al. berichteten Gruppen verwerten Methan, Dimethyläther und Methanol für die Wachstumsenergie, und sie wurden alle als strikt aerob und Gram-negativ berichtet. Sie zeichnen sich auch dadurch aus.
daß sie nicht Endosporen bilden, das heißt die Fähigkeit zur Bildung von Zysten und Exosporer. mit komplexer
Feinstruktur und komplexer Inneistruktur.
Nach einer Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, daß von Whitienbury et al. beschriebene Mikroorganismen,
wenn sie In Gegenwart von Methan gezüchtet werden, niedere a-Olefine, insbesondere Propylen, in
Gegenwart von Sauerstoff zu epoxydieren ve mögen. Diese Methan-verwertenden Mikroorganismen sind im
ίο allgemeinen als »Methylotrophe« bekannt. Das Enzymsystem oder die aus diesen Mikroorganismen stammenden
Präparate werden hier als »epoxydierendes Enzymsystem« bezeichnet, das vermutlich eine »Methan-monooxygenase«
und/oder eine »Methan-hydroxylase« ist. So versteht sich, daß das Enzymsystem oder die hler als
»Alken-epoxldase« oder »Propylen-epoxldase« bezeichneten Enzympräparate, zur Umwandlung der a-Oleflne in
1,2-Epoxide verwendet, das »epoxydierende Enzymsystem« ist bzw. sind, von denen angenommen wird, daß sie
Methan-monooxygenase- oder Methan-hydroxylase-Enzyme sind.
Die von Whittenbury et al. (deren Offenbarung hier einbezogen wird) berichteten methylotrophen Mikroorganismen
kommen für die Verwendung bei der praktischen Durchführung der Erfindung in Betracht. Insbesondere
sind die !n Tabelle 4, Seite 214 der Veröffentlichung von Whittenbury et al. erwähnten methylotrophen
Mikroorganismen verwendbar, das heißt, solche Mikroorganismen, die identifiziert sind als Methylosinus
Μ trichosporlum, Methylosinus sporium, Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Methylomonas albus,
Methylomonas streptobacterium, Methylomonas agile, Methylomonas rubrum, Methylomonas rosaceus, Methylobacier
chroococcum, Methylobacter bovis, Methylobacter capsulatus, Methylobacter vinelandli, Methylococcus
capsulatus und Methylococcus capsulatus, Stamm Texas, erwähnt von D. W. Ribbons, J. Bacterlol., 122,
1351-1363 (1975), und Methylococcus minimus. Diese methylotrophen Mikroorganismen können in Form ihrer
ganzen Zellen. Enzymextrakie oder Immobil gemachten Präparate solcher ganzen Zellen oder Enzymextrakte,
unbeweglich gemacht zum Beispiel durch die Verwendung von DEAE-Ccllulose oder lonenaustauscherharz oder
porösen Aluminiumoxidträgern, verwendet werden.
Subkulturen einiger von Whittenbury et al. beschr'ebener melhylotropher Mikroorganismen sind bei der
amtlichen Hinterlegungsstelle des United States Department of Agriculture, Agriculture Research Service,
Northern Regional Research Laboratory. Pcorla, Illinois 61604. jeweils durch Hinterlegen von Subkulturen
hinterlegt worden und haben von der Hiniesicgungsslelle die einzelnen, nachfolgend angegebenen NRRL-Stammbezeichnungen
erhalten. Diese Subkulturen sind nach den Bestimmungen des Department of Agriculture
ohne jegliche Beschränkung hinterlegt worden, so daß vermehrungsfähiges Material dieser Stämme für die
Öffentlichkeit zur Verfügung steht, auch, aber nicht ausschließlich, für Bürger der Vereinigten Staaten von
Amerika und solche der Bundesrepublik Deutschland. Stämme hinterlegler methylotropher Mikroorganismen
sind wie folgt bezeichnet:
Kultur Bezeichnung des
DSDA Agricultural
Research Service
Research Service
Metlwlosinus trichosphorium OB3B NRRL B-11.196
Methylosinus sporium 5 NRRL B-11.197
Methylocystus parvus OBBI' NRRL B-11.198
Methylomonas methanica S, NRRL B-11.199
Methylomonas ;ilbus BCiS NRRL B-11.200
Mcthvlobacler capsulatus Y NRRL B-! 1.201
Vermehrungsfähiges Material dieser Stämme steht jedermann auf Anfrage ohne jegliche Beschränkung der
Verfügbarkelt zur Verfügung. Subkulturen der vorgenannten Stämme wurden anfangs von R. Whittenbury,
Department of Biological Sdenec, University of Warwick, Warwickshire, Coventry, England, erhalten.
Die morphologischen und taxonomlschen Merkmale und Eigenschaften der vorerwähnten mcthyloirophen
Stämme sind wie folgt:
Methylosinus irichosporlum OB3b NRRL B-Il.196
produziert we'ße Kolonien auf Sal/agarplaitcn In Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind
beweglich, st^bchenformlg. Gram-negativ und aerob. Häufig werden Rosetten ausgebildet. Hai eine Membranstruktur
Typ M.
Mcihylosinus sporium 5 NRRI. B-Il.197
produziert w^llJe Kolonien auf Sal?ugarphticn In Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind
beweglich. sUibchcnfornilg, Gram-ncgailv und aerob. Häufig werden Rosetten ausgebildet Organismen bilden
Exosporcn. die wärmebeständig sind: Sporen gingen von den keine llagcllen tragenden Polen der Organismen
ab, die Vibrlo-F'orm annahmen. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol unterhalten das
Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ II.
Mcthylocystls parvus OBBP NRRL B-Il.198
produziert weiße Schlclm-Kolonlcn auf Salzagarplatlen In Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen
sind unbeweglich, von der Form des Coceo-Bazlllus,. Gram-negativ und aerob. Organismen bilden Zysten,
die liegen Auslrocknimg bcslilndlg, aber nicht wärmebeständig sind. Wuchst auf Kosten von Methan oder
Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol !Ordern das Wachstum nicht. Besli/t
eine Membranstruktur Typ II.
Mcthylomonas mcthanlca S1 NRRL B-11.199
produziert rosafarbene Kolonien auf Salzagarplallen In Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen
sind beweglich, stäbchenförmlg. Gram-negativ und aerob. Bildet schleimige Kapseln. Sie wachsen auf Kosten i>
von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern das Wachstum
nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
Mcthylomonas ilbus BG8 NRRL B-11.200
produziert weiße Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind
beweglich, stäbchenförmlg. Gram-negativ und aerob. Bildet schleimige Kapseln. Wachst auf Kosten von Methan
und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern das Wachstum nicht.
Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
Methylobacter capsulatus Y NRRL B-11.201
produziert weiße bis braune Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen
sind beweglich, släbchenförmlg. Gram-negativ und aerob. Bildet schleimige Kapseln. Wächst auf
Kosten von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern das 3»
Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
Kürzlich offenbarten Patt, CoIe und Hanson [International J. Systematic Bacteriology 27, (2) 226-229 (1976)],
daß methylotrophe Bakterien solche Bakterien sind, die unter Verwendung von Kohlenstoffverbindungen mit
einem oder mehreren Kohlenstoffatomen, aber ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, nicht-autotroph wachsen
können. Patt et al. haben vorgeschlagen, daß Methylotrophe als »obligat« angesehen werden sollten, wenn
sie nur Kohlenstoffverbindungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (zum Beispiel Methan, Methanol,
Dlmethyläther, Methylamine usw.) als einzige Quellen für Kohlenstoff und Energie verwerten können, während
»fakultative« Methylotrophe solche Mikroorganismen sind, die Verbindungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
und komplexe Verbindungen mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als einzige Quellen für
Kohlenstoff und Energie verwerten können. In ihrer Veröffentlichung offenbarten Patt et al. ein Methan-oxydierendes
Bakterium, das sie als Mcthylobacterlum organophilum sp nov. (ATCC 27 886) Identifizierten. Dieses
Bakterium unterscheidet sich vermutlich von allen zuvor beschriebenen Gattungen und Arten Methan-oxydierender
Bakterien aufgrund der Fähigkeit zur Verwertung einer Vielzahl organischer Substrate mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
als Quellen für Kohlenstoff und Energie.
Als weitere Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, daß dieser Mikroorganismus (Methylobacterium
organophilum sp nov. ATCC 27 886) und andere fakultativ methylotrophe Mikroorganismen auch C2-C4-Alkene
zu epoxydleren vermögen. Mit anderen Worten, sie besitzen Alken-epoxidase-Enzymaktivltät, wenn sie in
Gegenwart von Methan gezüchtet werden. Wie oben mit Bezug auf die methylotrophen Mikroorganismen von
Whlttenbury et al. erörtert, können die fakultativ Methylotrophen in Form ihres Rohextrakts (das heißt der
überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugleren der zerbrochenen Zellen für 30 min bei 10 000 g) oder in
unbeweglich gemachte Form gebracht oder !n zeügebundener Form verwendet werden, wenn sie !m erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden sollen.
Weitere bekannte methylotrophe Stämme können Im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, zum
Beispiel Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400) der US-PS 39 30 947 als von dem Fermentation Research
Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry for Industrial Trade and Industry, Chiba,
Japan, frei erhältlich, und Methylococcus 999 der US-PS 40 42 458 mit der NCIB-Zugansnummer 11 083 sowie
Methylomonas SM3 mit der NCiB-Zügarigsnurnrner 11 084 (beschrieben in der niederländischen Patentanmeldung
74/16644).
Bei kommerziellen Verfahren zur Vermehrung von Mikroorganismen muß im allgemeinen stufenweise vorgegangen
werden. Diese Stufen können wenige oder zahlreich sein, je nach der Art des Verfahrens und den Eigen- «>
schäften der Mikroorganismen. Gewöhnlich beginnt die Vermehrung durch Einimpfen von Zellen aus einer
Schrägkultur in ein vorsterilisiertes Nährmedium, das sich gewöhnlich In einem Kolben befindet. In dem
Kolben wird das Wachstum der Mikroorganismen durch verschiedene Maßnahmen gefördert, zum Beispiel
durch Schütteln zur gründlichen Durchlüftung und Einhalten geeigneter Temperatur. Dieser Schritt oder diese
Stufe wird ein- oder mehrmals in Kolben oder Kesseln wiederholt, die die gleichen oder größere Volumina an
Nährmedium enthalten. Diese Stufen können in angebrachter Weise als Kulturentwicklungsstufen bezeichnet
werden. Die Mikroorganismen mit oder ohne begleitendes Kulturmedium aus der letzten Entwicklungsstufe
werden in eine Fermentieranlage großen Umfangs eingeführt oder eingeimpft, um kommerzielle Mengen der
Mikroorganismen oder deren Enzyme zu erzeugen. :i'
Die Gründe für das Züchten der Mikroorganismen In Stufen sind zahlreich, hängen aber in erster Linie von :
den Bedingungen ab, die für das Wachstum der Mikroorganismen und/oder die Produktion Ihrer Enzyme notwendig
sind. Dazu gehören die Stabilität der Mlkororganlsmen, geeignete Nährstoffe, der pH-Wert, osmotische ;,,
> Beziehungen, der Grad der Belüftung, die Temperatur und die Aufrechterhaltung reiner Kulturbedingungen ->·■
während der Fermentation. Beispielsweise können zur Erzielung maximaler Ausbeuten der Alkcn-epoxldase die h
Fermentationsbedingungen In der Endstufe etwas von denen zu ändern sein, die zur Erzielung des Wachstums g
der Mikroorganismen in den Kulturentwicklungsstufen angewandt werden. Die Aufrechlerhaltung der Reinheit jj$
des Mediums Ist auch ein äußerst wichtiger Gesichtspunkt, insbesondere, wo die Fermentation unter aeroben f^
Bedingungen erfolgt, wie Im Falle der methylotrophen Mikroorganismen. Wird die Fermentation anfangs In Jf
einer großen Fermentleranlage gestartet. Ist eine verhältnismäßig lange Zelt notwendig, eine beträchtliche Ausbeute
an Mikroorganismen und/oder Alken-epoxldase-Enzym zu erzielen. Dies erhöht natürlich die Möglichkeit
der Verunreinigung des Mediums und der Mutation der Mikroorganismen.
Die für das Wachstum der methylotrophen Mikroorganismen und zum Einführen des Oxygenase- oder
Epoxydatlons-Enzymsystems verwendeten Kulturmedien bestehen aus anorganischen Phosphaten, Sulfaten und
Nitraten sowie aus Sauerstoff und einer Methanqueiie. Die Fermentation erfolgt im allgemeinen bei Temperaturen
Im Bereich von 5 bis etwa 55C C. vorzugsweise bei Temperaturen Im Bereich von etwa 25 bis etwa 50° C.
Der pH-Wert des Kulturmediums sollte auf einen Wert von etwa 4 bis 9, vorzugsweise von etwa 5,5 bis 8,5 und
insbesondere bevorzugt auf 6,0 bis 7.5 eingeregelt sein. Die Fermentation kann bei Atmosphärendruck durchgeführt
werden, obwohl höhere Drücke bis zu etwa 5 bar (5 al) und darüber angewandt werden können.
Typischerweise werden zum Wachstum der methylotrophen Mikroorganismen und zum Induzieren des
Oxygenase- oder Epoxydations-Enzymsystems die Mikroorganismen in das Medium eingeimpft, das mit einem
methan- und sauerstoffhaltlgen Gasgemisch in Berührung gebracht wird. Methan kann In Form von Naturgas
zugeführt werden. Zur kontinuierlichen Flleßkultur können die Mikroorganismen in jedem geeigneten ange-
-5 paßten Fermentailonsbehälter gezüchtet werden, zum Beispiel einem mit Prall- oder Leitflächen und Rührer
ausgestalteten Fermentator oder einem gespülten Turmfermenlator. der entweder mit Innenkühlung oder einer
äußeren Rückführkühlschleife ausgestattet lsi. Frisches Medium kann kontinuierlich in die Kultur mit
Geschwindigkeiten entsprechend 0,02 bis 1 Kulturvolumen pro Stunde eingepumpt werden, und die Kultur
kann mit solcher Geschwindigkeit entfernt werden, daß das Kullurvolumen konstant bleibt. Ein Gasgemisch,
das Methan und Sauerstoff und möglicherweise Kohlendloxid oder andere Gase enthält, wird mit dem Medium
vorzugsweise durch kontinuierliches Durchpcrlcn durch einen Sprinkler am Boden des Behälters In Berührung
gebracht. Die Quelle für Sauerstoff für die Kultur kann Luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte Luft
sein. Verbrauchtes Gas kann oben aus dem Behälter entfernt werden. Das verbrauchte Gas kann entweder über
eine Außenschleife oder intern mit Hilfe eines Gaszufuhrgebläscs In Umlauf gesetzt werden. Die Gasströme und
das umgewälzte Gas sollten so eingestellt werden, daß sich maximales Wachstum des Mikroorganismus und
maximale Methanausnutzung ergibt.
Das Oxygenase-Enzymsystem kann, wie oben beschrieben, als Rohextrakt oder als zollfreie Teilchenfraktion,
das heißt das Material, das sich bei einstündigem Zentrifugieren mit 10 000 g oder darüber der überstehenden
Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren gebrochener Zellen für 30 min bei 10 000 g abscheidet oder sedimentiert,
erhalten werden.
Die Mikroben-Zellen können aus dem Wachstunismedium nach irgendeiner der gewöhnlich verwendeten
Standardtechniken geerntet werden, zum Beispiel durch Ausflockung, Sedimentation und/oder Fällung mit
anschließendem Zentrifugieren und/oder Filtrieren. Die Biomasse kann auch getrocknet werden, zum Beispiel
durch Gefrier- oder Sprühtrocknen, und kann in dieser Form zur weiteren Verwendung bei der Epoxydationsreaktion
verwendet werden. Wird das zellfreie Enzym verwendet, können NADH und ein Metall (zum Beispiel
Kupfer oder Eisen) zugesetzt werden, um die Enzymaktivität zu steigern.
Zur praktischen Ausführung der Erfindung wird ein Oxygenase-Enzymsystem erhallen, wie zum Beispiel In
der oben beschriebenen Weise, das Methan in Methanol unter oxydatlven Bedingungen überführt. Die Quelle
für das Enzym ist nicht kritisch, vorzugsweise wird aber ein solches Präparat aus einem der fünf Gattungen der
in der Veröffentlichung von Whittenbury et al. offenbarten Mikroorganismen oder aus einem der fakultativ
Methylotrophen (Methylobacterlum) und Züchten des Mikroorganismus In einem Methan und Sauerstoff
enthaltenden Nährmedium, wie oben beschrieben, erhalten. Das Nährmedium kann das sein, das von Whittenbury
et al. beschrieben wurde, oder noch mehr bevorzugt das Kulturmedium, das von Foster und Davis.
J. Bacteriol. 91, 1924-1931 (1966) beschrieben wurde. Das Enzympräparat wird dann mit einem C2-Cj-Alken,
zum Beispiel Äthylen, Propylen, Buten-1 oder konjugiertem Butadien oder deren Gemischen in Gegenwart von
Sauerstoff in einer Pufferlösung oder in einem Nährmedium In Berührung gebracht (zum Beispiel kann das gleiche
Nährmedium, das zur Erzeugung des Mikroorganismus verwendet wird, verwendet werden, mit der
Ausnahme, daß das Olefin durch Methan ersetzt wird), und das Gemisch wird inkublert, bis der gewünschte
Umwandlungsgrad erzielt ist. Darauf wird das Epoxld durch herkömmliche Maßnahmen, zum Beispiel Destlllation
usw., gewonnen.
Um den notwendigen, wirksamen Kentakt von Sauerstoff und Enzym zu erleichtern oder zu ermöglichen (ob
es nun ein Enzympräparat oder meihylotrophc Mikroorganismen sind), wird zur Erzielung bester Ergebnisse
vorzugsweise ein starker, fein zerteilter Luftstrom In eine kräftig gerührte Dispersion des Olefins Im Epoxydationsmcdlum
eingeführt, das Im allgemeinen Wasser und einen Puffer enthält und In dem das Enzympräparat
oder die Mikroorganismenkultur suspendiert lsi. Das F.nzympräparat kann dann vom flüssigen Medium abgetrennt
werden, vorzugsweise durch Filtrieren oder Zentrifugieren. Das anfallende Epoxid kann dann im allgemeinen
erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise, halbkontinuierlich, kontinuierlich, im Gleichstrom oder
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise, halbkontinuierlich, kontinuierlich, im Gleichstrom oder
• im Gcgcnsironi durchgeführt werden. Ciegcbenenfalls wird die Suspension, die das Enzympräparat oder methy-
lotrophe Mikroorganismen und eine Pufferlösung enthüll, unter kräftigem Rühren Im Gegenstrom zu einem in
■ einem Rohrreaktor aufsteigenden Luftstrom nach unten geführt. Die obere Schicht wird von der nach unten
- fließenden Suspension entfernt, während Kultur- und zurückbleibende Pufferlösungsbestandteile, zumindest teil-
y weise, mit weiterem Olefin und unter Zugabe von frischem Enzympräparat oder methyloirophem Mikroorganis- <
H mus, je nach Bedarf, rückgefühn werden.
j| Das Wachstum der melhylotrophen Mikroorganismen und der EpoxydatlonsprozeU können bequemerweise
C' durch gleichzeitiges Durchführen, aber getrennt und unter Anwendung einer viel stärkeren Belüftung beim
;; Epoxydationsprozeß (zum Beispiel mit einem l.uftüberschuß von wenigstens dem zweifachen dessen, was für
ji, das Wachstum erforderlich ist, vorzugsweise mit wenigstens fünffacher Belüftung) gekoppelt werden. Sowohl in
V der Wachstumsprozeß als auch der EpoxydatlonsprozeU können Im gleichen Reaktor aufeinanderfolgend oder
^ gleichzeitig durch wechselnde Anwendung normaler und starker Belüftung durchgeführt werden.
& Die Erfindung wird durch die folgende Beispiele weiter veranschaulicht, die jedoch in keiner Welse
einschränkend zu sehen sind. Alle Teile und Prozentsätze, sofern nicht ausdrücklich anders angegeben beziehen
sich auf das Gewicht. '
Es wurde ein Nährmedium, wie von Foster und Davis, J.Bacterlol. 91, 1924-1931 (1966) beschrieben, mit
folgender Zusammensetzung pro Liter hergestellt: M
Na2HPO4 0,21 g
NaH2PO4 0,09 g
NaNO, 2,0 g
MgSO4 7H2O 0.2 g
KCI 0,04 g ,<
CaCl2 0,015 g
FeSO4 ■ 7H2O 1,0 mg
CuSO4-5H2O 0,01 mg
H1BO4 0,02 mg
MnSO4-5H2O 0,02 mg
ZnSO4 0,14 mg
MoO, 0,02 mg
Der pH-Wert des Nähmnedlums wurde durch Zugabe von Säure oder Base auf 7,0 eingestellt, und 50 ml-Teiimengen
des Nährmediums wurden in eine Reihe von 300-ml-SchütteIkolben gegeben. Die Schünelkolben
wurden mit einer Inokulationsschleife mit Zellen von einer Agar-Platte mit homogenen Kolonien der Mikroorganismen
auf der Platte beimpft (die Reinheit der Isolate wurde durch mikroskopische Prüfung bestätigt). Die
Isolate waren auf Agar-Platten unter einer Atmosphäre aus Methan und Luft mit einem 1 : 1 Vol/Vol-Gasverhältnls
gehalten worden, die alle zwei Wochen übertragen worden waren. Die Gasphase der beimpften Kolben
wurde dann durch ein Gasgemisch aus Methan und Luft mit einem Verhältnis von 1:1 auf Volumen/Volumen-Basls
ersetzt. Die beimpften Kolben wurden luftdicht verschlossen und auf einem Rotailonsschüttler mit
einem Orbitalradius von 2,5 cm bei 250 UpM und bei 30° C zwei Tage Inkubiert, bis sich die Trübung des Mediums
entwickelt hatte.
Die Zellen wurden durch 30m!nüt!gcs Zentrifugieren bei 4° C und 10 000 g gesammelt. Der. Zellklumpen
wurde zweimal mit einem 0,15 m PhosphatpulTcr beim pH 7,0 (mit 0,002 m MgCl2) gewaschen. Die gewaschenen
Zellen wurden dann In einem 0,15 m Phosphalpuffer bei pH 7.0 suspendiert.
^ Ein 0,5 ml-Antell einer jeden gewaschenen Zellsuspension (2 mg Zellen) wurde In 10 ml-Glasröhrchen bei
4° C gebracht, die mit einem Gummistopfen verschlossen wurden. Die Gasphase der Glasröhrchen wurde durch
Vakuum entfernt und dann durch ein Gasgemisch aus Alken und Sauerstoff Im Volumenverhälinis 1 : 1 ersetzt.
Dann wurde bei 300C an einem Rotationsschüttler mit 300 UpM Inkublert. Produktproben (3ul) wurden mit
einer Mikrosprltze periodisch entnommen und die Produkte gaschromatographlsch analysiert (Ionisatlonsfiammendetektorsaule).
Tabelle I zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation
von Propylen durch gewaschene Zellsuspensionen mehrerer Mikroorganismen, deren Stämme nach der oben
beschriebenen Versuchsarbeitsweise mit Methan gezüchtet worden waren. Aus diesen Daten 1st zu ersehen, daß
die mit Methan gezüchteten Mikroorganismen, die Methan zu Methanol zu hydroxylieren vermögen, auch
Propylen In Propylenoxld überführen können.
Umwandlungsgeschwindigkeilen für die Mclhö
Hydroxylierung und die l'ropylcn-lipoxydation
Mikroorganismus Stämme s)
UmwiindlunpSBcschwindigkcilcn
(μΜοΙ/h/nij;
l'rolcin) ·')
Hydroxy- l'riipylenoxid
11L'in ng
Mclhylosinus Irichüsporium
OB3b (NRRI. B-I 1.196)
Methylosinus sporium 5 (NRRL B-! 1.197)
Methylocystis parvus OBBP (NRRL B-II. 198)
Methylomonas methanicu Si
(NRRL B-11.199)
Methylomonas albus BG8 (NRRL B-11.200)
Methylobaclcr capsulalus Y (NRRL B-11.201)
Methylobacterium organophilum XX (ATCC 27.886)
·') Die Produkte Mvihiinnl und l'ropylenoxid wurden gaschnimulisch
durch Vergleich der Relentionszcitcn mil aulhentisch.cn
Standard-Proben idenlifi/ierl.
h) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0.2 g/100 ml Kulturbrühc.
| 1,5 | 3,6 |
| 1,1 | 2,0 |
| 0,7 | 1,6 |
| 1,3 | 2,7 |
| 1.8 | 1,4 |
| 1,2 | 1,5 |
| 1,0 | 1.8 |
Tabelle II zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Hydroxylierung von Methan und Epoxydation
von Propylen (aus Tabelle I) und die Epoxydation von Äthylen, Butcn-1 und Butadien durch gewaschene Zellsuspensionen
von zwei Mikroorganismusstämmen, die nach der oben beschriebenen Versuchsarbeitsweise mit
Methan gezüchtet worden waren. Diese mit Methan gezüchteten Mikroorganismen produzierten bei Berührung
mit Penten-1 und Hexen-1 in Gegenwart von Luft kein nachweisbares Epoxid. Den Daten ist auch zu entnehmen,
daß die Umwandlungsgeschwindigkeiten für Propylen In Propylenoxid für die jeweiligen mit Methan
gezüchteten Mikroorganismen höher waren als für die anderen Umwandlungen.
Umwandlungsgeschwindigkeiten fur die Methan-Hydroxylierung und die
Epoxydation von a-Olefincn
Umwandlungsgeschwindigkeiten (μΜοΙ/h/mg Prolein (;l)
Methan Äthylen Propylen Bulen-1 Butadien Pcntcn-1 Hcxcn-1
Mikroorganismus Stämme h)
oxid
oxid
Kpoxybutan
Kpoxybuten
Epoxypenlan
Epoxyhexan
Methylosinus tri- 1,5 1,9 3,6 0,45 2,6 0 0
chosporium OB3b (NRRL B-11.196)
Methylosinus -1,8 1,1 2,0 0,8 1,5 0 0
sporium 5 (NRRL B-11.197)
") Die Produkte wurden gaschromalographisch durch Vergleich der Rclcnlionszcilcn mti authentischen
Standardprnbcn identifiziert (die l'rnduklidcnlifizicrung wurde ergänzt durch die Feststellung des Vorhandenseins oder Fehlens von Produktpeaks vor und nach der Bromicrung oder sauren Hydrolyse.
Die Analyse zeigte auch. d.iB keine weitere Oxydation des F.poxidprodukts eintrat).
"1 Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0.2 g/100 ml Kulturbrühe.
Die oben beschriebene Versuchsarbeitsweise wurde im Falle der Stämme Methylocystis parvus OBBP (NRRL
B-I). 198), Methylomonas mcthanlca Si (NRRL B-11.199) und Methylomonas albus BG8 (NRRL B-U.200)
wiederholt, and gewaschene Zellsuspensionen dieser mit Methan gezüchteten Mikroorganismen wurden erfolgreich zur Umwandlung von Äthylen In Äthylenoxid mit Umwandlungsgeschwlndlgkeiien von 0,9, 0,95 und 1,2
μΜοΙ/h/mg Protein bei einem Trockengewicht der Zellen von 0,2 g/100 ml der Kulturbrühe verwendet.
Wie oben gezeigt, wurde ein neues Verfahren gefunden, wonach Propylenoxid durch Inkubieren von Propylen
in Gegenwart von Zellen oder zellfreien Extrakten von Mikroorganismen (oder daraus entstammender·. Enzymen), die in Gegenwart von Methan gezüchtet worden sind, erhalten wird. Diese Mikroorganismen vermögen
bekanntlich kurzkettige Alkane zu hydroxylieren (zum Beispiel Methan zu Methanol), und manche Forscher
haben vermutet, sie könnten in der Lage sein, Äthylen zu epoxydleren. Es wurde nun gefunden, daß diese mit
Methan gezüchteten Mikroorganismen und deren Enzympräparate die Fähigkeit haben. Propylen mit verhältnismäßig höheren Umwandlungsraten als im Falle von Äthylen, Buten-1 und Butadien, zu epoxydieren. In Ansatzversuchen unter Verwendung gewaschener, mit Methan gezüchteter Zellen verläuft die Epoxydationsreaktion
wenigstens zwei Stunden linear. Eine weitere Oxydation des Epoxid-Produkts wurde nicht nachgewiesen.
Das Epoxydations-Enzymsystem der mit Methan gezüchteten Mikroorganismen ist (durch das Methan) induzierbar, und das Epoxid-Produkt sammelt sich cxlrazellulär an (das heißt nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert, und das Epoxlfi-Produki fand sich nur In der überstehenden Flüssigkeitsfraktion und
nicht In dem Zellkuchen). Die Möglichkeit des Vorliegen;, von Propanal als Oxydationsprodukt des Propylene
wurde als Ergebnis einer Gas/Flüsslgkclts-chromatographischen Analyse ausgeschaltet.
Bei vergleichenden Versuchslests besaßen gewaschene Suspensionen der mit Methanol gezüchteten Mikroorganlsmenstamme Methyloslnus trtchosporium OB3b (NRRL B-11.196), Melhylocysils parvus OBBP (NRRL B-11,198), Methylomonas methanlca S1 (NRRL B-U.199) und Mcthylobwrter capsulatus Y (NRRL B-11.201) nicht
die Fähigkeit, Methan zu hydroxylieren, oder die Fähigkeit, Cj-O-Alkene. insbesondere Propylen, zu epoxydleren. Daraus ergibt sich, daß nur die mit Methan gezüchteten Mikroorganismen sowohl Methan-Hydroxyllerungs- als auch C2-C4-Epoxydatlonsvermögen besitzen.
Wie zuvor angegeben, können sowohl die ganzem Zellen als auch die zellfreien Extrakte mit Oxygenaseenzym-Aktlvltät der mit Methan gezüchteten Methylotrophcn bei den Hydroxylierungs- und Epoxydatlonsreaktlonen In Gegenwart von Luft verwendet werden. NADH und Metall (Elsen oder Kupfer) können zugesetzt
werden, urn die Aktivität zu verstärken, wenn die zellfreien oder reinen Enzympräparate verwendet werden. Bei
Verwendung des zellfreien Enzymsystems gemäß der Erfindung wurden die Enzympräparate wie folgt hergestellt:
Organismen wurden in 2,81-Kolbcn mit 700 ml Mineralsalzmedlum. wie In Beispiel 1 beschrieben, mit M
Methan (Methan und Luft Im Volumenvcrhültnis 1 :1) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet.
Zellen wurden während des exponentlellen Wachstums durch I5mlnüilges Zentrifugleren bei 12 000 g und 40C
gewonnen. Sie wurden zweimal mit 25 mmol Kallumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 5 mmol MgCIi gewaschen und
Im gleichen Puffer suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden bei 4° C durch einen einzigen Durchgang durch
eine Französische Druckzelle (1034 bar bzw. 15 000 lb/lnJ) zerstört und 15 min bei SOOOg zentrifugiert, um ·»
nlcht-aufgebrrchene Bakterien zu entfernen. Die überstehende Lösung (Rohextrakt) wurde dann 30 min bei
40 000 g zentrifugiert und lieferte eine Teichen-P(40)- und lösliche S(40)-Fraktlon. Die S(40)-Frakllon wurde
anschließend 60 min bei 80000 g zentrifugiert und lieferte eine Tellchenrraktlon P(80) und eine lösliche Fraktion S(80). Die Teilchenfraktionen P(40) und P(80) wurden In 25 mmol Kallumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 5
mmol MgCl2 suspendiert und bei 4° C homogenisiert.
Enzymlest
Die Oxydation von Methan und Propylen durch Tellthcnfraktionen P(40) und P(80) und die lösliche Fraktion
S(80) wurde bei j0"C durch Bestimmung der Produktion von Methanol b/w. Propylenoxid gemessen. Die Reak- so
tionsgemlsche enthielten In 1,0 ml: 150 mMol Kallumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 5 mMol MgCI2, 0,6 ml;
10 μΜοί NADH und Zellfraktion.
Reaktionsgemische waren In 10 ml-Probenröhrchen bei 4" C enthalten. Diese wurden mit Gummikappen
verschlossen. DIc Gasphase in den Probenröhrchen wurde mil Vakuum abgesaugt und dann durch ein Gasgemisch aus Methan oder Propylen und Sauerstoff Im Volumcnverhällnis I : I ersetzt. Die Oxydation anderer
gasförmiger n-Alkane und n-Alkene wurde untersucht, wie oben beschrieben. Für flüssige Substrate wurden
10 μΐ Substrat direkt verwendet. Probenröhrchen wurden dann bei .10" C auf einem RotallonsschUttler bei 200
UpM Inkubiert.
Die Produkte der Epoxydatlon von n-Alkcncn und die Hydroxylierung von n-Alkanen wurde durch
Flammenlonlsatlonsgaschromatographle unter Verwendung einer rostfreien Slahlsäule (3,65 m χ 3,2 mm bzw. 12' w
χ 1/8"). gepackt mit 101V, Carbowax 20M auf 80/100 Chromosorb W und einer Porapak Q-Saule geprüft. Die
Säulenlemperalur wurde bei 120" C konstant gehalten. Die Trilgergasslrömungsgeschwlndlgkelt betrug 30
ml/mln Helium. Die verschiedenen Produkte wurden durch Vergleich der Rctcnllons/cltcn und gemeinsame
Chromatographie mit authentischen Standardproben identifiziert.
Spezifische Aktivitäten wurden als μηιοΙ der pro Stunde pro mg Protein gebildeten Produkte ausgedrückt. hi
Konzentrationen an Protein In verschiedenen Fraktionen wurden nach der Methode von Lowry et al., J. Biol.
Chem. 193, 265-275 (1951) bestimmt.
Verteilung der n-Alkan- und n-Alken-Oxydationsakl'vitäten In Zellfraktionen
D/ei verschiedene Gruppen Methan-verwertender Organismen wurden ausgewählt, um die Oxydation von n-Alkanen
(Ci-C4) und n-Al'cenen (C2-C4) in zellfreien Systemen zu untersuchen. Zellfraktionen wurden aus obligaten,
Methan-verwertenden Organismen des Typs I, Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL B-IK208) und Methylococcus
capsulatus .'Texas. ATCC !9.069); obligaten, Mctriari-verwericriden Organismen des Iyps U, Methylosinus
trichosporium (OB3b, NRRL B-U.196) und Methylosinus sp. (CRL-15. NRRL B-11.202) und einem fakultativen,
Methan-verwertenden Bakterium, Methylobacierlum sp (CRL-26, NRRL B-11.222), hergestellt.
Tabelle III zeigt die Verteilung der Methan- und Propylcn-Üxydalicnsaktivltät in verschiedenen, aus diesen
Organismen stammenden Fraktionen. Etwa 85 bis 90% der Gesamtaktlvital wurde in der P(40)-Fraktlon und
10% In der P(80)-Fraktlon nachgewiesen. Die lösliche Fraktion S(80) enthielt keine Aktivität. Die spezifischen
Aktivitäten für die Methan- und die Propylenoxydation In den Fraktionen P(40) und P(80) variierte In den
verschiedenen untersuchten Organismen nicht wesentlich (Tabelle IV). Die Epoxydation von Propylen und die
Hydroxylierung von Methan hängen beide vom Vorhandensein von Sauerstoff und NADH ab. NADPH oder
Ascorbat und andere Elektronenlräger könnten auch verwendet werden. Beide Reaktionen waren In den ersten
15 min linear, gensessen durch gaschromatographlschcn Produktnachwcls.
Verteilung der Propylen- und Mcthan-Oxydalionsuktivrtülert in ZellfVuktionen von
Methylotrophen
Mikroorganismus
"Ai Verteilung in der /cIHraktion
l'ropylcn-Kpoxydations- Mclhan-Hydroxylicrungs-
aktivität ·') aktivität ·')
1'(4O) 1'(8O) S(80) P(40) P(80) S(80)
85
Typ 1 Obligate Methylotrophe Melhylomonas sp. (CRL-17. NRRL B-Il 208)
Methyloeoccus capsulatus (Texas, ATCC 19 069)
Typ Il Obligate Methyloirophc Methylosinus sp. (CRL-IS,
NRRL B-Il 202) Melhylosinus trichosporium (OB.lb,
NRRL B-I! 1%) Fakultative Mcthylotrophe 85 Methylobiiclcrium sp. (CRL-26, NRRL B-Il 222)
NRRL B-Il 202) Melhylosinus trichosporium (OB.lb,
NRRL B-I! 1%) Fakultative Mcthylotrophe 85 Methylobiiclcrium sp. (CRL-26, NRRL B-Il 222)
15
89
87
82
13
18
15
87
90
88
88
83
82
82
13
10
12
13 18
') Die Reaktionen wurden wie in limpid I heschriehen durchpclühn. Das Rcaklionsprodukl wurde gaschromaloeraphisch nach 5. Kl und 15 min Inklination des RcaMionsgemischcs hei 300C auf einem
Rcilationsschütller cmiitlell
Geschwindigkeit der Meihan-Mydroxylicrungund Propylcn-Epoxydation in den ZeII-
fraktioncn von Mi/thylotrophcn
/elllraklinn
l'ropylcn-Oxydalions-
aklivilät ")
1'(4(I) 1'(8D) S(80)
Typ 1 Obligater Methylotroph 2.2 2.0
Melhylomonas sp. (CRL-17. NRRI B-Il 208)
Mclln lococL'us capsulalus 2.6 2,0
(Texas. AICC 19 069)
aktivitäi ·')
l'(40) P(SO) S(80)
2,9
2,7
1I Die Ke.iklninen »uidtn »ie in lli-ispiel ! Iv.-sihriehen durthjieliihrl. Das l'riidukl tier Reaktion wurde
(!asehriinaliipraphisdi nach ">. IH und IS nun Inkuhaliun dir Reaklιnnsμemιsehc hei 111" ( aiii einem
RKl.itiiinssi'hullller ermillell Dm: I
>>. vdaiinns^esLhwinilinki-ii isl .iiis^edruekl als ,,Miil l'riidukl pro
SlIlIl(K llll'l III)! I1IdIfHl
Fortsetzung
| Mikroorganismus |
Zellfraklion
Propylcn-Oxydäiiorr aktivität J) P(40) P(«0) |
3,7 | S(SO) |
| Typ II Obligater Methylotroph Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11202) |
3,8 | 2,5 | 0 |
| Methylosinus trichosporium (OB3b, NRRL B-11 196) |
2,8 | 1,1 | 0 |
| Fakultativer Methylol roph Methylobacterium sp. (CRL-26, NRRL B-11222) |
1,2 | 0 |
aktivität J)
P(40) P(80) S(80)
4,8 4,2 0
3,1 3,0 0
2,7 2.8 0
') Die Reaktionen wurden wie in Beispiel I beschrieben xiurchgelLhrt. Das Produkt der Reaktion wurde
gaschromalographisch nach 5. IU und 15 min Inkubation der Reaktionsgemische bei 30° C auf einem
Rolalionsschüllller ermittelt. Die Oxydationsgcschwindigkcil ist ausgedrückt als μΜοΙ Produkt pro
Stunde und mg Prolein.
Die Teilchenfraktionen P(40) und P(80) aus verschiedenen Organismen katalysierten auch die Epoxydation
von anderen n-Alkenen (Äthylen, 1-Buten und 1,3-Butadien) zu den entsprechenden 1,2-Epoxlden und die
Hydroxylierung von Methan und Äthan zu den entsprechenden Alkoholen. Tabelle V zeigt die Oxydaiionsgeschwlndlgkelt
verschiedener n-Alkane und n-Alkene durch die Tcilchecfraktion P(40) von Methyloslnus sp.
(CRL-15, NRRL B-11.202). Das Oxydationsprodukt wurde nach Inkubieren der P(40)-Frakilon mit verschiedenen
Substraten bei 30° C für 10 min gaschromatographlsch Identifiziert.
Oxydat.on von n-Alkcncn und n-Alkcncn durch die
P(40)-Tcilchcnlraktion von Mclhylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11202)
| Substrat | Produkt | Geschwindigkeit der |
| l'roduktbildung ») | ||
| (μΜοΙ/h.'mg Protein) | ||
| Äthylen | Älhylcnoxid | !.27 |
| Propylen | Propylcnoxid | .; |
| 1-Buten | Hpoxybutan | 2,18 |
| Butadien | Kpoxybuten | 0,63 |
| I-Pcnten | - | 0 |
| Methan | Methanol | 4,8 |
| Älhan | Äthanol | 3,2 |
') Die Reaktionen wurden wie in Beispiel I beschrieben durchgerührt. Das Rcaklinnspnulukt wurde gaschrnmulograplmch nach
5. 10 und IS min Inkubation des Reaklionsgemisches hei 3(1°C
auf einem Rolulionsschütllcr ermittelt.
Methyloslnus sp. (CRL-15, NRRL B-11.202) wurde für weitere Studien zum Einfluß verschiedener'Umgebungsfaktoren
auf die Methan- und Propylcn-Oxydatlonsaktlvltäten In zellfreien Systemen ausgewählt.
Einfluß der Konzentration der Tcllchenfrakllon
Der Einfluß der Konzentration der P(40)-Tellchenfraktlon auf die Hydroxylierung von Methan und die
Epoxydation von Propylen wurde untersucht. Die Produktion von Methanol und Propylenoxld war direkt
abhängig von der Konzentration der Teilchenfraktion Im Bereich von I bis 6 mg Protcln/ml. Die Reaktionsgeschwindigkeit
nahm bei weiterer Erhöhung der Konzentration des teilchenförmigen Proteins auf 8 mg/ml ab.
/cltvcrlauf der Reaktionen Die Geschwindigkeit der Bildung von Methanol und Propylenoxld durch Hydroxylierung von Methan bzw.
Epoxydailon von Propylen durch die P(40)-Teilchenfraktlon von Methylosinus sp. (CRL-15. NRRL B-!!.202)
war mil der Zeit bis zu 15 min linear.
Der Einfluß des pH-Wertes
Der Einfluß des pH-Werts der Hydroxylierung von Methan und der Epoxydation von Propylen durch die
P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11.202) wurde durch Ermitteln der nach 10 min
Inkubation des Reaktionsgemischs gebildeten Menge an Methanol und Propylenoxid untersucht Der optimale
pH-Wert sowohl für die Hydroxylierung von Methan als auch die Epoxydalion von Propylen wurde zu 7,0 festgestellt.
Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs
bei 300C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. 1001A, Aktivität entspricht 4,8 bzw. 4,1 μΜοΙ des gebildeten
Methanols oder Prapylenoxids pro Stunde und mg Piotein.
i* Einfluß der Temperatur
Der Einfluß der Temperatur auf die Bildung von Methanol und Propylenoxid durch die P(40)-Teilchenfraktlon
von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11.202) wurde nach lOminütigem Inkubieren von Reaktionsgemischen
bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Die Optimaliemperatur für die Epoxydation von Propylen
-° und die Hydroxylierung von Methan war 35° C. Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen
durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5, 10 und
15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30" C auf einem RotationsschüUler ermittelt. 100% Aktivität
entsprechen 5.0 bzw. 4,2 μΜοΙ des gebildeten Methanols bzw. Propylcnoxlds pro Stunde und mg Protein.
-s l-influß der Lagerung
Es wurde festgestellt, daß sowohl die Aktivität der Hydroxylierung von Methan als auch der Epoxydation von
Propylen durch die P(40)-Teilchcnfraktlon von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-Il.202) bei Kühlschranktemperatur
(0 bis 4° C) gleichzeitig sanken. Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen durchgehe
führt, wie In Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5, 10 und 15 min
Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 C auf einem Rolallonsschüttler ermittelt. 100% Aktivität entsprechen
4,8 bzw. 4,1 μΜοΙ des gebildeten Methanols bzw. Propylenoxids pro Stunde und mg Protein.
Einfluß von Inhibitoren
Es ist berichtet worden, daß die Oxydation von Methan durch Zellsuspcnslonen von Methan-vcrwertenden
Bakterien durch verschiedene nietallb.lndendc oder mctallchclatlsierende Mitte! gehemmt wird [Patel et al., J.
Bacteriol. 126. 1017-1019 (1976)]. Duhcr wurde der Einiluß von Inhibitoren auf Methan- und Propylen-Oxydationsaktivltäten
durch die P(40)-TeilchVnlrak!lon von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11.202) untersucht.
Die Bildung von Methanol und Propylenoxid wurde durch verschiedene metallbindende Verbindungen mit
verschiedenen liganden Kombinationen das heißt Stickstoff-Stickstoff (α,ιΖ-Blpyrldyl), Sauerstoff-Stickstoff (8-Hydroxychinolln:
und Schwefel-Stickstoff (Thioharnstoff, Thiosemicarbazide wie In Tabelle VI gezeigt,
gehemmt. Dies legt die Beteiligung von Metallinncn an der Oxydation sowohl der Hydroxylierung von Methan
als auch der Epoxydation von Propylen nahe. Ähnlich hemmen, wie In Tabelle VIa geze gt. diese Verbindungen
4' auch die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation von Propylen, wenn zellhaltige Enzympräparate
verwendet werden.
11202)
| % Hemmung | ") | Melhan- | |
| Inhibitor | Konzentra | Propylcn- | Hydroxy- |
| lion (Mol) | Epoxydations- | lierungs- | |
| aklivität | aktivilät | ||
| 0 | |||
| Kontrolle | 0 | 99 | |
| α,α-Bipyridyl | ίο--1 | 98 |
on
7\J |
| 1,10-Phcnan- | JO--1 |
ni
7 J |
|
| throlin | 100 | ||
| Kaliumcyunid | K) ' | 98 | 100 |
| Thiosemicarbazid | 10-'97 | 98 | |
| Thioharnstoff | 10-'98 | 80 | |
| 8-Hydroxy | 10 '75 | ||
| chinolin | |||
") Die Reaktionen wurden durchgel'uhrl. wie in Beispiel I beschrieben. D:is Reaktionsprodukt wurde gaschromalographisch nach 5.
und 15 min Inkubation des Reaklionsgemischs hei 30°C auf
einem Rotationsschültlcr ermittelt. Die ungehemmten Oxydationsgeschwindigkeiten liir Methan und Propylen waren 4,5 bzw. 4.1
μΜοΙ gebildetes Methanol bzw. Propylenoxid pro Stunde und mg
Protein in der P(4ü)-I'raktion von Methylosinus ·>ρ. (CRL-15.
NRRL B-Il 202)
| von Methan | % Hemmung | Mclhylococcus | Hydroxy | Melhylobacterium | Hydroxy |
| Methylosinus | cupsulatus | lierung | organophilum | lierung | |
| Inhibitor | trichosporium OB3b | (CRL, Ml, | 100 | (CRL 26. | 100 |
| (NRRLB-Il 196) | 95 | 90 | |||
| 100 | NRRL B-! 1 222) | 100 | |||
| Epoxy- Hydroxy | NRRL B-Il 2i9) | 95 | Epoxy | 100 | |
| dation licrung | Epoxy- | 100 | dation | 95 | |
| 100 100 | dalion | 100 | |||
| Thioharnstoff | 90 92 | 100 | 90 | ||
| 1,10-Phenanthrolin | 100 90 | 95 | 100 | ||
| β,α-Bi pyridyl | 95 90 | 100 | 100 | ||
| imidazo! | 100 100 | 95 | 95 | ||
| Kaliumcyanol | 100 | ||||
Die Reaktionen wurden durchgeftihrl. wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Produkte wurden gaschromatografisch nach 1 h Inkubation bei iü°C ermittelt. Jeder Inhibitor wurde mit einer Endkonientralinn von
mMol zugesetzt.
Da die Methan-mono-oxygenase aus Methan-verwertenden Bakterien ein kupfer- oder eisenhaltiges Protein 1st
[Tonge et al., J. Biochem. 161, 333-344 (1977)], wurde der Einfluß von Kupfer- und Elsensalzen auf die Oxydation von Methan und Propylen durch die P(40)-Teilchenfraktlon von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11.202) untersucht. Die Geschwindigkeit der Hydroxylierung von Methan zu Methanol und der Epoxydation
von Propylen zu Propylenoxid wurde in Gegenwart zugesetzter Kupfersalze zweifach erhöht (Tabelle VII).
13
Einfluß von Metallen auf die Aktivität /or Epoxydation
von Propylen und Hydroxylierung von Methan durch Melhylo-sinus sp. (CRL-15, NRRL B-II 202)
Metall
Kon/.cntra- Propylen- Mcthan-
tiun (Mol) Oxydalions- Oxydations-
akliviliil ■') aktivität ■')
μΜοΙ/h/mg μΜοΙ/h/mg
Protein) Protein)
| Kontrolle | 4,5 | 4,0 | |
| Eisen(lll)ehlorid | 10-·' | 5,8 | 4.8 |
| Eisen(II »sulfat | io-J | 5,9 | 4,8 |
| ΐνυμιυιι i^uiui lu | io-? | 9,2 | 7,2 |
| Kupfer( 11 »sulfat | IO ' | 9,0 | 7,1 |
"I Die Reaktiuncn wurden diirchgclührt. wie in Beispiel 1 beschrieben Das Reaktionsprodukt wurde gaschromalographisch nach
5, IO und 15 mm Inkubation des Kcuklionsgcmischs bei 300C auf
einem Rnlalicinsschütilcr ermittelt. Die Oxydalionsgeschwindigkeitcn wurden als μΜι>Ι des gebildeten Produkts pro h und mg
Protein in der l'(4(l)-l:raklion von Mcthylosinus sp. (CRL-15.
NRRL B-Il 2(12) ausgedrückt
Subsirat-Konkurrenzversuche
Die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydatlon von Propylen durch Tellchenfraktlonen Methanverwertender
Bakterien erfordert Sauerstoff und NADH. Die Frage, ob dasselbe oder ein ähnliches Enzym an
der Oxydation beider Substrate beteiligt ist. wurde durch Substrat-Konkurrenzversuche geprüft. Der Versuch
bestand in der Bestimmung des Einflusses von Methan auf die Oxydation von Propylen zu Propylenoxid durch
die P(40)-Tellchenfraktion von Methyloslnus sp. (CRL-15, NRRL B-11.202). Wie In Tabelle VIII gezeigt, ergab
sich eine Senkung der Menge an in Gegenwart von Methan geUldetcm Propylenoxid. Folglich hemmte Methan
die Umwandlung von Propylen in Propylenoxid, vermutlich durch Konkurrenz um die verfügbare Enzymstelle.
Einfluß von Methan auf die Propylen-Epoxydationsaklivität
durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202)
Substrat
Gebildetes Propylenoxid ■') μΜοΙ/h/mg
Prolein
| Propylen | Methan | (1: | 1 Vol/Vol) | 4,3 |
| Propylen + | 1,8 | |||
| Methan | η | |||
Die Reaktionen wurden wie in licispicl 1 beschrieben durchgeführt. Das Reakiionsproduki wurde gaschromalographisch nach
5. K) und 15 min Inkubation des Reaktionsgcmischs bei 300C auf
einem Rolationsschüttlcr ermittelt.
Ähnlich beeinflußt Methan die Epoxydation von Proyplen aus Zellsuspenslonen von mit Methan gezüchtetem
Mcthylosinus trlchosporluni OB3b (NRRI H-11.1%). wie In Tabelle VIII a ge/eigt.
14
Tabelle Villa
Einfluß von Methan auf die Epoxydution von
Propylen")
Zusammensetzung
der Gasphase
der Gasphase
Gebildetes
l'ropylenoud
(μΜοΙΙ
"n Hemmung
Propylen + Helium + Oj 1,6 (25:25:50 Vol/Vol)
Propylen + Methan + Ch 0,8 (25:25:50 Vol/Vol)
0 50
') Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Ueispic! I beschrieben, mit der Ausnahme, dali verschiedene (ias/usammcnsei/ungcn verwendet wurden, um einen konstanten i'ropyicn-Partiaidruck aufrechtzuerhalten, /cllsuspensicmen von mit Methan
gezüchtetem Mclhylosinus trichospiirium (>B3b (NRRL B-II 196)
(3.6 mg) wurden verwendet. l'ropylenoxid wurde gasehromatographisch nach !5 min Inkubation ermittelt.
Die P(40)-Teilchenfraktion von Mcthyloslnus sp. (CRL-15, NRRL B-11.202) wurde zur Bestimmung der
Stöchiometrle der Hydroxyllerungs- und Epoxydationsrcaktion verwendet. Die Stöchlometrie der Methan- oder
Propylen-abhängigen NADH-Oxydation, der Sauerstoffverbrauch und die Produktbildung waren etwa 1:1:1
(T-.belle IX). Dies steht im Einklang mit der Katalyse der Methan- oder Propylen-Oxydation durch eine Monooxygenase.
Stöchiomctric der Propylcn-Epoxydation und Methan-Hydroxylierung durch die P(40)-Tcilchenfraktion von
Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202)")
Substrat
(μΜο1)
(μΜο1)
Gebildetes
Produkt
(μΜο1)
NAIJH, oxy- Oj verbraucht
dien (μΜοΙ) (μΜοΙ)
| Propylen | Propylenoxid | 4,8 |
| 5,0 | 4,5 5.0 | |
| Methan | Methanol | 4,6 |
| 5,0 | 4.2 4,8 | |
u) Unter identischen Rcaktionsbcdingungcn erfolgte die Hrmiulung
des oxydierten NAI)H spektropho'.ometrisch. die lirmilllung des
verbrauchten Suucrstolis wurde polarogmphisch gemessen und die
[Ermittlung des gebildeten Produkts erfolgte gaschromutographisch.
Vergleichweise wurde die Stöchiometrie der Epoxydation von Propylen durch eine Zeüsuspenslon von Meihyloslnus trichosporlum OB3b (NRRL B-11.196) wie folgt bestimmt: Das Reaktionsgemisch (3,0 ml) enthielt
0,05 m Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, und 3,6 uMol Propylen. Die Reaktion wurde durch Einspritzen von
0,1 ml Zellsuspension (3,1 mg Protein) gestartet. Eine Korrektur erfolgte für den endogenen Verbrauch von
Sauerstoff. Die Menge des während der Reaktion (3 min) verbrauchten Sauerstoffs wurde polarographlsch mit
einer Clark-Sauerstoffelektrode bestimmt. Das verbrauchte Propylen und das gebildete Propylenoxid wurden
gaschromalographisch ermittelt. Der Propylenverbrauch war 0,29 μΜοΙ, der Sauerstoffverbrauch 0,30 μΜοΙ und
das gebildete Propylenoxid 0,28 μΜοΙ.
Um weiter nachzuweisen, daß die Enzymaktlvliät in der Teilchenfraktion (nicht in der überstehenden Flüssigkeit) steckt, wurden die folgenden Versuche durchgeführt. Zellen von mit Methan gezüchtetem Methylococcus
capsulatus (CRL Ml, NRRL B-11.219) wurden nach der Methode des Beispiels 1 erhalten. Der Rohextrakt nach
Zentrifugieren bei 10000 g der durch Schalleinwirkung aufgebrochenen Zellen (3 χ 50 s, Ultraschalloszillator)
zeigte Aktivität weder für die Epoxydation noch für die Hydroxylierung. Wurden die Zellen jedoch durch zweimaligen Durchgang durch eine Französische Druckzelle (1000 kp Druck) aufgebrochen, fanden sich beide Aktivitäten Im Rohextrakt nach Zentrifugleren bei 10 000 g. Die gesamte Aktivität des Rohextrakts wurde als Teilchenfraktion durch weiteres Zentrifugleren des Rohextrakts 90 min bei 40 000 g und 4° C gesammelt. NADH
stimulierte sowohl die Epoxydatlons- als auch die Hydroxylierungsreaktlon, wie in Tabelle X gezeigt.
15
Epoxydiitions- und Hydroxylierungsaktivitiilen in /cllfrcien
Fraktionen von Mclhylococcus ciipsulutus
(CRLMl. NRRL H-! I 219)·)
/cllf'reic Iraktioncn Oxyduliiinsgcschwinüigkcil
(nMol/30 min/l'rohc)
lipoxydalion Hydroxylierung von l'ropylcn von Methan
1) Teilchenfraktion 750 500
(10 000-40 000 p)
1) + NADU WO 650
2) überstehende Fraktion 0 0
von 40 000 g
2) + NADlI 0 0
■') Die Zellen wurden durch dir l-ran/uüische Druckzelle, wie üben
*" beschrieben, aufgebrochen. NADII (2.5 μΜοΙΙ wurde, wo ange
geben, dem Rcaklionsgeniisili /ugcscl/i Die l'roleinmengc in der
Teilehenlraktion und der bei 40 (K)O ρ überstehenden l*raktion
war 1 mg b/w. 2.5 mg. Jcdi: Probe enthielt 0,5 ml Reaktionsgemisch
Zusammenfassung
Sowohl das System von Pseudomonas aeruglnosa von Van der Linden, Biochim. Biophys. Acta., 77, 157-159
(1963) als auch das System von Pseudomonas oleovorans, Abbott und Hou, Appl. Mlcroblol., 26, 86-91 (1973)
epoxydlerte flüssige 1-Alkene von G, bis C1, aber keine gasförmigen Alkene.
Die Erfindung führt zur Epoxydatlon von Äthylen, Propylen, 1-Buten und Butadien durch Zellsuspensionen
aller drei verschiedener Gruppen von Methan-verwertenden Bakterien. Die Epoxydation von Alkenen und die
Hydroxylierung von Methan wurden unter anaeroben Bedingungen oder mit Methanol gezüchteten Zellen niehl
gefunden, was vermuten läßt, daß das Enzymsystem !nduzicrbar ist. Die Produkt-!,2-epoxide sammelten sich
extrazellulär an. Der nicht-enzymatlsche Abbau von Propylenoxid im offenbarten Probensystem war selbst nach
verlängerter Inkubationszelt unbedeutend. Van der Linden, a. a. O., wies die Produktion von 1,2-Epoxyoctan aus
1-Octen durch mit Heptan gezüchtete Zellen von Pseudomonas sp. nach und stellte auch fest, daß das Epoxid
enzymatisch nicht welter oxydiert wurde. May und Abbott, Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 1230-1234
(1972) und J. Blol. Chem. 248, 1725-1730 (1973) berichteten jedoch, daß, wenn 1-Octen als Substrat dem ω-Hydroxyllerungs-Enzymsystem
von P. oleovorans zugeführt wurde, sowohl 8-Hydröxy-l-octen als auch 1,2-Epoxyoctan
gebildet wurden. Außerdem fanden Abbott und Hou, a. a. O., daß die Methylgruppe der letzteren
Verbindung auch der Hydroxylierung unterlag. Die vorliegenden, aus den Untersuchungen lebensfähiger Zeiisuspenslonen
der Methan-verwertenden Bakterien erhaltenen Ergebnisse jedoch zeigen, daß Propylenoxid
enzymatisch nicht welter im Stoffwechsel verarbeitet wurde.
Van der Linden. a.a.O., zeigte, daß die Epoxid-Ansammlung von l-Octen durch Pseudomonas aeruginosa
durch den Stoffwechsel einer großen Menge von l-Octen über Methylgruppen-Epoxydatlon begleitet war. Bei
der Epoxydatlon von Propylen durch Zellsuspensionen von Methan-verwertenden Bakterien jedoch wurde keine
Bildung von 3-Hydroxy-propen-l nachgewiesen.
Sowohl die Epoxydation der Cz-C4-I-Alkene als auch die Hydroxylierung von Methan mit den Zellsuspensionen
wurde durch verschiedene metallbindende und metallchelatisierende Mittel inhibiert, was die Beteiligung
von metallhaltigen En;;ymsystem(en) anzeigt. Das ähnliche Ausmaß der Hemmung sowohl für die Propylen- als
auch die Methan-Oxydation (Tabciie Via) zeigte, daB die Epoxydaüons- und Hydroxyllerungsreaktion durch
dasselbe oder ein ähnliches Enzymsystem katalysiert werden kann. Die Epoxydatlon von Propylen zu Propylenoxid
durch eine Zelisuspenslon eines mit Methan gezüchteten Stamms von Methylococcus capsulatus NRRL B-II.219
wurde In Gegenwart des Hydroxyllerungssubstrats, Methan (Tabelle X) gehemmt (50·*.). Dies legt deutlich
eine Konkurrenz zwischen dem Hydroxyllerungssubslral und dem Epoxydationssubstrat um ein einziges
Enzymsystem nahe. Wahrscheinlich katalysiert das Methan-monooxygenase-Enzymsystem sowohl die Epoxydation
von Alken als auch die Hydroxylierung von Methan. Die Veröffentlichungen von May und Abbott, a. a. O.,
berichteten, daß das ω-Hydroxylierungssystem von Pseudomonas oleovorans sowohl die Epoxydation von I- ·
Octen als auch die Hydroxylierung von n-Octan katalysierte.
Die Optimalbedingungen für die in-vtvo-Epoxydation von Propylen durch Zellsuspensionen der drei verschiedenen
Gruppen Methan-verwertender Bakterien sind recht ähnlich. Die pH-Optima lagen bei etwa 6 bis 7 und
das Temperaturoptimium um 35° C. Die offensichtliche Abnahme der Epoxydation über 40" C mag sowohl auf
der Instabilität des Monooxygenasesystems als auch auf Flüchtigkeit des Produkts, Propylenoxid (Sdp. 35° C)
beruhen.
Sowohl die Hydroxylierungs- als auch die Epoxydatlonsaktlvliät sitzt In der zellfreien Teilchenfraktion, die
beim Zentrifugieren zwischen IO 000 und 80 000 g ausfällt. Tonge et al., Biochem. J. 161, 333-344 (1977) und
FEBS Lett., 58, 293-299 (1975) haben die Reinigung einer membrangebundenen Methanmonooxygenase aus der
Claims (4)
1. Verfahren zur Epoxydailon von C.-C^-n-Alkenen, von Butadien oder deren Gemischen mil Sauerstoff
in Gegenwart von epoxidblldenden Mikroorganismen, wobei das Verfahren ansalzweise halbkontinulerlich
oder kontinuierlich Im Gleichstrom oder Gegenstrom durchgeführt wird, dadurch gekennzeichnet,
daß das Alken oder Butadien oder ein Gemisch der Olefine mit den Zellen von obligaten oder fakultativen,
meihylotrophen Mikroorganismen, die In einem Methan und Sauerstoff enthaltenden mineralischen Nährmedium
kultiviert worden sind, oder daraus stammenden Enzympräparaten, die gegebenenfalls in immobilisierter
Form verwendet werden, in Berührung gebracht wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß man beim Arbeiten mit zeilfreien Enzympräparaten
Elsen- oder Kupfcrsalze oder Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) als Promotoren zusetzt.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2. dadurch gekennzeichnet, daß als η-Alken Propylen verwendet wird.
4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen der Stämme Methyloslnus
trichosporlum OB3b (NRRL B-11.196); Methyloslnus sporlum 5 (NRRL B-11.197); Methylocystis
parvus OBBP (NRRL B-11.198); Methylomonas methanlca S1 (NRRL B-11.199); Methylomonas albus
BG8(NRRL B-11.200); Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-11.201); Melhylobacterium organophllum sp.
nov. (ATCC 27.886); Melhylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400); Meihylococcus 999 (NCIB-Zugangsnummer
11.083; und Methylomonas SM 3 (NCIB-Zugangsnummcr 11.084) eingesetzt werden.
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