CH647805A5 - Verfahren zur epoxydation eines olefins mit bis zu vier kohlenstoffatomen. - Google Patents
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Description
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Epoxydation eines C2-C4-Alkens oder eines C4-Diens.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Epoxydation eines C2-C4-Alkens oder eines C4-Diens ist dadurch gekennzeichnet, dass das Alken oder Dien unter aeroben Bedingungen in der Gegenwart von entweder Zellen eines bakteriellen methylotrophen Mikroorganismus, exklusive Methylococcus capsultatus Stamm Bath, oder Mikroorganismus, exklusive Methylococcus capsultatus Stamm Bath, oder eines Oxygena-
se-Enzympräparates aus den Zellen der genannten Mikroorganismen epoxidiert wird, wobei das Olefin mit den Zellen des Mikroorganismus oder dem Enzympräparat so lange inkubiert wird, bis das entsprechende Epoxid erhalten wird, 5 und wobei genannter methylotropher Mikroorganismus aerob in einem Methan enthaltenden Nährmedium gewachsen ist.
Epoxide sind aufgrund ihrer Fähigkeit, zahlreiche chemische Reaktionen, wie die Addition mit den aktiven Wasser-io Stoffatomen nukleophiler Reagentien (z.B. Ammoniak, organischer Säuren, Alkohole, Wasser usw.), einzugehen, äusserst wertvolle Produkte geworden. Die Produkte der Epoxydation (das heisst die 1,2-Epoxide, auch als a-Epoxide und Oxiran-Verbindungen bekannt) erfreuen sich aufgrund ihres Polyme-15 risationsVermögens unter thermischer, ionischer und freiradi-kalischer Katalyse zur Bildung von Epoxyhomo- und -copo-lymerisaten auch industrieller Bedeutung. Äthylenoxid und Propylenoxid stellen die beiden gewerblich wichtigsten Epoxide dar. Ein verbreitet angewandtes Verfahren ist das silber-2okatalysierte «Direktoxydations»-Verfahren von Lefort (US-PS 1 998 878 (1935) und die Reissue-PS'en 20 370 und 22241).
InderNL-PS291 Ï63 (offengelegt am 25.6.1965) ist ein Verfahren zur Herstellung von 1,2-Epoxiden durch Kontak-25 tieren von a-Olefinen mit Sauerstoff und Mikroorganismen offenbart, die auf einem Kohlenwasserstoff wachsen und aus diesem Kohlenstoff assimilieren können. Diese Patentschrift lehrt, dass der Mikroorganismus vorzugsweise auf einem Kohlenwasserstoff mit praktisch der gleichen Zahl der Koh-30 lenstoffatome wie das a-Olefin gezüchtet wird, das der Epoxydation unterworfen wird. Während die allgemeine Beschreibung dieses Patents a-Olefine mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen umfasst, zeigt das einzige Beispiel in dieser Patentschrift die Epoxydation von 1-Octen in Gegenwart von Luft und Pseu-35 domonas aeruginosa (Stamm 473), der auf n-Heptan gezüchtet worden war.
Whittenbury, Dalton, Eccleston und Reed (Microbial Growth on Q Compounds: Proceedings of the International Symposium on Microbial Growth on Cj Compounds, Socie-40 ty of Fermentation Technology, pp. 1-11 (1975) ) berichteten, dass Methan-oxydierende Bakterien das interessante Merkmal besitzen, Substrate oxydieren, aber nicht verbrauchen zu können, sie wachsen beispielsweise nicht auf Äthan, oxydieren es aber, wenn sie auf Methan wachsen oder zuvor mit « Methan gezüchtet worden sind.
DeBont (Antonie van Leeuwenhoek, 42,59-71 (1976) ) berichteten, dass Äthylen durch bestimmte Gram-positive Bakterien oxydiert wurde, die vermutlich zur Art Mycobacterium gehörten. DeBont berichtete, dass seine isolierten Stäm-50 me nicht in Gegenwart von Methan wuchsen, und leitete daraus her, dass diese im Boden befindlichen Bakterien keine Methan-oxydierenden Bakterien waren. DeBont und Albers (Antonie van Leeuwenhoek, 42,73-80 (1976) ) nahmen an, dass das Oxydationsprodukt der äthylenoxydierenden Stäm-55 me von DeBont (1976) Äthylenoxid war.
Hutchinson, Whittenbury und Dalton (J. Theor. Biol., 58, 325-335 (1976) «A Possible Role of Free Radicals in the Oxi-dation of Methane by Methylococcus capsulatus») und Colby und Dalton (J. Biochem., 157 495-597 (1976) «Some Proper-60 ties of a Soluble Methane Mono-Oxygenase from Methylococcus capsulatus Strain Bath») berichteten, dass Äthylen durch lösliche Methan-monooxygenase aus Methylococcus capsulatus, Stamm Bath, oxydiert wird. Diese letzteren Forscher berichteten, dass die «besonderen Membran-Präparate» 65 von Methylococcus capsulatus, Stamm Bath, keine Methan-oxygenase-Aktivität besassen, bestimmt nach dem Test des Brommethan-Verschwindens.
Auf der Grundlage des lsO-Einbaus aus 1802 in die Zellbe-
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standteile von Pseudomonas methanica vermuteten Leadbet- in Hohlfasermembranen zurückgehalten sind (Rony-Biotech-
ter und Foster (Nature, 184,1428-1429 (1959) ), dass an dem nology and Bioengineering, Juni 1971).
anfänglichen oxydativen Angriff auf das Methan eine Der Begriff «Teilchenfraktion» bezieht sich auf die
Oxygenase beteiligt ist. Higgins und Quayle (J. Biochem., Oxygenase-enzym-Aktivität in dem ausgefällten oder sedi-
118,201-208 (1970) ) isolierten CH3l8OH als Produkt der 5 mentierten Material, wenn die überstehende Flüssigkeit nach
Methanoxydation, wenn Supensionen von Pseudomonas dem Zentrifugieren aufgebrochener Zellen bei 10 000 g für 30
methanica oder Methanomonas methano-oxidans Methan in min 1 h bei 10 000 g oder darüber zentrifugiert wird.
1802-angereicherten Atmosphären oxydieren konnten. Die Die folgenden naturwissenschaftlichen Beobachtungen folgende Beobachtung einer Methan-stimulierten NADH- wurden gemacht, die sich auf verschiedene Aspekte der vorlie-
Oxydation, katalysiert durch Extrakte von Methylococcus io genden Erfindung beziehen. Die Erfindung ist jedoch nicht capsulatus, durch Ribbons (J. Baceriol., 122,1351-1363 auf diese Beobachtungen beschränkt.
( 1975) ) und Ribbons und Michalover, FEBS Lett. 11,41-44 Die Isolate Methan-verbrauchender Mikroorganismen
( 1970) oder Methylomonas capsulatus durch Ferenci (FEBS umfassen notwendige (Typ I und Typ II) und fakultative Bak-
Lett. 41,94-98 (1974) Hess vermuten, dass das für diese Oxy- terien.
dation verantwortliche Enzym eine Monooxygenäse ist. Die- is Neben ihrer Fähigkeit zur Oxydation von Methan zu se Forscher stützten sich auf indirekte Enzymtests oder Methanol oxydieren Ruhezell-Suspensionen mehrerer unter-spektrophotometrischer Messung Methan-stimulierten schiedlicher Typen von mit Methan gezüchteten Bakterien NADH-Verschwindens oder polarographischer Messung (zum Beispiel Typ I, notwendig; Typ II, notwendig) und fa-Methan-stimulierten 02-Verschwindens. In jüngerer Zeit kultativ C2-C4-n-Alkene und Butadien zu ihren entsprechenwurden Methan-monooxygenase-Systeme teilweise gereinigt 20 den 1,2-Epoxiden.
aus Methylosinus trichosporium OB3b (Tonge, Harrison und Die Produkt-1,2-Epoxide werden im Stoffwechsel nicht
Higgins, J. Biochem. 161,333-344 (1977) und Tonge, Harri- weiter umgesetzt und sammeln sich extrazellulär an.
son, Knowles und Higgins, FEBS Lett., 58,293-299 (1975) Mit Methanol gezüchtete Zellen zeigen weder Epoxyda-
und Methylococcus capsulatus (Bath) (Colby und Dalton, J. tions- noch Hydroxylierungsaktivität. Unter den gasförmigen
Biochem., 171,461-468 (1978) und Colby, Stirling und Dal- 25 Substrat-Alkenen wird Propylenmit der höchsten Rate ton, J. Biochem., 165,395-402 (1977). oxydiert.
Es wurde nun gefunden, dass C2-C4-n-Alkene und Buta- Methan hemmt die Epoxydation von Propylen.
dien, insbesondere Propylen, in einem energiearmen Intensiv- Die Stöchiometrie des Verbrauchs von Propylen und Sauverfahren epoxidiert werden, bei dem C2-C4-n-Alkene oder erstoff und die Produktion von Propylenoxid ist 1:1:1. Butadien mit Sauerstoff in Gedenwart der Teilchenfraktion 30 Ergebnisse aus Hemmstudien zeigen an, dass das gleiche eines Mikroorganismus oder aus diesem stammenden Enzym- Monooxygenase-System die Epoxydationsreaktionen kata-präparaten in Berührung gebracht werden, wobei die Mikro- lysiert.
Organismen in einem Sauerstoff und Methan enthaltenden, Die Epoxydationsaktivität sitzt in der zellfreien (Enzymgewöhnlich mineralischen, Nährmedium gezüchtet worden extrakt) Teilchenfraktion, die zwischen 10 000 und 80 000 g sind. Die bei dem Verfahren verwendeten Mikroorganismen 35 für 1 h ausgefällt oder sedimentiert wurde.
sind obligatorisch oder fakultativ Methylotrophe und stam- Zellfreie Teilchenfraktionen aus den obligatorisch und fa-
men vorzugsweise aus den Arten Methylosinus, Methylocy- kultativ methylotrophen Mikroorganismen katalysieren die stis, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus und Epoxydation von C2-C4-n-Alkenen und Dienen (zum Bei-
Methylobacterium. spiel Äthylen, Propylen, 1 -Buten und Butadien) in Gegenwart
Anders als beim silberkatalysierten «Direktoxydations-» 40 von Sauerstoff und reduziertem Nicotinamid-adenin-dinuc-
Verfahren zur Herstellung von Äthylenoxid wurde ferner ge- leotid (NADH) und die Hydroxylierung von Q-Q-n-Alka-
funden, dass die mit Methan gezüchteten methylotrophen nen (zum Beispiel Methan, Äthan, Propan und Butan).
Mikroorganismen oder ein daraus stammendes Enzympräpa- Die Epoxydationsaktivität von mit Methan gezüchteten rat a-Olefine mit zwei bis vier Kohlenstoffatomen und Buta- Methylotrophen gehen bei Lagerung gleichzeitig verloren und diene zu epoxydieren vermögen, nicht aber C5+-a-Olefine 45 werden durch verschiedene metallbindende Mittel stark
(zumindest in Mengen, die durch gewöhnliche analytische gehemmt.
Methoden leicht nachzuweisen sind). Als bevorzugte Ausfüh- Die Stöchiometrie des Verbrauchs des Substrats (Prop-
rungsform werden die Methan-induzierten methylotrophen ylen oder Methan), von Sauerstoff, NADH, und die Produkt-
Mikroorganismen oder die daraus stammenden Enzymprä- bildung erwies sich als annähernd 1:1:1:1.
parate zur oxydativen Umwandlung von Propylen in Prop- so Das von R. Whittenbury, K. C. Phillips und J. F. Wilkin-
ylenoxid verwendet. son (J. Gen. Microbiology, 61,205-218 (1970) (nachfolgend
Der Ausdruck «Mikroorganismus» umfasst hier nur Bäk- Whittenbury et al.) vorgeschlagene Klassifikationssystem terien. Methan-oxydierender Bakterien ist das derzeit angewandte
Der Begriff «Enzympräparat» soll sich auf jedes Mittel und am meisten verbreitete und anerkannte System. In diesem beziehen, das die gewünschte enzymatische Oxygenase-Akti- 55 Klassifikationssystem sind die morphologischen Eigenschaf-vität zeigt. Der Begriff soll sich zum Beispiel auf Zellenextrak- ten Methan-verbrauchender Bakterien in fünf Gruppen unte und gereinigte und konzentrierte, aus diesen Zellen stam- terteilt. Diese sind Methylosinus, Methylocystis, Methylomo-mende Präparate beziehen. Enzympräparate können entwe- nas, Methylobacter und Methylococcus. Bakterien dieser fünf der in trockner oder flüssiger Form vorliegen. Der Begriff von Whittenbury et al. berichteten Gruppen verwerten Me-umfasst auch die immobilisierte Form des Enzyms, zum Bei- <so than, Dimethyläther und Methanol für die Wachstumsener-spiel die ganzen Zellen des mit Methan gezüchteten Mikroor- gie, und sie wurden alle als strikt aerob und Gram-negativ be-ganismus oder Enzymextrakte, die an eine unlösliche Matrix richtet. Sie zeichnen sich auch dadurch aus, dass sie nicht durch kovalente chemische Bindungen, Sorption und Ein- Endosporen bilden, das heisst die Fähigkeit zur Bildung von schluss des Enzyms in einem Gelgitter mit genügend grossen Zysten und Exosporen mit komplexer Feinstruktur und kom-Poren für freien Durchgang der Moleküle des Substrats und 65 plexer Innenstruktur.
des Produkts, aber genügend kleinen Poren zum Zurückhai- Nach einer Ausführungsform der Erfindung wurde gefun-
ten des Enzyms unbeweglich gemacht oder gebunden sind. den, dass von Whittenbury et al. beschriebene Mikroorganis-
Der Begriff «Enzympräparat» schliesst auch Enzyme ein, die men, wenn sie in Gegenwart von Methan gezüchtet werden,
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niedere a-01efine, insbesondere Propylen, in Gegenwart von mann auf Anfrage ohne jegliche Beschränkung der Verfüg-Sauerstoff zu epoxydieren vermögen. Diese Methan-verwer- barkeit zur Verfügung. Subkulturen der vorgenannten Stäm-tenden Mikroorganismen sind im allgemeinen als «Methylo- me wurden anfangs von R. Whittenbury, Department of Bio-trophe» bekannt. Das Enzymsystem oder die aus diesen Mi- logicai Science, University of Warwick, Warwickshire, Co-kroorganismen stammenden Präparate werden hier als «epo- 5 ventry, England, erhalten.
xydierendes Enzymsystem» bezeichnet, das vermutlich eine Die morphologischen und taxonomischen Merkmale und
«Methan-monooxygenase» und/oder eine «Methan-hydro- Eigenschaften der vorerwähnten methylotrophen Stämme xylase» ist. So versteht sich, dass das Enzymsystem oder die sind wie folgt:
hier als «Alken-epoxidase» oder «Propylen-epoxidase» bezeichneten Enzympräparate, zur Umwandlung der a-Olefine 10 Methylosinus trichosporium OB3b NRRL B-l 1.196 in 1,2-Epoxide verwendet, das «epoxydierende Enzymsy- produziert weisse Kolonien auf Salzagarplatten in Gegen-
stem» ist bzw. sind, von denen angenommen wird, dass sie wart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind be-Methan-monooxygenase- oder Methan-hydroxylase-Enzyme weglich, stäbchenförmig, Gram-negativ und aerob. Häufig sind. werden Rosetten ausgebildet. Hat eine Membranstruktur Typ
Die von Whittenbury et al. (deren Offenbarung hier ein- 15 II.
bezogen wird) berichteten methylotrophen Mikroorganismen kommen für die Verwendung bei der praktischen Durchfüh- Methylosinus sporium 5 NRRL B-l 1.197 rung der Erfindung in Betracht. Insbesondere sind die in Ta- produziert weisse Kolonien auf Salzagarplatten in Gegen belle 4, Seite 214 der Veröffentlichung von Whittenbury et al. wart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beerwähnten methylotrophen Mikroorganismen verwendbar, 20 weglich, stäbchenförmig, Gram-negativ und aerob. Häufig das heisst, solche Mikroorganismen, die identifiziert sind als werden Rosetten ausgebildet. Organismen bilden Exosporen, Methylosinus trichosporium, Methylosinus sporium, die wärmebeständig sind; Sporen gingen von den keine Fla-
Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Methylo- gellen tragenden Polen der Organismen ab, die Vibro-Form monas albus, Methylomonas streptobacterium, Methylo- annahmen. Andere organische Verbindungen als Methan und monas agile, Methylomonas rubrum, Methylomonas rosa- 25 Methanol unterhalten das Wachstum nicht. Besitzt eine ceus, Methylobacter chroococcum, Methylobacter bovis, Membranstruktur Typ II.
Methylobacter capsulatus, Methylobacter vinelandii, Methylococcus capsulatus und Methylococcus capsulatus, Methylocystis parvus OBBP NRRL B-l 1.198 Stamm Texas, erwähnt von D. W. Ribbons, J. Bacteriol., 122, produziert weisse Schleim-Kolonien auf Salzagarplatten 1351-1363 (1975) ), und Methylococcus minimus. Diese 30 in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen methylotrophen Mikroorganismen können in Form ihrer sind unbeweglich, von der Form des Cocco-Bazillus, Gramganzen Zellen, Enzymextrakte oder immobil gemachten Prä- negativ und aerob. Organismen bilden Zysten, die gegen Ausparate solcher ganzen Zellen oder Enzymextrakte, unbeweg- trocknung beständig, aber nicht wärmebeständig sind.
lieh gemacht zum Beispiel durch die Verwendung von DEAE- Wächst auf Kosten von Methan oder Methanol. Andere or-Cellulose oder Ionenaustauscherharz oder porösen Alumini- 35 ganische Verbindungen als Methan und Methanol fördern umoxidträgern, verwendet werden. das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ II.
Subkulturen einiger von Whittenbury et al. beschriebener methylotropher Mikroorganismen sind bei der amtlichen Methylomonas methanica S! NRRL B-l 1.199 Hinterlegungsstelle des United States Department of Agricul- produziert rosafarbene Kolonien auf Salzagarplatten in ture, Agriculture Research Service, Northern Regional Re- 4° Gegenwart von Methan oder Metanol. Die Organismen sind search Laboratory, Peoria, Illinois 61604, jeweils durch Hin- beweglich, stäbchenförmig, Gram-negativ und aerob. Bildet terlegen von Subkulturen hinterlegt worden und haben von schleimige Kapseln. Sie wachsen auf Kosten von Methan und • der Hinterlegungsstelle die einzelnen, nachfolgend angegebe- Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und nen NRRL-Stammbezeichnungen erhalten. Diese Subkultu- Methanol fördern das Wachstum nicht. Besitzt eine Mem-ren sind nach den Bestimmungen des Department of Agricul- « branstruktur Typ I.
ture ohne jegliche Beschränkung hinterlegt worden, so dass vermehrungsfähiges Material dieser Stämme für die Öffent- Methylomonas albus BG8 NRRL B-l 1.200 lichkeit zur Verfügung steht. Stämme hinterlegter methylo- produziert weisse Kolonien auf Salzagarplatten in Gegen wart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind be-50 weglich, stäbchenförmig, Gram-negativ und aerob. Bildet schleimige Kapseln. Wächst auf Kosten von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
55
Methylobacter capsulatus Y NRRL B-l 1.201
produziert weisse bis braune Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich, stäbchenförmig, Gram-negativ und 60 aerob. Bildet schleimige Kapseln. Wächst auf Kosten von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
Kürzlich offenbarten Patt, Cole und Hanson (Internatio-65 nal J. Systematic Bacteriology 27, (2) 226-229 (1976) ), dass methylotrophe Bakterien solche Bakterien sind, die unter Verwendung von Kohlenstoffverbindungen mit einem oder Vermehrungsfähiges Material dieser Stämme steht jeder- mehreren Kohlenstoffatomen, aber ohne Kohlenstoff-Koh-
tropher Mikroorganismen sind wie folgt bezeichnet:
Kultur
Methylosinus trichosphorium
Methylosinus sporium
Methylocystis parvus
Methylomonas methanica Methylomonas albus
Methylobacter capsulatus
Bezeichnung des USD A Agricultural Research Service
OB3B NRRL B-l 1.196
5 NRRL B-ll. 197 OBBP NRRL B-l 1.198
S, NRRL B-l 1.199
BG8 NRRL B-l 1.200
Y NRRL B-l 1.201
5 647 805
lenstoff-Bindungen, nichtautotroph wachsen können. Patt et gungen ab, die für das Wachstum der Mikroorganismen und/ al. haben vorgeschlagen, dass Methylotrophe als «obligat» oder die Produktion ihrer Enzyme notwendig sind. Dazu geangesehen werden sollten, wenn sie nur Kohlenstoffverbin- hören die Stabilität der Mikroorganismen, geeignete Nährdungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen (zum Bei- stoffe, der pH-Wert, osmotische Beziehungen, der Grad der spiel Methan, Methanol, Dimethyläther,Methylamine usw.) 5 Belüftung, die Temperatur und die Aufrechterhaltung reiner als einzige Quellen für Kohlenstoff und Energie verwerten Kulturbedingungen während der Fermentation. Beispielswei-können, während «fakultative» Methylotrophe solche Mikro- se können zur Erzielung maximaler Ausbeuten der Alkenorganismen sind, die Verbindungen ohne Kohlenstoff-Koh- epoxidase die Fermentationsbedingungen in der Endstufe et-lenstoff-Bindungen und komplexe Verbindungen mit Koh- was von denen zu ändern sein, die zur Erzielung des Wach-lenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als einzige Quellen für Koh- io tums der Mikroorganismen in den Kulturentwicklungsstufen lenstoff und Energie verwerten können. In ihrer Veröffentli- angewandt werden. Die Aufrechterhaltung der Reinheit des chung offenbarten Patt et al. ein Methan-oxydierendes Bakte- Mediums ist auch ein äusserst wichtiger Gesichtspunkt, insbe-rium, das sie als Methylobacterium organophilum sp nov. sondere, wo die Fermentation unter aeroben Bedingungen er-(ATCC 27 886) identifizierten. Dieses Bakterium unterschei- folgt, wie im Falle der methylotrophen Mikroorganismen, det sich vermutlich von allen zuvor beschriebenen Gattungen is Wird die Fermentation anfangs in einer grossen Fermentie-und Arten Methan-oxydierender Bakterien aufgrund der Fä- ranlage gestartet, ist eine verhältnismässige lange Zeit not-higkeit zur Verwertung einer Vielzahl organischer Substrate wendig, eine beträchtliche Ausbeute an Mikroorganismen mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen als Quelle für Koh- und/oder Alken-epoxidase-Enzym zu erzielen. Dies erhöht lenstoff und Energie. natürlich die Möglichkeit der Verunreinigung des Mediums
Als weitere Ausführungsform der Erfindung wurde gefun- 20 und der Mutation der Mikroorganismen.
den, dass dieser Mikroorganismus (Methylobacterium orga- Die für das Wachstum der methylotrophen Mikroorga-
nophilum sp nov. ATCC 27 886) und andere fakultativ meth- nismen und zum Einführen des Oxygenase- oder Epoxyda-
ylotrophe Mikroorganismen auch C2-C4-Alkene zu epoxy- tions-Enzymsystems verwendeten Kulturmedien bestehen im dieren vermögen. Mit anderen Worten, sie besitzen Alken- allgemeinen aus anorganischen Phosphaten, Sulfaten und epoxidase-Enzymaktivität, wenn sie in Gegemwart von 25 Nitraten sowie aus Sauerstoff und Methan. Die Fermentation
Methan gezüchtet werden. Wie oben mit Bezug auf die meth- erfolgt im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von 5 bis ylotrophen Mikroorganismen von Whittenbury et al. erör- etwa 55 °C, vorzugsweise bei Temperaturen im Bereich von tert, können die fakultativ Methylotrophen in Form ihres etwa 25 bis etwa 50 °C. Der pH-Wert des Kulturmediums ist
Rohextrakts (das heisst der überstehenden Flüssigkeit nach gewöhnlich auf einen Wert von etwa 4 bis 9, vorzugsweise von dem Zentrifugieren der zerbrochenen Zellen für 30 min bei 30 etwa 5,5 bis 8,5 und insbesondere bevorzugt auf 6,0 bis 7,5
10 000 g) oder in unbeweglich gemachte Form gebracht oder eingeregelt. Die Fermentation kann bei Atmosphärendruck in zellgebundener Form verwendet werden, wenn sie im erfin- durchgeführt werden, obwohl höhere Drücke bis zu etwa 5
dungsgemässen Verfahren verwendet werden sollen. bar (5 at) und darüber angewandt werden können.
Weitere bekannte methylotrophe Stämme können im er- Typischerweise werden zum Wachstum der methylotro-findungsgemässen Verfahren verwendet werden, zum Beispiel 35 phen Mikroorganismen und zum Induzieren des Oxygenase-Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400) der US-PS oder Epoxydations-Enzymsystems die Mikroorganismen in 3 930 947 als von dem Fermentation Research Institute, das Medium eingeimpft, das mit einem methan- und sauer-Agency of Industriai Science and Technology, Ministry for stoffhaltigen Gasgemisch in Berührung gebracht wird. Me-Industrial Trade and Industry, Chiba, Japan, frei erhältlich, than kann in Form von Naturgas zugeführt werden. Zur kon-und Methylococcus 999 der US-PS 4 042 458 mit der NCIB- 40 tinuierlichen Fliesskultur können die Mikroorganismen in je-Zugangsnummer 11 083 sowie Methylomonas SM3 mit der dem geeigneten angepassten Fermentationsbehälter gezüchtet NCIB-Zugangsnummer 11 084 (beschrieben in der niederlän- werden, zum Beispiel einem mit Prall- oder Leitflächen und dischen Patentanmeldung 74/16644). Gemische methylotro- Rührer ausgestatteten Fermentator oder einem gespülten pher und nicht-methylotropher Mikroorganismen können Turmfermentator, der entweder mit Innenkühlung oder einer verwendet werden, wie zum Beispiel die in den US-PS'en 45 äusseren Rückführkühlschleife ausgestattet ist. Frisches Me-3 996 105 und 4 042 458 beschriebenen Systeme. dium kann kontinuierlich in die Kultur mit Geschwindig-Bei kommerziellen Verfahren zur Vermehrung von Mi- keiten entsprechend 0,02 bis 1 Kulturvolumen pro Stunde kroorganismen muss im allgemeinen stufenweise vorgegan- eingepumpt werden, und die Kultur kann mit solcher Gegen werden. Diese Stufen können wenige oder zahlreich sein, schwindigkeit entfernt werden, dass das Kulturvolumen kon-je nach der Art des Verfahrens und den Eigenschaften der Mi- so stant bleibt. Ein Gasgemisch, das Methan und Sauerstoff und kroorganismen. Gewöhnlich beginnt die Vermehrung durch möglicherweise Kohlendioxid oder andere Gase enthält, wird Einimpfen von Zellen aus einer Schrägkultur in ein vorsterili- mit dem Medium vorzugsweise durch kontinuierliches siertes Nährmedium, das sich gewöhnlich in einem Kolben Durchperlen durch einen Sprinkler am Boden des Behälters befindet. In dem Kolben wird das Wachstum der Mikroorga- in Berührung gebracht. Die Quelle für Sauerstoff für die Kul-nismen durch verschiedene Massnahmen gefördert, zum Bei- ss tur kann Luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte spiel durch Schütteln zur gründlichen Durchlüftung und Ein- Luft sein. Verbrauchtes Gas kann oben aus dem Behälter enthalten geeigneter Temperatur. Dieser Schritt oder diese Stufe fernt werden. Das verbrauchte Gas kann entweder über eine wird ein- oder mehrmals in Kolben oder Kesseln wiederholt, Aussenschleife oder intern mit Hilfe eines Gaszufuhrgebläses die die gleichen oder grössere Volumina an Nährmedium ent- in Umlauf gesetzt werden. Die Gasströme und das umgewälzhalten. Diese Stufen können in angebrachter Weise als 60 te Gas sollten so eingestellt werden, dass sich maximales Kulturentwicklungsstufen bezeichnet werden. Die Mikroor- Wachstum des Mikroorganismus und maximale Methanausganismen mit oder ohne begleitendes Kulturmedium aus der nutzung ergibt.
letzten Entwicklungsstufe werden in eine Fermentieranlage Das Oxygenase-Enzymsystem kann, wie oben beschrie-
grossen Umfangs eingeführt oder eingeimpft, um kommer- ben, als Rohextrakt oder als zellfreie Teilchenfraktion, das ziehe Mengen der Mikroorganismen oder deren Enzyme zu 65 heisst das Material, das sich bei einstündigem Zentrifugieren erzeugen. mit 10 000 g oder darüber der überstehenden Flüssigkeit nach
Die Gründe für das Züchten der Mikrooganismen in Stu- dem Zentrifugieren gebrochener Zellen für 30 min bei fen sind zahlreich, hängen aber in erster Linie von den Bedin- 10 000 g abscheidet oder sedimentiert, erhalten werden.
• 647 805 6
Die Mikroben-Zellen können aus dem Wachstumsmedi- folgend oder gleichzeitig durch wechselnde Anwendung nor-
um nach irgendeiner der gewöhnlich verwendeten Standard- maier und starker Belüftung durchgeführt werden.
techniken geerntet werden, zum Beispiel durch Ausflockung, Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter
Sedimentation und/oder Fällung mit anschliessendem Zentri- veranschaulicht. Alle Teile und Prozentsätze, sofern nicht fugieren und/oder Filtrieren. Die Biomasse kann auch ge- 5 ausdrücklich anders angegeben, beziehen sich auf das trocknet werden, zum Beispiel durch Gefrier- oder Sprüh- Gewicht.
trocknen, und kann in dieser Form zur weiteren Verwendung bei der Epoxydationsreaktion verwendet werden. Wird das Beispiel 1
zellfreie Enzym verwendet, können NADH und ein Metall Es wurde ein Nährmedium wie von Foster und Davis, J.
(zum Beispiel Kupfer oder Eisen) zugesetzt werden, um die 10 Bacteriol. 91,1924-1931 (1966) beschrieben, mit folgender
Enzymaktivität zu steigern. Zusammensetzung pro Liter hergestellt:
Zur praktischen Ausführung der Erfindung wird ein Oxy-
genase-Enzymsystem erhalten, wie zum Beispiel in der oben Na2HP04 0,21 g beschriebenen Weise, das Methan in Methanol unter oxydati- NaH2P04 0,09 g ven Bedingungen überführt. Die Quelle für das Enzym ist isNaN03 2,0 g nicht kritisch, vorzugsweise wird aber ein solches Präparat MgS04-7H20 0,2 g aus einem der fünf Gattungen der in der Veröffentlichung von KCl 0,04 g
Whittenbury et al. offenbarten Mikroorganismen oder aus ei- CaCl2 0,015g nem der fakultativ Methylotrophen (Methylobacterium) und FeS04-7H20 1,0 mg
Züchten des Mikroorganismus in einem Methan und Sauer- 20 CuS04-5H20 0,01 mg
Stoff enthaltenden Nährmedium, wie oben beschrieben, erhal- H3B04 0,02 mg ten. Das Nährmedium kann das sein, das von Whittenbury et MnS04-5H20 0,02 mg al. beschrieben wurde, oder noch mehr bevorzugt das Kultur- ZnS04 0,14 mg medium, das von Foster und Davis, J. Bacteriol. 91, M0O3 0,02 mg
1924-1931 (1966) beschrieben wurde. Das Enzympräparat 25 Der pH-Wert des Nährmediums wurde durch Zugabe von wird dann mit einem C2-C4-Alken, nämlich Äthylen, Prop- Säure oder Base auf 7,0 eingestellt, und 50 ml-Teilmengen des ylen, Buten-1, Buten-2 oder konjugiertem Butadien oder de- Nährmediums wurden in eine Reihe von 300 ml-Schüttelkol-ren Gemischen in Gegenwart von Sauerstoff z.B. in einer Puf- ben gegeben. Die Schüttelkolben wurden mit einer Inokula-ferlösung in Berührung gebracht, und das Gemisch wird in- tionsschleife mit Zellen von einer Agar-Platte mit homogenen kubiert, bis der gewünschte Umwandlungsgrad erzielt ist. 30 Kolonien der Mikroorganismen auf der Platte beimpft (die Darauf wird das Epoxid durch herkömmliche Massnahmen, Reinheit der Isolate wurde durch mikroskopische Prüfung be-zum Beispiel Destillation usw., gewonnen. stätigt). Die Isolate waren auf Agar-Platten unter einer
Um den notwendigen, wirksamen Kontakt von Sauerstoff Atmosphäre aus Methan und Luft mit einem 1:1 Vol/Vol-und Enzym zu erleichtern oder zu ermöglichen (ob es nun ein Gasverhältnis gehalten worden, die alle zwei Wochen über-Enzympräparat oder methylotrophe Mikroorganismen sind), 35 tragen worden waren. Die Gasphase der beimpften Kolben wird zur Erzielung bester Ergebnisse vorzugsweise ein starker, wurde dann durch ein Gasgemisch aus Methan und Luft mit fein zerteilter Luftstrom in eine kräftig gerührte Dispersion einem Verhältnis von 1:1 auf Volumen/Volumen-Basis er-des Olefins im Epoxydationsmedium eingeführt, das im allge- setzt. Die beimpften Kolben wurden luftdicht verschlossen meinen Wasser und einen Puffer enthält und in dem das En- und auf einem Rotationsschüttler mit einem Orbitalradius zympräparat oder die Mikroorganismenkultur suspendiert to von 2,5 cm bei 250 UpM und bei 30 °C zwei Tage inkubiert, ist. Das Enzympräparat kann dann vom flüssigen Medium bis sich die Trübung des Mediums entwickelt hatte.
abgetrennt werden, vorzugsweise durch Filtrieren oder Zen- Die Zellen wurden durch 30-minütiges Zentrifugieren bei • trifugieren. Das anfallende Epoxid kann dann im allgemeinen 4 °C und 10 000 g gesammelt. Der Zellklumpen wurde zweierhalten werden. mal mit einem 0,15 m Phosphatpuffer beim pH 7,0 (mit
Das erfindungsgemässe Verfahren kann ansatzweise, 45 0,002 m MgCl2) gewaschen. Die gewaschenen Zellen wurden halbkontinuierlich, kontinuierlich, im Gleichstrom oder im dann in einem 0,15m Phosphatpuffer bei pH 7,0 suspendiert. Gegenstrom durchgeführt werden. Gegebenenfalls wird die Ein 0,5 ml-Anteil einer jeden gewaschenen Zellsuspension
Suspension, die das Enzympräparat oder methylotrophe Mi- (2 mg Zellen) wurde in 10 ml-Glasröhrchen bei 4 °C gebracht, kroorganismen und eine Pufferlösung enthält, unter kräfti- die mit einem Gummistopfen verschlossen wurden. Die Gas-gem Rühren im Gegenstrom zu einem in einem Rohrreaktor 50 phase der Glasröhrchen wurde durch Vakuum entfernt und aufsteigenden Luftstrom nach unten geführt. Die obere dann durch ein Gasgemisch aus Alken und Sauerstoff im Vo-
Schicht wird von der nach unten fliessenden Suspension ent- lumenverhältnis 1:1 ersetzt. Dann wurde bei 30 °C an einem fernt, während Kultur- und zurückbleibende Pufferlösungs- Rotationsschüttler mit 300 UpM inkubiert. Produktproben bestandteile, zumindest teilweise, mit weiterem Olefin und (3 |il) wurden mit einer Mikrospritze periodisch entnommen unter Zugabe von frischem Enzympräparat oder methylotro- 55 und die Produkte gaschromatographisch analysiert (Ionisa-phem Mikroorganismus, je nach Bedarf, rückgeführt werden, tionsflammendetektorsäule).
Das Wachstum der methylotrophen Mikroorganismen Tabelle I zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für und der Epoxydationsprozess können bequemerweise durch die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation von gleichzeitiges Durchführen, aber getrennt und unter Anwen- Propylen durch gewaschene Zellsuspensionen mehrerer Mi-dung einer viel stärkeren Belüftung beim Epoxydationspro- 60 kroorganismen, deren Stämme nach der oben beschriebenen zess (zum Beispiel mit einem Luftüberschuss von wenigstens Versuchsarbeitsweise mit Methan gezüchtet worden waren, dem zweifachen dessen, was für das Wachstum erforderlich Aus diesen Daten ist zu ersehen, dass die mit Methan gezüch-ist, vorzugsweise mit wenigstens fünffacher Belüftung) gekop- teten Mikroorganismen, die Methan zu Methanol zu hydro-pelt werden. Sowohl der Wachstumsprozess als auch der Ep- xylieren vermögen, auch Propylen in Propylenoxid überfüh-oxydationsprozess können im gleichen Reaktor aufeinander- 65 ren können.
7
Tabelle I
Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Methan-Hydroxylierung und die Propylen-Epoxydation
647 805
Umwandlungsgeschwindigkeiten (uMol/h/mg Protein) (a)
Mikroorganismus
Methan-Hydroxy
Propylen ->
Stämme (b)
lierung
Propylenoxid
Methylosinus trichosporium OB3b
1,5
3,6
(NRRL B-ll.196)
Methylosinus sporium 5
1,1
2,0
(NRRL B-l 1.197)
Methylocystis parvus OBBP
0,7
1,6
(NRRL B-l 1.198)
Methylomonas methanica S,
1,3
2,7
(NRRL B-l 1.199)
Methylomonas albus BG8
1,8
1,4
(NRRL B-l 1.200)
Methylobacter capsulatus Y
1,2
1,5
(NRRL B-l 1.201)
Methylobacterium organophilum XX
1,0
1,8
(ATCC 27.886)
(a) Die Produkte Methanol und Propylenoxid wurden gaschromatographisch durch Vergleich der Retentionszei-ten mit authentischen Standard-Proben identifiziert.
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
Tabelle II zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Hydroxylierung von Methan und Epoxydation von Propylen (aus Tabelle I) und die Epoxydation von Äthylen, Buten-1 und Butadien durch gewaschene Zellsuspensionen von zwei Mikroorganismusstämmen, die nach der oben beschriebenen Versuchsarbeitsweise mit Methan gezüchtet worden waren. Diese mit Methan gezüchteten Mikroorganismen produzierten bei Berührung mit Penten-1 und Hexen-1 in Gegenwart von Luft kein nachweisbares Epoxid. Den Daten ist auch zu entnehmen, dass die Umwandlungsgeschwindigkeiten für Propylen in Propylenoxid für die jeweiligen mit 30 Methan gezüchteten Mikroorganismen höher waren als für die anderen Umwandlungen.
Tabellen
Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Methan-Hydroxylierung und die Epoxydation von a-Olefinen
Umwandlungsgeschwindigkeiten (uMol/h/mg Protein) (a)
Mikroorganismus
Methan
Äthylen
Propylen
Buten-1
Butadien
Pentan-1
Hexen-1
Stämme (b)
-»
—> ,
—>
—>
—>
->
Methanol
Äthylen
Propylen
1,2-Epoxy-
1,2-Epoxy-
1,2-Epoxy-
1,2-Epoxy-
oxid oxid butan buten pentan hexan
Methylosinus trichosporium
1,5
1,9
3,6
0,45
2,6
0
0
OB3b (NRRL B-l 1.196)
Methylosinus sporium 5
1,8
1,1
2,0
0,8
1,5
0
0
(NRRL B-ll.197)
(a) Die Produkte wurden gaschromatographisch durch Vergleich der Retentionszeiten mit authentischen Standardproben identifiziert (die Produktidentifizierung wurde ergänzt durch die Feststellung des Vorhandenseins oder Fehlens von Pro-duktpeaks vor und nach der Bromierung oder sauren Hydrolyse. Die Analyse zeigte auch, dass keine weitere Oxydation des Epoxidprodukts eintrat).
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
Die oben beschriebene Versuchsarbeitsweise wurde im Falle der Stämme Methylocystis parvus OBBP (NRRL B-ll 198), Methylomonas methanica S] (NRRL B-l 1 199) und Methylomonas albus BG8 (NRRL B-ll 200) wiederholt, und gewaschene Zellsuspensionen dieser mit Methan gezüchteten Mikroorganismen wurden erfolgreich zur Umwandlung von Äthylen in Äthylenoxid mit Umwandlungsgeschwindigkeiten von 0,9,0,95 und 1,2 ^Mol/h/mg Protein bei einem Trockengewicht der Zellen von 0,2 g/100 ml der Kulturbrühe verwendet.
Wie oben gezeigt, wurde ein neues Verfahren gefunden, 6o wonach Propylenoxid durch Inkubieren von Propylen in Gegenwart von Zellen oder zellfreien Extrakten von Mikroorganismen (oder daraus entstammenden Enzymen), die in Gegenwart von Methan aerob gezüchtet und anschliessend gesammelt worden sind, erhalten wird. Diese Mikroorganismen 65 vermögen bekanntlich kurzkettige Alkane zu hydroxylieren (z.B. Methan zu Methanol), und manche Forscher haben vermutet, dass, wenn sie ungesammelt, d.h. in der Gegenwart von Methan gelassen werden, sind, sie in der Lage seinkönn
647805
ten, Äthylen zu epoxydieren. Es wurden jedoch keine Beweise dafür angeführt. Es wurde nun gefunden, dass gesammelte, mit Methan aerob gezüchtete Mikroorganismen und deren Enzympräparate die Fähigkeit haben, Propylen mit verhältnismässig höheren Umwandlungsraten als im Falle von Äthylen, Buten-1 und Butadien, zu epoxydieren. In Ansatzversuchen unter Verwendung gewaschener, mit Methan gezüchteter Zellen verläuft die Epoxydationsreaktion wenigstens zwei Stunden linear. Eine weitere Oxydation des Epoxid-Produkts wurde nicht nachgewiesen.
Das Epoxydations-Enzymsystem der mit Methan aerob gezüchteten Mikroorganismen ist (durch das Methan) induzierbar, und das Epoxid-Produkt sammelt sich extrazellulär an (das heisst nach der Reaktion wurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und das Epoxid-Produkt fand sich nur in der überstehenden Flüssigkeitsfraktion und nicht in dem Zellkuchen). Die Möglichkeit des Vorliegens von Propanal als Oxydationsprodukt des Propylens wurde als Ergebnis einer Gas/Flüssigkeits-chromatographischen Analyse ausgeschaltet.
Bei vergleichenden Versuchstests besassen gewaschene Suspensionen der mit Methanol gezüchteten Mikroorganismenstämme Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-ll 196), Methylocystis parvus OBBP (NRRL B-ll 198), Methylomonas methanica Si (NRRL B-l 1 199) und Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-l 1 201) nicht die Fähigkeit, Methan zu hydroxylieren, oder die Fähigkeit, C2-C4-Alkene, insbesondere Propylen, zu epoxydieren. Daraus ergibt sich, dass nur die mit Methan gezüchteten Mikroorganismen sowohl Methan-Hydroxylierungs- als auch C2-C4-Epoxydationsver-mögen besitzen.
Wie zuvor angegeben, können sowohl die ganzen Zellen als auch die zellfreien Extrakte mit Oxygenase-enzym-Aktivi-tät der mit Methan gezüchteten Methylotrophen bei den Hydroxylierungs- und Epoxydationsreaktionen in Gegenwart von Luft verwendet werden. NADH und Metall (Eisen oder Kupfer) können zugesetzt werden, um die Aktivität zu verstärken, wenn die zellfreien oder reinen Enzympräparate verwendet werden. Bei Verwendung des zellfreien Enzymsystems gemäss der Erfindung wurden die Enzympräparate wie folgt hergestellt:
Herstellung von Zellfraktionen
Organismen wurden in 2,8 1-Kolben mit 700 ml Mineralsalzmedium, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Methan (Methan und Luft im Volumenverhältnis 1:1) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle gezüchtet. Zellen wurden während des exponentiellen Wachstums durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 12 000 g und 4 °C gewonnen. Sie wurden zweimal mit 25 mmol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 5 mmol MgCl2 gewaschen und im gleichen Puffer suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden bei 4 °C durch einen einzigen Durchgang durch eine Französische Druckzelle (1034 bar bzw. 15 000 lb/in2) zerstört und 15 min bei 5 000 g zentrifugiert, um nicht-aufgebrochene Bakterien zu entfernen. Die überstehende Lösung (Rohextrakt) wurde dann 30 min bei 40 000 g zentrifugiert und lieferte eine Teilchen-P(40)-und lösliche S(40)-Fraktion. Die S(40)-Fraktion wurde anschliessend 60 min bei 80 000 g zentrifugiert und lieferte eine Teilchenfraktion P(80) und eine lösliche Fraktion S(80). Die Teilchenfraktionen P(40) und P(80) wurden in 25 mmol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 5 mmol MgCl2 suspendiert und bei 4 °C homogenisiert.
8
Enzymtest
Die Oxydation von Methan und Propylen durch Teilchenfraktionen P(40) und P(80) und die lösliche Fraktion S(80) wurde bei 30 °C durch Bestimmung der Produktion von s Methanol bzw. Propylenoxid gemessen. Die Reaktionsgemische enthielten in 1,0 ml: 150 mMol Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 5 mMol MgCl2,0,6 ml; IOhMoI NADH und Zellfraktion.
Reaktionsgemische waren in 10 ml-Probenröhrchen bei io 4 °C enthalten. Diese wurden mit Gummikappen verschlossen. Die Gasphase in den Probenröhrchen wurde mit Vakuum abgesaugt und dann durch ein Gasgemisch aus Methan oder Propylen und Sauerstoff im Volumenverhältnis 1:1 ersetzt. Die Oxydation anderer gasförmiger n-Alkane und n-Alis kene wurde untersucht, wie oben beschrieben. Für flüssige Substrate wurden 10 p.1 Substrat direkt verwendet. Probenröhrchen wurden dann bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler bei 200 UpM inkubiert.
Die Produkte der Epoxydation von n-Alkenen und die 20 Hydroxylierung von n-Alkanen wurde durch Flammenioni-sationsgaschromatographie unter Verwendung einer rostfreien Stahlsäure (3,65 m x 3,2 mm bzw. 12' x 1/8"), gepacktmit 10% Carbowax 20M auf 80/100 Chromosorb W und einer Porapak Q-Säule geprüft. Die Ausdrücke «Carbowax», 25 «Chromosorb» und «Porapak» sind eingetragene Warenzeichen. Die Säulentemperatur wurde bei 120 °C konstant gehalten. Die Trägergasströmungsgeschwindigkeit betrug 30 ml/ min Helium. Die verschiedenen Produkte wurden durch Vergleich der Retentionszeiten und gemeinsame Chromatogra-30 phie mit authentischen Standardproben identifiziert.
Spezifische Aktivitäten wurden als (xMol der pro Stunde pro mg Protein gebildeten Produkte ausgedrückt. Konzentrationen an Protein in verschiedenen Fraktionen wurden nach der Methode von Lowry et al., J. Biol. Chem. 193,265-275 35 (1951) bestimmt.
Verteilung der n-Alkan- und n-Alken- Oxydationsaktivitäten in Zellfraktionen
Drei verschiedene Gruppen Methan-verwertender Organo nismen wurden ausgewählt, um die Oxydation von n-Alka-nen (Cr-C4) und n-Alkenen (C2-C4) in zellfreien Systemen zu untersuchen. Zellfraktionen wurden aus obligaten, Methanverwertenden Organismen des Typs I, Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL B-ll 208) und Methylococcus capsulatus « (Texas, ATCC19 069); obligaten, Methan-verwertenden Organismen des Typs II, Methylosinus trichosporium (OB3b, NRRL B-l 1 196) und Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) und einem fakultativen, Methan-verwertenden Bakterium, Methylobacterium sp (CRL-26, NRRL B-ll so 222), hergestellt.
Tabelle III zeigt die Verteilung der Methan- und Prop-ylen-Oxydationsaktivität in verschiedenen, aus diesen Organismen stammenden Fraktionen. Etwa 85-90% der Gesamtaktivität wurde in der P(40)-Fraktion und 10% in der P(80)-55 Fraktion nachgewiesen. Die lösliche Fraktion S(80) enthielt keine Aktivität. Die spezifischen Aktivitäten für die Methan-und die Propylenoxydation in den Fraktionen P(40) und P(80) variierte in den verschiedenen untersuchten Organismen nicht wesentlich (Tabelle IV). Die Epoxydation von 60 Propylen und die Hydroxylierung von Methan hängen beide vom Vorhandensein von Sauerstoff und NADH ab. NADPH oder Ascorbat und andere Elektronenträger könnten auch verwendet werden. Beide Reaktionen waren in den ersten 15 min linear, gemessen durch gaschromatographischen Pro-65 duktnachweis.
9
647805
Tabelle III
Verteilung der Propylen- und Methan-Oxidationsaktivitäten in Zellfraktionen von Methylotrophen
Mikroorganismus
Typ I Obligate Methylotrophe Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL B-l 1208) Methylococcus capsulatus (Texas, ATCC19 069)
Typ II Obligate Methylotrophe Methylosinus sp (CRL-15, NRRL B-l 1202) Methylosinus trichosporium (OB3b, NRRL B-ll 196 Fakultative Methylotrophe Methylobacterium sp. (CRL-26, NRRL B-l 1222)
% Verteilung in der Zellfraktion Propylen-Epoxyda- Methan-Hydroxylie-tionsaktivität (a) rungsaktivität (a) P(40) P(80) S(80) P(40) P(80) S(80)
85 15 0
89 11 0
87 13 0
82 18 0
85 15 0
87 13 0 90 10 0
88 12 0 83 13 0
82 18 0
(a) Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt.
Tabelle IV
Geschwindgkeit der Methan-Hydroxylierung und Propylen- Epoxydation in den Zellfraktionen von Methylotrophen
Zellfraktion
Mikroorganismus
Typ 1 Obligater Methylotroph Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL B-l 1208) Methylococcus capsulatus (Texas, ATCC 19 069)
Typ II Obligater Methylotroph Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) Methylosinus trichosporium (OB3b, NRRL B-ll 196) Fakultativer Methylotroph Methylobacterium sp. (CRL-26, NRRL B-l 1 222)
Propylen-Oxyda-tionsaktivität (a) P(40) P(80) S(80)
Methan-Oxydations-aktivität (a) P(40) P(80) S(80)
2,2 2,6
3,8 2,8
2,0 2,0
3,7 2,5
2,9 3,8
4,8 3,1
2,7 3,9
4,2 3,0
0 0
0 0
1,2 1,1 0
2,7 2,8 0
(a) Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Produkt der Reaktion wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation der Reaktionsgemische bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. Die Oxydationsgeschwindigkeit ist ausgedrückt als |xMol Produkt pro Stunde und mg Protein.
Die Teilchenfraktionen P(40) und P(80) aus verschiedenen Organismen katalysierten auch die Epoxydation von anderen n-Alkenen (Äthylen, 1-Buten und 1,3-Butadien) zu den entsprechenden 1,2-Epoxiden und die Hydroxylierung von Methan und Äthan zu den entsprechenden Alkoholen. Tabelle V zeigt die Oxydationsgeschwindigkeit verschiedener n-Al-kane und n-Alkene durch die Teilchenfraktion P(40) von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202). Das Oxydationsprodukt wurde nach Inkubieren der P(40)-Fraktion mit verschiedenen Substraten bei 30 °C für 10 min gaschromatographisch identifiziert.
so Substrat
Produkt
Tabelle V
Oxydation von n-Alkenen und n-Alkanen durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-l 1202)
55
60
Geschwindigkeit der Produktbildung (a) (uMol/h/mg Protein)
Äthylen
Äthylenoxid
1,27
Propylen
Propylenoxid
4,1
1-Buten
Epoxybutan
2,18
Butadien
Epoxybuten
0,63
1-Penten
-
0
Methan
Methanol
4,8
Äthan
Äthanol
3,2
(a) Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler eres mittelt.
Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) wurde für weitere Studien zum Einfluss verschiedener Umgebungsfak
647 805
toren auf die Methan- und Propylen-Oxydationsaktivitäten in zellfreien Systemen ausgewählt.
Einßuss der Konzentration der Teilchenfraktion
Der Einfluss der Konzentration der P(40)-Teilchenfrak-tion auf die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation von Propylen wurde untersucht. Die Produktion von Methanol und Propylenoxid war direkt abhängig von der Konzentration der Teilchenfraktion im Bereich von 1-6 mg Protein/ml. Die Reaktionsgeschwindigkeit nahm bei weiterer Erhöhung der Konzentration des teilchenförmigen Proteins auf 8 mg/ml ab.
Zeitverlauf der Reaktionen
Die Geschwindigkeit der Bildung von Methanol und Propylenoxid durch Hydroxylierung von Methan bzw. Epoxydation von Propylen durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) war mit der Zeit bis zu 15 min linear.
Der Einfluss des pH- Werts
Der Einfluss des pH-Werts der Hydroxylierung von Methan und der Epoxydation von Propylen durch die P(40)-Teil-chenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-l 1 202) wurde durch Ermitteln der nach 10 min Inkubation des Reaktionsgemischs gebildeten Menge an Methanol und Propylenoxid untersucht. Der optimale pH-Wert sowohl für die Hydroxylierung von Methan als auch die Epoxydation von Propylen wurde zu 7,0 festgestellt. Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. 100% Aktivität entspricht 4,8 bzw. 4,1 uMol des gebildeten Methanols oder Propylenoxids pro Stunde und mg Protein.
Einfluss der Temperatur
Der Einfluss der Temperatur auf die Bildung von Methanol und Propylenoxid durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) wurde nach 10-minütigem Inkubieren von Reaktionsgemischen bei verschiedenen Temperaturen untersucht. Die Optimaltempera-
10
tur für die Epoxydation von Propylen und die Hydroxylierung von Methan war 35 °C. Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatogra-5 phisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt . 100% Aktivität entsprechen 5,0 bzw. 4,2 uMol des gebildeten Methanols bzw. Propylenoxids pro Stunde und mg Protein.
io Einfluss der Lagerung
Es wurde festgestellt, dass sowohl die Aktivität der Hydroxylierung von Methan als auch der Epoxydation von Propylen durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) bei Kühlschranktemperatur 15 (0-4 °C gleichzeitig sanken. Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. 20 100% Aktivität entsprechen 4,8 bzw. 4,1 jiMol des gebildeten Methanols bzw. Propylenoxids pro Stunde und mg Protein.
Einfluss von Inhibitoren
Es ist berichtet worden, dass die Oxydation von Methan 25 durch Zellsuspensionen von Methan-verwertenden Bakterien durch verschiedene metallbindende oder metallchelatisieren-de Mittel gehemmt wird (Patel et al., J. Bacteriol. 126, 1017-1019 (1976) ). Daher wurde der Einfluss von Inhibitoren auf Methan- und Propylen-Oxydationsaktivitäten durch 30 die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) untersucht. Die Bildung von Methanol und Propylenoxid wurde durch verschiedene metallbindende Verbindungen mit verschiedenen liganden Kombinationen, das heisst Stickstoff-Stickstoff (a,a-Bipyridyl), Sauerstoff-Stick-35 stoff (8-Hydroxychinolin) und Schwefel-Stickstoff (Thio-harnstoff, Thiosemicarbazid), wie in Tabelle VI gezeigt, gehemmt. Dies legt die Beteiligung von Metallionen an der Oxydation sowohl der Hydroxylierung von Methan als auch der Epoxydation von Propylen nahe. Ähnlich hemmen, wie in 40 Tabelle Via gezeigt, diese Verbindungen auch die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation von Propylen,
wenn zellhaltige Enzympräparate verwendet werden.
Tabelle VI
Einfluss des Inhibitors auf die Aktivität zur Epoxydation von Propylen und Hydroxylierung von Methan durch Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202)
Inhibitor
Kontrolle a,a-Bipyridyl
1,10-Phenanthrolin
Kaliumzyanid
Thiosemicarbazid
Thioharnstoff
8-Hydroxychinolin
Konzentration (Mol)
10~3 10-3
10"3 io-3
IO"3
10-3
%Hemmung (a) Propylen-Epoxydations-aktivität
0 98 93 98
97
98 75
Methan-Hydroxy-
lierungsaktivi-
tät
0 99 90 100 100 98 80
(a) Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. Die ungehemmten Oxydationsgeschwindigkeiten für Methan und Propylen waren 4,5 bzw. 4,1 uMol gebüdetes Methanol bzw. Propylenoxid pro Stunde und mg Protein in der P(40)-Fraktion von Methylosinus sp.(CRL-l 5, NRRL B-l 1202).
11
647 805
Tabelle Via
Einfluss von Inhibitoren auf die Epoxydation von Propylen und die Hydroxylierung von Methan
% Hemmung
Methylosinus trichosporium Methylococcus capsulatus Methylobacterium organophi-OB3b (NRRL B-l 1196) (CRL, Ml, NRRL B-l 1 219) lum (CRL 26, NRRL B-l 1
222)
Inhibitor
Epoxy
Hydroxy
Epoxy
Hydroxy
Epoxy
Hydroxy
dation lierung dation lierung dation lierung
Thioharnstoff
100
100
100
100
100
100
1,10-Phenanthrolin
90
92
95
95
90
90
a,a-Bipyridyl
100
90
100
100
100
100
Imidazol
95
90
95
95
100
100
Kaliumzyanid
100
100
100
100
95
95
Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Produkte wurden gaschromatographisch nach 1 h Inkubation bei 30 °C ermittelt. Jeder Inhibitor wurde mit einer Endkonzentration von 1 mMol zugesetzt.
20
Einfluss von Metallen
Da die Methan-mono-oxygenase aus Methan-verwerten- Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202)untersucht. Die den Bakterien ein kupfer- oder eisenhaltiges Protein ist (Ton- Geschwindigkeit der Hydroxylierung von Methan zu Me-
ge et al., J. Biochem. 161,333-344 (1977) ), wurde der Ein- thanol und der Epoxydation von Propylen zu Propylenoxid fluss von Kupfer- und Eisensalzen auf die Oxydation von 2s wurde in Gegenwart zugesetzter Kupfersalze zweifach erhöht
Methan und Propylen durch die P(40)-Teilchenfraktion von (Tabelle VII).
Tabelle VII
Einfluss von Metallen auf die Aktivität zur Epoxydation von Propylen und Hydroxylierung von Methan durch Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202)
Metall Konzentration (Mol) Propylen-Oxydationsaktivität Methan-Oxydationsaktivität
(a) (uMol/h/mg Protein) (a) (|j,Mol/h/mg Protein)
Kontrolle - 4,5 4,0
Eisen(III)chlorid 10~3 5,8 4,8
Eisen(II)sulfat 10 3 5,9 4,8
Kupfer(I)chlorid 10 3 9,2 7,2
Kupfer(II)sulfat 10 3 9,0 7,1
(a) Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. Die Oxydationsgeschwindigkeiten wurden als (iMol des gebildeten Produkts pro h und mg Protein in der P(40)-Fraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202) ausgedrückt.
Substrat-Konkurrenzversuche Tabelle VIII ._
Die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation Einfluss von Methan auf die Propylen-Epoxydationsakti-
von Propylen durchTeilchenfraktionen Methan-verwertender V°n Methylosmus sp"
Bakterien erfordert Sauerstoff und NADH. Die Frage, ob (L-KL'n'JNKKL a~l 1 mi)
dasselbe oder ein ähnliches Enzym an der Oxydation beider so <j , . r ,
Substrate beteiligt ist, wurde durch Substrat-Konkurrenzver- u s ra pe ^ .,
suche geprüft. Der Versuch bestand in der Bestimmung des + •
Einflusses von Methan auf die Oxydation von Propylen zu UMol/n/mg Protein
Propylenoxid durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylo- Propylen 4,3
sinus sp. (CRL-15, NRRL B-ll 202). Wie in Tabelle VIII ge- 55 Propylen + Methan zeigt, ergab sich eine Senkung der Menge an in Gegenwart n-ivi/vn 18
von Methan gebildetem Propylenoxid. Folglich hemmte Meth n o'
Methan die Umwandlung von Propylen in Propylenoxid, ver- a mutlich durch Konkurrenz um die verfügbare Enzymstelle. (a) Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben
60 durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5,10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 °C auf einem Rotationsschüttler ermittelt.
65 Ähnlich beeinflusst Methan die Epoxydation von Propylen aus Zellsuspensionen von mit Methan gezüchtetem Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-ll 196), wie in Tabelle Villa gezeigt.
647805
Tabelle Villa
Einfluss von Methan auf die Epoxydation von Propylen
(a)
Zusammensetzung der Gasphase Gebildetes %
Propylen- Hemmung oxid (uMol)
Propylen + Helium + 02
(25:25:50 Vol/Vol) 1,6 0
Propylen + Methan + 02
(25:25:50Vol/Vol 0,8 50
(a) Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben, mit der Ausnahme, dass verschiedene Gaszusammensetzungen verwendet wurden, um einen konstanten Propylen-Partialdruck aufrechtzuerhalten. Zellsuspensionen von mit Methan gezüchtetem Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-l 1 196) (3,6 mg) wurden verwendet. Propylenoxid wurde gaschromatographisch nach 15 min Inkubation ermittelt.
Stöchiometrie der Propylen- und Methan-Oxydation
Die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-l 1 202) wurde zur Bestimmung der Stöchiometrie der Hydroxylierungs- und Epoxydationsreaktion verwendet. Die Stöchiometrie der Methan- oder Propylen-ab-hängigen NADH-Oxydation, der Sauerstoffverbrauch und die Produktbildung waren etwa 1:1:1 (Tabelle IX). Dies steht im Einklang mit der Katalyse der Methan- oder Propylen-Oxydation durch eine Monooxygenase.
Tabelle IX
Stöchiometrie der Propylen-Epoxydation und Methan-Hydroxylierung durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRB-ll 202) (a)
Substrat
Gebildetes
NADH,
02 ver
(UMol)
Produkt oxydiert braucht
(|iMol)
(uMol)
QiMol)
Propylen
Propylen oxid
5,0
4,5
5,0
4,8
Methan
Methanol
5,0
4,2
4,8
4,6
(a) Unter identischen Reaktionsbedingungen erfolgt die Ermittlung des oxydierten NADH spektrophotometrisch, die Ermittlung des verbrauchten Sauerstoffs wurde pola-rographisch gemessen und die Ermittlung des gebildeten Produkts erfolgte gaschromatographisch.
Vergleichsweise wurde die Stöchiometrie der Epoxydation von Propylen durch eine Zellsuspension von Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-l 1 196) wie folgt bestimmt: Das Reaktionsgemisch (3,0 ml) enthielt 0,05 m Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, und 3,6 [iMol Propylen. Die Reaktion wurde durch Einspritzen von 0,1 ml Zellsuspension (3,1 mg Protein) gestartet. Eine Korrektur erfolgte für den endogenen Verbrauch von Sauerstoff. Die Menge des während der Reaktion (3 min) verbrauchten Sauerstoffs wurde polarographisch mit einer Clark-Sauerstoffelektrode bestimmt. Das verbrauchte Propylen und das gebildete Propylenoxid wurden gaschromatographisch ermittelt. Der Propylenverbrauch war 0,29 |iMol, der Sauerstoffverbrauch 0,30 jiMol und das gebildete Propylenoxid 0,28 ^iMol.
Um weiter nachzuweisen dass die Enzymaktivität in der Teilchenfraktion (nicht in der überstehenden Flüssigkeit) steckt, wurden die folgenden Versuche durchgeführt. Zellen von mit Methan gezüchtetem Methylococcus capsulatus
12
(CRL Ml, NRRL B-ll 219) wurden nach der Methode des Beispiels 1 erhalten. Der Rohextrakt nach Zentrifugieren bei 10 000 g der durch Schalleinwirkung aufgebrochenen Zellen (3 x 50 s, Ultraschalloszillator Modell W 201 der Wave En-5 ergy System, Inc.) zeigte Aktivität weder für die Epoxydation noch für die Hydroxylierung. Wurden die Zellen jedoch durch zweimaligen Durchgang durch eine Französische Druckzelle (1 000 kp Druck) aufgebrochen, fanden sich beide Aktivitäten im Rohextrakt nach Zentrifugieren bei 10 000 g. io Die gesamte Aktivität des Rohextrakts wurde als Teilchenfraktion durch weiteres Zentrifugieren des Rohextrakts 90 min bei 40 000 g und 4 °C gesammelt. NADH stimulierte sowohl die Epoxydations- als auch die Hydroxylierungsreak-tion, wie in Tabelle X gezeigt.
15
Tabelle X
Epoxydations- und Hydroxylierungsaktivitäten in zellfreien Fraktionen von Methylococcus capsulatus (CRL Ml, NRRL B-ll 219) (a) 20 Oxydationsgeschwindigkeit
(nMol/30 min/Probe Zellfreie Epoxydation Hydroxylierung
Fraktionen von Propylen von Methan
(1) Teilchenfraktion 750
500
(10 000-40 000 g
(1) + NADH 900
650
(2) überstehende Frak
tion von 40 000 g 0
0
(2) + NADH 0
0
(a) Die Zellen wurden durch die Französische Druckzelle, wie oben beschrieben, aufgebrochen. NADH (2,5 |xMol) wurde, wo angegeben, dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Proteinmenge in der Teilchenfraktion und der bei 40 000 g 35 überstehenden Fraktion war 1 mg bzw. 2,5 mg. Jede Probe enthielt 0,5 ml Reaktionsgemisch.
Sowohl das System von Pseudomonas aeruginosa von Van der Linden, Biochem. Biophys. Acta., 77,157-159 40 (1963) als auch das System von Pseudomonas oleovorans, Abbott und Hou, Appi. Microbiol., 26,86-91 (1973) epoxy-diert flüssige 1-Alkene von C6 bis C!2, aber keine gasförmigen Alkene.
Die Erfindung führt zur Epoxydation von Äthylen, Prop-« ylen, 1-Buten und Butadien durch Zellsuspensionen aller drei verschiedener Gruppen von Methan-verwertenden Bakterien. Die Epoxydation von Alkenen und die Hydroxylierung von Methan wurden unter anaeroben Bedingungen oder mit Methanol gezüchteten Zellen nicht gefunden, was vermuten so lässt, dass das Enzymsystem induzierbar ist. Die Produkt-1,2-epoxide sammelten sich extrazellulär an. Der nicht-enzymati-sche Abbau von Propylenoxid im offenbarten Probensystem war selbst nach verlängerter Inkubationzeit unbedeutend. Van der Linden, a.a.O., wies die Produktion von 1,2-Epoxy-55 octan aus 1-Octen durch mit Heptan gezüchtete Zellen von Pseudomonas sp. nach und stellte auch fest, dass das Epoxid enzymatisch nicht weiter oxydiert wurde. May und Abbott, Biochem. Biophys. Res. Commun. 48,1230-1234 (1972) und J. Biol. Chem. 248,1725-1730 (1973) berichteten jedoch, 60 dass, wenn 1-Octen als Substrat dem ra-Hydroxylierungs-En-zymsystem von P. oleovorans zugeführt wurde, sowohl 8-Hydroxy-l-octen als auch 1,2-Epoxyoctan gebildet wurden. Ausserdem fanden Abbott und Hou, a.a.O., dass die Methylgruppe der letzteren Verbindung auch der Hydroxylierung 65 unterlag. Die vorliegenden, aus den Untersuchungen lebensfähiger Zellsuspensionen der Methan-verwertenden Bakterien erhaltenen Ergebnisse jedoch zeigen, dass Propylenoxid enzymatisch nicht weiter im Stoffwechsel verarbeitet wurde.
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Van der Linden, a.a.O., zeigte, dass die Epoxid-Ansamm- NRRL B-l 1196) (Typ II, obligate Methylotrophe); und lung von 1-Octen durch Pseudomonas aeruginosa durch den Methylobacterium sp. CRL-26, NRRL B-l 1 222) (ein fakul-Stoffwechsel einer grossen Menge von 1-Octen über Methyl- tativer Methylotroph) lieferte zellfreie Teilchenfraktionen, die gruppen-Epoxydation begleitet war. Bei der Epoxydation die Hydroxylierung von n-Alkanen und die Epoxydation von von Propylen durch Zellsuspensionen von Methan-verwer- s n-Alkenen katalysierten. Beide Aktivitäten lagen hauptsächtenden Bakterien jedoch wurde keine Bildung von 3-Hydr- lieh in der P(40)-Fraktion und waren von der Gegenwart von oxy-propen-1 nachgewiesen. Sauerstoff sowie einem Elektronenträger, zum Beispiel
Sowohl die Epoxydation der C2-C4-1 -Alkene als auch die NADH, abhängig.
Hydroxylierung von Methan mit den Zellsuspensionen wurde Die Hydroxylierung von Methan zu Methanol und die durch verschiedene metallbindende und metallchelatisierende u Epoxydation von Propylen zu Propylenoxid, durch die P(40)-
Mittel inhibiert, was die Beteiligung von metallhaltigen En- Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL
zymsystem(en) anzeigt. Das ähnliche Ausmass der Hemmung B-ll 202) katalysiert, haben ähnliche pH- und Temperatur-
sowohl für die Propylen- als auch die Methan-Oxydation (Ta- Optima. Beide Aktivitäten gingen bei der Lagerung der P(40)-
belle Via) zeigte, dass die Epoxydations- und Hydroxylie- Teilchenfraktion bei Kühlschranktemperatur gleichzeitig rungsreaktion durch dasselbe oder ein ähnliches Enzymsy- is verloren.
stem katalysiert werden kann. Die Epoxydation von Propylen Die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation zu Propylenoxid durch eine Zellsuspension eines mit Methan von Propylen mit den zellfreien Extrakten wurden durch vergezüchteten Stamms von Methylococcus capsulatus NRRL schiedene metallbindende oder metallchelatisierende Mittel B-l 1 219 wurde in Gegenwart des Hydroxylierungssubstrats, stark gehemmt (Tabelle VI). Die Geschwindigkeit beider ReMethan (Tabelle X) gehemmt (50%). Dies legt deutlich eine 20 aktionen wurde in Gegenwart von Kupfer- oder Eisensalzen Konkurrenz zwischen dem Hydroxylierungssubstrat und dem zweifach erhöht (Tabelle VII). Dies lässt die Beteiligung eines Epoxydationssubstrat um ein einziges Enzymsystem nahe. metallhaltigen Enzymsystems bei der Oxydation beider Sub-Wahrscheinlich katalysiert das Methan-monooxygenase-En- strate vermuten. Diese Ergebnisse und die Stöchiometrie der zymsystem sowohl die Epoxydation von Alken als auch die Hydroxylierungs- und Epoxydationsreaktion zeigen an, dass Hydroxylierung von Methan. Die Veröffentlichungen von 25 beide Reaktionen durch dasselbe metallhaltige Monooxygen-May und Abbott, a.a.O., berichteten, dass das oo-Hydroxylie- asesystem katalysiert werden können. Die Tatsache, dass die rungssystem von Pseudomonas oleovorans sowohl die Ep- Umwandlung von Propylen in Propylenoxid durch Methan oxydation von 1 -Octen als auch die Hydroxylierung von n- inhibiert wurde, stützt diese Vermutung.
Octan katalisierte. Es ist berichtet worden dass die zellfreien Teilchenfraktio-
Die Optimalbedingungen für die in-vivo-Epoxydation 30 nen, die aus Methylococcus capsulatus (Texas) (Ribbons et von Propylen durch Zellsuspensionen der drei verschiedenen al., J. Bacteriol., 122, 1351-1363 (1975) ), Methylomonas
Gruppen Methan-verwertender Bakterien sind recht ähnlich. methanica (Ferenci et al., J. Gen. MIcrobiol. 91,79-91
Die pH-Optima lagen bei etwa 6-7 und das Temperaturopti- (1975) ) und Methylosinus trichosporium (OB3b) (Tonge et mum um 35 °C. Die offensichtliche Abnahme der Epoxyda- al., Biochem. J., 161,333-344 (1977) ) die Sauerstoff- und tion über 40 "C mag sowohl auf der Instabilität des Mono- 35 NADH-abhängige Oxydation von Methan, Äthan, Propan,
oxygenasesystems als auch auf Flüchtigkeit des Produkts, Butan und Kohlenmonoxid katalysierten. Die Oxydation von
Propylenoxid (Sdp. 35 °C) beruhen. Methan durch Teilchenfraktionen dieser Organismen wurde
Sowohl die Hydroxylierungs- als auch die Epoxydations- durch verschiedene metallbindende oder metallchelatisieren-
aktivität sitzt in der zellfreien Teilchenfraktion, die beim Zen- de Mittel gehemmt. Die Epoxydation von n-Alkenen wurde trifugieren zwischen 10 000 und 80 000 g ausfällt. Tonge et 40 für diese Organismen jedoch nicht berichtet.
al., Biochem. J. 161,333-344 (1977) und FEBS Lett., 58, Die Methan-monooxygenase aus Methylosinus tricho-
293-299 (1975) haben die Reinigung einer membrangebunde- sporium (OB3b, NRRL B-l 1 196) wurde gereinigt, und es nen Methanmonooxygenase aus der Teilchenfraktion (beim zeigte sich, dass sie aus drei Komponenten bestand: einem
Zentrifugieren zwischen 10 000 und 150 000 g sedimentiert) löslichen, CO-bindenden Cytochrom c, einem kupferhaltigen von Methylosinus trichosporium OB3b berichtet. In jüngster 45 Protein (Methan-monooxygenase), und einem Protein niedri-
Zeit, aber nach den vorliegenden Erkenntnissen, haben Colby gen Molekulargewichts (Tonge et al., 1977, a.a.O.).
et al., Biochem. J., 165,395-402 (1977) eine einzigartige lös- Im Gegensatz zu den obigen Organismen berichteten Col-
liche Methan-monooxygenase aus Methylococcus capsulatus by et al., a.a.O., von der einzigartigen Aktivität löslicher
(Stamm Bath) nachgewiesen, die die Oxydation von n-Alka- Methan-monooxygenase aus Methylococcus capsulatus nen, n-Alkenen, Äthern und alicyclischen, aromatischen und 50 (Bath). Die Oxydation von Methan durch die lösliche Frak-
heterocyclischen Verbindungen katalysiert. Die Stämme der tion dieses Organismus wurde durch verschiedene metallbin-
drei verschiedenen Gruppen Methan-verwertender Bakterien, dende Mittel nicht inhibiert. Kürzlich lösten Colby und Dal-
die hier untersucht wurden, katalysieren alle die Epoxydation ton (Biochem. J. 171,461-468 (1978) ) die Methan-monooxy-
gasförmiger Alkene (C2-C4) und die Hydroxylierung gasför- genäse von Methylococcus capsulatus (Bath) in drei Kompo-
miger Alkane (C1-C4). Auch wurde unerwarteterweise gefun- 55 nenten auf und identifizierten eine der Komponenten als ei-
den, dass die Enzymaktivität in der Teilchenfraktion steckt senhaltiges Flavoprotein.
(das heisst in dem Material, das sich absetzt, wenn die über- Die Methan-oxydierenden Aktivitäten der oben beschrie-
stehende Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren aufgebrochener benen methylotrophen Bakterien liegen in der Teilchenfrak-
Zellen bei 10 000 g für 30 min eine Stunde lang bei 10 000 g tion und unterscheiden sich von der löslichen Aktivität von oder darüber zentrifugiert wird), nicht in der löslichen Frak- 60 Methylococcus capsulatus (Bath), wie von Colby et al. be-
tion (das heisst, der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zen- schrieben.
trifugieren aufgebrochener Zellen bei 80 000 g oder darüber Van der Linden (1963, a.a.O.) wies die Produktion von für eine Stunde). 1,2-Epoxiden aus l-Octen durch mit Heptan gezüchtete ru-
Differentielles Zentrifugieren von Suspensionen aufgebro- hende Zellen von Pseudomonas sp. nach. Epoxide wurden als chener Zelten von Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL B-l I 6s Produkte des Alkan-Stoffwechsels nicht nachgewiesen und
208 und Methylococcus capsulatus (Texas ATCC 19 069), wurden durch Pseudomonas sp. nicht oxydiert. So ist die Rol-
(Typ I, obligate Methylotrophe); Methylosinus sp. (CRL-15, le der Epoxide beim Alkan-Stoffwechsel ungewiss. Van der
NRRL B-11202) und Methylosinus trichosporium (OB3b, Linden postulierte, dass das Enzymsystem, das Epoxide bil
647805 14
det, das gleiche sein kann wie das System, das die Anfangs- aktionen katalysierte. Die Enzymsysteme aus Pseudomonas oxydation von Alkanen katalysiert. Cardini und Jurtshuk (J. und Corynebacterium sp. katalysierten die Epoxydation von
Biol. Chem. 245,2789-2796 (1970) ) fand, dass ein zellfreier Q-C^-n-Alkenen. Die Epoxydation von C2-C5-n-Alkenen Extrakt von einem Corynebacterium sp. die Oxydation von 1- wurde durch die Enzymsysteme von Pseudomonas nicht ka-
Octen zu Epoxyoctan zusätzlich zur Hydroxylierung von Oc- 5 talysiert.
tan zu Octanol bewirkte. McKenna und Coon (J. Biol. Chem. Vorliegend wurde unerwarteterweise gezeigt, dass die drei
245,3883-3889 (1970) ) isolierten ein Enzymsystem aus Pseu- verschiedenen Gruppen Methan-oxydierender Bakterien die domonas oleovorans, das die Hydroxylierung von n-Alkanen Hydroxylierung von n-Alkanen (Ci~C4) sowie die Epoxyda-
(C6-C12) und Fettsäuren katalysierte. Später berichteten Ab- tion von n-Alkenen (C2-C4) katalysieren. Ferner wird die bott und Hou, a.a.O., und May und Abbott, a.a.O., dass das i0 Hydroxylierungs- und Epoxydationsreaktion durch die glei-
Enzymsystem von Pseudomonas oleovorans auch die Epoxy- che oder eine ähnliche NADH-abhängige Monooxygenase dations von 1 -Alkenen zusätzlich zu den HydroxyUerungsre- katalysiert.
C
Claims (9)
1. Verfahren zur Epoxydation eines C2-C4-Alkens oder eines C4-Diens, dadurch gekennzeichnet, dass das Alken oder Dien unter aeroben Bedingungen in der Gegenwart von entweder Zellen eines bakteriellen methylotrophen Mikroorganismus, exklusive Methylococcus capsulatus Stamm Bath, oder eines Oxygenase-Enzympräparates aus den Zellen der genannten Mikroorganismen epoxidiert wird, wobei das Olefin mit den Zellen des Mikroorganismus oder dem Enzympräparat so lange inkubiert wird, bis das entsprechende Epoxid erhalten wird, und wobei genannter methylotropher Mikroorganismus aerob in einem Methan enthaltenden Nährmedium gewachsen ist.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzympräparat aus der Teilchenfraktion eines Extraktes von Zellen der genannten Mikroorganismen hergestellt ist.
3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzympräparat ein zellfreier Extrakt aus Zellen der genannten Mikroorganismen ist.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen von Mikroorganismen der Gattungen aus der Gruppe Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus und Methy-lobacterium eingesetzt werden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen von Mikroorganismen der Arten Methylosinus trichosporium, Methylosinus sporium, Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Methylomonas albus, Methylomonas streptobacterium, Methylomonas agile, Methylomonas rubrum, Methylomonas rosa-ceus, Methylobacter chroococcum, Methylobacter bovis, Methylobacter capsulatus, Methylobacter vinelandii, Methylococcus capsulatus, Methylococcus minimus und Me-thylobacterium organophilum eingesetzt werden.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass Zellen von Mikroorganismen der Stämme Methylosinus trichosporium OB3b NRRL B-l 1196; Methylosinus sporium 5 NRRL B-l 1197; Methylocystis parvus OBBP NRRL B-l 1198; Methylomonas methanica Sj NRRL B-l 1199; Methylomonas albus BG8 NRRL B-l 1 200; Methylobacter capsulatus Y NRRL B-l 1201; Methylo-bacterium organophilum sp. nov. ATCC 27 886; Methylomonas sp. AJ-3670 FERM P-2400; Methylococcus 999 NCIB 11 083; und Methylomonas SM 3 NCIB 11 084 eingesetzt werden.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Epoxydation ansatzweise erfolgt.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, dass die Epoxydation ansatzweise erfolgt und das Enzympräparat ein immobilisiertes Enzympräparat ist.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichent, dass die Epoxydation kontinuierlich erfolgt und das Enzympräparat ein immobilisiertes Enzympräparat ist.
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