DE2915108A1 - Epoxydation niederer alpha -olefine - Google Patents
Epoxydation niederer alpha -olefineInfo
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Description
Die Erfindung "bezieht sich auf die Umwandlung niederer oC-Olefine
in Epoxide. Insbesondere bezieht sie sich auf die Bildung von Propylenoxid aus Propylen und dieses enthaltenden Strömen
durch die Einwirkung von Sauerstoff und methylotrophen Mikroorganismen oder aus diesen stammenden Enzympräparaten.
Epoxide sind aufgrund ihrer Fähigkeit, zahlreiche chemische
Reaktionen, wie die Addition mit den aktiven V/ass er st of fat omen
nukleophiler Reagentien (z.B. Ammoniak, organischer Säuren,
Alkohole, Wasser usw.), einzugehen, äußerst wertvolle Produkte geworden. Die Produkte der Epoxydation (das heißt die 1,2-Epoxide,
auch als «(-Epoxide und Oxiran-Verbindungen bekannt) erfreuen
sich aufgrund ihres Polymerisationsvermögens unter thermischer, ionischer und freiradikalischer Katalyse zur Bildung von Epoxyhomo-
und -copolymer!saten auch industrieller Bedeutung. Äthylenoxid
und Propylenoxid stellen die beiden gewerblich wichtigsten Epoxide dar. Ein verbreitet angewandtes Verfahren ist das
silberkatalysierte "Direktoxydations"-Verfahren von lefort
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(US-PS 1 998 878 (1935) und die Beissue-PS'en 20 370 und
22 241).
In der NL-PS 291 163 (offengelegt am 25.6.1965) ist ein Verfahren zur Herstellung von 1,2-Epoxiden durch Kontaktieren
von ^-Olefinen mit Sauerstoff und Mikroorganismen offenbart,
die auf einem Kohlenwasserstoff wachsen und aus diesem Kohlenstoff assimilieren können. Diese Patentschrift lehrt, daß
der MikrοOrganismus vorzugsweise auf einem Kohlem^asserstoff
mit praktisch der gleichen Zahl der Kohlenstoffatome wie das of-Olefin gezüchtet wird, das der Epoxydation unterworfen wird.
Während, die allgemeine Beschreibung dieses Patents «rf-Olefine
mit 2 bis 30 Kohlenstoffatomen umfaßt, zeigt das einzige Beispiel in dieser Patentschrift die Epoxydation von 1-Octen in
Gegenwart von Luft und Pseudomonas aeruginosa (Stamm 473), der auf n-He'ptan gezüchtet worden war.
Whittenbury, Dalton, Eccleston und Reed (Microbial Growth on Ο,. Compounds: Proceedings of the International Symposium on
Microbial Growth on C^ Compounds, Society of Permentation
Technology, pp. 1-11 (1975)) berichteten, daß Hethan-oxydierende
Bakterien das interessante Merkmal besitzen, Substrate oxydieren, aber nicht verbrauchen zu können, sie wachsen beispielsweise
nicht auf Äthan, oxydieren es aber, wenn sie auf Methan wachsen oder zuvor mit Methan gezüchtet worden sind.
DeBont (Antonie van Leeuwenhoek, 42, 59-71 (1976)) berichteten, daß Äthylen durch bestimmte Gram-positive Bakterien oxydiert
wurde, die vermutlich zur Art Mycobacterium gehörten. DeBont berichtete, daß seine isolierten Stämme nicht in Gegenwart
von Methan wuchsen, und leitete daraus her, daß diese im Boden befindlichenBakterien keine Methan-oxydierenden Bakterien
waren. DeBont und Albers (Antonie van Leeuwenhoek, 42, 73-80 (1976)) nahmen an, daß das Oxydationsprodukt der äthylenoxydierenden
Stämme von DeBont (1976) Äthylenoxid war.
Hutchinson, Whittenbury und Dalton (J. Theor. Biol., 5J3, 325-
§09843/0882
335 (1976) "A Possible Role of !Free Radicals in the Oxidation
of Methane by Methylococcus capsulatus") und Oolby und Dalton
(J. Biochem., J57, 495-597 (1976) "Some Properties of a Soluble
Methane Mono-Oxygenase from Methylococcus capsulatus Strain Bath") berichteten, daß Äthylen durch lösliche Methan-monooxygenase
aus Methylococcus capsulatus, Stamm Bath, oxydiert wird. Diese letzteren Forscher berichteten, daß die "besonderen Membran-Präparate"
von Methylococcus capsulatus, Stamm Bath, keine Methan-oxygenase-Aktivität besaßen, bestimmt nach dem Test
des Brommeüian-Verschwindens.
Auf der Grundlage des O-Einbaus aus O2 in die Zellbestandteile
von Pseudomonas methanica vermuteten Leadbetter und Poster (Nature, t84_, 1428-1429 (1959)), daß an dem anfänglichen
oxydativen Angriff auf das Methan eine Oxygenase beteiligt ist,
Higgins und Quayle (J. Biochem., 118, 201-208 (197O)) isolierten
CH-, OH als Produkt der Methanoxydation, wenn Suspensionen
von Pseudomonas methanica oder Methanomonas methano-oxidans Methan in Op-angereicherten Atmosphären oxydieren konnten.
Die folgende Beobachtung einer Methan-stimulierten NADH-Oxydation,
katalysiert durch Extrakte von Methylococcus capsulatus, durch Ribbons (J. Baceriol., 122, 1351-1363 (1975)) und Ribbons
und Michalover, PEBS Lett. IJ-, 41-44 (1970) oder Methylomonas
capsulatus durch Perenci (PEBS Lett. £L, 94-98 (1974) ließ vermuten,
daß das für diese Oxydation verantwortliche Enzym eine Monooxygenase ist. Diese Porscher stützten sich auf indirekte
Enzymtests oder spektrophotometrischer Messung Methan-stimu- ■
lierten NADH-Verschwindens oder polarographischer Messung Methan-stimulierten
O2-VerSchwindens. In jüngerer Zeit wurden
Methan-monooxygenase-Systeme teilweise gereinigt aus Methylosinus trichosporium 0B3b (Tonge, Harrison und Higgins, J. Biochem.
161, 333-344 (1977) und Tonge, Harrison, Knowles und Higgins,
PEBS Lett., 5_8, 293-299 (1975) und Methylococcus capsulatus
(Bath) (Colby und Dalton, J. Biochem., VJ±9 461-468 (1978) und
Colby, Stirling und Dalton, J. Biochem., 1j$5, 395-402 (1977).
Es wurde nun gefunden, daß Cg-C.-n-Alkene und Butadien, insbe-
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sondere Propylen, nach einem energiearmen Intensiwerfahren hergestellt werden können, bei dem C„-C.-n-Alkene oder Butadien
mit Sauerstoff in Gegenwart von Mikroorganismen oder aus diesen stammenden Enzympräparaten in Berührung gebracht werden,
wobei die Mikroorganismen in einem Methan oder Dimethyläther enthaltenden mineralischen Nährmedium gezüchtet worden
sind. Die bei dem Verfahren verwendeten Mikroorganismen sind bevorzugt obligatorisch oder fakultativ Methylotrophe und
stammen vorzugsweise aus den Arten Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus und Methyl
obacterium.
Anders als beim silberkatalysierten "Direktoxydations-"Verfahren zur Herstellung von Äthylenoxid wurde ferner gefunden,
daß die mit Methan gezüchteten methyl ο trophen Mkr ο Organismen
oder ein daraus stammendes Enzympräparat «x'-Olefine mit zwei
bis vier Kohlenstoffatomen und Butadiene zu epoxydieren vermögen, nicht aber C,-+-ei-Olefine (zumindest in Mengen, die durch
gewöhnliche analytische Methoden leicht nachzuweisen sind). Als bevorzugte Ausführungsform werden die Methan-induzierten methylotrophen
Mikroorganismen oder die daraus stammenden Enzympräparate zur oxydativen Umwandlung von Propylen in Propylenoxid
verwendet.
Der Ausdruck "Mikroorganismus" wird hier in seinem breitesten Sinne verwendet und umfaßt nicht nur Bakterien, sondern auch
Hefen, fadenförmige Fungi, Actinomyceten und Protozoen. Vorzugsweise
umfassen die Mikroorganismen Bakterien und insbesondere bevorzugt die zur Methan-Oxydation befähigten Bakterien.
Der Begriff "Enzympräparat" soll sich auf jedes Mittel beziehen, das die gewünschte enzymatische Oxygenase-Aktivität zeigt.
Der Begriff soll sich zum Beispiel auf ganze lebende Zellen, getrocknete Zellen, Zellenextrakte und gereinigte und konzentrierte,
aus diesen Zellen stammende Präparate beziehen. Enzympräparate können entweder in trockner oder flüssiger Form
vorliegen. Der Begriff umfaßt auch die immobilisierte Form des Enzyms, zum Beispiel die ganzen Zellen des mit Methan gezüch-
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teten Mikroorganismus oder Enzymextrakte, die an eine unlösliche Matrix durch kovalente chemische Bindungen, Sorption und Einschluß
des Enzyms in einem Gelgitter mit genügend großen Poren für freien Durchgang der Moleküle des Substrats und des Produkts,
aber genügend kleinen Poren zum Zurückhalten des Enzyms unbeweglich gemacht oder gebunden sind. Der Begriff "Enzympräparat"
schließt auch Enzyme ein, die in Hohlfasermembranen zurückgehalten sind (Rony-Biotechnology and Bioengineering,
Juni 1971).
Der Begriff "Teilchenfraktion" bezieht sich auf die Oxygenaseenzym-Aktivität
in dem ausgefällten oder sedimentierten Material, wenn die überstehende Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren
aufgebrochener Zellen bei 10 000 g für 30 min 1 h bei
10 000 g oder darüber zentrifugiert wird.
Zur Erfindung gehören die folgenden Merkmale:
Die Isolate Methan-verbrauchender Mikroben gemäß der Erfindung
umfassen notwendige (Typ I und Typ II) und fakultative Bakterien sowie neue, Methan-verbrauchende Hefen.
Neben ihrer Fähigkeit zur Oxydation von Methan zu Methanol oxydieren Ruhezeil-Suspensionen mehrerer unterschiedlicher
Typen von mit Methan gezüchteten Bakterien (zum Beispiel Typ I, notwendig; Typ II, notwendig) und fakultativ Cp-G.-n-Alkene
und Butadien zu ihren entsprechenden 1,2-Epoxiden.
Die Produkt-1,2-Epoxide werden im Stoffwechsel nicht weiter
umgesetzt und sammeln sich extrazellulär an.
Mit Methanol gezüchtete Zellen zeigen weder Epoxydations- noch
Hydroxylierungsaktivität. Unter den gasförmigen Substrat-Alkenen
wird Propylen mit der höchsten Rate oxydiert.
Methan hemmt die Epoxydation von Propylen.
Die stöchiometrie des Verbrauchs von Propylen und Sauerstoff
und die Produktion von Propylenoxid ist 1:1:1.
Ergebnisse aus Hemmstudien zeigen an, daß das gleiche Monooxygenase-System
sowohl die Hydroxylierungs- als auch die Epoxy-
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dationsreaktionen katalysiert.
Sowohl die Hydroxylierungs- als auch die Epoxydationsaktivität sitzt in der zellfreien (Enzymextrakt) Teilchenfraktion, die
zwischen 10 000 und 80 000 g für 1 h ausgefällt oder sedimentiert wurde.
Zellfreie Teilchenfraktionen aus den obligatorisch und fakultativ
methylotrophen Mikroorganismen katalysieren die Hydroxylierung von Methan zu Methanol und die Epoxydation
von Cp-C.-n-Alkenen und Dienen (zum Beispiel Äthylen, Propylen,
1-Buten und Butadien) in Gegenwart von Sauerstoff und reduziertem Nicotinamid-adenin-dinucleotid (NADH) und die Hydroxylierung
von Cj-C.-n-Alkanen (zum Beispiel Methan, Athan,
Propan und Butan).
Die Hydroxylierungs- und die Epoxydationsaktivität von mit Methan gezüchteten Methylotrophen gehen "bei Lagerung gleichzeitig
verloren und werden durch verschiedene metallbindende Mittel stark gehemmt.
Die Stöchiometrie des Verbrauchs des Substrats (Propylen oder
Methan), von Sauerstoff, NADH, und die Produktbildung erwies sich als annähernd 1:1:1:1.
Das von R. Whittenbury, K. C. Phillips und J. i1. Wilkinson
(J. Gen. Microbiology, 61., 205-218 (1970) (nachfolgend Whittenbury
et alU) vorgeschlagene Klassifikationssystem Methan-oxydierender Bakterien ist das derzeit angewandte und am meisten verbreitete
und anerkannte System. In diesem Klassifikationssystem
sind die morphologischen Eigenschaften Methan-verbrauchender Bakterien in fünf Gruppen unterteilt. Diese sind Methylosinus,
Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter und Methylococcus. Bakterien dieser fünf von Whittenbury et al. berichteten Gruppen
verwerten Methan, Dimethyläther und Methanol für die Wachstumsenergie, und sie wurden alle als strikt aerob und Gram-negativ
berichtet. Sie zeichnen sich auch dadurch aus, daß sie nicht Endosporen bilden, das heißt die Fähigkeit zur Bildung
von Zysten und Exosporen mit komplexer Feinstruktur und komplexer Innenstruktur.
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IJach einer Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, daß
von V/hittenbury et al. beschriebene Mikroorganismen, wenn sie
in Gegenwart von Methan gezüchtet v/erden, niedere c/-Olefine,
insbesondere Propylen, in Gegenwart von Sauerstoff zu epoxydieren vermögen. Diese Methan-verwertenden Mikroorganismen sind
im allgemeinen als "Methylotrophe" bekannt. Das Enzymsystem
oder die aus diesen KikrοOrganismen stammenden Präparate werden
hier als "epoxydierendesEnzymsystem" bezeichnet, das vermutlich eine "Methan-monooxygenase" und/oder eine "Methan-hydroxylase"
ist. So versteht sich, daß das Enzymsystem oder die hier als "Alken-epoxidase" oder "Propylen-epoxidase" bezeichneten
Enzympräparate, zur Umwandlung der «(-Olefine in 1,2-Epoxide
verwendet, das "epoxydierende Enzymsystem" ist bzw. sind, von
denen angenommen wird, daß sie Methan-monooxygenase- oder Methan-hydroxylase-Enzyme
sind.
Die von "Whittenbury et al.(deren Offenbarung hier einbezogen
wird) berichteten methylotrophen Mikroorganismen kommen für die
Verwendung bei der praktischen Durchführung der Erfindung in Betracht. Insbesondere sind die in Tabelle 4, Seite 214 der Veröffentlichung
von Vßiittenbury et al. erwähnten methylotrophen
Mikroorganismen verwendbar, das heißt, solche Mikroorganismen, die identifiziert sind als Methylosinus trichosporium, Methylosinus
sporium, Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Methylomonas albus, Methylomonas streptobacterium, Methylomonas
agile, Methylomonas rubrum, Methylomonas rosaceus, Methylobacter chroococcum, Methylobacter bovis, Methylobacter
capsulatus, Methylobacter vinelandii, Methylococcus capsulatus und Methylococcus capsulatus, Stamm Texas, erwähnt von
D. W. Ribbons, J. Bacteriol., 222, 1551-1363 (1975)), und
Methylococcus minimus. Diese methylotrophen Mikroorganismen können in Form ihrer ganzen Zellen, Enzymextrakte oder immobil
gemachten Präparate solcher ganzen Zellen oder Enzymextrakte, unbeweglich gemacht zum Beispiel durch die Verwendung von
DEAE-Cellulose oder Ionenaustauscherharz oder porösen Aluminium
oxidträgern, verwendet werden.
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Subkulturen einiger von Whittenbury et al. beschriebener methylotropher Mikroorganismen sind bei der amtlichen Hinterlegungsstelle
des United States Department of Agriculture, Agriculture Research Service, Northern Regional Research
Laboratory, Peoria, Illinois 6I6O4, jeweils durch Hinterlegen
von Subkulturen hinterlegt worden und haben von der Hinterlegungsstelle die einzelnen, nachfolgend angegebenen NRRL-Stammbezeichnungen
erhalten. Diese Subkulturen sind nach den Bestimmungen des Department of Agriculture ohne jegliche Beschränkung
hinterlegt worden, so daß vermehrungsfähiges Material dieser Stämme für die Öffentlichkeit zur Verfügung
steht, auch, aber nicht ausschließlich, für Bürger der Vereinigten Staaten von Amerika und solche der Bundesrepublik
Deutschland. Stämme hinterlegter methylotropher Mikroorganismen sind wie folgt bezeichnet:
Bezeichnung des
Kultur USDA Agricultural
Research Service
| Methylosinus | trichosphorium | OB3B | NRRL | B-11.196 |
| Methylosinus | sporium | 5 | NRRL | B-11.197 |
| Methylocystii | 3 parvus | OBBP | NRRL | B-11.198 |
| Methylomonas | methanica | S1 | NRRL | B-11.199 |
| Methylomonas | albus | BG8 | NRRL | B-11.200 |
| Methylobacter capsulatus | Y | NRRL | B-11.201 |
Vermehrungsfähiges Material dieser Stämme steht jedermann auf
Anfrage ohne jegliche Beschränkung der Verfügbarkeit zur Verfügung·
Subkulturen der vorgenannten Stämme wurden anfangs von R· Whittenbury, Department of Biological Science, University
of Warwick, Warwickshire, Coventry, England, erhalten.
Die morphologischen und taxonomischen Merkmale und Eigenschaften der vorerwähnten methylotrophen Stamme sind wie folgt:
Methylosinus trichosporium OB3b NRRL B-11.196
produziert weiße Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweblich, stäbchen-
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förmig, Gram-negativ und aerob. Häufig werden Rosetten ausgebildet.
Hat eine Membranstruktur Typ II,
Methylosinus sporium 5 NRRl B-11.197
produziert weiße Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweblich, stabellenförmig, Gram-negativ und aerob. Häufig werden Rosetten ausgebildet.
Organismen bilden Exosporen, die wärmebeständig sind;
Sporen gingen von den keine Elagellen tragenden Polen der Organismen
ab, die Vibrio-3?orm annahmen. Andere organische Verbindungen
als Methan und Methanol unterhalten das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ II.
Methylocystis parvus OBBP NRRL B-11.198
produziert weiße Schleim-Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart
von Methan oder Methanol. Die Organismen sind unbeweglich, von der Form des Cocco-Bazillus, Gram-negativ und aerob.
Organismen bilden Zysten, die gegen Austrocknung beständig, aber nicht wärmebeständig sind. Wächst auf Kosten von Methan
oder Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur
Typ II.
Methylomonas methanica S1 NRRL B-11.199
produziert rosafarbene Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich,
stäbchenförmig, Gram-negativ und aerob. Bildet schleimige Kapseln.
Sie wachsen auf Kosten von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern das
Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
Methylomonas albus BG8 NRRL B-11.200
produziert weiße Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Methan oder Methanol. Die Organismen sind beweglich, stäbchenförmig,
Gram-negativ und aerob. Bildet schleimige Kapseln. Wächst auf Kosten von Methan und Methanol. Andere organische
Verbindungen als Methan und Methanol fördern das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
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Methylobacter capsulatus Y NRRL B-11.201
produziert weiße bis braune Kolonien auf Salzagarplatten in Gegenwart von Hethan oder Methanol. Die Organismen sind be-
\tfeglich, s tabellenförmig, Gram-negativ und aerob. Bildet
schleimige Kapseln. Wächst auf Kosten von Methan und Methanol. Andere organische Verbindungen als Methan und Methanol fördern
das Wachstum nicht. Besitzt eine Membranstruktur Typ I.
Kürzlich offenbarten Patt, CoIe und Hanson (International J.
Systematic Bacteriology 2£, (2) 226-229 (1976)^ daß methylotrophe
Bakterien solche Bakterien sind, die unter Verwendung von Kohlenstoffverbindungen mit einem oder mehreren Kohlenstoffatomen,
aber ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen, nichtautotroph wachsen können. Patt et al. haben vorgeschlagen, daß
Methylotrophe als "obligat" angesehen werden sollten, wenn sie nur Kohlenstoffverbindungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
(zum Beispiel Methan, Methanol, Dirnethyläther, Methylamine
usw.) als einzige Quellen für Kohlenstoff und Energie verwerten können, während "fakultative" Methylotrophe solche
Mikroorganismen sind, die Verbindungen ohne Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen und komplexe Verbindungen mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
als einzige Quellen für Kohlenstoff und Energie verwerten können. In ihrer Veröffentlichung offenbarten
Patt et al. ein Methan-oxydierendes Bakterium, das sie als Methylobacterium organophilum sp nov. (ATCC 27 886) identifizierten.
Dieses Bakterium unterscheidet sich vermutlich von allen zuvor beschriebenen Gattungen und Arten Methan-oxydierender
Bakterien aufgrund der Fähigkeit zur Verwertung einer Vielzahl organischer Substrate mit Kohlenstoff-Kohlenstoff-Bindungen
als Quellen für Kohlenstoff und Energie.
Als weitere Ausführungsform der Erfindung wurde gefunden, daß dieser MikroOrganismus (Methylobacterium organophilum sp nov.
ATCC 27 886) und andere fakultativ methylotrophe Mikroorganismen auch C2-C--Alkene zu epoxydieren vermögen. Mit anderen
Worten, sie besitzen Alken-epoxidase-Enzymaktivität, wenn sie
in Gegenwart von Methan gezüchtet werden. Wie oben mit Bezug
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auf die methylotrophen Mikroorganismen von Whittenbury et al. erörtert, können die fakultativ Methylotrophen in Form ihres
Rohextrakts (das heißt der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren der zerbrochenen Zellen für 30 min bei 10 000 g)
oder in unbeweglich gemachte Form gebracht oder in zellgebundener Form verwendet werden, wenn sie im erfindungsgemäßen Verfahren
verwendet werden sollen.
V/eitere bekannte methylotrophe Stämme können im erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden, zum Beispiel Methylomonas sp. AJ-3670 (FERM P-2400) der US-PS 3 930 947 als von dem
Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology, Ministry for Industrial Trade and Industry,
Chiba, Japan, frei erhältlich, und Methylococcus 999 der US-PS 4 042 458 mit der UCIB-Zugangsnummer 11083 sowie Methylomonas
SM3 mit der NCIB-Zugangsnummer 11084 (beschrieben in der niederländischen
Patentanmeldung 74/16644). Gemische methylotropher und nicht-methylotropher Mikroorganismen können verwendet
werden, wie zum Beispiel die in den US-PS'en 3 996 I05 und
4 042 458 beschriebenen Systeme.
Bei kommerziellen Verfahren zur Vermehrung von Mikroorganismen muß im allgemeinen stufenweise vorgegangen werden. Diese Stufen
können wenige oder zahlreich sein, je nach der Art des Verfahrens
und den Eigenschaften der Mikroorganismen. Gewöhnlich beginnt die Vermehrung durch Einimpfen von Zellen aus einer
Schrägkultur in ein vorsterilisiertes Nährmedium, das sich gewöhnlich
in einem Kolben befindet. In dem Kolben wird das Wachstum der Mikroorganismen durch verschiedene Maßnahmen gefördert,
zum Beispiel durch Schütteln zur gründlichen Durchlüftung und Einhalten geeigneter Temperatur. Dieser Schritt
oder diese Stufe wird ein- oder mehrmals in Kolben oder Kesseln wiederholt, die die gleichen oder größere Volumina an
Hährmedium enthalten» Diese Stufen können in angebrachter Weise
als Kulturentwicklungsstufen bezeichnet v/erden. Die Mikroorganismen mit oder ohne begleitendes Kulturmedium aus der
letzten Entwicklungsstufe v/erden in eine Fermentieranlage gro-
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ßen Umfangs eingeführt oder eingeimpft, um kommerzielle Mengen
der Mikroorganismen oder deren Enzyme zu erzeugen.
Die Gründe für das Züchten der Mikroorganismen in Stufen sind zahlreich, hängen aber in erster Linie von den Bedingungen ab,
die für das Wachstum der Mikroorganismen und/oder die iroduktion
ihrer Enzyme notwendig sind. Dazu gehören die Stabilität der liikr ο Organismen, geeignete Nährstoffe, der pH-'.'ort, osmotische
Beziehungen, der Grad der Belüftung, die Temperatur und die Aufrechterhaltung reiner Kulturbedingungen während der
Fermentation. Beispielsweise können zur Erzielung maximaler Ausbeuten der Alken-epoxidase die Fermentationsbedingungen in
der Endstufe etwas von denen zu ändern sein, die zur Erzielung des Wachstums der Mikroorganismen in den Kulturentwicklungsstufen
angewandt werden. Die Aufrechterhaltung der Reinheit des Mediums ist auch ein äußerst wichtiger Gesichtspunkt, insbesondere,
wo die Fermentation unter aeroben Bedingungen erfolgt, wie im Falle der methylotrophen Mikroorganismen. Wird die Fermentation
anfangs in einer großen Fermentieranlage gestartet, ist eine verhältnismäßig lange Zeit notwendig, eine beträchtliche
Ausbeute an Mikroorganismen und/oder Alken-epoxidase-Enzym zu erzielen. Dies erhöht natürlich die Möglichkeit der
Verunreinigung des Mediums und der Mutation der Mikroorganismen«
Die für das Wachstum der methylotrophen Mikroorganismen und zum Einführen des Oxygenase- oder Epoxydations-Enzymsystems verwendeten
Kulturmedien bestehen aus anorganischen Phosphaten, Sulfaten und Nitraten sowie aus Sauerstoff und einer Methanquelle.
Die Fermentation erfolgt im allgemeinen bei Temperaturen im Bereich von 5 bis etwa 550C, vorzugsweise bei Temperaturen im Bereich
von etwa 25 bis etwa 5O°C. Der pH-Wert des Kulturmediums sollte auf einen Wert von etwa 4 bis 9, vorzugsweise von etwa
5,5 bis 8,5 und insbesondere bevorzugt auf 6,0 bis 7,5 eingeregelt sein. Die Fermentation kann bei Atmosphärendruck durchgeführt
werden, obwohl höhere Drücke bis zu etwa 5 bar (5 at) und darüber angewandt werden können.
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lypischerweise werden zum Wachstum der methylotrophen Hikroorganismen
und zum Induzieren des Oxygenase- oder Epoxydations-Snzymsystems die Mikr ο Organismen in das Medium eingeimpft, das
mit einem methan- und sauerstoffhaltigen Gasgemisch in Berührung gebracht wird. Methan kann in Form von Naturgas zugeführt
werden. Zur kontinuierlichen Fließkultur können die Mikroorganismen in jedem geeigneten angepaßten Fermentationsbehälter
gezüchtet werden, zum Beispiel einem mit Prall- oder leitflächen und Rührer ausgestatteten Fermentator oder einem gespülten
Turmfermentator, der entweder mit Innenlcühlung oder einer
äußeren Rückführkühlschleife ausgestattet ist. Frisches Medium kann kontinuierlich in die Kultur mit Geschwindigkeiten entsprechend
0,02 "bis 1 Kulturvolumen pro Stunde eingepumpt werden, und die Kultur kann mit solcher Geschwindigkeit entfernt
werden, daß das Kulturvolumen konstant bleibt. Ein Gasgemisch, das Methan und Sauerstoff und möglicherweise Kohlendioxid oder
andere Gase enthält, wird mit dem Medium vorzugsweise durch kontinuierliches Durchperlen durch einen Sprinkler am Boden
des Behälters in Berührung gebracht. Die Quelle für Sauerstoff
für die Kultur kann luft, Sauerstoff oder mit Sauerstoff angereicherte
luft sein. Verbrauchtes Gas kann oben aus dem Behälter entfernt werden. Das verbrauchte Gas kann entweder über
eine Außenschleife oder intern mit Hilfe eines Gaszufuhrgebläses in Umlauf gesetzt werden. Die Gasströme und das umgewälzte
Gas sollten so eingestellt werden, daß sich maximales Wachstum des Mikroorganismus und maximale Methanausnutzung ergibt.
Das Oxygenase-Enzymsystem kann, wie oben beschrieben, als Rohextrakt
oder als zellfreie Teilchenfraktion, das heißt das Material, das sich bei einstündigem Zentrifugieren mit 10 000 g
oder darüber der überstehenden Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren gebrochener Zellen für 30 min bei 10 000 g abscheidet
oder sedimentiert, erhalten werden»
Die Mikroben-Zellen können aus dem Wachstumsmedium nach irgend-
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einer der gewöhnlich verwendeten Standardtechniken geerntet werden, zum Beispiel durch Ausflockung, Sedimentation und/oder
Fällung mit anschließendem Zentrifugieren und/oder Filtrieren. Die Biomasse kann auch getrocknet werden, zum Beispiel durch
Gefrier- oder Sprühtrocknen, und kann in dieser Form zur weiteren Verwendung bei der Epoxydationsreaktion verwendet v/erden.
Wird das zellfreie Enzym verwendet, können NADH und ein Metall (zum Beispiel Kupfer oder Eisen) zugesetzt werden, um
die Enzymaktivität zu steigern.
Zur praktischen Ausführung der Erfindung wird ein Oxygenase-Enzymsystem
erhalten, wie zum Beispiel in der oben beschriebenen Weise, das Methan in Methanol unter oxydativen Bedingungen
überführt. Die Quelle für das Enzym ist nicht kritisch, vorzugsweise wird aber ein solches Präparat aus einem der fünf
Gattungen der in der Veröffentlichung von Whittenbury et al. offenbarten Mikroorganismen oder aus einem der fakultativ
Methylotrophen (Methylobacterium) und Züchten des Mikroorganismus
in einem Methan und Sauerstoff enthaltenden Nährmedium, wie oben beschrieben, erhalten. Das Nährmedium kann das sein,
das von Whittenbury et al. beschrieben wurde, oder noch mehr bevorzugt das Kulturmedium, das von Foster und Davis, J.
Bacteriol. £1, 1924-1931 (1966) beschrieben wurde. Das Enzympräparat
wird dann mit einem Cp-C.-Alken, zum Beispiel Äthylen,
Propylen, Buten-1 oder konjugiertem Butadien oder deren
Gemischen in Gegenwart von Sauerstoff in einer Pufferlösung oder in einem Nährmedium in Berührung gebracht (zum Beispiel
kann das gleiche Nährmedium, das zur Erzeugung des Mikroorganismus verwendet wird, verwendet werden, mit der Ausnahme, daß
das Olefin durch Methan ersetzt wird), und das Gemisch wird inkubiert, bis der gewünschte Umwandlungsgrad erzielt ist.
Darauf wird das Epoxid durch herkömmliche Maßnahmen, zum Beispiel Destillation usw., gewonnen.
Um den notwendigen, wirksamen Kontakt von Sauerstoff und Enzym zu erleichtern oder zu ermöglichen (ob es nun ein Enzympräparat
oder methylotrophe Mikroorganismen sind), wird zur Erzie-
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lung tester Ergebnisse vorzugsweise ein starker, fein zerteilter Luftstrom in eine kräftig gerührte Dispersion des Olefins
im Epoxydationsmedium eingeführt, das im allgemeinen Wasser und einen Puffer enthält und in dem das Enzympräparat oder die Mikroorganismenkultur
suspendiert ist. Das Enzympräparat kann dann vom flüssigen Medium abgetrennt vrerden, vorzugsweise durch Filtrieren
oder Zentrifugieren. Das anfallende Epoxid kann dann im
allgemeinen erhalten werden.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann ansatzweise, halbkontinuierlich,
kontinuierlich, im Gleichstrom oder im Gegenstrom durchgeführt werden. Gegebenenfalls wird die Suspension, die das Enzympräparat
oder methylotrophe Mikroorganismen und eine Pufferlösung enthält, unter kräftigem Rühren im Gegenstrom zu einem in einem
Rohrreaktor aufsteigenden Luftstrom nach unten geführt. Die obere Schicht wird von der nach unten fließenden Suspension entfernt,
während Kultur- und zurückbleibende Pufferlösungsbestandteile, zumindest teilweise, mit weiterem Olefin und unter Zugabe
von frischem Enzympräparat oder methylotrophem Mikroorganismus, je nach Bedarf, rückgeführt werden.
Das Wachstum der methylotrophen Mikroorganismen und der Epoxydationsprozeß
können bequemerweise durch gleichzeitiges Durchführen, aber getrennt und unter Anwendung einer viel stärkeren
Belüftung beim Epoxydationsprozeß (zum Beispiel mit einem Luftüberschuß von wenigstens dem zweifachen dessen, was für das
Wachstum erforderlich ist, vorzugsweise mit wenigstens fünffacher Belüftung) gekoppelt werden. Sowohl der Wachstumsprozeß
als auch der Epoxydationsprozeß können im gleichen Reaktor aufeinanderfolgend oder gleichzeitig durch wechselnde Anwendung
normaler und starker Belüftung durchgeführt werden.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter veranschaulicht,
die jedoch in keiner Weise einschränkend zu sehen sind. Alle Teile und Prozentsätze, sofern nicht ausdrücklich anders
angegeben, beziehen sich auf das Gewicht.
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| Es v/urde ein Nährmedium, wie von | Poster und Davis, J.Bacteriol. |
| il, 1924-1931 (1966) beschrieben, | mit folgender Zusammensetzung |
| pro Liter hergestellt: | |
| Wa2HPO4 | 0,21 g |
| WaH2PO4 | 0,09 g |
| WaNO3 | 2,0 g |
| MgSO4.7H2O | 0,2 g |
| KCl | 0,04 g |
| CaCl2 | 0,015 g |
| PeSO4.7H2O | 1,0 mg |
| CuSO.·5Ηο0 4 ^ |
0,01 mg |
| H3BO4 | 0,02 mg |
| MiSO-.5H2O | 0,02 mg |
| ZnSO4 | 0,14 mg |
| MoO3 | 0,02 mg |
Der pH-V/ert des Nährmediums wurde durch Zugabe von Säure oder
Base auf 7,0 eingestellt, und 50 ml-Teilmengen des Währmediums
wurden in eine Reihe von 300 ml-Schüttelkolben gegeben. Die
Schüttelkolben wurden mit einer Inokulationsschleife mit Zellen
von einer Agar-Platte mit homogenen Kolonien der Mikroorganismen auf der Platte beimpft (die Reinheit der Isolate wurde durch
mikroskopische Prüfung bestätigt). Die Isolate waren auf Agar-Platten unter einer Atmosphäre aus Methan und Luft mit einem
1:1 Yol/Yol-Gasverhältnis gehalten worden, die alle zwei Yfochen
übertragen worden waren. Die Gasphase der beimpften Kolben wurde dann durch ein Gasgemisch aus Methan und Luft mit einem Verhältnis
von 1:1 auf Volumen/Volumen-Basis ersetzt. Die beimpften Kolben wurden luftdicht verschlossen und auf einem Rotationsschüttler mit einem Orbitalradius von 2,5 cm bei 250 UpM und bei
300C zwei Tage inkubiert, bis sich die Trübung des Mediums entwickelt
hatte.
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Die Zellen wurden durch 30-minütiges Zentrifugieren bei 4°C
und 10 000 g gesammelt. Der Zellklumpen wurde zweimal mit einem 0,15 m Phosphatpuffer beim pH 7,0 (mit 0,002 m MgCl2)- gewaschen.
Die gewaschenen Zellen wurden dann in einem 0,15 m Phosphatpuffer bei pH 7,0 suspendiert.
Ein 0,5 ml-Anteil einer jeden gewaschenen Zellsuspension (2 mg
Zellen) wurde in 10 ml-G-lasröhrchen bei 4-0C gebracht, die mit
einem Gummi,stopfen verschlossen wurden. Die G-asphase der GKLasröhrchen
wurde durch Vakuum entfernt und dann durch ein Gasgemisch aus Alken und Sauerstoff im Volumenverhältnis 1:1 ersetzt.
Dann wurde bei 300C an einem Rotationsschüttler mit 300 TJpM inkubiert. Produktproben (3 ul) wurden mit einer Mikrospritze
periodisch entnommen und die Produkte gaschromatographisch analysiert (Ionisationsflammendetektorsäule).
Tabelle I zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Hydroxylierung
von Methan und die Epoxydation von Propylen durch gewaschene Z eil suspensionen mehrerer Mikroorganismen, deren
Stämme nach der oben beschriebenen Versuchsarbeitsweise mit Methan gezüchtet worden waren. Aus diesen Daten ist zu ersehen,
daß die mit Methan gezüchteten Mikroorganismen, die Methan zu Methanol zu hydroxylieren vermögen, auch Propylen in Propylenoxid
überführen können.
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Umwandlungsgesehwindigkeiten für die Methan-Hydroxylierung
und die Propylen-Epoxidation
Mikroorganismus Umwaaidlungsgeschwindigkeiten (uMol/h/mg Protein) (a)
Stämme (b) Methan-Hydroxy- Propylen —>
lierung Propylenoxid
Methylosinus trichosporium OB3b 1,5 3,6
(NRElL B-11.196)
!? Methylosinus sporium 5 1,1 2,0
S (NRRL B-11,197)
*- Methylocystis parvus OBBP
ω (NRRL B-11.198) 0,7 1,6
° Methylomonas methanica S1 1,3 2,7
S (NRRL B-11.199) Ί
Methylomonas albus BG8
(NRRL B-11.200) 1,8 1,4
Methylobacter capsulatus Y 1,2 1,5
(NRRL B-11.201)
Methylobacterium organophilum XX 1,0 1,8
(ATCC 27.886)
(a) Die Produkte Methanol und Propylenoxid wurden gaschromatographisch durch Vergleich ^
der Retentionszeiten mit authentischen Standard-Proben identifiziert. ^53
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/1 OO ml Kulturbrühe. —»·
23151
Tabelle II zeigt die Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Hydroxylierung von Methan und Epoxydation von Propylen (aus
Tabelle I) und die Epoxydation von Äthylen, Buten-1 und Butadien durch gewaschene Zellsuspensionen von zwei Mikroorganismus
st aminen, die nach der oben beschriebenen Versuchsarbeitsweise mit !!ethan gezüchtet worden waren. Diese mit Methan gezüchteten
Mikroorganismen produzierten bei Berührung mit Penten-1 und Hexen-1 in Gegenwart von Luft kein nachweisbares Epoxid.
Den Daten ist auch zu entnehmen, daß die Umwandlungsgeschwindigkeiten für Propylen in Propylenoxid für die jeweiligen
mit Methan gezüchteten Mikroorganismen höher waren als für die anderen Umwandlungen.
9Ö9843/0882
O
OO
OO
OO
OO
Umwandlungsgeschwindigkeiten für die Methan-Hydroxylierunff und die Epoxidation von <x-01efinen
Umwandlungsgeschwindigkeiten (uJYIol/h/mg Protein) ^a'
Äthylen Propylen Buten-1 Butadien Pentan-1 Hexen-1
Mikroorganismus Methan Ät^en„ p^W 1,7-Epoxy- 1,2~Epoxy- 1,2^lpoxy- 1 ,T-Epoxy-Stä Mthl id id bt bt t
^ ^ ,py py ,py ,p cd Stämme Methanol oxid oxid butan buten ρentan hexan
Methylosinus trichosporium 1,5 1,9 3f6 0,45 2,6 O O
0B3b (NRRL B-11.196)
Methylosinus sporium 5 1,8 1,1 2,0 0,8 1,5 O O
(NRRL B-11.197)
(a) Die Produkte wurden gaschromatographisch durch Vergleich der Retentionszeiten mit
authentischen Standardproben identifiziert (die Produktidentifizierung wurde ergänzt
durch die Peststellung des Vorhandenseins oder Fehlens von Produktpeaks vor und nach
der Bromierung oder sauren Hydrolyse. Die Analyse zeigte auch, daß keine weitere
Oxydation des Epoxidprodukts eintrat).
(b) Das Trockengewicht der Zellen betrug etwa 0,2 g/100 ml Kulturbrühe.
Die oben beschriebene Versuchsarbeitsweise wurde im Falle der
Stämme Methylocystis parvus OBBP (IJRRL B-11 198), Methylomonas
methanica S1 (HRRI. B-11 199) und Methylomonas albus BG8 (HRRI
B-11 200) wiederholt, und gewaschene Zellsuspensionen dieser mit Methan gezüchteten Mikroorganismen wurden erfolgreich zur
Umwandlung von Äthylen in Äthylenoxid mit Umwandlungsgeschwindigkeiten
von 0,9, Q95 und 1,2 uMol/h/mg Protein bei einem
Trockengewicht der Zellen von 0,2 g/100 ml der Kulturbrühe
verwendet.
Wie oben gezeigt, wurde ein neues Verfahren gefunden, wonach Propylenoxid durch Inkubieren von Propylen in Gegenwart von
Zellen oder zellfreien Extrakten von Mikroorganismen (oder daraus entstammenden Enzymen), die in Gegenwart von Methan gezüchtet
worden sind, erhalten wird* Diese Mikroorganismen vermögen bekanntlich kurzkettige Alkane zu hydroxylieren (zum Beispiel
Methan zu Methanol), und manche Forscher haben vermutet, sie könnten in der lage sein, Äthylen zu epoxydieren. Es wurde nun
gefunden, daß diese mit Methan gezüchteten Mikroorganismen und deren Enzympräparate die Fähigkeit haben, Propylen mit verhältnismäßig
höheren Umwandlungsraten als im Falle von Äthylen, Buten-1 und Butadien, zu epoxydieren. In Ansatzversuchen unter
Verwendung gewaschener, mit Methan gezüchteter Zellen verläuft die Epoxydationsreaktion wenigstens zwei Stunden linear. Eine
weitere Oxydation des Epoxid-Produkts wurde nicht nachgewiesen.
Das Epoxydations-Enzymsystem der mit Methan gezüchteten Mikroorganismen
ist (durch das Methan) induzierbar, und das Epoxid-Produkt
sammelt sich extrazellulär an (das heißt nach der Reaktion \tfurde das Reaktionsgemisch zentrifugiert und das Epoxid-Produkt
fand sich nur in der überstehenden Flüssigkeitsfraktion und nicht in dem Zellkuchen). Die Möglichkeit des Vorliegens von
Propanal als Oxydationsprodukt des Propylens wurde als Ergebnis einer Gas/Flüssigkeits-chromatographischen Analyse ausgeschaltet.
Bei vergleichenden Versuchstests besaßen gewaschene Suspensionen
90 9 8 43/0882
der mit Methanol gezüchteten Mkroorganismenstämme Methylosinus
trichosporium OB3b (NRRL B-11 196), Methylocystis parvus
OBBP (KRRL B-11 193), Methylomonas methanica S1 (NRRL B-11 199)
und Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-11 201) nicht die Fähigkeit,
Methan zu hydroxylieren, oder die Fähigkeit, C2-C.-Alkene,
insbesondere Propylen, zu epoxydieren. Daraus ergibt sich, daß nur die mit Methan gezüchteten Mikroorganismen sowohl Methan-Hydroxylierungsals
auch Cp-C.-Epoxydationsvermögen besitzen.
Wie zuvor angegeben, können sowohl die ganzen Zellen als auch die zellfreien Extrakte mit Oxygenase-enzym-Aktivität der mit
Methan gezüchteten Methylotrophen bei den Hydroxyl!erungs- und
Epoxydationsreaktionen in Gegenwart von Luft verwendet v/erden. NADH und Metall (Eisen oder Kupfer) können zugesetzt werden, um
die Aktivität zu verstärken, wenn die zellfreien oder reinen Enzympräparate
verwendet werden. Bei Verwendung des zellfreien Enzymsystems gemäß der Erfindung wurden die Enzympräparate wie
folgt hergestellt:
Organismen wurden in 2,8 1-Kolben mit 700 ml Mineralsalzmedium,
wie in Beispiel 1 beschrieben, mit Methan (Methan und Luft im Volumenverhältnis 1:1) als einziger Kohlenstoff- und Energiequelle
gezüchtet. Zellen wurden während des exponentiellen Wachstums durch 15-minütiges Zentrifugieren bei 12 000 g und
4°C gewonnen. Sie wurden zweimal mit 25 mmol Kaliumphosphatpuffer,
pH 7»0, mit 5 mmol MgCl« gewaschen und im gleichen Puffer
suspendiert. Die Zellsuspensionen wurden bei 4°C durch einen einzigen Durchgang durch eine Französische Druckzelle
(1034 "bar bzw. 15 000 lb/in2) zerstört und 15 min bei 5 000 g
zentrifugiert, um nicht-aufgebrochene Bakterien zu entfernen.
Die überstehende Lösung (Rohextrakt) wurde dann 30 min bei 40 000 g zentrifugiert und lieferte eine Teilchen-P(40)-und
lösliche S(40)-Fraktion. Die S(40)-Fraktion wurde anschließend
60 min bei 80 000 g zentrifugiert und lieferte eine Teilchenfraktion P(80) und eine lösliche Fraktion S(80). Die Teilchen-
909843/0882
fraktionen P(40) und P(80) wurden in 25 mmol Kaliumphosphatpuffer,
pH
genisiert.
genisiert.
puffer, pH 7,0, mit 5 mmol MgCl2 suspendiert und "bei 4°C homo-
Enzymtest
Die Oxydation von Methan und Propylen durch Teilchenfraktionen P(4O) und P(80) und die lösliche !Fraktion S(80) wurde bei 300C
durch Bestimmung der Produktion von Methanol bzw. Propylenoxid gemessen. Die Reaktionsgemische enthielten in 1,0 ml: 150 ml-Iol
Kaliumphosphatpuffer, pH 7,0, mit 5 mMol MgCl2, 0,6 ml; 10 μϊ·Ιο1
ITADH und Zellfraktion.
Reaktionsgemische waren in 10 ml-Probenröhrchen bei 4°C enthalten.
Diese wurden mit Gummikappen verschlossen. Die Gasphase in den Probenröhrchen wurde mit Vakuum abgesaugt und dann durch
ein Gasgemisch aus Methan oder Propylen und Sauerstoff im Volumenverhältnis 1:1 ersetzt. Die Oxydation anderer gasförmiger
n-Alkane und n-Alkene wurde untersucht, wie oben beschrieben.
Mir flüssige Substrate wurden 10 ul Substrat direkt verwendet. Probenröhrchen wurden dann bei 3O0C auf einem Rotationsschüttler
bei 200 UpM inkubiert.
Die Produkte der Epoxydation von n-Alkenen und die Hydroxylierung
von n-Alkanen wurde durch Flammenionisationsgaschromatographie
unter Verwendung einer rostfreien Stahlsäule (3,65 πι χ
3,2 mm bzw* 12' χ 1/8"), gepackt mit 10 % Carbowax 2OM auf
80/100 Chromosorb ¥ und einer Porapak Q-Säule geprüft. Die Säulentemperatur wurde bei 1200C konstant gehalten. Die Trägergasströmungsgeschwindigkeit
betrug 30 ml/min Helium. Die verschiedenen Produkte wurden durch Vergleich der Retentionszeiten
und gemeinsame Chromatographie mit authentischen Standardproben identifiziert.
Spezifische Aktivitäten wurden als uMol der pro Stunde pro
mg Protein gebildeten Produkte ausgedrückt. Konzentrationen an Protein in verschiedenen Fraktionen wurden nach der Methode
von Lowry et al., J. Biol. Chem. Ij^, 265-275 (1951) be-
909843/0882
BAD ORIGINAL
29151 OB
stimmt.
Verteilung der n-Alkan- und n-Alken-Oxydationsaktivitäten in Zellfraktionen
Drei verschiedene Gruppen Methan-verwertender Organismen wurden ausgewählt, um die Oxydation von n-Alkanen (C^-C,) und
n-Alkenen (C2-C.) in zellfreien Systemen zu untersuchen. Zellfraktionen
wurden aus obligaten, Methan-verwertenden Organismen des Typs I, Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL B-11 208) und
Methylococcus capsulatus (Texas, ATCC 19 069); obligaten, Methan-verwertenden Organismen des Typs II, Methylosinus trichosporium
(0B3b, NRRL B-11 196) und Methylosinus sp. (CRL-15,
NRRL B-11 202) und einem fakultativen, Methan-verwertenden Bakterium,
Methylobacterium sp (CRL-26, NRRL B-11 222), hergestellt.
Tabelle III zeigt die Verteilung der Methan- und Propylen-Oxydationsaktivität
in verschiedenen, aus diesen Organismen stammenden Fraktionen. Etwa 85-90 % der Gesamtaktivität wurde in
der P(40)-Fraktion und 10 % in der P(80)-Fraktion nachgewiesen. Die lösliche Fraktion S(80) enthielt keine Aktivität. Die spezifischen
Aktivitäten für die Methan- und die Propylenoxydation in den Fraktionen P(40)und P(80) variierte in den verschiedenen
untersuchten Organismen nicht wesentlich (Tabelle IV). Die Epoxydation von Propylen und die Hydroxylierung von Methan hängen
beide vom Vorhandensein von Sauerstoff und NADH ab. NADPH oder Aseorbat und andere Elektronenträger könnten auch verwendet
werden. Beide Reaktionen waren in den ersten 15 min linear, gemessen durch gaschromatographischen Produktnachweis.
909843/0882
Verteilung der Propylen- und Methan-Oxydationsaktivitäten
in Zellfraktionen von Methylotro-phen
in Zellfraktionen von Methylotro-phen
% Verteilung in der Zellfraktion
Propylen-Epoxydations- v ' Methan-Hydroxylierungs- v '
| 85 | 15 | 0 |
| 89 | 11 | 0 |
| 87 | 13 | 0 |
| 82 | 18 | 0 . |
| 87 | 13 | 0 |
| 90 | 10 | 0 |
| 88 | 12 | 0 |
| 83 | 13 | .0 |
aktivität aktivität
«ο Typ I Obligate Methylotrophe S Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL
oo B-11 208)
f^ Methylococcus capsulatus ^n (Texas, ATCC 19 069)
° Typ II Obligate Methylotrophe oo Methylosinus sp (CRL-15,
K5 NRRL B-11 202)
Methylosinus trichosporium
(0B3b, NRRL B-11 196)
Fakultative Methylotrophe
Methylobacterium sp. 85 15 O 82 18 O
(CRL-26, NRRL B-11 222)
(a) Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Reaktionsprodukt
wurde gas chromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemische bei N>
30 C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. CO
• ■ ' O " ■ O2<
Geschwindigkeit der Methan-Hydroxylierung und Propylen-Epoxydation in den Zellfräktionen von Methvlotro-phen
O
OO
OO
OO
OO
Typ 1 Obligater Methylotroph Methylomonas sp. (CRL-17, NRRL B-11 208)
Methylococcus capsulatus (Texas, ATCC 19 069)
Typ II Obligater Methylotroph Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202)
Methylosinus trichosporium (0B3b, NRRL B-11 196)
Fakultativer Methylotroph
Methylobacterium sp. (CRL-26, NRRL B-11 222)
(a) Die Reaktionen
| Zellfraktion (a) Propylen-Oxydations-V ' aktivität P(40) P(80) S(80) |
2,0 | O | Methan-Oxydations-^a aktivität P(40) P(80) S(80) |
2,7 | O |
| 2,2 | 2,0 | O | 2,9 | 3,9 | O |
| 2,6 | 3,7 | O | 3,8 | 4,2 | O |
| 3,8 | 2,5 | O | 4,8 | 3,0 | O |
| 2,8 | 3,1 |
1,1
2,7
2,8
eaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Produkt der Reaktion
wurde gas chromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation der Reaktionsgemische bei 30 C
auf einem Rotationsschüttler ermittelt. Die Oxydationsgeschwindigkeit ist ausgedrückt als
uMol Produkt pro Stunde und mg Protein.
wurde gas chromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation der Reaktionsgemische bei 30 C
auf einem Rotationsschüttler ermittelt. Die Oxydationsgeschwindigkeit ist ausgedrückt als
uMol Produkt pro Stunde und mg Protein.
23151
Die Teilchenfraktionen ?(4O) und P(80) aus verschiedenen Organismen
katalysierten auch die Epoxidation von anderen n-Alkenen
(Äthylen, 1-Buten und 1,3-Butadien) zu den entsprechenden
1,2-Epoxiden und die Hydroxylierung von Methan und Äthan
zu den entsprechenden Alkoholen. Tabelle Y zeigt die Oxydationsgesehwindigkeit
verschiedener n-Alkane und n-Alkene durch die Teilchenfraktion P(40) von Methylosinus sp. (CRL-15, ITRRL
B-11 202). Das Oxydationsprodukt wurde nach InkuMeren der
P(40)-Eraktion mit verschiedenen Substraten bei 300C für
10 min gaschromatographisch identifiziert.
Substrat
Äthylen Propylen 1-Buten Butadien 1-Penten
Methan
Oxydation von n-Alkenen und n-Alkanen durch
die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (ORL-15. ffiffiL B-11 202)
| Produkt | Geschwindigkeit der Pro duktbildung (a) (uMol/h/mg; Protein) |
| Äthylenoxid | 1,27 |
| Propylenoxid | 4,1 |
| Epoxybutan | 2,18 |
| Epoxybuten | 0,63 |
| — | 0 |
| Methanol | 4,8 |
| Äthanol | 3,2 |
(a) Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt.
Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei
3O0C auf einem Rotationsschüttler ermittelt.
Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202) wurde für v/eitere
Studien zum Einfluß verschiedener Umgebungsfaktoren auf die Methan- und Propylen-Oxydationsaktivitäten in zellfreien Systemen
ausgewählt.
909843/0882
Der Einfluß der Konzentration der P(40)-Teilchenfraktion auf die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation von Propylen wurde
untersucht. Die Produktion von Methanol und Propylenoxid war direkt abhängig von der Konzentration der Teilchenfraktion im Bereich
von 1-6 mg Protein/ml. Die Reaktionsgeschwindigkeit nahm bei weiterer Erhöhung der Konzentration des teilchenförmigen
Proteins auf 8 mg/ml ab.
Die Geschwindigkeit der Bildung von Methanol und Propylenoxid durch Hydroxylierung von Methan bzw. Epoxydation von Propylen
durch die P(4-0)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15,
NRRL B-11 202) war mit der Zeit bis zu 15 min linear.
Der Einfluß des pH-Werts der Hydroxylierung von Methan und der Epoxydation von Propylen durch die P(40)-Teilchenfraktion von
Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202) wurde durch Ermitteln der nach 10 min Inkubation des Reaktionsgemische gebildeten Menge
an Methanol und Propylenoxid untersucht. Der optimale pH-Wert sowohl für die Hydroxylierung von Methan als auch die Epoxydation
von Propylen wurde zu 7,0 festgestellt. Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen wie in Beispiel 1 beschrieben
durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch
nach 5, 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 30 C
auf einem Rotationsschüttler ermittelt. 100 % Aktivität entspricht
4,8 bzw. 4,1 uMol des gebildeten Methanols oder Propylenoxids
pro Stunde und mg Protein.
Der Einfluß der Temperatur auf die Bildung von Methanol und Propylenoxid
durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202) wurde nach 10-minütigem Inkubieren
von Reaktionsgemischen bei verschiedenen Temperaturen unter-
909843/0882
sucht. Die Optimaltemperatur für die Epoxydation von Propylen
und die Hydroxylierung von Methan war 35°C. Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen durchgeführt, wie in
Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemische
bei 3O0C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. 100 >a
Aktivität entsprechen 5,0 bzw. 4,2 uMol des gebildeten Methanols bzw. Propylenoxids pro Stunde und mg Protein.
Es wurde festgestellt, daß sowohl die Aktivität der Hydroxylierung
von Methan als auch der Epoxydation von Propylen durch die P(4O)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRI-15, NRRL B-11
202) bei Kühlschranktemperatur (0-40C) gleichzeitig sanken.
Bei der Durchführung dieser Tests wurden die Reaktionen durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt
wurde gaschromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemischs bei 3O°C auf einem Rotationsschüttler ermittelt.
100 % Aktivität entsprechen 4,8 bzw. 4,1 pMol des gebildeten
Methanols bzw. Propylenoxids pro Stunde und mg Protein.
Es ist berichtet worden, daß die Oxydation von Methan durch Zellsuspensionen von Methan^-verwertenden Bakterien durch verschiedene
metallbindende oder metallchelatisierende Mittel gehemmt wird (Patel et al., J. Baeteriol. jy>6, 1017-1019 (1976)).
Daher wurde der Einfluß von Inhibitoren auf Methan- und Propylen-Oxydationsaktivitäten
durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRI-15, NRRL B-11 202) untersucht. Die Bildung
von Methanol und Propylenoxid wurde durch verschiedene metallbindende Verbindungen mit verschiedenen liganden Kombinationen,
das heißt Stickstoff-Stickstoff (ci,«c-Bipyridyl), Sauerstoff-Stickstoff
(8-Hydroxychinolin) und Schwefel-Stickstoff (Thioharnstoff, Thiosemicarbazid), wie in Tabelle 71 gezeigt,
gehemmt. Dies legt die Beteiligung von Metallionen an der Oxydation sowohl der Hydroxylierung von Methan als auch der Epoxy-
909843/0882
dation von Propylen nahe. Ähnlich hemmen, wie in Tabelle VIa
gezeigt, diese Verbindungen auch die Hydroxylierung von liethan
und die Epoxydation von Propylen, wenn zellhaltige Enzympräparat
e verwendet v/erden.
Einfluß des Inhibitors auf die Aktivität zur Epoxydation von Propylen und Hydroxylierung von Methan durch
Methvlosinus sp. (ORL-15. ITBRI B-11 202)
Inhibitor
Kontrolle
1,1O-Phenanthrolin
Ealiumzyanid Thiosemicarbazid Thioharnstoff 8-Hydroxychinolin
| % Hemmung | Me than-Hydroxy- | 0 | |
| Propylen- | lierungsaktivi- | 99 | |
| Konzentra | Epoxydations- | tät | 90 |
| tion (Mol) | aktivität | 100 | |
| 0 | 100 | ||
| ΙΟ"3 | 98 | 98 | |
| 10~3 | 93 | 80 | |
| ΙΟ"3 | 98 | ||
| ΙΟ"3 | 97 | ||
| ΙΟ"3 | 98 | ||
| 10-3 | 75 | ||
(a) Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben.
Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch
nach 5» 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemische bei 300C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. Die ungehemmten
Oxydationsgeschwindigkeiten für Methan und Propylen waren 4,5 bzw. 4,1 uMol gebildetes Methanol bzw. Propylenoxid
pro Stunde und mg Protein in der P(40)-Fraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202).
909843/0882
Einfluß von Inhibitoren auf die Epoxydation von Propylen und die Hydroxylierung
von Methan
%
Hemmung
CD CO Ji-CO
O OO OO i-O
Inhibitor
Thioharnstoff
1,1O-Phenanthrolin
Imidazol Kaliumzyanid
Methylosinus Methylococcus Methylobacterium
trichosporium 0B3b capsulatus organophilum
(NRRL B-11 196) (CRL, M1, NRRL B-11 219) (CRL 26, NRRL B-11 222)
Epoxy- Hydroxy- Epoxy- Hydroxy- Epoxy- Hydroxy-
dation lierung dation lierung datipn lierung
| 100 | 100 | 100 |
| 90 | 92 | 95 |
| 100 | 90 | 100 |
| 95 | 90 | 95 |
| 100 | 100 | 100 |
| 100 | 100 |
| 95 | 90 |
| 100 | 100 |
| 95 | 100 |
| 100 | 95 |
100
90
100
100
95
OJ
Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Die Produkte wurden
gaschromatographisch nach 1 h Inkubation bei 30 C ermittelt. Jeder Inhibitor wurde mit
einer Endkonzentration von 1 mMol zugesetzt.
O CXt·
■ 231510a
Einfluß von Metallen
Da die ilethan-mono-oxygenase aus Methan-verwertenden Bakterien
ein kupfer- oder eisenhaltiges Protein ist (Tonge et al., J. Biochem. 1_61_, 333-344 (1977)), wurde der Einfluß von Kupfer-
und Eisensalzen auf die Oxydation von Methan und Propylen durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL
B-11 202) untersucht. Die Geschwindigkeit der Hydroxylierung
von Methan zu Methanol und der Epoxydation von Propylen zu Propylenoxid wurde in Gegenwart zugesetzter Kupfersalze zweifach
erhöht (Tabelle VII).
9098A3/0882
Einfluß von Metallen auf die Aktivität zur Epoxidation von Propylen und Hydroxylierung
von Methan durch Methylosinus sp. (CRL-I5, NRRl B-11 202)
Metall
Konzentration (Mol)
Propylen-Oxydationsaktivität (a)
(uMol/h/mg Protein)
Me than-Oxydati onsaktivität
(a) (uMol/h/mg Protein)
Kontrolle Eisen(III)Chlorid Eisen(II)sulfat
Kupfer(I) Chlorid Kupfer(II)sulfat
10 10 10 10'
4,5 5,8 5,9 9,2 9,0
4,0 4,8 4,8 7,2 7,1
(a) Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben. Das Reaktionsprodukt
wurde gaschromatographisch nach 5, 10 und 15 min Inkubation
des Reaktionsgemische bei 300C auf einem Rotationsschüttler ermittelt. Die
Oxydationsgeschwindigkeiten wurden als uMol des gebildeten Produkts pro h
und mg Protein in der P(40)-Fraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL
B-11 202) ausgedrückt.
Die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation von Propylen durch Teilchenfraktionen Methan-verwertender Bakterien
erfordert Sauerstoff und NADH. Die Präge, ob dasselbe oder ein ähnliches Enzym an der Oxydation beider Substrate beteiligt
ist, wurde durch Substrat-Konkurrenzversuche geprüft. Der Versuch bestand in der Bestimmung des Einflusses von Methan auf
die Oxydation von Propylen zu Propylenoxid durch die P(4O)-Teilchenfraktion
von Methylosinus sp. (CRL-I5f NRRL B 11 202).
Wie in Tabelle VIII gezeigt, ergab sich eine Senkung der Menge an in Gegenwart von Methan gebildetem Propylenoxid. Folglich
hemmte Methan die Umwandlung von Propylen in Propylenoxid, vermutlich
durch Konkurrenz um die verfügbare Enzymstelle.
Einfluß von Methan auf die Propylen-Epoxydationsaktivität durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL
B-11 202)
Gebildetes Propylenoxid v '
Substrat uMol/h/mg Protein
Propylen 4,3
Propylen + Methan (1:1 Vol/Vol) 1,8
Methan 0
(a) Die Reaktionen wurden wie in Beispiel 1 beschrieben durchgeführt. Das Reaktionsprodukt wurde gaschromatographisch
nach 5f 10 und 15 min Inkubation des Reaktionsgemische
bei 3O°C auf einem Rotationsschüttler
ermittelt.
Ähnlich beeinflußt Methan die Epoxydation von Propylen aus Zellsuspensionen von mit Methan gezüchtetem Methylosinus
trichosporium OB3b (NRRL B-11 196), wie in Tabelle VIII a
gezeigt.
909843/0882
2915101
Einfluß von Methan auf die Epoxydation von Propylen
v
'
Zusammensetzung der Gebildetes Propy- % Gasphase 1 en oxid (uMol) Hemmung
Propylen + Helium +Op .. g 0
(25:25:50 Vol/Vol)
Propylen + Methan +O2 0 8 50
(25:25:50 Vol/Vol)
(a) Die Reaktionen wurden durchgeführt, wie in Beispiel 1 beschrieben,
mit der Ausnahme, daß verschiedene Gaszusammensetzungen verwendet wurden, um einen konstanten Propylen-Partialdruck
aufrechtzuerhalten. Zellsuspensionen von mit Methan gezüchtetem Methylosinus trichosporium 0B3b (NRRii
B-11 196) (3,6 mg) wurden verwendet. Propylenoxid wurde gaschromatographisch nach 15 min Inkubation ermittelt.
Die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15, NRRL
B-11 202) wurde zur Bestimmung der Stöchiometrie der Hydroxylierungs- und EpOxydationsreaktion verwendet. Die Stöchiometrie
der Methan- oder Propylen-abhängigen NADH-Oxydation, der
Sauerstoffverbrauch und die Produktbildung waren etwa 1:1:1 (Tabelle IX). Dies steht im Einklang mit der Katalyse der Methan-
oder Propylen-Oxydation durch eine Monooxygenase.
Stöchiometrie der Propylen-EpOxydation und Methan-Hydroxylierung
durch die P(40)-Teilchenfraktion von Methylosinus sp. (CRL-15. NRRL B-11 202) ^
NADH, oxy- Q0 verbraucht diert (uMol) - -■ ■ -
| Substrat | Gebildetes Pro |
| (μΜοί) | dukt (uMol) |
| Propylen | Propylenoxid |
| 5,0 | 4,5 |
| Methan | Methanol |
| 5,0 | 4,2 |
5,0 4,8 4,8 4,6
909843/0882
(a) Unter identischen Reaktionsbedingungen erfolgte die Ermittlung
des oxydierten NADH spektrophotometrisch, die Ermittlung des verbrauchten Sauerstoffs wurde polarographisch
gemessen und die Ermittlung des gebildeten Produkts erfolgte gaschromatographisch.
Vergleichsweise vmrde die Stöchiometrie der Epoxydation von
Propylen durch eine Zellsuspension von Methylosinus trichosporium OB3b (WRRL B-11 196) wie folgt bestimmt: Das Reaktionsgemisch
(3,0 ml) enthielt 0,05 m Natriumphosphatpuffer, pH 7,0, und 3,6 uMol Propylen. Die Reaktion wurde durch Einspritzen
von 0,1 ml Zellsuspension (3,1 mg Protein) gestartet. Eine Korrektur erfolgte für den endogenen Verbrauch von Sauerstoff.
Die Menge des während der Reaktion (3 min) verbrauchten Sauerstoffs wurde polarographisch mit einer Clark-Sauerstoffelektrode
bestimmt. Das verbrauchte Propylen und das gebildete Propylenoxid wurden gaschromatographisch ermittelt. Der Propylenverbrauch
war 0,29 uMol, der Sauerstoffverbrauch 0,30 uMol und das
gebildete Propylenoxid 0,28 uMol.
Um weiter nachzuweisen, daß die Enzymaktivität in der Teilchenfraktion
(nicht in der überstehenden Flüssigkeit) steckt, wurden die folgenden Versuche durchgeführt. Zellen von mit Methan gezüchtetem
Methylococcus capsulatus (CRL M1, NRRL B-11 219) wurden
nach der Methode des Beispiels 1 erhalten. Der Rohextrakt nach Zentrifugieren bei 10 000 g der durch Schalleinwirkung aufgebrochenen
Zellen (3 x 50 s, Ultraschalloszillator Modell W der Wave Energy System, Inc.) zeigte Aktivität weder für die Epoxydation
noch für die Hydroxylierung. Wurden die Zellen jedoch durch zweimaligen Durchgang durch eine Französische Druckzelle
(1000 kp Druck) aufgebrochen, fanden sich beide Aktivitäten im Rohextrakt nach Zentrifugieren bei 10 000 g. Die gesamte Aktivität
des Rohextrakts wurde als Teilchenfraktion durch weiteres Zentrifugieren des Rohextrakts 90 min bei 40 000 g und 4°C gesammelt.
NADH stimulierte sowohl die Epoxydations- als auch die Hydroxylierungsreaktion, wie in Tabelle X gezeigt.
909843/0882
-γί- 291510
Tabelle Σ
Epoxydations- und Hydroxylierungsaktivitäten in zellfreien
Fraktionen von Methylococcus capsulatus (CRL K1, NRRL
B-11 219) fe)
Oxydationsgeschwindigkeit (nMol/ 30 min/Probe
Zellfreie Epoxydation von Hydroxylierung Fraktionen Propylen von Methan
(1) leilchenfraktion 750 500
(10 000 - 40 000 g)
(1) + NADH 900 650
(2) überstehende Frak- 0 0 tion von 40 000 g
(2) + NADH 0 0
(a) Die Zellen wurden durch die Französische Druckzelle, wie
oben beschrieben, aufgebrochen. NADH (2,5 uMol) wurde, wo angegeben, dem Reaktionsgemisch zugesetzt. Die Proteinmenge
in der leilehenfraktion und der bei 40 000 g überstehenden
Fraktion war 1 mg bzw. 2,5 mg. Jede Probe enthielt 0,5 ml Reaktionsgemisch.
Sowohl das System von Pseudomonas aeruginosa von Van der linden, Biochim. Biophys. Acta., Jl* 157-159 (1963) als auch das System
von Pseudomonas oleovorans, Abbott und Hou, Appl. Microbiol.,
26, 86-91 (1973) epoxydierte flüssige ί-Alkene von Cg bis C12,
aber keine gasförmigen Alkene.
Die Erfindung führt zur Epoxydation von Äthylen, Propylen, 1-Buten und Butadien durch Zellsuspensionen aller drei verschiedener
Gruppen von Methan-verwertenden Bakterien. Die Epoxydation
von Alkenen und die Hydroxylierung von Methan wurden unter anaeroben Bedingungen oder mit Methanol gezüchteten Zellen
nicht gefunden, was vermuten läßt, daß das Enzymsystem induzierbar
ist. Die Produkt-1,2-epoxide sammelten sich extrazellulär an. Der nicht-enzymatische Abbau von Propylenoxid im
909843/0882
offenbarten Probensystem war selbst nach, verlängerter Inkubationszeit
unbedeutend. Van der Linden, a.a.O., wies die Produktion von 1,2-Epoxyoctan aus 1-Octen durch mit Heptan gezüchtete
Zellen von Pseudomonas sp. nach und stellte auch fest, daß das Epoxid enzymatisch nicht weiter oxydiert wurde.
May und Abbott, Biochem. Biophys. Res. Commun. 48, 1230-1234
(1972) und J. Biol. Chem. 2^8, 1725-1730 (1973) berichteten
jedoch, daß, wenn 1-Octen als Substrat dem co-HydroxyIierungs-Enzymsystem
von P. oleovorans zugeführt wurde, sowohl 8-Hydroxy-1-octen als auch 1,2-Epoxyoctan gebildet wurden. Außerdem
fanden Abbott und Hou, a.a.O., daß die Methylgruppe der letzteren Verbindung auch der Hydroxylierung unterlag. Die
vorliegenden, aus den Untersuchungen lebensfähiger Zellsuspensionen der Methan-verwertenden Bakterien erhaltenen Ergebnisse
jedoch zeigen, daß Propylenoxid enzymatisch nicht weiter im Stoffwechsel verarbeitet wurde.
Van der Linden, a.a.O., zeigte, daß die Epoxid-Ansammlung von 1-Octen durch Pseudomonas aeruginosa durch den Stoffwechsel
einer großen Menge von 1-Octen über Methylgruppen-Epoxydation begleitet war. Bei der Epoxydation von Propylen durch Zellsuspensionen
von Methan-verwertenden Bakterien jedoch wurde keine
Bildung von 3-Hydroxy-propen-1 nachgewiesen.
Sowohl die Epoxydation der G2«G.-1-Alkene als auch die Hydroxylierung
von Methan mit den Zellsuspensionen wurde durch verschiedene metallbindende und metallchelatisierende Mittel inhibiert,
was die Beteiligung von metallhaltigen Enzymsystem(en)
anzeigt. Das ähnliche Ausmaß der Hemmung sowohl für die Propylen- als auch die Methan-Oxydation (Tabelle VIa) zeigte, daß
die Epoxydations- und Hydroxylierungsreaktion durch dasselbe oder ein ähnliches Enzymsystem katalysiert werden kann. Die Epoxydation
von Propylen zu Propylenoxid durch eine Zellsuspension eines mit Methan gezüchteten Stamms von Methylococcus capsulatus
NRRL B-11 219 wurde in Gegenwart des Hydroxylierungssubstrats, Methan (Tabelle X) gehemmt (50%)· Dies legt deutlich eine Konkurrenz
zwischen dem Hydroxylierungssubstrat und dem Epoxyda-
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HI
tionssubstrat um ein einziges Enzymsystem nahe. Wahrscheinlich
katalysiert das Methan-monooxygenase-Enzymsystem sowohl die Epoxydation von Alken als auch die Hydroxylierung von Kethan.
Die Veröffentlichungen von May und Abbott, a.a.O., berichteten, daß das co-Hydroxylierungssystem von Pseudomonas oleovorans sov/ohl
die Epoxydation von 1-Octen als auch die Hydroxylierung
von n-Octan katalysierte.
Die Optimalbedingungen für die in-vivo-Epoxydation von Propylen
durch Zellsuspensionen der drei verschiedenen Gruppen Methan-verwert
end er Bakterien sind recht ähnlich. Die pH-Optima lagen bei etwa 6-7 und das Temperaturoptimum um 35°C. Die offensichtliche
Abnahme der Epoxydation über 4O0C mag sowohl auf
der Instabilität des Monooxygenasesystems als auch auf Flüchtigkeit des Produkts, Propylenoxid (Sdp. 350O) beruhen.
Sowohl die Hydroxylierungs- als auch die Epoxydationsaktivität
sitzt in der zellfreien Teilchenfraktion, die beim Zentrifugieren zwischen 10 000 und 80 000 g ausfällt. Tonge et al.,
Biochem. J. 161, 333-344 (1977) und I1EBS Lett., 5£, 293-299
(1975) haben die Reinigung einer membrangebundenen Methanmonooxygenase
aus der Teilchenfraktion (beim Zentrifugieren zwischen 10 000 und 150 000 g sedimentiert) von Methylosinus
trichosporium 0B3b berichtet. In jüngster Zeit, aber nach den vorliegenden Erkenntnissen, haben Colby et al., Biochem. J.,
165» 395-402 (1977) eine einzigartige lösliche Methan-monooxygenase
aus Methylococcus capsulatus (Stamm Bath) nachgewiesen,. die die Oxydation von n-Alkana^ n-Alkenen, Äthern und alicyclischen,
aromatischen und heterocyclischen Verbindungen katalysiert. Die Stämme der drei verschiedenen Gruppen Methanverwertender
Bakterien, die hier untersucht wurden, katalysieren alle die Epoxydation gasförmiger Alkene (Cp-C.) und die
Hydroxylierung gasförmiger Alkane (Cj-C,). Auch wurde unerwarteterweise
gefunden, daß die Enzymaktivität in der Teilchenfraktion steckt (das heißt in dem Material, das sich absetzt,
wenn die überstehende Flüssigkeit nach dem Zentrifugieren aufgebrochener Zellen bei 10 000 g für 30 min eine Stunde lang
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bei 10 000 g oder darüber zentrifugiert wird), nicht in der
löslichen Traktion (das hei.jt, der überstehenden Flüssigkeit
nach dem Zentrifugieren aufgebrochener Zellen bei 80 OOÜ ζ
oder darüber für eine Stunde).
Differentielles Zentrifugieren von Suspensionen aufgebrochener
Zellen von Methylomonas sp. (CRL-17, HRRL B-11 208 und Hethylococcus
capsulatus (Texas A1I1CC 19 069), (Typ I, obligate
Ilethylotrophe); Hethylosinus sp. (CRL-15, NRRL B-11 202) und
Hethylosinus trichosporium (0B3b, ITRRL B-11 196) (Ty? II, obligate
Hethylotrophe) ; und Hethylobacterium sp. CRL-26, NRIIIj
B-11 222) (ein fakultativer Hethylotroph)lieferte zellfreie Teilchenfraktionen, die die Hydroxylierung von n-Alkanen und
die Epoxydation von n-Alkenen katalysierten. Beide Aktivitäten lagen hauptsächlich in der P(40)-Fraktion und waren von der
Gegenwart von Sauerstoff sowie einem Elektronenträger, zum Beispiel IJADH, abhängig.
Die Hydroxylierung von Methan zu !-!ethanol und die Epoxydation
von Propylen zu Propylenoxid, durch die P(40)-Teilchenfraktion
von Kethylosinus sp. (CRL-15, WRRL B-11 202) katalysiert, haben
ähnliche pH- und Temperatur-Optima (Piguren 3 und 4). Beide Aktivitäten
gingen bei der Lagerung der P(40)-Teilchenfraktion bei Kühlschranlctemperatur gleichzeitig verloren.
Die Hydroxylierung von Methan und die Epoxydation von i?ropylen mit den zellfreien Extrakten wurden durch verschiedene metallbindende
oder metallchelatisierende Mittel stark gehemmt (Tabelle VI). Die Geschwindigkeit beider Reaktionen wurde in Gegenwart
von Kupfer- oder Eisensalzen zweifach erhöht (Tabelle VII). Dies läßt die Beteiligung eines metallhaltigen Enzymsystems
bei der Oxydation beider Substrate vermuten. Diese Ergebnisse und die Stöchiometrie der Hydroxylierungs- und Epoxydationsreaktion
zeigen an, daß beide Reaktionen durch dasselbe metallhaltige Monooxygenasesystem katalysiert werden können.
Die Tatsache, daß die Umwandlung von Propylen in Propylenoxid durch Methan inhibiert wurde, stützt diese Vermutung.
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2815101
Es ist berichtet worden, daß die zellfreien Teilchenfraktionen,
die aus Methylococcus capsulatus (Texas) (Ribbons et al., J. Bacteriol., ,122., 1351-1363 (1975)), Methylomonas methanica
(iFerenci et al., J. Gen. Microbiol. 9±, 79-91 (1975)) und
Methylosinus triehosporium (OB3b) (Tonge et al., Biochem. J.,
161, 333-344 (1977)) die Sauerstoff- und NADH-abhängige Oxydation
von Methan, Äthan, Propan, Butan und Kohlenmonoxid katalysierten. Die Oxydation von Methan durch Teilchenfraktionen
dieser Organismen wurde durch verschiedene metallbindende oder metallchelatisierende Mittel gehemmt. Die Epoxydation von n-Alkenen
wurde für diese Organismen jedoch nicht berichtet.
Die Hethan-monooxygenase aus Methylosinus trichosporium (OB3b,
MRL B-11 196) wurde gereinigt, und es zeigte sich, daß sie aus
drei Komponenten bestand: einem löslichen, CO-bindenden Cytochrom c, einem kupferhaltigen Protein (Methan-monooxygenase),
und einem Protein niedrigen Molekulargewichts (Tonge et al., 1977, a.a.O.).
Im Gegensatz zu den obigen Organismen berichteten Golby et al.,
a.a.O., von der einzigartigen Aktivität löslicher Methan-monooxygenase aus Methylococcus capsulatus (Bath). Die Oxydation
von Methan durch die lösliche Fraktion dieses Organismus wurde durch verschiedene metallbindende Mittel nicht inhibiert. Kürzlich
lösten Colby und Dalton (Biochem. J. 221» 461-468 (1978)) die Methan-monooxygenase von Methylococcus capsulatus (Bath) in
drei Komponenten auf und identifizierten eine der Komponenten als eisenhaltiges ELavoprotein.
Die Methan-oxydierenden Aktivitäten der oben beschriebenen methylotrophen
Bakterien liegen in der Teilchenfraktion und unterscheiden sich von der löslichen Aktivität von Methylococcus
capsulatus (Bath), wie von Colby et al. beschrieben.
Van der Linden (1963» a.a.O.) wies die Produktion von 1,2-Epoxiden
aus 1-Octen durch mit Heptan gezüchtete ruhende Zellen
von Pseudomonas sp· nach· Epoxide wurden als Produkte des Al-
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kan-Stoffwechsels nicht nachgewiesen und wurden durch
Pseudoraonas sp. nicht oxydiert. So ist die Rolle der Epoxide beim Alkan-3toff wechsel ungewiß. Van der Linden postulierte,
daß das Enzymsystern, das Epoxide bildet, das gleiche sein
kann wie das System, das die AnfangsOxydation von Alkanen katalysiert.
Cardini und Jurtshuk (J.Biol. Chem. 245., 2789-2796 (197O)) fand, daß ein zellfreier Extrakt von einem Corynebacterium
sp. die Oxydation von 1-Octen zu Epoxyoctan zusätzlich
zur Hydroxylierung von Octan zu Octanol bewirkte. McKenna und
Coon (J.Biol. Chem. 24J5, 3883-3889 (197O)) isolierten ein Enzymsystem
aus Pseudomonas oleovorans, das die Hydroxylierung von n-Alkanen (Cg-C.,«) "und Fettsäuren katalysierte. Später berichteten
Abbott und Hou, a.a.O., und May und Abbott, a.a.O., daß das Enzymsystem von Pseudomonas oleovorans auch die Epoxydations
von 1-Alkenen zusätzlich zu den Hydroxylierungsreaktionen
katalysierte. Die Enzymsysteme aus Pseudomonas und Corynebacterium sp. katalysierten die Epoxydation von Og-C^pn-Alkenen.
Die Epoxydation von Cp-C^-n-Alkenen wurde durch die
Enzymsysteme von Pseudomonas nicht katalysiert.
Vorliegend wurde unerwarteterweise gezeigt, daß die drei verschiedenen
Gruppen Methan-oxydierender Bakterien die Hydroxylierung
von n-Alkanen (C.-C.) sowie die Epoxydation von n-Alkenen
(Cp-C.) katalysieren. Ferner wird die Hydroxylierungs-
und Epoxydationsreaktion durch die gleiche oder eine ähnliche NADH-abhängige Monooxygenase katalysiert.
Außer methylotrophen Bakterien können andere HikrοOrganismen
zur Durchführung der Epoxydation der Cp-C.-Alkene verwendet
werden. Dazu gehören Bakterien, Fungi und Hefen, die auf kurzkettigen Alkanen wachsen. Die methylotrophen Bakterien (obligat
oderfekultativ) oder die anderen MikrοOrganismen werden
entweder mit Methan als einziger Quelle für Kohlenstoff oder mit einer anderen Kohlenstoffverbindung (in Gegenwart von Methan
oder einem anderen Induktor) gezüchtet, und die Zellen oder daraus stammenden Enzyme können beim erfindungsgemäßen
Verfahren verwendet werden.
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Claims (10)
- Patentansprüche\
1.;Verfahren zur Epoxydation eines Cp-C,-n-Alkens oder eines^- ■' Diens aus der Gruppe Äthylen, Propylen, Buten-1 und Butadien, dadurch gekennzeichnet, daß das Alken oder Dien mit Sauerstoff in Gegenwart der leilchenfraktion von Mikroorganismen oder daraus stammenden Enzympräparaten in Berührung gebracht wird, wobei die Mikroorganismen in einem Methan oder Dimethyläther und Sauerstoff enthaltenden Nährmedium kultiviert worden sind. - 2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als η-Alken Propylen verwendet wird.
- 3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß als MikrοOrganismen obligate oder fakultative Methylotrophe eingesetzt werden.
- 4· Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen der Gattungen aus der Gruppe Methylosinus, Methylocystis, Methylomonas, Methylobacter, Methylococcus und Methylobacterium eingesetzt werden.909843/088 2
- 5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß MikroOrganismen der Arten Methylosinus trichosporium, Methylosinus sporium, Methylocystis parvus, Methylomonas methanica, Methylomonas albus, Methylomonas streptobacterium, Methylomonas agile, Methylomonas rubrum, Methylomonas rosaceus, Methylobacter chroococcum, Methylobacter bovis, Methylobacter capsulatus, Methylobacter vinelandii, Methylococcus capsulatus, Methylococcus minimus und Methylobacterium organophilum eingesetzt werden.
- 6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß Mikroorganismen der Stämme Methylosinus trichosporium OB3b (NRRL B-11 196); Methylosinus sporiun 5 (NRRL B-11 197); Methylocystis parvus OBBP (NRRL B-11 198); Methylomonas methanica S1 (NRRL B-11 199); Methylomonas albus BG8(NRRL B-11 200); Methylobacter capsulatus Y (NRRL B-11 201); Methylobacterium organophilum sp. nov. (ATCG 27 886); Methylomonas sp. AJ-3670 (PERIi P-2400); Methylococcus 999 (NCIB-Zugangsnummer 11 083; und Methylomonas SM 3 (NCIB-Zugangsnummer 11 084) eingesetzt werden.
- 7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Epoxydation ansatzweise erfolgt.
- 8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß die Epoxydation ansatzweise erfolgt und das Enzympräparat immobil gemacht wird.
- 9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Epoxydation kontinuierlich erfolgt und das Enzympräparat immobil gemacht wird.
- 10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dadurch gekennzeichnet, daß das Enzympräparat aus einem Enzymextrakt des Mikroorganismus hergestellt wird.909843/0882
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