JP2802588B2 - 微生物の生物学的に純粋な培養物、並びにそれを用いるジオール製造方法および環状エーテル製造方法 - Google Patents
微生物の生物学的に純粋な培養物、並びにそれを用いるジオール製造方法および環状エーテル製造方法Info
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- JP2802588B2 JP2802588B2 JP20308194A JP20308194A JP2802588B2 JP 2802588 B2 JP2802588 B2 JP 2802588B2 JP 20308194 A JP20308194 A JP 20308194A JP 20308194 A JP20308194 A JP 20308194A JP 2802588 B2 JP2802588 B2 JP 2802588B2
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は新規微生物及びそれを用
いる香料関連化合物の製造に関する。
いる香料関連化合物の製造に関する。
【０００２】
【従来の技術】式、
【化学式１０】 のスクラレオライドは、それ自体芳香性を有するが香料
に用いられる重要な物質である式、
に用いられる重要な物質である式、
【化学式１１】 のエーテル化合物製造における価値ある中間体として見
出された。
出された。
【０００３】米国特許第4,798,799号は、本願に関連す
る化合物について次のように記載している。式、
る化合物について次のように記載している。式、
【化学式１２】 のジオールは、前記スクラレオライド生成における中間
体として、また前記エーテル化合物のプレカーサとして
有用である。また、式、
体として、また前記エーテル化合物のプレカーサとして
有用である。また、式、
【化学式１３】 の環状エーテルは前記ジオール生成における中間体とし
て有用である旨記載されている。
て有用である旨記載されている。
【０００４】なるほど、この米国特許は、微生物Hyphoz
yma roseoniger ATCC 20604が、式、
yma roseoniger ATCC 20604が、式、
【化学式１４】 のスクラレオールならびに前記環状エーテルを包含する
化合物を前記ジオールに変換する能力があり、この微生
物の培養物の利用を開示している。
化合物を前記ジオールに変換する能力があり、この微生
物の培養物の利用を開示している。
【０００５】しかしながらこの先行技術には、(i) 式、
【化学式１５】 の反応を微生物を通じて行い比較的高収量でラクトンを
得ること、 (ii) 式、
得ること、 (ii) 式、
【化学式１６】 の反応をBensingtonia ciliata, ATCC 20919またはCryp
tococcus laurentii ATCC 20920を用いる特徴的方法を
通じて行うこと、及び(iii) 式、
tococcus laurentii ATCC 20920を用いる特徴的方法を
通じて行うこと、及び(iii) 式、
【化学式１７】 の反応をCryptococcus laurentii ATCC 20920使用の微
生物的手法によることについては何らの教示も暗示もな
い。
生物的手法によることについては何らの教示も暗示もな
い。
【０００６】しかも本発明の微生物はいずれも新規なも
のである。
のである。
【０００７】
【発明の要旨】本発明は、下記微生物の生物学的に純粋
な培養に関するものである。 Cryptococcus albidus, ATCC 20918, Bensingtonia ciliata, ATCC 20919、 Cryptococcus laurentii, ATCC 20920、 及び Cryptococcus albidus, ATCC 20921
な培養に関するものである。 Cryptococcus albidus, ATCC 20918, Bensingtonia ciliata, ATCC 20919、 Cryptococcus laurentii, ATCC 20920、 及び Cryptococcus albidus, ATCC 20921
【０００８】他の実施例に於いて本発明は、下記微生物
に関する培養物についてのものである。 Cryptococcus albidus, ATCC 20918、 Bensingtonia ciliata, ATCC 20919、 Cryptococcus laurentii, ATCC 20920、 及び Cryptococcus albidus, ATCC 20921
に関する培養物についてのものである。 Cryptococcus albidus, ATCC 20918、 Bensingtonia ciliata, ATCC 20919、 Cryptococcus laurentii, ATCC 20920、 及び Cryptococcus albidus, ATCC 20921
【０００９】これら培養物は各々、水性養分培地におけ
る通気条件下で、次の構造のジオールか、
る通気条件下で、次の構造のジオールか、
【化学式１８】 次の構造のスクラレオライド[sclareolide]の
【化学式１９】 どちらかを次のようにして生産することができる。Cryp
tococcus albidus, ATCC20918 と Cryptococcus albidu
s, ATCC 20921は、次の構造のスクラレオール[sclareo
l]と
tococcus albidus, ATCC20918 と Cryptococcus albidu
s, ATCC 20921は、次の構造のスクラレオール[sclareo
l]と
【化学式２０】 次の構造のエピスクラレオール[episclareol]との混合
物から
物から
【化学式２１】 次の構造のスクラレオライド[sclareolide]
【化学式２２】 を生産することができる、また、Bensingtonia ciliat
a, ATCC 20919 と Cryptococcus laurentii, ATCC 2092
0は、次の構造のスクラレオール[sclareol]と、
a, ATCC 20919 と Cryptococcus laurentii, ATCC 2092
0は、次の構造のスクラレオール[sclareol]と、
【化学式２３】 次の構造のエピスクラレオール[episclareol]から
【化学式２４】 次の構造のジオール
【化学式２５】 を生産することができるものである。
【００１０】さらに別の実施例では本発明は、水性養分
培地における通気条件下で、次の微生物を（個々に）培
養することによって産生される混合物にも関する。ATCC
20918、Cryptococcus albidus,ATCC 20919、Bensingto
nia ciliata,ATCC 20920、Cryptococcus laurentii,ATC
C 20921、Cryptococcus albidus、 以上
培地における通気条件下で、次の微生物を（個々に）培
養することによって産生される混合物にも関する。ATCC
20918、Cryptococcus albidus,ATCC 20919、Bensingto
nia ciliata,ATCC 20920、Cryptococcus laurentii,ATC
C 20921、Cryptococcus albidus、 以上
【００１１】さらに別の実施例では本発明は、(1) 次の
構造
構造
【化学式２６】 及び/又は、 次の構造の
【化学式２７】 １または２以上の化合物を含有する水性養分培地におい
て通気条件下でATCC 20918のCryptococcus albidusまた
はATCC 20921のCryptococcus albidusといった微生物の
いずれかを培養することを特徴とする次の構造のスクラ
レオライド
て通気条件下でATCC 20918のCryptococcus albidusまた
はATCC 20921のCryptococcus albidusといった微生物の
いずれかを培養することを特徴とする次の構造のスクラ
レオライド
【化学式２８】 の生産方法の過程に関する。
【００１２】さらに別の実施例では発明は、次の構造の
ジオールの生産方法の過程に関し、
ジオールの生産方法の過程に関し、
【化学式２９】 (a) ATCC 20919、Bensingtonia ciliata、または(b) AT
CC 20920、Cryptococcuslaurentiiといった微生物のい
ずれかを、 (1) 次の構造のスクラレオール
CC 20920、Cryptococcuslaurentiiといった微生物のい
ずれかを、 (1) 次の構造のスクラレオール
【化学式３０】 (2) 次の構造のエピスクラレオール
【化学式３１】 (3) 次の構造のアセテート
【化学式３２】 から成る群から選択される化合物の１または２以上を有
する水性養分培地で通気条件下に培養することを特徴と
するものである。
する水性養分培地で通気条件下に培養することを特徴と
するものである。
【００１３】発明のなお更なる実施例は、上記エピスク
ラレオール及び／又はスクラレオールを含有する水性養
分培地中で、Cryptococcus laurentii、 ATCC 20920を通
気条件下で培養することにより次式の環状エーテルを産
生することを特徴とするものである。
ラレオール及び／又はスクラレオールを含有する水性養
分培地中で、Cryptococcus laurentii、 ATCC 20920を通
気条件下で培養することにより次式の環状エーテルを産
生することを特徴とするものである。
【化学式３３】 ここに起こり得る反応は次の通りである。
【化学式３４】 及び、
【化学式３５】
【００１４】化合物の変換過程は、次の構造の
【化学式３６】 化合物の１または２または全部の存在下に、水性養分培
地で、ATCC 20918のCryptococcus albidus,ATCC 20919
のBensingtonia ciliata,ATCC 20920のCryptococcus la
urentii, またはATCC 20921のCryptococcus albidusと
いった微生物の１の培養を含むものである。
地で、ATCC 20918のCryptococcus albidus,ATCC 20919
のBensingtonia ciliata,ATCC 20920のCryptococcus la
urentii, またはATCC 20921のCryptococcus albidusと
いった微生物の１の培養を含むものである。
【００１５】このようにこれら化合物は単独で、または
上記化合物の任意の数を含有する混合物として使用する
ことができる。
上記化合物の任意の数を含有する混合物として使用する
ことができる。
【００１６】こうしてATCC 20918のCryptococcus albid
us, またはATCC 20921のCryptococcus albidusを使用し
て反応させると、次の反応を起すことができる。
us, またはATCC 20921のCryptococcus albidusを使用し
て反応させると、次の反応を起すことができる。
【化学式３７】 及び/又は
【化学式３８】
【００１７】ATCC 20919のBensingtonia ciliata、また
はATCC 20920のCryptococcus laurentiiを使用して反応
をさせると次の反応を起こすことができる。
はATCC 20920のCryptococcus laurentiiを使用して反応
をさせると次の反応を起こすことができる。
【化学式３９】 及び／又は
【化学式４０】
【００１８】使用される微生物の形態[form]は重要でな
い。微生物は、細胞およびその細胞に好適な養分溶液を
含む培養物（懸濁液）としてか、または緩衝液中に懸濁
した細胞という形態で使用することができる。細胞また
はその抽出された酵素は適当な固形支持体上に固定する
ことができ、そうすれば、これらは化合物の変換に用い
ることができる。
い。微生物は、細胞およびその細胞に好適な養分溶液を
含む培養物（懸濁液）としてか、または緩衝液中に懸濁
した細胞という形態で使用することができる。細胞また
はその抽出された酵素は適当な固形支持体上に固定する
ことができ、そうすれば、これらは化合物の変換に用い
ることができる。
【００１９】懸濁状の培養物混合物は適当な水性養分培
地への微生物の接種によって調製される。適当な養分培
地とは窒素源、無機塩、成長要素、好適な基質、および
任意的にその他の炭素源を包含するものをいう。本発明
方法の実施に好適な種類の炭素源としては、例えばグル
コース、ガラクトース、Ｌ−ソルボース、マルトース、
スクロース、セロビオース、トレハロース、Ｌ−アラビ
ノース、Ｌ−ラムノース、エタノール、グリセロール、
Ｌ−エリトリトール、Ｄ−マンニトール、ラクトース、
メリビオース、ラフィノース、メレチトース、デンプ
ン、Ｄ−キシロース、Ｄ−ソルビトール、α−メチル−
Ｄ−グルコシド、乳酸、クエン酸、およびコハク酸があ
る。好適な窒素源には、例えばペプトン、肉抽出物、抽
出酵母、コーンスティープリカー、カゼイン、尿素、ア
ミノ酸のような窒素含有の有機物質、または硝酸塩、亜
硝酸塩、無機アンモニア塩のような窒素含有の無機化合
物がある。好適な無機塩には例えば、マグネシウム、カ
リウム、カルシウム、またはナトリウムのリン酸塩があ
る。上記の培地の養分は、所望により例えばビタミンＢ
群の１または２以上、及び／又はＦｅ，Ｍｏ，Ｃｕ，Ｍ
ｎ及びＢのような１または２以上の微量鉱物で補足する
ことができる。ビタミンや微量鉱物は、酵母エキスの少
量が培地に追加されるときには不要である。細菌汚染が
問題になるときは、クロロアンフェニコル［ｃｈｌｏｒ
ｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ］またはクロロテトラサイクリ
ンのような抗生物質を添加することが好ましい。
地への微生物の接種によって調製される。適当な養分培
地とは窒素源、無機塩、成長要素、好適な基質、および
任意的にその他の炭素源を包含するものをいう。本発明
方法の実施に好適な種類の炭素源としては、例えばグル
コース、ガラクトース、Ｌ−ソルボース、マルトース、
スクロース、セロビオース、トレハロース、Ｌ−アラビ
ノース、Ｌ−ラムノース、エタノール、グリセロール、
Ｌ−エリトリトール、Ｄ−マンニトール、ラクトース、
メリビオース、ラフィノース、メレチトース、デンプ
ン、Ｄ−キシロース、Ｄ−ソルビトール、α−メチル−
Ｄ−グルコシド、乳酸、クエン酸、およびコハク酸があ
る。好適な窒素源には、例えばペプトン、肉抽出物、抽
出酵母、コーンスティープリカー、カゼイン、尿素、ア
ミノ酸のような窒素含有の有機物質、または硝酸塩、亜
硝酸塩、無機アンモニア塩のような窒素含有の無機化合
物がある。好適な無機塩には例えば、マグネシウム、カ
リウム、カルシウム、またはナトリウムのリン酸塩があ
る。上記の培地の養分は、所望により例えばビタミンＢ
群の１または２以上、及び／又はＦｅ，Ｍｏ，Ｃｕ，Ｍ
ｎ及びＢのような１または２以上の微量鉱物で補足する
ことができる。ビタミンや微量鉱物は、酵母エキスの少
量が培地に追加されるときには不要である。細菌汚染が
問題になるときは、クロロアンフェニコル［ｃｈｌｏｒ
ｏａｍｐｈｅｎｉｃｏｌ］またはクロロテトラサイクリ
ンのような抗生物質を添加することが好ましい。
【００２０】微生物の培養は、静置培養としてでも、あ
るいは通気条件下で深部培養（例えば、攪拌培養、発酵
器[fermentor]を用いた培養）としてでも行うことがで
きる。ものによってはｐＨ約２.５〜９.０の範囲で行な
うことができるが、好ましくは約３.０〜７.５、最適に
は約３.０〜６.５の範囲である。ｐＨ値は、塩酸、酢
酸、シュウ酸等の無機酸または有機酸を添加することに
よって調整することができ、あるいは水酸化ナトリウ
ム、水酸化アンモニウムのような塩基を添加することに
より、またはリン酸塩またはフタル酸塩のような緩衝剤
を添加することにより調整することができる。インキュ
ベーション温度は約１２℃〜約３３℃に維持されていな
ければならず、より好ましくは約１５℃〜３０℃、最適
には約１８℃〜２８℃である。
るいは通気条件下で深部培養（例えば、攪拌培養、発酵
器[fermentor]を用いた培養）としてでも行うことがで
きる。ものによってはｐＨ約２.５〜９.０の範囲で行な
うことができるが、好ましくは約３.０〜７.５、最適に
は約３.０〜６.５の範囲である。ｐＨ値は、塩酸、酢
酸、シュウ酸等の無機酸または有機酸を添加することに
よって調整することができ、あるいは水酸化ナトリウ
ム、水酸化アンモニウムのような塩基を添加することに
より、またはリン酸塩またはフタル酸塩のような緩衝剤
を添加することにより調整することができる。インキュ
ベーション温度は約１２℃〜約３３℃に維持されていな
ければならず、より好ましくは約１５℃〜３０℃、最適
には約１８℃〜２８℃である。
【００２１】本発明に係る方法は、下記構造の化合物
【化学式４１】 及び／又は
【化学式４２】 の１つ又は混合物を単一炭素源として培養着手時に養分
培地に添加することによって好適に行われる。別法とし
て、培養中か、または炭素源が枯渇されたときに、デキ
ストロースのような別の炭素源と組み合わせて基質を加
えてもよい。培地における基質濃度に対する唯一の制限
は培養物を効果的に空気にさらすことができることにあ
る。しかし基質濃度は好ましくは約０.１g／l〜約１３
０g／l、より好ましくは約０.５g／l〜１２０g／l、最
適には約２.５g／l〜約１００g／lの範囲がよい。化合
物の変換は、上記のいかなる環境下でも最適に行なわれ
得る。
培地に添加することによって好適に行われる。別法とし
て、培養中か、または炭素源が枯渇されたときに、デキ
ストロースのような別の炭素源と組み合わせて基質を加
えてもよい。培地における基質濃度に対する唯一の制限
は培養物を効果的に空気にさらすことができることにあ
る。しかし基質濃度は好ましくは約０.１g／l〜約１３
０g／l、より好ましくは約０.５g／l〜１２０g／l、最
適には約２.５g／l〜約１００g／lの範囲がよい。化合
物の変換は、上記のいかなる環境下でも最適に行なわれ
得る。
【００２２】化合物の変換の全時間（初期培養期後の）
は養分培地の組成および基質濃度に依って変ってくる。
一般に振盪フラスコを用いた培養は約１２時間〜約２６
４時間を要する。しかし、発酵器が使用されるときは培
養時間は約４８時間またはそれ以下に短縮される。
は養分培地の組成および基質濃度に依って変ってくる。
一般に振盪フラスコを用いた培養は約１２時間〜約２６
４時間を要する。しかし、発酵器が使用されるときは培
養時間は約４８時間またはそれ以下に短縮される。
【００２３】化合物の変換は培養物から単離された微生
物の細胞、または従来技術として周知の方法で細胞から
単離された抽出酵素を用いて行われる。この場合には化
合物の変換は、例えば緩衝溶液中、生理食塩溶液中、新
鮮な養分培地中、または水中といった様々な水性養分培
地で便宜的に行われる。単離された細胞または抽出され
た酵素は固形支持体上に固定されて所望の化合物の変換
が達成される。また基質の化合物の変換は、この有機体
（微生物）の突然変異体によって影響される。このよう
な突然変異体は、例えば細胞を紫外線またはＸ線、ある
いは例えばアクリジンオレンジのような公知の突然変異
誘発物質にさらすという周知の方法によって簡単に得る
ことができる。
物の細胞、または従来技術として周知の方法で細胞から
単離された抽出酵素を用いて行われる。この場合には化
合物の変換は、例えば緩衝溶液中、生理食塩溶液中、新
鮮な養分培地中、または水中といった様々な水性養分培
地で便宜的に行われる。単離された細胞または抽出され
た酵素は固形支持体上に固定されて所望の化合物の変換
が達成される。また基質の化合物の変換は、この有機体
（微生物）の突然変異体によって影響される。このよう
な突然変異体は、例えば細胞を紫外線またはＸ線、ある
いは例えばアクリジンオレンジのような公知の突然変異
誘発物質にさらすという周知の方法によって簡単に得る
ことができる。
【００２４】基質は粉末として、あるいはTWEEN 80(商
標)(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸塩)
のような乳化剤中スラリーとして、あるいは乳化剤中の
溶液として、あるいは例えばアセトン、メタノール、エ
タノール、エチレングリコール、あるいはジオキサンの
ような親水性溶媒中の溶液として培地に添加することが
できる。表面活性剤または分散剤も基質の水性懸濁液に
添加することができるし、あるいは基質は超音波を用い
て乳化することができる。
標)(ポリオキシエチレンソルビタンモノオレイン酸塩)
のような乳化剤中スラリーとして、あるいは乳化剤中の
溶液として、あるいは例えばアセトン、メタノール、エ
タノール、エチレングリコール、あるいはジオキサンの
ような親水性溶媒中の溶液として培地に添加することが
できる。表面活性剤または分散剤も基質の水性懸濁液に
添加することができるし、あるいは基質は超音波を用い
て乳化することができる。
【００２５】シリコーン油（例えばUCON）、ポリアルキ
レングリコール誘導体、とうもろこし油、または大豆油
のような入手容易な消泡剤が発泡を抑制するのに使用で
きる。
レングリコール誘導体、とうもろこし油、または大豆油
のような入手容易な消泡剤が発泡を抑制するのに使用で
きる。
【００２６】基質の変換は、気−液クロマトグラフィ(G
LC), 薄層クロマトグラフィ(TLC),高圧液体クロマトグ
ラフィ(HPLC), 赤外スペクトル(IR)、および核磁気共鳴
(NMR)のような標準的な分析法を用いてモニターするこ
とができる。もし基質の急速な消失が観察されるときに
は、微生物の化合物変換能力を最大限にするため、もっ
とたくさんの基質をそのとき追加することができる。一
般にこの過程は、基質の大部分が培地から消失したとき
に終りにされる。使用される微生物の種類に依って、下
記構造の化合物、
LC), 薄層クロマトグラフィ(TLC),高圧液体クロマトグ
ラフィ(HPLC), 赤外スペクトル(IR)、および核磁気共鳴
(NMR)のような標準的な分析法を用いてモニターするこ
とができる。もし基質の急速な消失が観察されるときに
は、微生物の化合物変換能力を最大限にするため、もっ
とたくさんの基質をそのとき追加することができる。一
般にこの過程は、基質の大部分が培地から消失したとき
に終りにされる。使用される微生物の種類に依って、下
記構造の化合物、
【化学式４３】 または下記構造の化合物を
【化学式４４】 水性養分培地から回収できる。下記構造の化合物は、
【化学式４５】 米国特許第4,798,799号明細書の第8欄、第52行、第53行に
記載されているように(この言及により本明細書の一部
に組み入れるものとする)下記構造の化合物に環化され
る。
記載されているように(この言及により本明細書の一部
に組み入れるものとする)下記構造の化合物に環化され
る。
【化学式４６】 下記構造の化合物も、
【化学式４７】 また、その芳香の価値から用いてもよく、あるいは下記
構造の化合物に
構造の化合物に
【化学式４８】 次の反応を経て還元されてもよい。
【化学式４９】
【００２７】次の構造の化合物の生成は
【化学式５０】 まづ次の構造の化合物を
【化学式５１】 次の構造のジオールへと還元し、
【化学式５２】 次にそのジオールを再閉環し、次の構造の化合物を生成
することにより行われる。
することにより行われる。
【化学式５３】 これは次の反応による。
【化学式５４】 および
【化学式５５】
【００２８】好ましくはこの還元反応は、
【化学式５６】 VITRIDE(商標)のような還元剤−−−−米国特許第3,50
7,895号明細書に記載されている水素化ビス(２−メトキ
シエトキシ)水酸化アルミニウムナトリウム−−−−を
使用したトルエンのような不活性溶媒の存在下で行われ
る。この反応は好ましくは約７０℃〜約９０℃の温度域
で約１時間〜約３時間で行われる。
7,895号明細書に記載されている水素化ビス(２−メトキ
シエトキシ)水酸化アルミニウムナトリウム−−−−を
使用したトルエンのような不活性溶媒の存在下で行われ
る。この反応は好ましくは約７０℃〜約９０℃の温度域
で約１時間〜約３時間で行われる。
【００２９】再閉環反応、即ち、
【化学式５７】 は好ましくは、例えば水性水酸化カリウム、あるいは水
性水酸化ナトリウムのような水性水酸化アルカリ金属と
いう塩基性条件で行われる。その詳細については後述の
実施例８に記載する。下記構造の化合物の発酵ブイヨン
からの単離および精製は、
性水酸化ナトリウムのような水性水酸化アルカリ金属と
いう塩基性条件で行われる。その詳細については後述の
実施例８に記載する。下記構造の化合物の発酵ブイヨン
からの単離および精製は、
【化学式５８】 または
【化学式５９】 ろ過、遠心、溶媒抽出、蒸留、結晶化等の従来技術によ
って行うことができる。
って行うことができる。
【００３０】下記構造の化合物は、
【化学式６０】 米国特許第4,798,799号の第8欄、第58〜68行、 米国特許
第4,798,799号の第9欄、第1〜2行に記載されている当業
者に周知のよく使われる環化法により、下記構造の化合
物に変換することができる。
第4,798,799号の第9欄、第1〜2行に記載されている当業
者に周知のよく使われる環化法により、下記構造の化合
物に変換することができる。
【化学式６１】
【００３１】本発明に使用される各微生物は、様々な地
理的箇所から入手された土壌サンプルから単離された。
各菌株は次の入手番号下にアメリカン タイプ カルチャ
ーコレクション[ATCC]に寄託した。Cryptococcus albid
us, ATCC 20918;Bensingtonia ciliata, ATCC 20919;Cr
yptococcus laurentii, ATCC 20920; 及びCryptococcus
albidus, ATCC 20921
理的箇所から入手された土壌サンプルから単離された。
各菌株は次の入手番号下にアメリカン タイプ カルチャ
ーコレクション[ATCC]に寄託した。Cryptococcus albid
us, ATCC 20918;Bensingtonia ciliata, ATCC 20919;Cr
yptococcus laurentii, ATCC 20920; 及びCryptococcus
albidus, ATCC 20921
【００３２】Bensingtonia ciliataとCryptococcus lau
rentiiの両微生物は、セントラルビューロー ヴォー シ
メール カルチャーズ(CBS)で調べられ、CBSは両微生物
に次の名前を与えた。即ち、 Lecythophere hoffmannii (van Beijma)、 W. Gams (synonym Phialophora hoffmannii) なぜならCBSによればこれは糸状菌だからである。
rentiiの両微生物は、セントラルビューロー ヴォー シ
メール カルチャーズ(CBS)で調べられ、CBSは両微生物
に次の名前を与えた。即ち、 Lecythophere hoffmannii (van Beijma)、 W. Gams (synonym Phialophora hoffmannii) なぜならCBSによればこれは糸状菌だからである。
【００３３】Cryptococcus albidus, ATCC 20918もCBS
で調べられ、CBSはこの培養菌をCryptococcus albidus
var. albidus (Saito)Skinnerと命名した。Cryptococcu
s albidus, ATCC 20918については次のように記述され
ている。形態学： 液体培地における増殖は単極の出芽
細胞を現した。この液体表面には薄膜が現われ、一方重
い沈降物が観察された。固体寒天における増殖は単細胞
で、白色から僅かにピンク色がかった、非常に光沢のあ
る、明るく、ねばねばした、丸くてはっきりとした境界
のコロニーを持っていた。偽菌糸[pseudohyphae]はコー
ンミール寒天に形成されなかった。 生理学および生化学： 炭素固定： 炭素固定： (増殖) (増殖) グルコース ＋ Ｄ−リボース 不明 ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ エタノール 不明 スクロース ＋ エリトリトール − セロビオース ＋ グリセロール 不明 トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） ＋ ラクトース ＋ ズルシトール（ガラクチトール） ＋ メリビオース − Ｄ−マンニトール ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） ＋ メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ イヌリン − サリシン ＋ 可溶性デンプン − イノシトール ＋ Ｄ−キシロース − 乳酸 − Ｌ−アラビノース − クエン酸 − Ｄ−アラビノース − コハク酸 ＋ ３０℃で増殖 ＋ ３７℃で増殖 − ビタミンなしの増殖 − アルブチンの分裂 ＋ 窒素同化： ＮＨ4ＮＯ3 ＋ ＫＮＯ3 ＋ ＮＯ2 ＋ エチルアミン ＋ 発 酵（酸形成） グルコース − ガラクトース − マルトース − スクロース − ラクトース − ラフィノース − メリビオース − イヌリン − セロビオース − メレチトース − デンプン − トレハロース −
で調べられ、CBSはこの培養菌をCryptococcus albidus
var. albidus (Saito)Skinnerと命名した。Cryptococcu
s albidus, ATCC 20918については次のように記述され
ている。形態学： 液体培地における増殖は単極の出芽
細胞を現した。この液体表面には薄膜が現われ、一方重
い沈降物が観察された。固体寒天における増殖は単細胞
で、白色から僅かにピンク色がかった、非常に光沢のあ
る、明るく、ねばねばした、丸くてはっきりとした境界
のコロニーを持っていた。偽菌糸[pseudohyphae]はコー
ンミール寒天に形成されなかった。 生理学および生化学： 炭素固定： 炭素固定： (増殖) (増殖) グルコース ＋ Ｄ−リボース 不明 ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ エタノール 不明 スクロース ＋ エリトリトール − セロビオース ＋ グリセロール 不明 トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） ＋ ラクトース ＋ ズルシトール（ガラクチトール） ＋ メリビオース − Ｄ−マンニトール ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） ＋ メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ イヌリン − サリシン ＋ 可溶性デンプン − イノシトール ＋ Ｄ−キシロース − 乳酸 − Ｌ−アラビノース − クエン酸 − Ｄ−アラビノース − コハク酸 ＋ ３０℃で増殖 ＋ ３７℃で増殖 − ビタミンなしの増殖 − アルブチンの分裂 ＋ 窒素同化： ＮＨ4ＮＯ3 ＋ ＫＮＯ3 ＋ ＮＯ2 ＋ エチルアミン ＋ 発 酵（酸形成） グルコース − ガラクトース − マルトース − スクロース − ラクトース − ラフィノース − メリビオース − イヌリン − セロビオース − メレチトース − デンプン − トレハロース −
【００３４】Bensingtonia ciliata, ATCC 20919につい
ては次のように記述されている。形態学： 酵母維持ブ
イヨン(ATCC 培地 #200)上で細胞は１細胞当り１〜３芽
を持つ球形である。固形培地で細胞は、産生された射出
胞子を有する糸状のものとなる。コロニーは、サーモン
黄褐色で、平たくて、どんよりしていているが、はっき
りした境界を持っている。コーンミール寒天(ATCC 培地
#307)上で、３週間後に真の菌糸体が観察された。 生理学： 炭素固定： グルコース ＋ Ｄ−リボース − ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ エタノール 弱 スクロース ＋ エリトリトール ＋ セロビオース ＋ グリセロール ＋ トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） 弱 ラクトース − ズルシトール（ガラクチトール） 弱 メリビオース ＋ Ｄ−マンニトール 弱 ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） 弱 メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド 弱 イヌリン − サリシン 弱 可溶性デンプン ＋ イノシトール − Ｄ−キシロース ＋ 乳酸 − Ｌ−アラビノース ＋ クエン酸 − Ｄ−アラビノース − コハク酸 弱 ビタミンなしの成長 − 窒素同化： ＮＨ4ＮＯ3 弱 高温における増殖： ３０℃ 弱／− ３７℃ −
ては次のように記述されている。形態学： 酵母維持ブ
イヨン(ATCC 培地 #200)上で細胞は１細胞当り１〜３芽
を持つ球形である。固形培地で細胞は、産生された射出
胞子を有する糸状のものとなる。コロニーは、サーモン
黄褐色で、平たくて、どんよりしていているが、はっき
りした境界を持っている。コーンミール寒天(ATCC 培地
#307)上で、３週間後に真の菌糸体が観察された。 生理学： 炭素固定： グルコース ＋ Ｄ−リボース − ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ エタノール 弱 スクロース ＋ エリトリトール ＋ セロビオース ＋ グリセロール ＋ トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） 弱 ラクトース − ズルシトール（ガラクチトール） 弱 メリビオース ＋ Ｄ−マンニトール 弱 ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） 弱 メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド 弱 イヌリン − サリシン 弱 可溶性デンプン ＋ イノシトール − Ｄ−キシロース ＋ 乳酸 − Ｌ−アラビノース ＋ クエン酸 − Ｄ−アラビノース − コハク酸 弱 ビタミンなしの成長 − 窒素同化： ＮＨ4ＮＯ3 弱 高温における増殖： ３０℃ 弱／− ３７℃ −
【００３５】分類学上の説明： Ｂｅｎｓｉｎｇｔｏｎｉａ ｃｉｌｉａｔａ Ｃ．Ｔ．
Ｉｎｇｏｌｄ（後記の注意書参照）線菌綱（不完全菌
類）［Ｆｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ］射出胞子の
菌類（勢いよくはじき飛ばされる胞子）この射出胞子は
無色で、液体培地中で２×５μ、ほとんど８×５μの卵
形で、尖端が尖り基部が平らである。射出胞子は酵母の
ような出芽型胞子を形成して発芽する。そして上記出芽
型胞子は反復的に胞子形成を繰り返しながら典型的な酵
母コロニーを形成する。ある種の射出胞子は、射出胞子
を産生する短い菌糸の形成や反復的な胞子の放出を伴っ
て発芽し、全体的に菌糸型のコロニーとなる。
Ｉｎｇｏｌｄ（後記の注意書参照）線菌綱（不完全菌
類）［Ｆｕｎｇｉ Ｉｍｐｅｒｆｅｃｔｉ］射出胞子の
菌類（勢いよくはじき飛ばされる胞子）この射出胞子は
無色で、液体培地中で２×５μ、ほとんど８×５μの卵
形で、尖端が尖り基部が平らである。射出胞子は酵母の
ような出芽型胞子を形成して発芽する。そして上記出芽
型胞子は反復的に胞子形成を繰り返しながら典型的な酵
母コロニーを形成する。ある種の射出胞子は、射出胞子
を産生する短い菌糸の形成や反復的な胞子の放出を伴っ
て発芽し、全体的に菌糸型のコロニーとなる。
【００３６】下記培地からの評価： ATCC培地 #307 コーンミール寒天 (Difco 0386)及び半力の
コーンミール寒天 #200 酵母モルト寒天 (Difco 0712) #331 アカパンカビ[Neurospora]寒天(Difco0321) #1245 YEPD #324 モルトエキス寒天 (Difco 0024) #336 ポテトデキストロース寒天 #343 V−8ジュース寒天 注意書 1. Ingold, C.T. (1986) Bensingtonia ciliata
Gen. et. sp. nov.,Ballistoporic Fungus. Trans. B
r. Mycol.Soc. 86(2): 325−328 注意書 2. Ingold, C.T. (1988) Bensingtonia ciliata
に関するさらなる観察Trans. Br. Mycol. Soc. 91(1):
162−166
コーンミール寒天 #200 酵母モルト寒天 (Difco 0712) #331 アカパンカビ[Neurospora]寒天(Difco0321) #1245 YEPD #324 モルトエキス寒天 (Difco 0024) #336 ポテトデキストロース寒天 #343 V−8ジュース寒天 注意書 1. Ingold, C.T. (1986) Bensingtonia ciliata
Gen. et. sp. nov.,Ballistoporic Fungus. Trans. B
r. Mycol.Soc. 86(2): 325−328 注意書 2. Ingold, C.T. (1988) Bensingtonia ciliata
に関するさらなる観察Trans. Br. Mycol. Soc. 91(1):
162−166
【００３７】Cryptococcus laurentii, ATCC 20920 に
ついては次のように記載されている。 即ち、 生理学および生化学： 炭素固定： (増殖) グルコース ＋ Ｄ−リボース ＋弱 ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋弱 Ｄ−グルコサミン 可変 マルトース ＋ エタノール ＋ スクロース ＋ エリトリトール ＋ セロビオース ＋ グリセロール ＋ トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） ＋弱 ラクトース ＋弱 ズルシトール（ガラクチトール） 可変 メリビオース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） ＋ メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ イヌリン ＋ サリシン ＋ 可溶性デンプン ＋ イノシトール ＋ Ｄ−キシロース ＋ 乳酸 ＋ Ｌ−アラビノース ＋ クエン酸 ＋ Ｄ−アラビノース ＋弱 コハク酸 ＋
ついては次のように記載されている。 即ち、 生理学および生化学： 炭素固定： (増殖) グルコース ＋ Ｄ−リボース ＋弱 ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋弱 Ｄ−グルコサミン 可変 マルトース ＋ エタノール ＋ スクロース ＋ エリトリトール ＋ セロビオース ＋ グリセロール ＋ トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） ＋弱 ラクトース ＋弱 ズルシトール（ガラクチトール） 可変 メリビオース ＋ Ｄ−マンニトール ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） ＋ メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ イヌリン ＋ サリシン ＋ 可溶性デンプン ＋ イノシトール ＋ Ｄ−キシロース ＋ 乳酸 ＋ Ｌ−アラビノース ＋ クエン酸 ＋ Ｄ−アラビノース ＋弱 コハク酸 ＋
【００３８】窒素同化： ＮＨ4ＮＯ3 ＋ ＫＮＯ3 ＋ ＮＯ2 ＋ エチルアミン ＋ ビタミンなしの成長 ＋ アルブチンの分裂 ＋ 発 酵 (ガス発生) グルコース − ガラクトース − マルトース − スクロース − ラクトース − ラフィノース − メリビオース − イヌリン − セロビオース − メレチトース − デンプン − トレハロース −
【００３９】形態学：ピンク色のねばねばしたコロニー
で、丸い発芽細胞、フラスコ中で重い沈澱物；Dalmau
皿上に薄い菌糸が形成された。 参照：C. P. Kurtzman, Mycologia 65; p.388−395, 19
73
で、丸い発芽細胞、フラスコ中で重い沈澱物；Dalmau
皿上に薄い菌糸が形成された。 参照：C. P. Kurtzman, Mycologia 65; p.388−395, 19
73
【００４０】Cryptococcus albidus, ATCC 20921につい
ては次のように記載されている。 生理学および生化学： 炭素固定： (増殖) グルコース ＋ Ｄ−リボース − ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ エタノール 可変 スクロース ＋ エリトリトール − セロビオース ＋ グリセロール 可変 トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） 可変 ラクトース ＋ ズルシトール（ガラクチトール） ＋ メリビオース − Ｄ−マンニトール ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） ＋ メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ イヌリン − サリシン ＋ 可溶性デンプン ＋ イノシトール ＋ Ｄ−キシロース ＋ 乳酸 − Ｌ−アラビノース ＋ クエン酸 − Ｄ−アラビノース ＋ コハク酸 ＋
ては次のように記載されている。 生理学および生化学： 炭素固定： (増殖) グルコース ＋ Ｄ−リボース − ガラクトース ＋ Ｌ−ラムノース ＋ Ｌ−ソルボース ＋ Ｄ−グルコサミン ＋ マルトース ＋ エタノール 可変 スクロース ＋ エリトリトール − セロビオース ＋ グリセロール 可変 トレハロース ＋ アドニトール（リビトール） 可変 ラクトース ＋ ズルシトール（ガラクチトール） ＋ メリビオース − Ｄ−マンニトール ＋ ラフィノース ＋ Ｄ−ソルビトール（グルシトール） ＋ メレチトース ＋ ａ−メチル−Ｄ−グルコシド ＋ イヌリン − サリシン ＋ 可溶性デンプン ＋ イノシトール ＋ Ｄ−キシロース ＋ 乳酸 − Ｌ−アラビノース ＋ クエン酸 − Ｄ−アラビノース ＋ コハク酸 ＋
【００４１】窒素同化： ＮＨ4ＮＯ3 ＋ ＫＮＯ3 ＋ ＮＯ2 ＋ エチルアミン ＋ ビタミンなしの成長 ＋ アルブチンの分裂 ＋
【００４２】発 酵 (ガス発生)： グルコース − ガラクトース − マルトース − スクロース − ラクトース − ラフィノース − メリビオース − イヌリン − セロビオース − メレチトース − デンプン − トレハロース −
【００４３】形態学： 黄褐色の、ねばねばしたコロニ
ー。丸い発芽細胞。フラスコ中に重い沈澱物、偽菌糸
体または真の菌糸体。
ー。丸い発芽細胞。フラスコ中に重い沈澱物、偽菌糸
体または真の菌糸体。
【００４４】
【実施例】図１は、Cryptococcus albidus (ATCC 2091
8)を使用したときのpHに対する実施例１の生成物の薄層
クロマトグラフィ展開スポットの写真で、下記構造のス
クラレオライドと、
8)を使用したときのpHに対する実施例１の生成物の薄層
クロマトグラフィ展開スポットの写真で、下記構造のス
クラレオライドと、
【化学式６２】 下記構造のジオール中間体とが、
【化学式６３】 下記構造のスクラレオール（基質）から生成されてい
る。
る。
【化学式６４】
【００４５】図２は、実施例３の出発物質のＧＣ−ＭＳ
のスペクトルである。符号21で示されるピークは、下記
構造のスクラレオールのピークである。
のスペクトルである。符号21で示されるピークは、下記
構造のスクラレオールのピークである。
【化学式６５】 符号20で示されるピークは、下記構造の化合物、即ち内
部標準化合物のピークである。
部標準化合物のピークである。
【化学式６６】
【００４６】図３は、下記構造を有する化合物である実
施例２の反応生成物の核磁気共鳴[NMR]スペクトルであ
る。
施例２の反応生成物の核磁気共鳴[NMR]スペクトルであ
る。
【化学式６７】
【００４７】図４は、下記構造を有する実施例３の反応
生成物の核磁気共鳴スペクトルである。
生成物の核磁気共鳴スペクトルである。
【化学式６８】
【００４８】図５は、実施例９による下記構造の化合物
の核磁気共鳴スペクトルである。
の核磁気共鳴スペクトルである。
【化学式６９】
【００４９】以下実施例は、現時点で好適な本発明の具
体例を示すために記載されるものであって、いかなる意
味においても本発明の範囲を限定するものではない。特
に断っていない限り重量はグラム、温度は摂氏、圧力は
mm/Hgの単位で示す。
体例を示すために記載されるものであって、いかなる意
味においても本発明の範囲を限定するものではない。特
に断っていない限り重量はグラム、温度は摂氏、圧力は
mm/Hgの単位で示す。
【００５０】実施例１： Cryptococcus albidus(Saito
[Skinner var. albidus])(ATCC 20918)を使用してスク
ラレオールをスクラレオライドに変換するときのpHの影
響 反応：
[Skinner var. albidus])(ATCC 20918)を使用してスク
ラレオールをスクラレオライドに変換するときのpHの影
響 反応：
【化学式７０】 および
【化学式７１】 次の培地が調製された。 ＮＨ4ＮＯ3 ０.１％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％ 酵母エキス ０.２％
【００５１】各々１００mlの培地と、TWEEN80(商標)中
の１gのスクラレオール(TWEEN80：スクラレオール＝
２：１)を内包する１１個のフラスコ。各フラスコは、
２５℃、１５０rpmでデキストロース上に増殖する２４
時間培養物の５mlで接種された。生成物と基質は、薄層
クロマトグラフィで既知標準化合物を対照にモニターさ
れた。ここに「基質」とは、下記構造の化合物と、
の１gのスクラレオール(TWEEN80：スクラレオール＝
２：１)を内包する１１個のフラスコ。各フラスコは、
２５℃、１５０rpmでデキストロース上に増殖する２４
時間培養物の５mlで接種された。生成物と基質は、薄層
クロマトグラフィで既知標準化合物を対照にモニターさ
れた。ここに「基質」とは、下記構造の化合物と、
【化学式７２】 下記構造の化合物
【化学式７３】 との８０：２０の混合物であるスクラレオールをいう。
「中間体」とは、下記構造の化合物をいう。
「中間体」とは、下記構造の化合物をいう。
【化学式７４】 「生成物」とは、下記構造の化合物であるスクラレオライ
ドをいう。
ドをいう。
【化学式７５】
【００５２】
【表１】
【００５３】図１はCryptococcus albidus (ATCC 2091
8)を使用した生成物の薄層クロマトグラフィ溶出物のス
ポットである。
8)を使用した生成物の薄層クロマトグラフィ溶出物のス
ポットである。
【００５４】実施例２： ジオール中間体の生成 反応：
【化学式７６】 および
【化学式７７】 ニュージャージー州、バーネガットタウンシップ、グリー
ンウッドフォレストから持ち込まれた１０個の土壌サン
プルをスクリーニングしている間に、数個のフラスコは
薄層クロマトグラフィに下記構造の化合物に対応するス
ポットを示した。
ンウッドフォレストから持ち込まれた１０個の土壌サン
プルをスクリーニングしている間に、数個のフラスコは
薄層クロマトグラフィに下記構造の化合物に対応するス
ポットを示した。
【化学式７８】 次の培地が調整された。 ＮＨ4ＮＯ3 ０.２％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％ 酵母エキス ０.２％ デキストロース １.０％
【００５５】５００mlフラスコ中に、１００mlの培地
と、スクラレオール粉末：TWEEN 80(商標)が５０：５０
の混合物１gと、が入れられた。このフラスコは、Bensi
ngtonia ciliata, ATCC 20919の分離株４００マイクロ
リットルで接種された。２５℃、１５０rpmで１週間後
に、生成した生成物が、３３０mlの酢酸エチルで抽出さ
れ、抽出物は無水硫酸ナトリウム上に乾燥された。溶媒
は回転蒸発器で除去された。残渣は温めたヘキサンと酢
酸エチル中に溶解された。その抽出物は２４時間かけて
自然蒸発されたが、そのとき下記構造の化合物の純結晶
（３５０mg）が得られた。
と、スクラレオール粉末：TWEEN 80(商標)が５０：５０
の混合物１gと、が入れられた。このフラスコは、Bensi
ngtonia ciliata, ATCC 20919の分離株４００マイクロ
リットルで接種された。２５℃、１５０rpmで１週間後
に、生成した生成物が、３３０mlの酢酸エチルで抽出さ
れ、抽出物は無水硫酸ナトリウム上に乾燥された。溶媒
は回転蒸発器で除去された。残渣は温めたヘキサンと酢
酸エチル中に溶解された。その抽出物は２４時間かけて
自然蒸発されたが、そのとき下記構造の化合物の純結晶
（３５０mg）が得られた。
【化学式７９】
【００５６】図３は下記構造の化合物の核磁気共鳴スペ
クトルである。
クトルである。
【化学式８０】
【００５７】実施例３： Cryptococcus albidus (Sait
o [Skinner var. albidus]), ATCC20918を使用したスク
ラレオライドの生成 反応：
o [Skinner var. albidus]), ATCC20918を使用したスク
ラレオライドの生成 反応：
【化学式８１】 および
【化学式８２】 培 地 ＮＨ4ＮＯ3 ０.２％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％ 抽出酵母 ０.２％ 消泡剤 １０.０g ｄ−Ｈ2Ｏ ８.５l 発酵体パラメータ 温度： ２５℃ 通気： １.０ l/min. 攪拌： ４３０ rpm ｐＨは２５％ＮａＯＨで５.８に制御される。 期間： ４日間基質の調整： ５００gのスクラレオール、２５０gのTWEEN 80および１
１２５gの水がブレンダーにかけられ、５分間攪拌され
てエマルションになった。上記培地を有する発酵器が１
２１℃で３０分間滅菌され２５℃にまで冷やされた。こ
の発酵器がCryptococcus albidus（Saito [Skinner va
r. albidus]） ATCC 20918の２４時間増殖菌３００mlで
接種された。６００gのスクラレオールのエマルジョン
が接種の際に添加され、６００gのエマルジョンが２４
時間、４８時間、７２時間目に添加された。９６時間後
に、発酵器の内容物は４００メッシュのふるいでろ過さ
れた。このようにして得られた粗固形生成物はIPA中に
溶解され、ろ過され、その溶液が濃縮されると結晶化さ
れて、４３０gの純スクラレオライドが得られた。
１２５gの水がブレンダーにかけられ、５分間攪拌され
てエマルションになった。上記培地を有する発酵器が１
２１℃で３０分間滅菌され２５℃にまで冷やされた。こ
の発酵器がCryptococcus albidus（Saito [Skinner va
r. albidus]） ATCC 20918の２４時間増殖菌３００mlで
接種された。６００gのスクラレオールのエマルジョン
が接種の際に添加され、６００gのエマルジョンが２４
時間、４８時間、７２時間目に添加された。９６時間後
に、発酵器の内容物は４００メッシュのふるいでろ過さ
れた。このようにして得られた粗固形生成物はIPA中に
溶解され、ろ過され、その溶液が濃縮されると結晶化さ
れて、４３０gの純スクラレオライドが得られた。
【００５８】図２はこの実施例３中の初期反応混合物の
ＧＣ−ＭＳスペクトルである。符号21で示すピークはス
クラレオールのピークで、下記構造の化合物の８０：２
０の混合物である。
ＧＣ−ＭＳスペクトルである。符号21で示すピークはス
クラレオールのピークで、下記構造の化合物の８０：２
０の混合物である。
【化学式８３】 符号20で示すピークは下記構造の化合物の内部標準化合
物のピークである。
物のピークである。
【化学式８４】 図４は、下記構造のこの実施例３により生成されたスク
ラレオライドの核磁気共鳴スペクトルである。
ラレオライドの核磁気共鳴スペクトルである。
【化学式８５】
【００５９】実施例４： Cryptococcus albidus，ATCC
20918を使用してのスクラレオールからのスクラレオラ
イドの生成 実施例３で使用されたものと同一の培地ならびにパラメ
ータが使用された。しかし基質調整および添加の方法は
変更した。スクラレオール粉末１６０gと、TWEEN 80(商
標)８０gが滅菌に先だち培地に加えられた。それとは別
の基質が、微細粉にされたスクラレオール(２部)とTWEE
N 80(１部)を混ぜてペースト状に形成することで調整さ
れた。このペーストの２２５g部が接種後２４時間、４
８時間、７２時間目に加えられた。全部で６５５gの、
純度６７.３４％の粗スクラレオライドが得られた。
20918を使用してのスクラレオールからのスクラレオラ
イドの生成 実施例３で使用されたものと同一の培地ならびにパラメ
ータが使用された。しかし基質調整および添加の方法は
変更した。スクラレオール粉末１６０gと、TWEEN 80(商
標)８０gが滅菌に先だち培地に加えられた。それとは別
の基質が、微細粉にされたスクラレオール(２部)とTWEE
N 80(１部)を混ぜてペースト状に形成することで調整さ
れた。このペーストの２２５g部が接種後２４時間、４
８時間、７２時間目に加えられた。全部で６５５gの、
純度６７.３４％の粗スクラレオライドが得られた。
【００６０】実施例５： Cryptococcus albidus, ATCC
20921を使用してのスクラレオールからスクラレオライ
ドの生成 実施例４で使用されたものと同一の培地ならびにパラメ
ータが使用された。しかし基質の量および攪拌は変更し
た。スクラレオール１５０gと、TWEEN80(商標)７５gが
滅菌に先だち培地に加えられた。ペースト状の基質２４
１gだけが接種後２４時間目に加えられた。攪拌は４３
０rpmで開始され、その後６３０rpmまで高められた。全
部で４９１gの、純度４４％の粗スクラレオライド（モ
ル／モル変換９４.７％）が得られた。
20921を使用してのスクラレオールからスクラレオライ
ドの生成 実施例４で使用されたものと同一の培地ならびにパラメ
ータが使用された。しかし基質の量および攪拌は変更し
た。スクラレオール１５０gと、TWEEN80(商標)７５gが
滅菌に先だち培地に加えられた。ペースト状の基質２４
１gだけが接種後２４時間目に加えられた。攪拌は４３
０rpmで開始され、その後６３０rpmまで高められた。全
部で４９１gの、純度４４％の粗スクラレオライド（モ
ル／モル変換９４.７％）が得られた。
【００６１】実施例６： スクラレオール、ジオール中
間体、およびジオールアセテートからのスクラレオライ
ドの生成 反応：
間体、およびジオールアセテートからのスクラレオライ
ドの生成 反応：
【化学式８６】 および
【化学式８７】
【００６２】次の培地が調整された。 ＮＨ4ＮＯ3 ０.２％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％ 抽出酵母 ０.２％ デキストロース ０.５％
【００６３】１０l容量の発酵器が次の操作条件で用い
られた。 温度： ２５℃ ｐＨ： ６.０ 攪拌： ４３０rpm 滅菌： １２１℃で３０分間
られた。 温度： ２５℃ ｐＨ： ６.０ 攪拌： ４３０rpm 滅菌： １２１℃で３０分間
【００６４】この発酵器は、同一培地で２５℃、１５０
rpmで増殖された４８時間振盪フラスコ培養液１００ml
で接種された。２４時間の増殖後、発行器内の発行物が
それぞれ２００mlに分取され、冷却されている遠心機中
で１０,０００rpm１０分間、遠心された。各試験管中の
この細胞が２度、バターフィールド氏のリン酸−緩衝液
で洗浄された。
rpmで増殖された４８時間振盪フラスコ培養液１００ml
で接種された。２４時間の増殖後、発行器内の発行物が
それぞれ２００mlに分取され、冷却されている遠心機中
で１０,０００rpm１０分間、遠心された。各試験管中の
この細胞が２度、バターフィールド氏のリン酸−緩衝液
で洗浄された。
【００６５】緩衝液の調製 保存溶液： リン酸水素モノカリウム ３４.０g 蒸留水 ５００.０ml 約１７５mlの１.０Ｎ（規定）水酸化ナトリウム溶液で
ｐＨ７.２に調整し、１lに希釈し貯蔵する。 希釈剤：１.２５mlの保存溶液を蒸留水で１lに希釈す
る。適当な容器中に希釈盲検溶液を調製する。１２１℃
で１５分間滅菌する。
ｐＨ７.２に調整し、１lに希釈し貯蔵する。 希釈剤：１.２５mlの保存溶液を蒸留水で１lに希釈す
る。適当な容器中に希釈盲検溶液を調製する。１２１℃
で１５分間滅菌する。
【００６６】この細胞は次にこの緩衝液１００ml中に採
取される。ｐＨが６に調整され、そしてこの混合物は５
００mlフラスコに移された。
取される。ｐＨが６に調整され、そしてこの混合物は５
００mlフラスコに移された。
【００６７】テストされた化合物： ａ．化合物１＝TWEEN80中のスクラレオール（１：２）
ペースト ｂ．化合物２＝下記構造のアセテートをTWEEN80に１：
１で混合したもの
ペースト ｂ．化合物２＝下記構造のアセテートをTWEEN80に１：
１で混合したもの
【化学式８８】 ｃ．化合物３＝TWEEN80中に混合された下記構造のジオ
ール（１：１）ペースト
ール（１：１）ペースト
【化学式８９】
【００６８】１００mlの緩衝液を内包する３００mlフラ
スコと細胞(休止細胞)が、２５℃、１５０rpmでシェー
カーインキュベータに入れられ、薄層クロマトグラフィ
を用いて標準既知化合物に対して２４時間、４８時間、
および７２時間と、サンプルが分析された。
スコと細胞(休止細胞)が、２５℃、１５０rpmでシェー
カーインキュベータに入れられ、薄層クロマトグラフィ
を用いて標準既知化合物に対して２４時間、４８時間、
および７２時間と、サンプルが分析された。
【００６９】次の表２において、Ｐとは生成物たる下記
構造のスクラレオライド：
構造のスクラレオライド：
【化学式９０】 Ｓとは下記構造の基質で化合物の１つ：８０：２０の比
率の
率の
【化学式９１】 および
【化学式９２】 Ｉは下記構造の化合物たる中間体：
【化学式９３】 Ｔは微量ということである。
【００７０】
【表２】
【００７１】実施例７： Bensingtonia ciliata, ATCC
20919を用いたスクラレオライドからのジオール中間体
の生成 実施例２と同一方法による実験が、次の仕様で行われ
た。 微生物：Bensingtonia ciliata, ATCC 20919 培地： ＮＨ4ＮＯ3 ４０.０ｇ 抽出酵母 ４０.０ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ２０.０ｇ ＭｇＳＯ4.７Ｈ2Ｏ １０.０ｇ スクラレオール １６０.０ｇ TWEEN 80 ８０.０ｇ ｄ−Ｈ2Ｏ １９.０l 発酵器パラメータ： 温度： ２５℃ 通気： ２l／分 攪拌： ３００rpm ｐＨ： ２５％のＮａＯＨで６.０に制御 期間： １５日間 上記培地を有する発酵器が１２１℃
で３０分間滅菌され、２５℃に冷やされた。この発酵器
が４８時間増殖されたBensingtonia ciliata, ATCC 20
919の培養物１lで接種された。１５日間のインキュベー
ション後に基質は生成物になっていた。発酵器の内容物
は４００メッシュのふるいにかけられてろ過された。こ
のようにして得られた粗固形生成物は風乾された。１０
１.７gの生成物が得られた。
20919を用いたスクラレオライドからのジオール中間体
の生成 実施例２と同一方法による実験が、次の仕様で行われ
た。 微生物：Bensingtonia ciliata, ATCC 20919 培地： ＮＨ4ＮＯ3 ４０.０ｇ 抽出酵母 ４０.０ｇ ＫＨ2ＰＯ4 ２０.０ｇ ＭｇＳＯ4.７Ｈ2Ｏ １０.０ｇ スクラレオール １６０.０ｇ TWEEN 80 ８０.０ｇ ｄ−Ｈ2Ｏ １９.０l 発酵器パラメータ： 温度： ２５℃ 通気： ２l／分 攪拌： ３００rpm ｐＨ： ２５％のＮａＯＨで６.０に制御 期間： １５日間 上記培地を有する発酵器が１２１℃
で３０分間滅菌され、２５℃に冷やされた。この発酵器
が４８時間増殖されたBensingtonia ciliata, ATCC 20
919の培養物１lで接種された。１５日間のインキュベー
ション後に基質は生成物になっていた。発酵器の内容物
は４００メッシュのふるいにかけられてろ過された。こ
のようにして得られた粗固形生成物は風乾された。１０
１.７gの生成物が得られた。
【００７２】実施例８： デカヒドロ−３ａ,６,６,９
ａ−テトラメチルナフト[２−１−ｂ]フランの調製 反応：
ａ−テトラメチルナフト[２−１−ｂ]フランの調製 反応：
【化学式９４】 および
【化学式９５】
【００７３】機械的攪拌装置、温度計、滴下漏斗、およ
び還流冷却器が装備された１lの三口反応容器に、１２
４mlのVITRIDE(商標)｛水素化ビス（２−メトキシエト
キシ）アルミニウムナトリウム｝を添加した。このVITR
IDEに攪拌しながら５００mlのトルエンが添加された。
実施例６の方法で調製された下記構造のスクラレオライ
ド５０gが１２０mlのトルエン中に溶解された。
び還流冷却器が装備された１lの三口反応容器に、１２
４mlのVITRIDE(商標)｛水素化ビス（２−メトキシエト
キシ）アルミニウムナトリウム｝を添加した。このVITR
IDEに攪拌しながら５００mlのトルエンが添加された。
実施例６の方法で調製された下記構造のスクラレオライ
ド５０gが１２０mlのトルエン中に溶解された。
【化学式９６】 次にこのスクラレオール／トルエン溶液は滴下漏斗を介
して反応混合物へ半時間のあいだ滴々滴下された。この
ときの反応混合物の温度は５５℃にまで上げてもよい。
次に反応混合物は２時間のあいだ８０℃に加熱された。
次に反応混合物は、氷で冷却されながら５％水酸化ナト
リウム水溶液６００mlをゆっくりと添加することにより
処理された。トルエン層が分液され、飽和塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄され、等容量のメチルアルコールと飽和
炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄された。次にトルエ
ン層を濃縮すると重量４３.３４gの固体が得られた(収
率８６％)。このようにして得られた固体は下記構造を
持つ。
して反応混合物へ半時間のあいだ滴々滴下された。この
ときの反応混合物の温度は５５℃にまで上げてもよい。
次に反応混合物は２時間のあいだ８０℃に加熱された。
次に反応混合物は、氷で冷却されながら５％水酸化ナト
リウム水溶液６００mlをゆっくりと添加することにより
処理された。トルエン層が分液され、飽和塩化ナトリウ
ム水溶液で洗浄され、等容量のメチルアルコールと飽和
炭酸水素ナトリウムの水溶液で洗浄された。次にトルエ
ン層を濃縮すると重量４３.３４gの固体が得られた(収
率８６％)。このようにして得られた固体は下記構造を
持つ。
【化学式９７】 この化合物１.５gが、３０ml水中の水酸化カリウム１
２.０gの溶液に混合された。この混合物がヒーター、攪
拌装置、および還流冷却器で装備されたフラスコ中に入
れられ３時間のあいだ８０℃で還流された。３時間後
に、生成物が蒸気温度１６２〜１６４℃、気圧１５mm／
Hg.で分別蒸留され、下記構造のかなり純粋な化合物を
得た。
２.０gの溶液に混合された。この混合物がヒーター、攪
拌装置、および還流冷却器で装備されたフラスコ中に入
れられ３時間のあいだ８０℃で還流された。３時間後
に、生成物が蒸気温度１６２〜１６４℃、気圧１５mm／
Hg.で分別蒸留され、下記構造のかなり純粋な化合物を
得た。
【化学式９８】
【００７４】実施例９： 環状エーテルの生成 反応：
【化学式９９】 および
【化学式１００】 次の培地が調製された。 成 分 重量部 ＮＨ4ＮＯ3 ０.２％ ＫＨ2ＰＯ4 ０.１％ ＭｇＳＯ4・７Ｈ2Ｏ ０.０５％ 抽出酵母 ０.２％ デキストロース １.０％
【００７５】５００mlのフラスコに１００mlの培地と
１.０gのスクラレオール粉末・TWEEN800の５０:５０混
合物が入れられた。フラスコは４００マイクロリットル
のCryptococcus laurentii, ATCC 20920の分離株で接種
された。２５℃、１５０rpmで１週間後、生じた生成物
は３３０mlの酢酸エチルで抽出され、この抽出物は無水
硫酸ナトリウムで乾燥された。溶媒は回転蒸発器で蒸留
された。残渣は温かいヘキサンと酢酸エチル中に溶解さ
れた。有機層を２４時間自然蒸発すると、下記構造の化
合物の純結晶（３５０mg）が得られた。
１.０gのスクラレオール粉末・TWEEN800の５０:５０混
合物が入れられた。フラスコは４００マイクロリットル
のCryptococcus laurentii, ATCC 20920の分離株で接種
された。２５℃、１５０rpmで１週間後、生じた生成物
は３３０mlの酢酸エチルで抽出され、この抽出物は無水
硫酸ナトリウムで乾燥された。溶媒は回転蒸発器で蒸留
された。残渣は温かいヘキサンと酢酸エチル中に溶解さ
れた。有機層を２４時間自然蒸発すると、下記構造の化
合物の純結晶（３５０mg）が得られた。
【化学式１０１】
【図１】Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ａｌｂｉｄｕｓ
（ＡＴＣＣ ２０９１８）を使用したときのｐＨに対す
る実施例１の生成物の薄層クロマトグラフィ展開スポッ
トである。
（ＡＴＣＣ ２０９１８）を使用したときのｐＨに対す
る実施例１の生成物の薄層クロマトグラフィ展開スポッ
トである。
【図２】実施例３の出発物質のＧＣ−ＭＳのスペクトル
である。
である。
【図３】下記構造を有する化合物である実施例２の反応
生成物の核磁気共鳴［ＮＭＲ］スペクトルである。
生成物の核磁気共鳴［ＮＭＲ］スペクトルである。
【図４】下記構造を有する実施例３の反応生成物の核磁
気共鳴スペクトルである。
気共鳴スペクトルである。
【図５】実施例９による下記構造の化合物の核磁気共鳴
スペクトルである。 z
スペクトルである。 z
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 ＦＩ (Ｃ１２Ｐ 7/18 Ｃ１２Ｒ 1:01） (Ｃ１２Ｐ 17/06 Ｃ１２Ｒ 1:01） (72)発明者 ジェームス エイ モーリス アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07719、 ウォール、ウエスト コート 1406 (72)発明者 アーサー イー ダウニィ アメリカ合衆国、ニュージャージー州 07036、 リンデン、モーリスタウン ロード 135 (58)調査した分野(Int.Cl.6，ＤＢ名) C12P 7/18 C12N 1/20 C12P 17/06
Claims (5)
- 【請求項１】 下記構造の化合物 【化１】 及び 【化２】 の１または２を含む水性養分培地中で通気条件下に、上
記化合物の少なくとも１を変換して下記のジオール 【化３】 及び、下記の環状エーテル 【化４】 を生産できるＣｒｙｏｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎ
ｔｉｉ，ＡＴＣＣ ２０９２０の生物学的に純粋な培養
物。 - 【請求項２】 下記構造の化合物 【化１】 及び 【化２】 の１または２を含む水性養分培地中で通気条件下に、ｃ
ｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓｌａｕｒｅｎｔｉｉ，ＡＴＣＣ
２０９２０を培着し、上記化合物の少なくとも１を変
換して下記のジオール 【化３】 を回収可能な量で生産することを特徴とする前記ジオー
ルの製造方法。 - 【請求項３】 下記構造の化合物 【化４】 及び 【化５】 の１または２以上の化合物を含む水性養分培地中で通気
条件下に、Ｃｒｙｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｌａｕｒｅｎｔ
ｉｉ，ＡＴＣＣ ２０９２０を培養し、上記化合物の少
なくとも１の化合物を変換して回収可能な量で下記の環
状エーテル 【化６】 を生産することを特徴とする前記環状エーテルの製造方
法。 - 【請求項４】 培養を、追加の炭素源を含む水性養分
培地中で （ｉ）ｐＨ：約２．５〜約９．０ （ｉｉ）温度：約１２℃〜約３３℃ （ｉｉｉ）化合物濃度：約０．１ｇ／ｌ〜約１３０ｇ／
ｌ の条件の下で行う請求項２または３に記載の方法。 - 【請求項５】 追加の炭素源がデキストロースである
請求項４に記載の方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20308194A JP2802588B2 (ja) | 1994-08-05 | 1994-08-05 | 微生物の生物学的に純粋な培養物、並びにそれを用いるジオール製造方法および環状エーテル製造方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP20308194A JP2802588B2 (ja) | 1994-08-05 | 1994-08-05 | 微生物の生物学的に純粋な培養物、並びにそれを用いるジオール製造方法および環状エーテル製造方法 |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2196449A Division JPH0779682B2 (ja) | 1989-08-28 | 1990-07-26 | 微生物の生物学的に純粋な培養物、ラクトン生成方法、ジオール生成方法、化合物生成方法および環状エーテルの生成方法 |
Related Child Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP23334397A Division JP3002654B2 (ja) | 1997-08-14 | 1997-08-14 | 微生物の生物学的に純粋な培養物、およびそれを用いるジオール製造方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH09107982A JPH09107982A (ja) | 1997-04-28 |
| JP2802588B2 true JP2802588B2 (ja) | 1998-09-24 |
Family
ID=16468051
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP20308194A Expired - Lifetime JP2802588B2 (ja) | 1994-08-05 | 1994-08-05 | 微生物の生物学的に純粋な培養物、並びにそれを用いるジオール製造方法および環状エーテル製造方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP2802588B2 (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007097106A1 (ja) | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Kao Corporation | 新規微生物、当該新規微生物を用いたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法 |
| JP2007222110A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-09-06 | Kao Corp | 新規微生物、当該新規微生物を用いたアンブロキサン中間体の製造方法 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7588759B2 (en) * | 2004-12-17 | 2009-09-15 | Avoca, Inc. | Compositions comprising sclareol or derivatives thereof and uses thereof |
| JP5113379B2 (ja) * | 2006-02-24 | 2013-01-09 | 花王株式会社 | 新規微生物、当該新規微生物を用いたドデカヒドロ−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルナフト［２，１−ｂ］フラン中間体の製造方法 |
-
1994
- 1994-08-05 JP JP20308194A patent/JP2802588B2/ja not_active Expired - Lifetime
Cited By (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2007097106A1 (ja) | 2006-02-24 | 2007-08-30 | Kao Corporation | 新規微生物、当該新規微生物を用いたドデカヒドロ-3a,6,6,9a-テトラメチルナフト[2,1-b]フラン中間体の製造方法 |
| JP2007222110A (ja) * | 2006-02-24 | 2007-09-06 | Kao Corp | 新規微生物、当該新規微生物を用いたアンブロキサン中間体の製造方法 |
| JP4598692B2 (ja) * | 2006-02-24 | 2010-12-15 | 花王株式会社 | 新規微生物、当該新規微生物を用いたドデカヒドロ−３ａ，６，６，９ａ−テトラメチルナフト［２，１−ｂ］フラン中間体の製造方法 |
| US8084237B2 (en) | 2006-02-24 | 2011-12-27 | Kao Corporation | Microorganism and method for producing dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphtho[2,1-b]furan intermediate using the novel microorganism |
| US8293518B2 (en) | 2006-02-24 | 2012-10-23 | Kao Corporation | Microorganism and method for producing dodecahydro-3a,6,6,9a-tetramethylnaphtho[2,1-b]furan intermediate using the novel microorganism |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH09107982A (ja) | 1997-04-28 |
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